نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه رازی
2 دانشیار، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه رازی.
3 عضو گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی، دانشگاه رازی.
چکیده
بابونه (Matricaria aurea L.) یک گیاه دارویی مهم و متعلق به خانواده کاسنی میباشد که به شکل گسترده-ای در داروسازی، صنایع غذایی، آرایشی و بهداشتی مصرف میشود. با توجه به اهمیت این گیاه، بهینهسازی کشت بافت آن میتواند زمینهساز تحقیقات و استفاده بیشتر از این گیاه گردد. به منظور بهینهسازی کشت بافت این گیاه آزمایشهای القاء کالوس و باززایی غیرمستقیم انجام شد. هر دو آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار روی محیط کشت MS اجرا گردید. در هر دو آزمایش سطوح مختلف تنظیم کنندههای رشد گیاهی NAA و BAP به همراه دو ریز نمونه ساقه و برگ مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در محیط کشت فاقد هورمون رشد (شاهد) القای کالوس مشاهده نشد. بررسیها نشان داد که القای کالوس ریزنمونهها در ترکیب هورمونی (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) سریعتر بود. ترکیبهای (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریزنمونههای ساقه و برگ (100%) به ترتیب شناخته شدند. اثرمتقابل غلظتهای مختلف NAA و BAP در ریزنمونه بر صفت قطر کالوس معنیدار شد و ریزنمونه برگ در سطح 2 میلیگرم در لیتر NAA و 5/1 میلیگرم در لیتر BAP با میانگین 31/15 میلیمتر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (59/85% )، درکالوسهای حاصل از برگ و ترکیب هورمونی 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده شد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effect of explant types and different levels of plant growth regulators on callogenesis and regeneration in medicinal plant, Matricaria aurea
نویسندگان [English]
1 Dept. of Agronomy and Plant Breeding- Faculty of Agriculture- Razi university
2 Academic Member of Razi university
3
چکیده [English]
Matricaria aureais an important medicinal plant belonging to Asteraceae, the widely used in the phrmacetical, food and cosmetics industrial. According to importance of this plant, the aim of current study was optimizing tissue culture in Matricaria aurea. In order to optimize of tissue culture two experiments, callus induction and indirect regeneration were carried out. These experiments were laid out in factorial arrangement based on completely randomized designs (CRD) with three replications on MS base medium. In these experiments, various levels of plant growth regulators, NAA (0, 0.5, 1and 2 mg/l) and BAP (0, 0.5, 1and 1.5mg/l), with two explant types (stem and leaves) were compared. The results showed that was not observed in growth hormone-free medium (control). Results showed that callus induction was occurred fast in all explants in combination of NAA (0.5 mg/l) and BAP (1 mg/l). The best combinations of plant growth regulators for callus induction were 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP and 1 mg/l NAA + 1 mg/l BAP for stem and leaves (100%) respectively. Interaction of different concentration of NAA and BAP was significant for callus diameter trait and leaf explant in combination of 2 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP was the highest callus diameter with mean of 15.31 mm. We observed maximum of indirect regeneration percentage (85.59%) in calli derived from leaf in medium with 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP.
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر نوع ریز نمونه و سطوح مختلف تنظیمکنندههای رشد بر کالزایی و باززایی در گیاه دارویی بابونه (Matricaria aurea L.)
شیما وطندوست1 و علیرضا زبرجدی1،2*
1ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی
2 ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی برای تنش خشکی
تاریخ دریافت: 22/11/96 تاریخ پذیرش: 11/2/98
چکیده
بابونه (Matricaria aurea L.) یک گیاه دارویی مهم و متعلق به خانواده کاسنی میباشد که به شکل گستردهای در داروسازی، صنایع غذایی، آرایشی و بهداشتی مصرف میشود. باتوجه به اهمیت این گیاه، بهینهسازی کشت بافت آن میتواند زمینهساز تحقیقات و استفاده بیشتر از این گیاه گردد. بهمنظور بهینهسازی کشت بافت این گیاه آزمایشهای القاء کالوس و باززایی غیرمستقیم انجام شد. هر دو آزمایش بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار روی محیط کشت MS اجرا گردید. در هر دو آزمایش سطوح مختلف تنظیم کنندههای رشد گیاهی NAA و BAP به همراه دو ریز نمونه ساقه و برگ مورد مقایسه قرارگرفتند. نتایج نشان داد که در محیط کشت فاقد هورمون رشد (شاهد) القای کالوس مشاهده نشد. بررسیها نشان داد که القای کالوس ریز نمونهها در ترکیب هورمونی (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) سریعتر بود. ترکیبهای (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونههای ساقه و برگ (100 درصد) شناخته شدند. ریز نمونه برگ در سطح 2 میلیگرم در لیتر NAA و 5/1 میلیگرم در لیتر BAP با میانگین 31/15 میلیمتر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (59/85 درصد)، درکالوسهای حاصل از برگ و ترکیب هورمونی 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده شد.
واژههای کلیدی: بابونه، باززایی غیرمستقیم، کالوس، NAA، BAP
* نویسنده مسئول: تلفن: 09181321809، پست الکترونیکی:zebarjadiali@yahoo.com
مقدمه
بابونه یکی از مهمترین گیاهان دارویی است که شامل چندین جنس میباشد اما جنس L. Matricaria به دلیل کاربرد بسیار بیشتر موردتوجه محققین گیاهان دارویی قرارگرفته است و دارای گونههای متعددی میباشد (16). یکی از گونهها بابونه اورآ یا بابونه اروپایی زرد بانام علمی Matricaria aureaو از تیره کاسنی یا مرکبان (Asteraceae) است (32). از گلهای بابونه در صنایع داروسازی و صنایع غذایی استفاده زیادی میشود (5). مهمترین ترکیبات موجود در گلهای بابونه عبارتند از: اسانس، فلاونوئید و کومارین (32). اسانس حاصل از گلهای بابونه دارای خواص ضدعفونیکننده، آرامبخش، ضداسپاسم، ضدآلرژی، ضدنفخ، ضدقارچ (4و 12)، ضد التهاب (18)، ضد میکروب (33) میباشد. مهمترین اثرات فلاونوئیدها خواص آنتیاکسیدانی قوی آنهاست (3)، همچنین به خاطر اثر مرطوبکنندگی در صنایع بهداشتی و آرایشی بهصورت گستردهای استفاده میشود (5). از دمکرده گلهای بابونه جهت کاهش تورم دست و پا، بهبودی دلدرد و از بین بردن نفخ استفاده میشود (17).
اگرچه تقاضا برای مواد مؤثره موجود افزایشیافته است اما تولید آنها در مقیاس تجاری امری مشکل و پرهزینه است و از طرفی غلظت پایین این ترکیبات در گیاه، مشکلات مرتبط با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان مانع تأمین این مواد از طبیعت شده است. به همین دلیل توجه محققین به راهکارهایی مثل کشت سلولها، اندامها و بافتها و مهندسی ژنتیک معطوف شده است (23 و 30). کشت بافت نسبت به سایر روشهای مرسوم دارای مزیتهایی ازجمله تولید تعداد زیادی گیاه با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت در زمان کوتاهتر و فضای نسبتاً محدود (42)، تولید گیاهان عاری از بیماری، توانایی تولید چند نسل در طی یک سال، تسریع برنامههای اصلاحی در جهت تکثیر واریتههای جدید میباشد (10). در کشت بافت از هر بخش گیاه نظیر نوک ساقه، جوانه برگ، سلولهای مزوفیل، اپیدرم و... میتوان برای تولید کالوس استفاده کرد (6). امروزه روشهای بیوتکنولوژی و اصلاح گیاهی براساس باززایی گیاه از طریق کشت بافت قرارگرفته است. باززایی گیاه از سلول و بافت گیاهی به دلیل وجود خاصیت پرتوانی امکانپذیر است. گزارشهایی متعددی از کشت بافت بابونه برای تولید کالوس و باززایی غیرمستقیم وجود دارد که به تعدادی از آنها اشاره میشود. در گزارش راچلینی و بکر از تنظیمکنندههای رشد مثل NAA و 2,4-D در القای کالوس استفاده شده است و محیط MS حاوی 7/2 میکرومول NAA را برای القای کالوس ریز نمونه ساقه بابونه مناسب دانستند و همچنین بهترین باززایی غیرمستقیم را در محیط MS حاوی یک میلیگرم در لیتر کینتین و 5/0 میلیگرم در لیتر NAA مشاهده کردند (34). در تحقیقات راچلینی و همکاران (1984) روی کشت ساقه بابونه، محیط MS حاوی 7/2 میکرو مول NAA و 9/11 میکرومول Kin را برای کالزایی مناسب دانستند (35). در آزمایش کوهی و همکاران (2011) تأثیر دو نوع تنظیمکننده رشد NAA (0، 5/1 و 4 میلیگرم بر لیتر) و BAP (0، 1 و 3 میلیگرم بر لیتر) روی برگ و هیپوکوتیل بابونه مورد بررسی قرارگرفت. هر دو ریز نمونه در تمام ترکیبات هورمونی کالوسزایی نشان دادند، فقط ریز نمونه برگ در محیط کشت MS کالوسزایی نداشت (22). در بررسی سلارووا و همکاران نشان دادند ترکیبی از NAA و Kin در غلظت 7/2 میکرومول از هرکدام منجر به القای کالوس گل بابونه میشود و همچنین در بررسی باززایی غیرمستقیم بابونه به این نتیجه رسیدند که محیط MS به همراه 1/0 میلیگرم کینتین یا ترکیب هورمونی (5/0 میلیگرم در لیتر کینتین و 5/0 میلیگرم (NAA بهترین پاسخ را میدهد (7). در آزمایشی اثر تنظیمکنندههای رشد مختلف و ریز نمونههای مختلف روی کالوسزایی و باززایی غیرمستقیم بابونه مورد بررسی قرارگرفت. در آزمایش کالوسزایی مشاهده شد که در صفت درصد القای کالوس و حجم کالوس فقط اثرات ساده معنیدار شد و مقایسه میانگین آن نشان داد که ریز نمونه ساقه بیشترین درصد کالوسزایی (32/57 درصد) به خود اختصاص داده است و بیشترین درصد کالوسزایی جوانه جانبی و برگ به ترتیب با میانگین 69/49 و 76/44 درصد بود. همچنین ریز نمونه ساقه با میانگین 23/11 بیشترین حجم کالوس را داشت که با ریز نمونه جوانه جانبی با میانگین 10/11 اختلاف معنیداری نداشت (26). بهترین سطح 2,4-D برای صفتهای فوق 1 میلیگرم در لیتر و بهترین سطح کینتین نیز برای این دو صفت 5/0 میلیگرم در لیتر بود. در آزمایش باززایی غیرمستقیم نیز گزارش کرد که باززایی هر سه ریز نمونه تنها در محیط حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر Kin مشاهده شد. بهطوری که ریز نمونه برگ بیشترین باززایی را با میانگین 77 درصد داشت. در تحقیقات دهقان گرده و همکاران (2011) (9) روی گیاه بابونه و ریز نمونه هیپوکوتیل در سطوح مختلف هورمونهای (2,4-D، BA، NAA و Kin)، به این نتیجه رسیدند که محیط کشت MS حاوی 2 میلیگرم در لیتر 2,4-D و 45/0 میلیگرم در لیتر BAP کمترین درصد کالوسزایی (23/52) را داشت و بیشترین درصد شاخهزایی (33/38) نیز در محیط کشت حاوی 186/0 میلیگرم در لیتر NAA و 225/0 میلیگرم بر لیتر BAP مشاهده شد. در مطالعه صیادی و همکاران (2014) (37)، اثرات تنظیمکنندههای رشد NAA (0، 1، 2 و 4 میلیگرم در لیتر) و Kin (0، 5/0، 1 و 2 میلیگرم در لیتر) را بر روی ریز نمونههای برگ، ساقه و جوانه جانبی ازنظر القای کالوس روی محیط کشت MS بررسی کردند. آنها نشان دادند که غلظت 1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیترKin بهترین ترکیب هورمونی ازلحاظ صفات مورد بررسی شامل روز تا القای کالوس، درصد کالزایی و حجم کالوس میباشد. به طوری که این ترکیب کمترین زمان را برای شروع القای کالوس را داشت و همچنین بیشترین درصد کالزایی ریز نمونههای برگ، جوانهجانبی و ساقه به ترتیب با میانگین 26/93، 68/89 و 75/80 درصد بود و بیشترین حجم کالوس در ریز نمونههای ساقه، جوانهجانبی و برگ به ترتیب با میانگین 49/17، 20/16 و 52/15 درصد بود.
در تحقیق مرادیپور و همکاران (2017) اثر دو نوع تنظیمکننده رشد گیاهی، BAP و TDZ در غلظتهای 4/4 و 8/8 میکرو مولار در ترکیب با 2/2 میکرو مولار IAA بر باززایی مستقیم ریز نمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ گیاه بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.) مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اصفهان (49/92 درصد) در محیط کشت MS حاوی 4/4 میکرو مولار BAP به همراه 2/2 میکرو مولار IAA به دست آمد. همچنین حداکثر ریشهزایی (100 درصد) در محیطهای 1/2MS فاقد تنظیمکننده رشد و MS حاوی 0/5 و 1 میکرو مولار IBA به دست آمد (27).
در تحقیق معصومی اصل و همکاران (2016) که بر باززایی مستقیم دو گونه بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.) و شیرازی (Matricaria recutita L.) انجام شد هر دو ریز نمونه، ساقه دارای گره و کوتیلدون به ترتیب با 75/78 و 75 درصد دارای باززایی قابل قبولی بودند (25).
ولیزاده (1976) (43) در تحقیق خود اثر غلظتهای مختلف تنظیمکنندههای رشد گیاهی NAA (0 ، 1/0 ، 5/0 و 5/1 میلیگرم در لیتر) و BA (0، 1 و 3 میلیگرم در لیتر) بر روی القاء کالوس را مورد مطالعه قرارداد. نتایج نشان داد که القاء کالوس در اکثر تیمارهای هورمونی مشاهده شد و بالاترین فراوانی القاء کالوس در ریز نمونه جنین نابالغ در محیط کشت حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAو در ریز نمونه برگ در تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 3 میلیگرم در لیتر BA به دست آمد.
باتوجه به اینکه بابونه دارای خواص دارویی و مواد مؤثره زیادی میباشد اما محدودیت در کشت زراعی و همچنین برداشت بیرویه آن باعث به خطر افتادن انقراض این گیاه میشود، یکی از روشهای حفاظت از گیاهان دارویی و بهبود کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاهان تولید آنها در خارج از زیستگاههای طبیعی میباشد لذا تولید آن از طریق فنون کشت بافت گیاهی در شرایط آزمایشگاهی مورد توجه قرارگرفته است. بهینهسازی شرایط القای کالوس اولین مرحله برای تولید مقدار زیادی ترکیبات فعال است، در کشت بافت گیاهی نیز میتوان از هر بخش گیاه برای تولید کالوس استفاده کرد. تنظیمکنندههای رشد برای القای کالوس و ترویج رشد بسیاری از سلولهای بنیادی مورد نیاز میباشند، از آنجایی که هرگونه گیاهی نیاز به انواع و سطوح مختلف تنظیمکننده دارد بنابراین انتخاب مناسبترین تنظیمکننده و تعیین غلظت مطلوب آن ضروری است. این پژوهش نیز باهدف بررسی تأثیر ریز نمونه و غلظتهای مختلف تنظیمکنندههای رشد در کالزایی و باززایی غیرمستقیم گیاه بابونه و بهینهسازی پروتکل مناسب انجام شد.
مواد و روشها
این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت گیاهان دارویی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه رازی کرمانشاه طی سال 1394 انجام شد. بذرهای گیاه بابونه از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. برای استریل کردن بذور ابتدا بذور در اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه تکان داده شد و پس از شستشو با آب مقطر به مدت 15-10 دقیقه بهوسیله هیپوکلریت سدیم (NaOCl) 5/1 درصد قرار گرفتند. پس از این مرحله بذور با آب مقطر استریل در سه زمان 1، 3 و 5 دقیقهای شستشو داده شدند. سپس بذور با کاغذ صافی استریل خشک شدند و روی محیط MS بدون هورمون کشت شدند. همهی مراحل استریل بذر زیر هود لامینار و در شرایط استریل انجام شد. سپس شیشههای کشت شده با پارافیلم پیچیده شد و به اتاقک رشد (فیتوترون) با دمای°C2±25 و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل گردیدند. پس از جوانهزنی در شرایط استریل، گیاهچههای 30 روزه را به زیر هود لامینار برده و ریز نمونه برگ و ساقه در قطعات 1-5/0 سانتیمتری جدا شد و روی محیط MS پایه حاوی غلظتهای مختلف تنظیمکننده رشد به همراه ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر و آگار 8 گرم در لیتر با 8/5=pH قرار داده شدند. تمامی تیمارها پس از 14 روز در محیطهای مشابه واکشت شدند. بهمنظور بررسی تأثیر نوع ریز نمونه و همچنین تأثیر ترکیبات هورمونی بر القای کالوس، آزمایش فاکتوریل با سه فاکتور بر پایه طرح کاملاً تصادفی (CRD) در سه تکرار انجام شد. فاکتور اول ریز نمونه در دو سطح (ساقه و برگ)، فاکتور دوم هورمون NAA در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 2 میلیگرم در لیتر) و فاکتور سوم هورمون BAP در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلیگرم در لیتر) مورد استفاده قرارگرفت. صفات اندازهگیری شده عبارتند از: روز تا القای کالوس، درصد القای کالوس (از طریق شمارش تعداد کالوسهای تولید شده تقسیم بر تعداد ریز نمونههای کشت شده ضرب در 100 محاسبه شد) (44)، قطر کالوس (نحوه محاسبه به این صورت است که به کمک کاغذ میلیمتری طول و عرض کالوسها اندازهگیری شد و سپس در هم ضرب شده و از آن جذرگرفته شد)، صفات درصد و قطر کالوس 4 هفته بعد از کشت یادداشتبرداری شد. کالوسها 5-3 روز بعد از القاء در همین محیطهای کشت وارد فاز باززایی غیرمستقیم شدند، لذا آزمایش باززایی غیرمستقیم از کالوسها نیز به شکل فاکتوریل با سه فاکتور و در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام گرفت. فاکتور اول ریز نمونه در دو سطح (کالوسهای حاصل از ساقه و کالوسهای به دست آمده از برگ)، فاکتور دوم هورمون NAA در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 2 میلیگرم در لیتر) و فاکتور سوم هورمون BAP در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلیگرم در لیتر) در محیط کشت MS بکار رفت، صفت درصد باززایی نیز ثبت گردید. نو ساقههای باززاشده به محیط MS بدون تنظیمکننده رشدی منتقل شدند و در همین محیط ریشهدار شدند. نو ساقههایی که ریشهدار شده بودند، بعد از رشد کافی ریشهها از شیشه خارج و بهآرامی با آب شستشو داده شد تا بقایای محیط کشت و آگار از اطراف آنها بهطور کامل حذف شود، سپس به گلدانهای حاوی پرلیت، ورمیکولیت و خاک (دو قسمت خاک مزرعه یک قسمت ماسه اتوکلاو شده) منتقل شدند، هنگام انتقال گیاهچهها به خاک باید توجه نمود که حداقل تنش به آنها وارد شود. جهت سازگاری تدریجی گیاهان طی انتقال از شرایط استریل درون شیشهای به شرایط معمولی رشد، به مدت دو هفته داخل اتاقک رشد با دمای C°1±25 و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. در طول مدت سازگاری جهت بالا بردن رطوبت نسبی ابتدا گلدانها با سرپوش شفاف پوشیده شدند و پس از مدتی در سرپوشها منافذی ایجاد شد و بهتدریج سرپوشها حذف شدند. همچنین از آب مقطر استریل جهت آبیاری گلدانها استفاده شد. هدف از انتقال گیاهان باززا شده به گلدان رسیدن به گیاه کامل با توانایی تولید بذر بود. درنهایت بذور گیاهان منتقل شده به گلدان جمعآوری گردید. تحلیل دادههای آزمایش با استفاده از نرمافزارهای Excel 2007،9.1 SAS و SPSS 16 انجام شد. برای انجام آزمون مقایسه میانگینها از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 1 درصد استفاده گردید.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس صفات اندازهگیری شده در آزمایش کالوسدهی در جدول 1 نشان داده شده است. درصد القای کالوس یکی از صفات مهم در مطالعه القای کالوس میباشد که در اکثر آزمایشات کالوسزایی گزارش میشود. نتایج آزمایش نشان داد که فقط بین دو ریز نمونه بکار رفته تفاوت معنیداری ازنظر تأثیر بر روی صفت درصد کالزایی مشاهده نشد اما سایر اثرات برای این صفت در سطح احتمال 1 درصد معنیدار میباشد. اثرات نوع ریز نمونه، غلظتهای مختلف NAA، BAP و همچنین اثرات متقابل بین آنها بر روی صفت تعداد روز تا شروع القای کالوس و همچنین قطر کالوس در سطح احتمال 1 درصد ازنظر آماری بسیار معنیدار بود.
جدول-1- تجزیه واریانس اثرات ریز نمونه و تنظیم کنندههای رشد بر روی صفات اندازهگیری شده در آزمایش کالوسدهی در گیاه بابونه
|
میانگین مربعات |
|
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
قطر کالوس |
درصد کالوسدهی |
روز تا القای کالوس |
||
617/119** |
008/0ns |
042/100** |
1 |
(A)ریز نمونه |
449/176** |
267/1** |
44/62** |
3 |
(B) NAA |
922/116** |
933/0** |
528/130** |
3 |
(C) BAP |
074/11** |
044/0** |
819/18** |
3 |
A×B |
164/83** |
208/0** |
458/49** |
3 |
C×A |
202/13** |
133/0** |
102/104** |
9 |
C×B |
667/11** |
027/0** |
792/50** |
9 |
C×B×A |
258/0 |
340/0 |
281/0 |
64 |
خطا |
04/7 |
42/12 |
80/4 |
|
%(CV)ضریب تغییرات |
ns و **به ترتیب نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار و اختلاف معنیدار در سطح 1درصد
اثرات متقابلNAA در BAP در ریز نمونه بر صفت روز تا القای کالوس بابونه در (جدول 1) معنیدار شده است. لذا مقایسه میانگین اثرات متقابلNAA در BAP در ریز نمونه بر صفت روز تا القای کالوس بابونه در شکل 1 مشخصشده است. نمودار نشان میدهد که کمترین مدتزمان برای القای کالوس در ترکیب تیماری (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) بود که در ریز نمونه ساقه با میانگین 7 روز و ریز نمونه برگ با میانگین 33/9 روز مشاهده گردید. پس از چهار هفته کشت، تمام ریز نمونهها ازلحاظ رشدی در مرحله مناسبی قرار گرفتند و یادداشتبرداری درصد و قطر کالوس انجام شد (شکل 2).
مقایسه میانگین اثرات متقابل NAA درBAP برای صفت درصد کالوسزایی بابونه بر روی ریز نمونههای ساقه و برگ در شکل 3 الف نشان داده شده است، این نمودار نشان میدهد که در ریز نمونه برگ ترکیبهای هورمونی (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) و (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر (BAP و (1 میلیگرم در لیتر NAA و 5/1 میلیگرم در لیتر (BAP بیشترین درصد کالوسزایی (100 درصد) را به خود اختصاص دادهاند.
شکل1- تأثیر غلظتهای مختلف NAA و BAP بر صفت روز تا القای کالوس در ریز نمونه برگ و ساقه
|
|
شکل2- کالوس حاصل از ریز نمونه ساقه (الف). کالوس حاصل از ریز نمونه برگ (ب)
ریز نمونه ساقه نیز در ترکیبهای هورمونی (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) و (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) بالاترین درصد القای کالوس 100 درصد را داشت. مقایسه میانگین تأثیر ترکیبات NAA و BAP روی صفت قطر کالوس ریز نمونههای برگ و ساقه بابونه در شکل 3 ب آورده شده است. این نمودار نشان میدهد که ریز نمونه برگ در سطح (2 میلیگرم در لیتر NAA و 5/1 میلیگرم در لیتر (BAP با میانگین 31/15 میلیمتر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین قطر کالوس ریز نمونه ساقه نیز در سطح (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر (BAP به میزان 10/13 میلیمتر بود.
نتایج تجزیه واریانس باززایی غیرمستقیم در جدول 2 نشان داده شده است. این جدول نشان میدهد که اثرات ساده ریز نمونه و تنظیمکنندههای رشد و همچنین اثرات متقابل دوگانه و سهگانه آنها در سطح 1 درصد برای درصد باززایی معنیدار شده است.
مقایسه میانگین تأثیر ترکیبات مختلف NAA و BAP روی صفت درصد باززایی غیرمستقیم ریز نمونههای کالوس حاصل از برگ و ساقه بابونه در شکل 4 آورده شده است.
شکل3- تأثیر غلظتهای مختلف NAA و BAP در ریز نمونه برگ و ساقه بر روی صفت درصد القای کالوس (الف) و صفت قطر کالوس (ب)
جدول 2- تجزیه واریانس صفت درصد باززایی غیرمستقیم در بابونه
میانگین مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
|
04/1** |
1 |
(A)ریز نمونه |
|
452/0** |
3 |
(B) NAA |
|
67/1** |
3 |
(C) BAP |
|
097/0** |
3 |
A×B |
|
120/0** |
3 |
C×A |
|
095/0** |
9 |
C×B |
|
026/0** |
9 |
C×B×A |
|
003/0 |
64 |
خطا |
|
31/16 |
|
%(CV)ضریب تغییرات |
|
**نشاندهنده اختلاف معنیدار در سطح 1 درصد
این نمودار نشان میدهد که بالاترین درصد باززایی غیرمستقیم در کالوس حاصل از ریز نمونه برگ با استفاده از (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر (BAP به میزان 59/85 درصد بود، بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم کالوس حاصل از ساقه نیز در سطح (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر (BAP به میزان 47/70 درصد بود که با سطح (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) اختلاف معنیداری نداشت. نو ساقه حاصل از کالوس ریز نمونههای ساقه و برگ در شکل 5 نشان داده شده است.
شکل4- تأثیر غلظتهای مختلف NAA و BAP بر روی صفت باززایی غیرمستقیم در ریز نمونه کالوس حاصل از برگ و ساقه
شکل 5- نو ساقه حاصل از کالوس ریزنمونهبرگ (الف). نو ساقه حاصل از کالوس ریزنمونهساقه (ب)
انتقال گیاهچههای ریشهدار از محیط درون شیشهای به محیط گلدانی بهراحتی انجام پذیرفت. به دلیل وجود شرایط مناسب و رعایت برخی نکات ازجمله تأمین رطوبت و همچنین تغذیه گیاهان با مواد غذایی محیط کشت MS، پس از گذشت حدوداً 4 هفته گلدانها از اتاق سازگاری به محیط گلخانه منتقل شد. میزان موفقیت در سازگاری گیاهان در این مرحله بیش از 90 درصد ثبت گردید. درنهایت پس از گلدهی گیاهان منتقل شده، بذور رسیده جمعآوری و در یخچال نگهداری گردید. باتوجه به اینکه برای تحقیقات آینده (انتقال ژن بهمنظور تغییر متابولیت های ثانویه بابونه) بهینهسازی کشت بافت و حصول بذر از گیاهان باززا شده ضروری است، این نتایج بیانگر موفقیت آزمایش حاضر میباشد. مراحل باززایی کالوس حاصل از ریز نمونه برگ بابونه در شکل 6 نشان داده شده است.
بحث
دراین آزمایش اثر ریز نمونه و غلظتهای مختلف NAA و BAP بر روی گیاه دارویی بابونه (M. aurea) مطالعه شد. بهینهسازی القای کالوس اولین گام در شرایط کشت بافت است زیرا کالوس میتواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سوماتیک، تولید اندامهای ریشه و ساقه و تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرارگیرد (20). عوامل مختلفی مانند ژنوتیپ مورد استفاده، نوع ریز نمونه، شرایط محیطی، محیط کشت و تنظیمکنندههای رشد و ... میتواند روی القای کالوس تأثیر بگذارد (19). در مطالعه حاضر نتایج برای صفات ارزیابی شده نشان داد که کالوسزایی در این گیاه علاوه بر تحت تأثیر قرارگرفتن تیمارهای هورمونی مختلف، تحت تأثیر ریز نمونه نیز قرار میگیرد. ریز نمونه برگ و ساقه روی محیط MS فاقد هورمون، کالوسزایی نداشتند، Koohi و همکاران (2011) (22) نیز در آزمایش خود نشان دادند که در ریز نمونه برگ روی محیط فاقد هورمون اثری از کالوس دیده نشد. ولی زاده (2017) (43)، نیز در آزمایش خود نشان داد که در ریز نمونه برگ روی محیط کشت فاقد اکسین اثری از کالوس دیده نشد. میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب هورمونهای رشد بکار رفته و تعادل بین هورمونهای اکسین و سیتوکینین دارد (1). زیرا این تنظیمکنندهها باعث تنظیم رشد و تقسیم سلولی و همچنین رشد بهتر اندامهای گیاهی میشوند. ازآنجاکه نیاز گونههای گیاهی و بافتهای مختلف به این مواد متفاوت بوده، انتخاب تنظیمکننده رشد مناسب و تعیین غلظت بهینه آن مهم میباشد (8). لذا دراین آزمایش شرایط بهینهسازی کشت بافت برای گیاه بابونه انجام شد. ریز نمونههای موجود بر روی محیطهای کشت بسته به غلظت تنظیمکنندههای رشدی بکار رفته، واکنشهای متفاوتی از خود نشان دادند.
شکل6-نوساقه حاصل از کالوس ریز نمونه برگ (الف). ریشهدار شدن نوساقه در محیط کشت MS بدون تنظیمکنندههای رشدی (ب). انتقال گیاه کامل باززا شده به گلدان (ج). گلدهی گیاهان باززا شده (د)
7 تا 17 روز پس از کشت بسته به نوع هورمون مورد استفاده در محیط کشت القای کالوس از نواحی برش خورده ریز نمونهها آغاز شد و کالوس سبزرنگی تشکیل شد و درنهایت کالوس تمام سطح ریز نمونه را پوشاند. در آزمایش ولی زاده (2017) (43) القای کالوس از جنین نابالغ و برگ بابونه به ترتیب 12 و 15 روز بعد از کشت ریز نمونه رخ داد. القای کالوس از نواحی برش خورده آغاز میشود و زخم در ریز نمونه باعث تحریک تولید کالوس میشود (38)، باتوجه به اینکه در این آزمایش نیز برای تسریع القای کالوس در ریز نمونهها زخمهایی ایجاد شد. کالوسهای القا شده در برگ دارای رنگ سبز تیره و کالوسهای ساقه سبز روشن بودند. کالوسهای سبز به دلیل آنکه قادر به عمل فتوسنتز بوده و منبع کربن مورد نیاز خود را تأمین میکنند رشد بهتری نسبت به کالوسها بارنگ کرم دارند (11). نتایج تحقیق نیز این موضوع را تأیید میکند که کالوسهای حاصل از برگ نسبت به کالوس ساقه رشد بهتر و حجم بیشتری داشتند. زبرجدی و همکاران (2013) (46) نیز کالوس دهی گیاه دارویی سرخارگل را در غلظتهای مختلف NAA و BAP مورد بررسی قراردادند که نتایج نشان داد که بیشترین میزان کالوس دهی در زیزنمونه برگهای اولیه در تیمار BAP (2/0 میلیگرم در لیتر) و NAA (صفر) به میزان 97 درصد و در زیزنمونه هیپوکتیل در تیمار BAP (2/0 میلیگرم در لیتر) و NAA (6/0 میلیگرم در لیتر) به میزان 91 درصد مشاهده گردید که با نتایج آزمایش حاضر همخوانی نشان داد. کمترین مدتزمان برای القای کالوس در هردو ریز نمونه در ترکیب تیماری 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده گردید و با استفاده از این تیمار هورمونی میتوان تقریباً حجم نسبتاً زیادی کالوس را در مدتزمان کمتری به دست آورد. تولید کالوس بیشتر در مدتزمان کمتر یکی از اهداف مهم روشهای کشت بافت میباشد و این امر باعث صرفهجویی در وقت و هزینه میشود. صیادی و همکاران (2014) (37) گزارش کردند که غلظت 1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر Kin کمترین مدتزمان را برای شروع کالوسزایی ریز نمونههای بابونه با میانگین 11 روز را به خود اختصاص داده است. محمدی (2010) (26) نیز در آزمایش خود مشاهده کرد که القای کالوس 11 تا 18 روز بعد از کشت از ریز نمونه برگ، ساقه و جوانهجانبی بابونه اتفاق میافتد.
دراین پژوهش دیده شد که برای تولید کالوس وجود هورمونها ضروری است و همچنین القای کالوس در بابونه در تیمار هورمونی همزمان اکسین و سیتوکینین بسیار مؤثرتر از زمانی است که اکسین یا سیتوکینین بهتنهایی استفاده میشود، بهطوری که ترکیبهای (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلیگرم در لیتر NAA و1 میلیگرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونههای ساقه و برگ (100 درصد) شناخته شدند. ولی زاده (2017) (43) در آزمایش خودروی بابونه به این نتیجه رسید که استفاده همزمان اکسین و سیتوکنین اثر بهتری نسبت به استفاده اکسین بهتنهایی بر القای کالوس داشت. اسکوگ و میلر (1957) (40) نیز در بررسیهای خود نشان دادند که نسبت یکسان اکسین و سیتوکینین سبب تولید کالوس یا پینه میشود. ریچلینگ و بیدربرک (1991) (36) در تحقیقات خود نشان دادند که هورمون Kin در غلظت مساوی یا کمتر از اکسین برای رشد کالوس بابونه ضروری میباشد. محمدی (2010) (26) نیز در آزمایش خود نشان داد که افزایش هورمون NAA و 2,4-D تا غلظت 1 میلیگرم در لیتر باعث افزایش کالزایی بابونه میشود اما استفاده از Kin با همان غلظت 1 میلیگرم در لیتر برای کالزایی ضروری و میزان القای کالوس را چندین برابر میکند. شینویاما و همکاران (2004) (39) در تحقیقات خود روی گیاه داوودی نشان دادند که افزایش غلظت Kin و 2,4-D در حد 1 میلیگرم در لیتر تولید کالوس را افزایش داده است. در گیاه Allium chinenseنیز مشخص شد که بیشترین میزان تولید کالوس در محیط کشت همراه با هورمونهای 1 میلیگرم در لیتر BAP و 1 میلیگرم در لیتر 2,4-D بوده و با افزایش میزان اکسین یا سیتوکینین اثرات کاهشی دیده شد (45). موافقی و همکاران (2008) (29) نیز بیشترین مقدار شاخص کالوس را در محیط کشت حاوی (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) در گیاه کور مشاهده کردند. معتمدی و همکاران (2010) (28) در آزمایش خود نشان دادند که بیشترین میزان کالوسزایی گیاه گلرنگ در محیط کشت حاوی (1 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) به میزان 97 درصد بود. تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، میتواند به دلیل تمایز در بیان ژنهای کنترلکننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژنهای مسئول در سنتز کالوس بهطور کامل بیان نشوند (24).
نتایج آزمایش باززایی غیرمستقیم نشان میدهد که در محیط فاقد هورمون BAP باززایی صورت نگرفته است. به این دلیل که سیتوکینینها نقش بسیار مؤثری در پیشرفت و القای قسمتهای هوایی بهطور مستقیم و غیرمستقیم دارند. برای تحریک رشد جوانههای جانبی و کاهش چیرگی رأسی، معمولاً یک یا چند سیتوکینین در مرحله تکثیر در محیط استفاده میشود (14). براساس برخی گزارشها BAP بهعنوان مؤثرترین سیتوکینین مورد استفاده در شاخهزایی بسیاری از گیاهان معرفیشده است (13). اثرات محرک BAP برای القاء و تشکیل قسمتهای هوایی برای گونههای دارویی مثل کرچک و بابونه نیز گزارششده است (2و 41). دراین آزمایش نیز با اضافه کردن هورمون BAP به محیط MS در کالوس حاصل از برگ باززایی غیرمستقیم اتفاق افتاد، اما باززایی غیرمستقیم برای کالوس حاصل از ساقه با کاربرد همزمان BAP با یکی از ترکیبات اکسینی مثل NAA انجام شد. بنابراین مشخص میشود که با کاربرد ترکیبات تنظیمکننده رشد مختلف، بین کالوسهای حاصله از ریز نمونه ساقه و برگ ازنظر درصد باززایی اندامهای هوایی تفاوت وجود دارد، این عامل به خاطر این است که نسبت تنظیمکنندههای رشد گیاهی در بافتها و اندامهای مختلف گیاهی متفاوت است و این مسئله میتواند بر روی کالوسزایی و باززایی از کالوسهای موجود اثرگذار باشد (13). بنابراین میتوان نتیجه گرفت که بسته به نوع ریز نمونه استفاده شده و مقدار هورمونهای درونزای آن، نیاز به مصرف اکسین و سیتوکینین خارجی مورد نیاز برای القا جوانههای نا بهجای شاخه تفاوت میکند. جورج و دبورگ (2008) (15) نیز بیان کردند که نسبت سیتوکینین به اکسین بسیار مهم است و در باززایی نقش مهمی ایفا میکند، و نسبت اکسین پایین و سیتوکینین بالا را برای شاخهزایی لازم دانستند، که مطابقت آن با نتایج این تحقیق آشکار است، بهطوری که بیشترین باززایی غیرمستقیم هر دو نوع ریز نمونه دراین تحقیق در محیط (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) دیده شد. ریچلینگ و بکر (1976) (34) بیشترین باززایی غیرمستقیم گیاه بابونه را در محیط MS حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و1 میلیگرم در لیتر Kin مشاهده کردند. کاظم (2012) (21) در آزمایش خود نشان داد که ترکیب هورمونی 5/0 میلیگرم در لیتر NAA و1 میلیگرم در لیتر BAP بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (65 درصد) را در گیاه باباآدم دارد. اما محمدی (2010) (26) در آزمایش خود نشان داد که سیتوکینین بهتنهایی و بدون حضور اکسین روی شاخهزایی کالوسهای بابونه تأثیر داشت. نکته قابلذکر در این مرحله این است که وقتی نوساقه حاصل از کالوسها به محیطهای بدون تنظیمکننده رشدی منتقل شدند طی چندین هفته هیچکدام از کالوسها تمایزی به سمت نوساقهدهی بیشتر نشان ندادند، در حالیکه ریشهدهی مشاهده گردید. علت ریشهزایی در غیاب اکسین را میتوان به وجود هورمونهای اکسین داخلی نسبت داد. محمدی (2010) (26) در مطالعات خود روی بابونه به همین نتیجه دستیافت، اما با نتایج پاسامونتی و همکاران (1998) (31) روی بابونه تضاد داشت، این محققین برای ریشهزایی شاخههای باززا شده از محلول اکسین ایندول بوتریک اسید استفاده کردند.
نتیجهکلی
بهطور کلی میتوان نتیجه گرفت که برگ و ساقه هر دو ریز نمونه مناسب برای تولید کالوس میباشد. در بابونه برای القای مؤثر کالوس لازم است از تیمار همزمان اکسین و سیتوکینین استفاده گردد، بهطوری که ترکیب (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) کمترین مدتزمان و همچنین بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونههای ساقه و برگ (100درصد) شناخته شد. وجود هورمون BAP برای القاء و تشکیل قسمتهای هوایی در هر دو نوع ریز نمونه ضروری و نسبت اکسین پایین و سیتوکینین بالا برای شاخهزایی مؤثرتر بود بطوریکه کالوسهای حاصل از برگ و ساقه بیشترین باززایی غیرمستقیم را در ترکیب (5/0 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP) داشتند.
سپاسگزاری
بدینوسیله از زحمات کلیه همکاران محترم گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی دانشگاه رازی که ما را در انجام این پژوهش یاری نمودند سپاسگزاری می گردد.