نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه رازی

2 دانشیار، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه رازی.

3 عضو گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی، دانشگاه رازی.

چکیده

بابونه (Matricaria aurea L.) یک گیاه دارویی مهم و متعلق به خانواده کاسنی می‌باشد که به شکل گسترده-ای در داروسازی، صنایع غذایی، آرایشی و بهداشتی مصرف می‌شود. با توجه به اهمیت این گیاه، بهینه‌سازی کشت بافت آن می‌تواند زمینه‌ساز تحقیقات و استفاده بیشتر از این گیاه گردد. به منظور بهینه‌سازی کشت بافت این گیاه آزمایش‌های القاء کالوس و باززایی غیرمستقیم انجام شد. هر دو آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار روی محیط کشت MS اجرا گردید. در هر دو آزمایش سطوح مختلف تنظیم کننده‌های رشد گیاهی NAA و BAP به همراه دو ریز نمونه ساقه و برگ مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در محیط کشت فاقد هورمون رشد (شاهد) القای کالوس مشاهده نشد. بررسی‌ها نشان داد که القای کالوس ریزنمونه‌ها در ترکیب هورمونی (5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) سریع‌تر بود. ترکیب‌های (5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریزنمونه‌های ساقه و برگ (100%) به ترتیب شناخته شدند. اثرمتقابل غلظت‌های مختلف NAA و BAP در ریزنمونه بر صفت قطر کالوس معنی‌دار شد و ریزنمونه برگ در سطح 2 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP با میانگین 31/15 میلی‌متر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (59/85% )، درکالوس‌های حاصل از برگ و ترکیب هورمونی 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of explant types and different levels of plant growth regulators on callogenesis and regeneration in medicinal plant, Matricaria aurea

نویسندگان [English]

  • Shima Vatandost 1
  • Alireza Zebarjadi 2 3

1 Dept. of Agronomy and Plant Breeding- Faculty of Agriculture- Razi university

2 Academic Member of Razi university

3 Academic Member of Razi university

چکیده [English]

Matricaria aureais an important medicinal plant belonging to Asteraceae, the widely used in the phrmacetical, food and cosmetics industrial. According to importance of this plant, the aim of current study was optimizing tissue culture in Matricaria aurea. In order to optimize of tissue culture two experiments, callus induction and indirect regeneration were carried out. These experiments were laid out in factorial arrangement based on completely randomized designs (CRD) with three replications on MS base medium. In these experiments, various levels of plant growth regulators, NAA (0, 0.5, 1and 2 mg/l) and BAP (0, 0.5, 1and 1.5mg/l), with two explant types (stem and leaves) were compared. The results showed that was not observed in growth hormone-free medium (control). Results showed that callus induction was occurred fast in all explants in combination of NAA (0.5 mg/l) and BAP (1 mg/l). The best combinations of plant growth regulators for callus induction were 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP and 1 mg/l NAA + 1 mg/l BAP for stem and leaves (100%) respectively. Interaction of different concentration of NAA and BAP was significant for callus diameter trait and leaf explant in combination of 2 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP was the highest callus diameter with mean of 15.31 mm. We observed maximum of indirect regeneration percentage (85.59%) in calli derived from leaf in medium with 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Matricaria aurea
  • Indirect regeneration
  • Callus
  • NAA
  • BAP

بررسی اثر نوع ریز نمونه و سطوح مختلف تنظیم­کننده­های رشد بر کال­زایی و باززایی در گیاه دارویی بابونه (Matricaria aurea L.)

شیما وطن‌دوست1 و علیرضا زبرجدی1،2*

1ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

2 ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی برای تنش خشکی

تاریخ دریافت: 22/11/96              تاریخ پذیرش: 11/2/98

چکیده

بابونه (Matricaria aurea L.) یک گیاه دارویی مهم و متعلق به خانواده کاسنی می­باشد که به شکل گسترده­ای در داروسازی، صنایع غذایی، آرایشی و بهداشتی مصرف می­شود. باتوجه به اهمیت این گیاه، بهینه­سازی کشت بافت آن می­تواند زمینه­ساز تحقیقات و استفاده بیشتر از این گیاه گردد. به‌منظور بهینه­سازی کشت بافت این گیاه آزمایش­های القاء کالوس و باززایی غیرمستقیم انجام شد. هر دو آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار روی محیط کشت MS اجرا گردید. در هر دو آزمایش سطوح مختلف تنظیم کننده‌های رشد گیاهی NAA و BAP به همراه دو ریز نمونه ساقه و برگ مورد مقایسه قرارگرفتند. نتایج نشان داد که در محیط کشت فاقد هورمون رشد (شاهد) القای کالوس مشاهده نشد. بررسی­ها نشان داد که القای کالوس ریز نمونه‌ها در ترکیب هورمونی (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) سریع­تر بود. ترکیب­های (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونه‌های ساقه و برگ (100 درصد) شناخته شدند. ریز نمونه برگ در سطح 2 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP با میانگین 31/15 میلی­متر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (59/85 درصد)، درکالوس­های حاصل از برگ و ترکیب هورمونی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد.

واژه­های کلیدی: بابونه، باززایی غیرمستقیم، کالوس، NAA، BAP

* نویسنده مسئول: تلفن: 09181321809، پست الکترونیکی:zebarjadiali@yahoo.com

مقدمه

 

بابونه یکی از مهم­ترین گیاهان دارویی است که شامل چندین جنس می­باشد اما جنس L. Matricaria به دلیل کاربرد بسیار بیشتر موردتوجه محققین گیاهان دارویی قرارگرفته است و دارای گونه­های متعددی می­باشد (16). یکی از گونه­ها بابونه اورآ یا بابونه اروپایی زرد بانام علمی Matricaria aureaو از تیره کاسنی یا مرکبان (Asteraceae) است (32). از گل­های بابونه در صنایع داروسازی و صنایع غذایی استفاده زیادی می­شود (5). مهم­ترین ترکیبات موجود در گل­های بابونه عبارتند از: اسانس، فلاونوئید و کومارین (32). اسانس حاصل از گل­های بابونه دارای خواص ضدعفونی­کننده، آرام­بخش، ضد­اسپاسم، ضد­آلرژی، ضد­نفخ، ضد­قارچ (4و 12)، ضد التهاب (18)، ضد میکروب (33) می­باشد. مهم­ترین اثرات فلاونوئیدها خواص آنتی­اکسیدانی قوی آن­هاست (3)، همچنین به خاطر اثر مرطوب­کنندگی در صنایع بهداشتی و آرایشی به‌صورت گسترده­ای استفاده می­شود (5). از دم­کرده گل­های بابونه جهت کاهش تورم دست و پا، بهبودی دل‌درد و از بین بردن نفخ استفاده می­شود (17).

اگرچه تقاضا برای مواد مؤثره موجود افزایش‌یافته است اما تولید آن­ها در مقیاس تجاری امری مشکل و پرهزینه است و از طرفی غلظت پایین این ترکیبات در گیاه، مشکلات مرتبط با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان مانع تأمین این مواد از طبیعت شده است. به همین دلیل توجه محققین به راهکارهایی مثل کشت سلول­ها، اندام­ها و بافت­ها و مهندسی ژنتیک معطوف شده است (23 و 30). کشت بافت نسبت به سایر روش­های مرسوم دارای مزیت­هایی ازجمله تولید تعداد زیادی گیاه با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت در زمان کوتاه­تر و فضای نسبتاً محدود (42)، تولید گیاهان عاری از بیماری، توانایی تولید چند نسل در طی یک سال، تسریع برنامه‌های اصلاحی در جهت تکثیر واریته‌های جدید می­باشد (10). در کشت بافت از هر بخش گیاه نظیر نوک ساقه، جوانه برگ، سلول­های مزوفیل، اپیدرم و... می­توان برای تولید کالوس استفاده کرد (6). امروزه روش‌های بیوتکنولوژی و اصلاح گیاهی براساس باززایی گیاه از طریق کشت بافت قرارگرفته است. باززایی گیاه از سلول و بافت گیاهی به دلیل وجود خاصیت پرتوانی امکان‌پذیر است. گزارش­هایی متعددی از کشت بافت بابونه برای تولید کالوس و باززایی غیرمستقیم وجود دارد که به تعدادی از آنها اشاره می­شود. در گزارش راچلینی و بکر از تنظیم­کننده­های رشد مثل NAA و 2,4-D در القای کالوس استفاده شده است و محیط MS حاوی 7/2 میکرومول NAA را برای القای کالوس ریز نمونه ساقه بابونه مناسب دانستند و همچنین بهترین باززایی غیرمستقیم را در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر کینتین و 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده کردند (34). در تحقیقات راچلینی و همکاران (1984) روی کشت ساقه بابونه، محیط MS حاوی 7/2 میکرو مول NAA و 9/11 میکرومول Kin را برای کال­زایی مناسب دانستند (35). در آزمایش کوهی و همکاران (2011) تأثیر دو نوع تنظیم­کننده رشد NAA (0، 5/1 و 4 میلی­گرم بر لیتر) و BAP (0، 1 و 3 میلی­گرم بر لیتر) روی برگ و هیپوکوتیل بابونه مورد بررسی قرارگرفت. هر دو ریز نمونه در تمام ترکیبات هورمونی کالوس­زایی نشان دادند، فقط ریز نمونه برگ در محیط کشت MS کالوس­زایی نداشت (22). در بررسی سلارووا و همکاران  نشان دادند ترکیبی از NAA و Kin در غلظت 7/2 میکرومول از هرکدام منجر به القای کالوس گل بابونه می­شود و همچنین در بررسی باززایی غیرمستقیم بابونه به این نتیجه رسیدند که محیط MS به همراه 1/0 میلی­گرم کینتین یا ترکیب هورمونی (5/0 میلی­گرم در لیتر کینتین و 5/0 میلی­گرم (NAA بهترین پاسخ را می­دهد (7). در آزمایشی اثر تنظیم­کننده­های رشد مختلف و ریز نمونه‌های مختلف روی کالوس­زایی و باززایی غیرمستقیم بابونه مورد بررسی قرارگرفت. در آزمایش کالوس­زایی مشاهده شد که در صفت درصد القای کالوس و حجم کالوس فقط اثرات ساده معنی­دار شد و مقایسه میانگین آن نشان داد که ریز نمونه ساقه بیشترین درصد کالوس­زایی (32/57 درصد) به خود اختصاص داده است و بیشترین درصد کالوس­زایی جوانه جانبی و برگ به ترتیب با میانگین 69/49 و 76/44 درصد بود. همچنین ریز نمونه ساقه با میانگین 23/11 بیشترین حجم کالوس را داشت که با ریز نمونه جوانه جانبی با میانگین 10/11 اختلاف معنی­داری نداشت (26). بهترین سطح 2,4-D برای صفت­های فوق 1 میلی­گرم در لیتر و بهترین سطح کینتین نیز برای این دو صفت 5/0 میلی­گرم در لیتر بود. در آزمایش باززایی غیرمستقیم نیز گزارش کرد که باززایی هر سه ریز نمونه تنها در محیط­ حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده شد. به‌طوری که ریز نمونه برگ بیشترین باززایی را با میانگین 77 درصد داشت. در تحقیقات دهقان گرده و همکاران (2011) (9) روی گیاه بابونه و ریز نمونه هیپوکوتیل در سطوح مختلف هورمون­های (2,4-D، BA، NAA و Kin)، به این نتیجه رسیدند که محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 45/0 میلی­گرم در لیتر BAP کمترین درصد کالوس­زایی (23/52) را داشت و بیشترین درصد شاخه­زایی (33/38) نیز در محیط کشت حاوی 186/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 225/0 میلی‌گرم بر لیتر BAP مشاهده شد. در مطالعه صیادی و همکاران (2014) (37)، اثرات تنظیم­کننده­های رشد NAA (0، 1، 2 و 4 میلی­گرم در لیتر) و Kin (0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) را بر روی ریز نمونه‌های برگ، ساقه و جوانه جانبی ازنظر القای کالوس روی محیط کشت MS بررسی کردند. آنها نشان دادند که غلظت 1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیترKin بهترین ترکیب هورمونی ازلحاظ صفات مورد بررسی شامل روز تا القای کالوس، درصد کال­زایی و حجم کالوس می­باشد. به طوری که این ترکیب کمترین زمان را برای شروع القای کالوس را داشت و همچنین بیشترین درصد کال­زایی ریز نمونه‌های برگ، جوانه­جانبی و ساقه به ترتیب با میانگین 26/93، 68/89 و 75/80 درصد بود و بیشترین حجم کالوس در ریز نمونه‌های ساقه، جوانه­جانبی و برگ به ترتیب با میانگین 49/17، 20/16 و 52/15 درصد بود.

در تحقیق مرادی­پور و همکاران (2017) اثر دو نوع تنظیم‌کننده رشد گیاهی، BAP و TDZ در غلظت­های 4/4 و 8/8 میکرو مولار در ترکیب با 2/2 میکرو مولار  IAA بر باززایی مستقیم ریز نمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ گیاه بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.) مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اصفهان (49/92 درصد) در محیط کشت MS حاوی 4/4 میکرو مولار BAP به همراه 2/2 میکرو مولار IAA به دست آمد. همچنین حداکثر ریشه‌زایی (100 درصد) در محیط‌های 1/2MS فاقد تنظیم‌کننده رشد و MS حاوی 0/5 و 1 میکرو مولار IBA به دست آمد (27).

در تحقیق معصومی اصل و همکاران (2016) که بر باززایی مستقیم دو گونه بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.) و شیرازی (Matricaria recutita L.) انجام شد هر دو ریز نمونه، ساقه دارای گره و کوتیلدون به ترتیب با 75/78 و 75 درصد دارای باززایی قابل قبولی بودند (25).

ولی­زاده (1976) (43) در تحقیق خود اثر غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی NAA  (0 ، 1/0 ، 5/0 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) و BA (0، 1 و 3 میلی‌گرم در لیتر) بر روی القاء کالوس را مورد مطالعه قرارداد. نتایج نشان داد که القاء کالوس در اکثر تیمارهای هورمونی مشاهده شد و بالاترین فراوانی القاء کالوس در ریز نمونه جنین نابالغ در محیط کشت حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAو در ریز نمونه برگ در تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA  و 3 میلی­گرم در لیتر BA به دست آمد.

باتوجه به اینکه بابونه دارای خواص دارویی و مواد مؤثره زیادی می­باشد اما محدودیت در کشت زراعی و همچنین برداشت بی­رویه آن باعث به خطر افتادن انقراض این گیاه می­شود، یکی از روش­های حفاظت از گیاهان دارویی و بهبود کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاهان تولید آن­ها در خارج از زیستگاه­های طبیعی می­باشد لذا تولید آن از طریق فنون کشت بافت گیاهی در شرایط آزمایشگاهی مورد توجه قرارگرفته است. بهینه­سازی شرایط القای کالوس اولین مرحله برای تولید مقدار زیادی ترکیبات فعال است، در کشت بافت گیاهی نیز می­توان از هر بخش گیاه برای تولید کالوس استفاده کرد. تنظیم­کننده­های رشد برای القای کالوس و ترویج رشد بسیاری از سلول­های بنیادی مورد نیاز می­باشند، از آن­جایی که هرگونه گیاهی نیاز به انواع و سطوح مختلف تنظیم­کننده دارد بنابراین انتخاب مناسب­ترین تنظیم­کننده و تعیین غلظت مطلوب آن ضروری است. این پژوهش نیز باهدف بررسی تأثیر ریز نمونه و غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد در کال­زایی و باززایی غیرمستقیم گیاه بابونه و بهینه­سازی پروتکل مناسب انجام شد.

 

مواد و روشها

این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت گیاهان دارویی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه رازی کرمانشاه طی سال 1394 انجام شد. بذرهای گیاه بابونه از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. برای استریل کردن بذور ابتدا بذور در اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه تکان داده شد و پس از شستشو با آب مقطر به مدت 15-10 دقیقه به‌وسیله هیپوکلریت سدیم (NaOCl) 5/1 درصد قرار گرفتند. پس از این مرحله بذور با آب مقطر استریل در سه زمان 1، 3 و 5 دقیقه‌ای شستشو داده شدند. سپس بذور با کاغذ صافی استریل خشک شدند و روی محیط MS بدون هورمون کشت شدند. همه‌ی مراحل استریل بذر زیر هود لامینار و در شرایط استریل انجام شد. سپس شیشه­های کشت شده با پارافیلم پیچیده شد و به اتاقک رشد (فیتوترون) با دمای°C2±25 و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل گردیدند. پس از جوانه­زنی در شرایط استریل، گیاهچه­های 30 روزه را به زیر هود لامینار برده و ریز نمونه برگ و ساقه در قطعات 1-5/0 سانتی­متری جدا شد و روی محیط ­MS پایه حاوی غلظت­های مختلف تنظیم­کننده رشد به همراه ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر و آگار 8 گرم در لیتر با 8/5=pH قرار داده شدند. تمامی تیمارها پس از 14 روز در محیط­های مشابه واکشت شدند. به‌منظور بررسی تأثیر نوع ریز نمونه و همچنین تأثیر ترکیبات هورمونی بر القای کالوس، آزمایش فاکتوریل با سه فاکتور بر پایه طرح کاملاً تصادفی (CRD) در سه تکرار انجام شد. فاکتور اول ریز نمونه در دو سطح (ساقه و برگ)، فاکتور دوم هورمون NAA در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) و فاکتور سوم هورمون BAP در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر) مورد استفاده قرارگرفت. صفات اندازه‌گیری شده عبارتند از: روز تا القای کالوس، درصد القای کالوس (از طریق شمارش تعداد کالوس‌های تولید شده تقسیم بر تعداد ریز نمونه‌های کشت شده ضرب در 100 محاسبه شد) (44)، قطر کالوس (نحوه محاسبه به این صورت است که به کمک کاغذ میلی‌متری طول و عرض کالوس‌ها اندازه‌گیری شد و سپس در هم ضرب شده و از آن جذرگرفته شد)، صفات درصد و قطر کالوس 4 هفته بعد از کشت یادداشت‌برداری شد. کالوس­ها 5-3 روز بعد از القاء در همین محیط­های کشت وارد فاز باززایی غیرمستقیم شدند، لذا آزمایش باززایی غیرمستقیم از کالوس­ها نیز به شکل فاکتوریل با سه فاکتور و در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام گرفت. فاکتور اول ریز نمونه در دو سطح (کالوس­های حاصل از ساقه و کالوس­های به دست آمده از برگ)، فاکتور دوم هورمون NAA در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) و فاکتور سوم هورمون  BAP در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر) در محیط کشت MS بکار رفت، صفت درصد باززایی نیز ثبت گردید. نو ساقه‌های باززاشده به محیط MS بدون تنظیم‌کننده رشدی منتقل شدند و در همین محیط ریشه‌دار شدند. نو ساقه‌هایی که ریشه‌دار شده بودند، بعد از رشد کافی ریشه­ها از شیشه خارج و به‌آرامی با آب شستشو داده شد تا بقایای محیط کشت و آگار از اطراف آن­ها به‌طور کامل حذف شود، سپس به گلدان­های حاوی پرلیت، ورمی‌کولیت و خاک (دو قسمت خاک مزرعه یک قسمت ماسه اتوکلاو شده) منتقل شدند، هنگام انتقال گیاهچه‌ها به خاک باید توجه نمود که حداقل تنش به آن­ها وارد شود. جهت سازگاری تدریجی گیاهان طی انتقال از شرایط استریل درون شیشه‌ای به شرایط معمولی رشد، به مدت دو هفته داخل اتاقک رشد با دمای C°1±25 و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. در طول مدت سازگاری جهت بالا بردن رطوبت نسبی ابتدا گلدان­ها با سرپوش شفاف پوشیده شدند و پس از مدتی در سرپوش­ها منافذی ایجاد شد و به‌تدریج سرپوش­ها حذف شدند. همچنین از آب مقطر استریل جهت آبیاری گلدان­ها استفاده شد. هدف از انتقال گیاهان باززا شده به گلدان رسیدن به گیاه کامل با توانایی تولید بذر بود. درنهایت بذور گیاهان منتقل شده به گلدان جمع‌آوری گردید. تحلیل داده­های آزمایش با استفاده از نرم­افزارهای Excel 2007،9.1 SAS و SPSS 16 انجام شد. برای انجام آزمون مقایسه میانگین­ها از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد استفاده گردید.

نتایج

نتایج تجزیه واریانس صفات اندازه‌گیری شده در آزمایش کالوس­دهی در جدول 1 نشان داده شده است. درصد القای کالوس یکی از صفات مهم در مطالعه القای کالوس می‌باشد که در اکثر آزمایشات کالوس‌زایی گزارش می‌شود. نتایج آزمایش نشان داد که فقط بین دو ریز نمونه بکار رفته تفاوت معنی­داری ازنظر تأثیر بر روی صفت درصد کال­زایی مشاهده نشد اما سایر اثرات برای این صفت در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار می‌باشد. اثرات نوع ریز نمونه، غلظت­های مختلف NAA، BAP و همچنین اثرات متقابل بین آنها بر روی صفت تعداد روز تا شروع القای کالوس و همچنین قطر کالوس در سطح احتمال 1 درصد ازنظر آماری بسیار معنی‌دار بود.

 

 

جدول-1- تجزیه واریانس اثرات ریز نمونه و تنظیم کننده­های رشد بر روی صفات اندازه­گیری شده در آزمایش کالوس­دهی در گیاه بابونه

 

میانگین مربعات

 

 

درجه آزادی

 

منابع تغییرات

قطر کالوس

درصد کالوس­دهی

روز تا القای کالوس

617/119**

008/0ns

042/100**

1

(A)ریز نمونه

449/176**

267/1**

44/62**

3

(B) NAA

922/116**

933/0**

528/130**

3

(C) BAP

074/11**

044/0**

819/18**

3

A×B

164/83**

208/0**

458/49**

3

C×A

202/13**

133/0**

102/104**

9

C×B

667/11**

027/0**

792/50**

9

C×B×A

258/0

340/0

281/0

64

خطا

04/7

42/12

80/4

 

%(CV)ضریب  تغییرات

ns و **به ترتیب نشان­دهنده عدم اختلاف معنی­دار و اختلاف معنی‌دار در سطح 1درصد

 

اثرات متقابلNAA در BAP در ریز نمونه بر صفت روز تا القای کالوس بابونه در (جدول 1) معنی­دار شده است. لذا مقایسه میانگین اثرات متقابلNAA در BAP در ریز نمونه بر صفت روز تا القای کالوس بابونه در شکل 1 مشخص‌شده است. نمودار نشان می­دهد که کمترین مدت‌زمان برای القای کالوس در ترکیب تیماری (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) بود که در ریز نمونه ساقه با میانگین 7 روز و ریز نمونه برگ با میانگین 33/9 روز مشاهده گردید. پس از چهار هفته کشت، تمام ریز نمونه‌ها ازلحاظ رشدی در مرحله مناسبی قرار گرفتند و یادداشت­برداری درصد و قطر کالوس انجام شد (شکل 2).

مقایسه میانگین اثرات متقابل NAA درBAP برای صفت درصد کالوس­زایی بابونه بر روی ریز نمونه‌های ساقه و برگ در شکل 3 الف نشان داده شده است، این نمودار نشان می­دهد که در ریز نمونه برگ ترکیب­های هورمونی (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) و (1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر (BAP و (1 میلی­گرم در لیتر NAA و 5/1 میلی­گرم در لیتر (BAP بیشترین درصد کالوس­زایی (100 درصد) را به خود اختصاص داده­اند.

 

 

 

شکل1- تأثیر غلظت­های مختلف NAA و BAP بر صفت روز تا القای کالوس در ریز نمونه برگ و ساقه

 

الف

 

ب

 

شکل2- کالوس حاصل از ریز نمونه ساقه (الف). کالوس حاصل از ریز نمونه برگ (ب)

 

 

ریز نمونه ساقه نیز در ترکیب­های هورمونی (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) و (1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) بالاترین درصد القای کالوس 100 درصد را داشت. مقایسه میانگین تأثیر ترکیبات NAA و BAP روی صفت قطر کالوس ریز نمونه‌های برگ و ساقه بابونه در شکل 3 ب آورده شده است. این نمودار نشان می­دهد که ریز نمونه برگ در سطح (2 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/1 میلی‌گرم در لیتر (BAP با میانگین 31/15 میلی­متر بالاترین قطر کالوس را داشت. بیشترین قطر کالوس ریز نمونه ساقه نیز در سطح (5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر (BAP به میزان 10/13 میلی­متر بود.

نتایج تجزیه واریانس باززایی غیرمستقیم در جدول 2 نشان داده شده است. این جدول نشان می­دهد که اثرات ساده ریز نمونه و تنظیم­کننده­های رشد و همچنین اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه آنها در سطح 1 درصد برای درصد باززایی معنی­دار شده است.

مقایسه میانگین تأثیر ترکیبات مختلف NAA و BAP روی صفت درصد باززایی غیرمستقیم ریز نمونه‌های کالوس حاصل از برگ و ساقه بابونه در شکل 4 آورده شده است.

 

 

شکل3- تأثیر غلظت­های مختلف NAA و BAP در ریز نمونه برگ و ساقه بر روی صفت درصد القای کالوس (الف) و صفت قطر کالوس (ب)

 

جدول 2- تجزیه واریانس صفت درصد باززایی غیرمستقیم در بابونه

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

04/1**

1

(A)ریز نمونه

452/0**

3

(B) NAA

67/1**

3

(C) BAP

097/0**

3

A×B

120/0**

3

C×A

095/0**

9

C×B

026/0**

9

C×B×A

003/0

64

خطا

31/16

 

%(CV)ضریب تغییرات

       

**نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 1 درصد

این نمودار نشان می­دهد که بالاترین درصد باززایی غیرمستقیم در کالوس حاصل از ریز نمونه برگ با استفاده از (5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر (BAP به میزان 59/85 درصد بود، بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم کالوس حاصل از ساقه نیز در سطح (5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر (BAP به میزان 47/70 درصد بود که با سطح (1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) اختلاف معنی­داری نداشت. نو ساقه حاصل از کالوس ریز نمونه‌های ساقه و برگ در شکل 5 نشان داده شده است.

 

 

شکل4- تأثیر غلظت­های مختلف NAA و BAP بر روی صفت باززایی غیرمستقیم در ریز نمونه کالوس حاصل از برگ و ساقه

 
   

 


                                                                      

 

 

 

 

 

شکل 5- نو ساقه حاصل از کالوس ریزنمونه­برگ (الف). نو ساقه حاصل از کالوس ریزنمونه­ساقه (ب)

 

انتقال گیاهچه­های ریشه­دار از محیط درون شیشه­ای به محیط گلدانی به‌راحتی انجام پذیرفت. به دلیل وجود شرایط مناسب و رعایت برخی نکات ازجمله تأمین رطوبت و همچنین تغذیه گیاهان با مواد غذایی محیط کشت MS، پس از گذشت حدوداً 4 هفته گلدان­ها از اتاق سازگاری به محیط گلخانه منتقل شد. میزان موفقیت در سازگاری گیاهان در این مرحله بیش از 90 درصد ثبت گردید. درنهایت پس از گلدهی گیاهان منتقل شده، بذور رسیده جمع‌آوری و در یخچال نگهداری گردید. باتوجه به اینکه برای تحقیقات آینده (انتقال ژن به‌منظور تغییر متابولیت های ثانویه بابونه) بهینه‌سازی کشت بافت و حصول بذر از گیاهان باززا شده ضروری است، این نتایج بیانگر موفقیت آزمایش حاضر می‌باشد. مراحل باززایی کالوس حاصل از ریز نمونه برگ بابونه در شکل 6 نشان داده شده است.

بحث

دراین آزمایش اثر ریز نمونه و غلظت­های مختلف NAA و BAP بر روی گیاه دارویی بابونه (M. aurea) مطالعه شد. بهینه­سازی القای کالوس اولین گام در شرایط کشت بافت است زیرا کالوس می‌تواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سوماتیک، تولید اندام‌های ریشه و ساقه و تولید متابولیت‌های ثانویه مورد استفاده قرارگیرد (20). عوامل مختلفی مانند ژنوتیپ مورد استفاده، نوع ریز نمونه، شرایط محیطی، محیط کشت و تنظیم­کننده­های رشد و ... می­تواند روی القای کالوس تأثیر بگذارد (19). در مطالعه حاضر نتایج برای صفات ارزیابی شده نشان داد که کالوس­زایی در این گیاه علاوه بر تحت تأثیر قرارگرفتن تیمارهای هورمونی مختلف، تحت تأثیر ریز نمونه نیز قرار می­گیرد. ریز نمونه­ برگ و ساقه روی محیط MS فاقد هورمون، کالوس­زایی نداشتند، Koohi و همکاران (2011) (22) نیز در آزمایش خود نشان دادند که در ریز نمونه برگ روی محیط فاقد هورمون اثری از کالوس دیده نشد. ولی زاده (2017) (43)، نیز در آزمایش خود نشان داد که در ریز نمونه برگ روی محیط کشت فاقد اکسین اثری از کالوس دیده نشد. میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب هورمون­های رشد بکار رفته و تعادل بین هورمون­های اکسین و سیتوکینین دارد (1). زیرا این تنظیم­کننده­ها باعث تنظیم رشد و تقسیم سلولی و همچنین رشد بهتر اندام‌های گیاهی می­شوند. ازآنجاکه نیاز گونه­های گیاهی و بافت‌های مختلف به این مواد متفاوت بوده، انتخاب تنظیم­کننده رشد مناسب و تعیین غلظت بهینه آن مهم می­باشد (8). لذا دراین آزمایش شرایط بهینه‌سازی کشت بافت برای گیاه بابونه انجام شد. ریز نمونه‌های موجود بر روی محیط­های کشت بسته به غلظت تنظیم­کننده­های رشدی بکار رفته، واکنش­های متفاوتی از خود نشان دادند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل6-نوساقه حاصل از کالوس ریز نمونه برگ (الف). ریشه‌دار شدن نوساقه در محیط کشت MS بدون تنظیم‌کننده‌های رشدی (ب). انتقال گیاه کامل باززا شده به گلدان (ج). گلدهی گیاهان باززا شده (د)

 

7 تا 17 روز پس از کشت بسته به نوع هورمون مورد استفاده در محیط کشت القای کالوس از نواحی برش خورده ریز نمونه‌ها آغاز شد و کالوس سبزرنگی تشکیل ­شد و درنهایت کالوس تمام سطح ریز نمونه را پوشاند. در آزمایش ولی زاده (2017) (43) القای کالوس از جنین نابالغ و برگ بابونه به ترتیب 12 و 15 روز بعد از کشت ریز نمونه رخ داد. القای کالوس از نواحی برش خورده آغاز می­شود و زخم در ریز نمونه باعث تحریک تولید کالوس می­شود (38)، باتوجه به اینکه در این آزمایش نیز برای تسریع القای کالوس در ریز نمونه‌ها زخم­هایی ایجاد شد. کالوس­های القا شده در برگ دارای رنگ سبز تیره و کالوس­های ساقه سبز روشن بودند. کالوس­های سبز به دلیل آنکه قادر به عمل فتوسنتز بوده و منبع کربن مورد نیاز خود را تأمین می­کنند رشد بهتری نسبت به کالوس­ها بارنگ کرم دارند (11). نتایج تحقیق نیز این موضوع را تأیید می­کند که کالوس­های حاصل از برگ نسبت به کالوس ساقه رشد بهتر و حجم بیشتری داشتند. زبرجدی و همکاران (2013) (46) نیز کالوس دهی گیاه دارویی سرخارگل را در غلظت­های مختلف NAA و BAP مورد بررسی قراردادند که نتایج نشان داد که بیشترین میزان کالوس دهی در زیزنمونه برگهای اولیه در تیمار BAP (2/0 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (صفر) به میزان 97 درصد و در زیزنمونه هیپوکتیل در تیمار BAP (2/0 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (6/0 میلی‌گرم در لیتر) به میزان 91 درصد مشاهده گردید که با نتایج آزمایش حاضر همخوانی نشان داد. کمترین مدت‌زمان برای القای کالوس در هردو ریز نمونه در ترکیب تیماری 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید و با استفاده از این تیمار هورمونی می‌توان تقریباً حجم نسبتاً زیادی کالوس را در مدت‌زمان کمتری به دست آورد. تولید کالوس بیشتر در مدت‌زمان کمتر یکی از اهداف مهم روش­های کشت بافت می­باشد و این امر باعث صرفه­جویی در وقت و هزینه می­شود. صیادی و همکاران (2014) (37) گزارش کردند که غلظت 1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر Kin کمترین مدت‌زمان را برای شروع کالوس­زایی ریز نمونه‌های بابونه با میانگین 11 روز را به خود اختصاص داده است. محمدی (2010) (26) نیز در آزمایش خود مشاهده کرد که القای کالوس 11 تا 18 روز بعد از کشت از ریز نمونه برگ، ساقه و جوانه­جانبی بابونه اتفاق می­افتد.

دراین پژوهش دیده شد که برای تولید کالوس وجود هورمون­ها ضروری است و همچنین القای کالوس در بابونه در تیمار هورمونی هم­زمان اکسین و سیتوکینین بسیار مؤثرتر از زمانی است که اکسین یا سیتوکینین به‌تنهایی استفاده می­شود، به‌طوری که ترکیب­های (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) و همچنین (1 میلی­گرم در لیتر NAA و1 میلی­گرم در لیتر BAP) بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونه‌های ساقه و برگ (100 درصد) شناخته شدند. ولی زاده (2017) (43) در آزمایش خودروی بابونه به این نتیجه رسید که استفاده هم‌زمان اکسین و سیتوکنین اثر بهتری نسبت به استفاده اکسین به‌تنهایی بر القای کالوس داشت. اسکوگ و میلر (1957) (40) نیز در بررسی­های خود نشان دادند که نسبت یکسان اکسین و سیتوکینین سبب تولید کالوس یا پینه می‍شود. ریچلینگ و بیدربرک (1991) (36) در تحقیقات خود نشان دادند که هورمون Kin در غلظت مساوی یا کمتر از اکسین برای رشد کالوس بابونه ضروری می­باشد. محمدی (2010) (26) نیز در آزمایش خود نشان داد که افزایش هورمون NAA و 2,4-D تا غلظت 1 میلی­گرم در لیتر باعث افزایش کال­زایی بابونه می­شود اما استفاده از Kin با همان غلظت 1 میلی­گرم در لیتر برای کال­زایی ضروری و میزان القای کالوس را چندین برابر می­کند. شینویاما و همکاران (2004) (39) در تحقیقات خود روی گیاه داوودی نشان دادند که افزایش غلظت Kin و 2,4-D در حد 1 میلی­گرم در لیتر تولید کالوس را افزایش داده است. در گیاه Allium chinenseنیز مشخص شد که بیشترین میزان تولید کالوس در محیط کشت همراه با هورمون­های 1 میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D بوده و با افزایش میزان اکسین یا سیتوکینین اثرات کاهشی دیده شد (45). موافقی و همکاران (2008) (29) نیز بیشترین مقدار شاخص کالوس را در محیط کشت حاوی (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) در گیاه کور مشاهده کردند. معتمدی و همکاران (2010) (28) در آزمایش خود نشان دادند که بیشترین میزان کالوس­زایی گیاه گلرنگ در محیط کشت حاوی (1 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) به میزان 97 درصد بود. تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، می­تواند به دلیل تمایز در بیان­ ژن­های کنترل­کننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژن­های مسئول در سنتز کالوس به‌طور کامل بیان نشوند (24).

نتایج آزمایش باززایی غیرمستقیم نشان می­دهد که در محیط فاقد هورمون BAP باززایی صورت نگرفته است. به این دلیل که سیتوکینین­ها نقش بسیار مؤثری در پیشرفت و القای قسمت­های هوایی به‌طور مستقیم و غیرمستقیم دارند. برای تحریک رشد جوانه­های جانبی و کاهش چیرگی رأسی، معمولاً یک یا چند سیتوکینین در مرحله تکثیر در محیط استفاده می­شود (14). براساس برخی گزارش­ها BAP به‌عنوان مؤثرترین سیتوکینین مورد استفاده در شاخه­زایی بسیاری از گیاهان معرفی‌شده است (13). اثرات محرک BAP برای القاء و تشکیل قسمت­های هوایی برای گونه­های دارویی مثل کرچک و بابونه نیز گزارش‌شده است (2و 41). دراین آزمایش نیز با اضافه کردن هورمون BAP به محیط MS در کالوس حاصل از برگ باززایی غیرمستقیم اتفاق افتاد، اما باززایی غیرمستقیم برای کالوس حاصل از ساقه با کاربرد هم‌زمان BAP با یکی از ترکیبات اکسینی مثل NAA انجام شد. بنابراین مشخص می­شود که با کاربرد ترکیبات تنظیم­کننده­ رشد مختلف، بین کالوس­های حاصله از ریز نمونه ساقه و برگ ازنظر درصد باززایی اندام­های هوایی تفاوت وجود دارد، این عامل به خاطر این است که نسبت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی در بافت­ها و اندام­های مختلف گیاهی متفاوت است و این مسئله می­تواند بر روی کالوس­زایی و باززایی از کالوس­های موجود اثرگذار باشد (13). بنابراین می­توان نتیجه گرفت که بسته به نوع ریز نمونه استفاده شده و مقدار هورمون­های درون­زای آن، نیاز به مصرف اکسین و سیتوکینین خارجی مورد نیاز برای القا جوانه­های نا به‌جای شاخه تفاوت می­کند. جورج و دبورگ (2008) (15) نیز بیان کردند که نسبت سیتوکینین به اکسین بسیار مهم است و در باززایی نقش مهمی ایفا می­کند، و نسبت اکسین پایین و سیتوکینین بالا را برای شاخه­زایی لازم دانستند، که مطابقت آن با نتایج این تحقیق آشکار است، به‌طوری که بیشترین باززایی غیرمستقیم هر دو نوع ریز نمونه دراین تحقیق در محیط (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) دیده شد. ریچلینگ و بکر (1976) (34) بیشترین باززایی غیرمستقیم گیاه بابونه را در محیط MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و1 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده کردند. کاظم (2012) (21) در آزمایش خود نشان داد که ترکیب هورمونی 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و1 میلی‌گرم در لیتر BAP بیشترین درصد باززایی غیرمستقیم (65 درصد) را در گیاه باباآدم دارد. اما محمدی (2010) (26) در آزمایش خود نشان داد که سیتوکینین به‌تنهایی و بدون حضور اکسین روی شاخه­زایی کالوس­های بابونه تأثیر داشت. نکته قابل‌ذکر در این مرحله این است که وقتی نوساقه حاصل از کالوس­ها به محیط‌های بدون تنظیم­کننده رشدی منتقل شدند طی چندین هفته هیچ‌کدام از کالوس­ها تمایزی به سمت نوساقه­دهی بیشتر نشان ندادند، در حالیکه ریشه­دهی مشاهده گردید. علت ریشه­زایی در غیاب اکسین را می­توان به وجود هورمون­های اکسین داخلی نسبت داد. محمدی (2010) (26) در مطالعات خود روی بابونه به همین نتیجه دست‌یافت، اما با نتایج پاسامونتی و همکاران (1998) (31) روی بابونه تضاد داشت، این محققین برای ریشه­زایی شاخه­های باززا شده از محلول اکسین ایندول بوتریک اسید استفاده کردند.

نتیجه­کلی

به‌طور کلی می­توان نتیجه گرفت که برگ و ساقه هر دو ریز نمونه مناسب برای تولید کالوس می­باشد. در بابونه برای القای مؤثر کالوس لازم است از تیمار هم­زمان اکسین و سیتوکینین استفاده گردد، به‌طوری که ترکیب­ (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) کمترین مدت‌زمان و همچنین بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالوس ریز نمونه‌های ساقه و برگ (100درصد) شناخته شد. وجود هورمون BAP برای القاء و تشکیل قسمت­های هوایی در هر دو نوع ریز نمونه ضروری و نسبت اکسین پایین و سیتوکینین بالا برای شاخه­زایی مؤثرتر بود بطوری­که کالوس­های حاصل از برگ و ساقه بیشترین باززایی غیرمستقیم را در ترکیب (5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP) داشتند.

سپاسگزاری

بدینوسیله از زحمات کلیه همکاران محترم گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی دانشگاه رازی که ما را در انجام این پژوهش یاری نمودند سپاسگزاری می­ گردد.

1. Abbasi, B., Saxena, P. K., Murch, S. J., and Liu, C. Z., 2007. Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities. In Vitro Cellular and Development Biology- Plant, 43, PP: 481-492.

2. Alam, I., Sharmin, S. A., Mondal, S. C., Alam, M. J., Khalekuzzaman, M., Anisuzzaman, M., and Alam, M. F., 2010. In vitro micropropgation through cotyledonary node culture of castor bean (Ricinus communis L.), Australian Journal of Crop Science, 4 (2), PP: 81-84.

3. Asgari, S., Naderi, G. H., and Asgari, N., 2005. The protective effects of flavonoids against RBC hemolysis caused by free radicals. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 21 (4), PP: 505-515. 

4. Ayoughi, F., Barzegar, M., Sahari, M. A., and Naghdibadi, H., 2011. Chemical compositions of essential oils of Artemisia dracunculus L. and endemic Matricaria chamomilla L. and an evaluation of their anti oxidative effects, Journal Agricultural Science and Technology, 13, PP: 79- 88.

5. Azizi, M., 2006. Study of four Chamomile varieties (Matricaria chamomilla L.) modified in climatic conditions of Iran, Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 22 (4), PP: 386-396. 

6. Bagheri, A., Moshtaghi, N., and Sharifi, A., 2007. Plant Biotechnology. Mashhad Jehad Daneshgahi, 236 p.

7. Cellarova, E., Grelakova, K., Repack, M., and Honsariv, R., 1982. Morphogenesis in callus tissue cultures of some Matricaria and Achillea Species. Biologia plantarum (PRAHA), 24 (6), PP: 430-433.

8. Chan, L. K., Koay, S. S., Low, P. H., and Boey, P. L., 2008. Effect of plant growth regulators and subculture frequency on callus culture and the establishment of Melastomamala bathricum cell suspension cultures for the production of pigments. Biotechnology, 7 (4), PP: 678-685.

9. Dehghan-Gardeh, S., Zare, N., Asghari-Zakaria, R., and Azimi, F., 2011. Callus and plant regeneration Golden chamomile (Tinctoria anthemis), First National Congress Economic in Agriculture and Natural Resource, Ghom, 14-15 December.

10. Dhawan, V., and Bhojwani, S. S., 1986. Micropropagation in crop plants. Glimpses Plant Research, 7, PP: 1–75.

11. Ehsanpoor, A., and Amini, F., 2003. Plant cell tissue culture. Isfahan Jehad Daneshgahi, 181p.

12. Fallahi, J., Koocheki, A., and Rezvani Moghaddam, P., 2008. Effects of biofertilizers on quantitative and qualitative yield of chamomile (Matricaria recutita L.) as a medicinal plant. Iranian Journal of Field Crops, 7 (1), PP: 127 - 35.

13. Farsi, M., and Zolali, J., 2003. Principles of Plant Biotechnology. (Translation), Ferdowsi Mashhad University Press, 508 p.

14. George, E. F., Hall, M. A., and. Klerk, G. J. D., 2008. Plant propagation by tissue culture, Volume 1. The Background. Springer, 502 p.

15. George, E. F., and Deburgh, P. C., 2008. Micropropagation. Uses and methods, PP: 29-64.

16. Ghanavati, M., 2007. Study of salinity effect on some growth characters of two matricaria spices, A department of plant breeding, Shahrekord University, PP: 25-68.

17. Hadi, M., Khabandeh, N., Darzi, M., and Yasa, N., 2000. The effects of planting date and plant density on chamazalene amount of oil and chamomile. National Conference of Iranian Medicinal Plants, Research Institute of Forests and Rangelands, 119, PP: 24-26.

18. Haghi, G., Safaei, A., and Safari, J., 2004. Identification and quantitative determination of flavonoids in the flower and in extract of Matricaria chamomilla by HPLC, Abstract book: 3th International Congress of Health, Environment and Natural Products, Mashhad 87.

19. Han, Y., Jin, X., Wu, F., and Zhang, G., 2011. Genotypic differences in callus induction and plant regeneration from mature embryos of barley (Hordeum vulgare L.), Journal of Zhejiang University Science, 12 (5), PP: 399-407.

20. Hassandokht, M. R., and Ebrahimi, R., 2006. Principles of plant tissue culture. Marz Danesh, 328 p.

21. Kazem, S., 2012. Optimization of tissue culture and gene transformation in (Arctium lappa), Biotechnology, Master of Science Thesis, Dept., of Agronomy and Plant Breeding, Razi University, Kermanshah. Iran.

22. Koohi, L., Zare, N., Asghari-Zakaria, R., SheikhZade Mosaddegh, P., and Daryani, P., 2011. In vitro callus induction and regeneration of German Chamomile in response to different hormones compounds, the 12th Congress of Iranian Genetics, Tehran, 21-23 may.

23. Kumar, J., and Gupta, P. K., 2008. Molecular approaches for improvement of medicinal and aromatic plants, Plant Biotechnology Reports, 2, PP: 93-112.

24. Mahmoudi, B., 2002. Plant fragrant essential oils and healing effects of understanding (aromatherapy). Tehran, Noor Danesh Prees, 1, PP: 1-6.

25. Masomi-Asl, A., Ariaeenezhad, A., and Dehdari, M., 2016. Investigation of direct regeneration in Matricaria chamomilla, L., and Matricaria recutite L., in in vitro conditions, Journal of Horticultural Science, 4(29), PP: 601-609.

26. Mohamadi, Z., 2010. Study of callus, regeneration and suspension cultures of different genotypes of chamomile (Matricaria chamomilla). Master's Thesis in Plant Breeding, Agronomy and Plant Breeding Dept, Faculty of Agriculture, Ilam University.

27. Moradipour, E., Hosseini, B., and Pirzad, A., 2017. Effects of plant growth regulators on direct shoot regeneration from shoot apical explants in four genotypes of Matricaria chamomilla L., Journal of Plant Researches (Iranian Journal of Biology), 2(30), PP: 364-375.

28. Motamedi, J., Zebarjadi, A. R., Kahrizi, D., Salmanian, A. H., and Soheilikhah, Z. H., 2010. Study of callus induction and shoot regeneration of Safflower (Carthamus tinctorius, L.,) using hypocotyl and cotyledon explants culture, Journal of Agricultural Biotechnology, 1, PP: 99-111.

29. Movafeghi, A., Habibi, G. H., and Aliasgarpoor, M., 2008. Plant regeneration of Capparis spinosa L., using hypocotyl explant, Iranian Journal of Plant Biology, 21 (2), PP: 289-297. 

30. Mulabagal, V., and Tsay, H. S., 2004. Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science and Engineering, 2, PP: 29-48.

31. Passamonti, F., Piccioni, E., Standardi, A., and Veronesi, F., 1998. Micropropagation of Chamomilla recutita L, Rauschert, Journal Acta Horticulturae, 457, PP: 303–309.

32. Rahimi-Kolamrody, H., 2011. Botany, cultivation of diploid and triploid chamomile and oil mixtures and compared with samples available in Iran, PhD's thesis of Pharmacy, Faculty of Medical Sciences, Isfahan University, PP: 174.

33. Rani, M., Ozguven, M., and Kirici, A., 2011. The effects of some Herb's essential oils on some microbes, Journal of Medicinal Plants, 6 (20), PP: 3525-9.

34. Reichling, J., and Becker, H., 1976. Tissue-culture of Matricaria chamomilla L., 1. Isolation and maintenance of tissue-culture-preliminary phytochemical investigations. Planta Medica, 30 (3), PP: 258–268.

35. Reichling, J., Bisson, W., and Becker, H., 1984.Comparative-study on the production and accumulation of essential oil in the whole plant and in the callus culture of Matricaria chamomilla. Planta Medica, 50 (4), PP: 334–337.

36. Reichling, J., and Beiderbeck, R., 1991. Chamomilla recutita L., Rauschert (Camomile): In vitro culture and the production of secondary metabolites, Medicinal and Aromatic Plants III. Springer, Berlin Heidelberg New York, PP: 156–175.

37. Sayadi, V., Mehrabi, A. A., Saidi, M., and Nourollahi, K. H., 2014. In vitro culture and callus induction of chamomile (Matricaria chamomilla L.) explants under different concentrations of plant growth regulators, International Journal of Biosciences, 4 (10), PP: 206-211.

38. Schultz, W., Hose, S., AbonMandou, R. A., and Czygan, F. C., 1990. Melissa officinalis L. (Lemon balm), In vitro culture and the production and analysis of volatile compounds, Biotechnology in Agriculture and Forestry, 24, 242 p.

39. Shinoyama, H., Nomura, Y., Tsuchiya, T., and Kazuma, T., 2004. A simple and efficient method for somatic embryogenesis and plant regeneration from leaves of Chrysanthemum (dendranthema×grandiflorum (Ramat.) Kitamura), Journal Plant Biotechnology, 21 (1), PP: 25-33.

40. Skoog, F., and Miller, C. O., 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultures in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11, PP: 118–131.

41. Stefaan, P., Werbrouck, O., and Debergh, P. C., 1994. Applied aspects of plant regeneration. In: Dixon RA and Gonzales RA (eds) Plant Cell Culture: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford New York, PP: 127-145.

42. Tripathi, L., and Tripathi, J. N., 2003. Role of biotechnology in medicinal plants, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2, PP: 243-253.

43. Valizadeh, M., 2017. In vitro shoot regeneration of medicinal plant Anthemis hyaline DC. Journal of Crop Breeding, 9 (21), PP: 76-81.

44. Vatandoost, S. H., 2015. Optimization of tissue culture and gene transformation in Matricaria aurea. Master od science Thesis, Dept. of Production Engineering and Plant Genetics, Faculty of Science and Agricultural Engineering, Campus of Agriculture and Natural Resources, Razi University, Kermanshah.

45. Yan, M. M., Xu, C., Kim, C. H., and Um, Y. C., 2009. Effects of explant type, culture media and growth regulators on callus induction and plant regeneration of Chines jiaotou (Allium chinense), Scientia Horticulturae, 123, PP: 124-128.

46. Zebarjadi, A. R., Motamedi, M. J., Taravat, E., and Ismaili, A., 2013. Micropropagation of medicinal purple coneflower (Echinacea purpurea L.) using cotyledon and hypocotyl segments, Journal of Plant Researches (Iranian Journal of Biology), 3(26), PP: 311-319.