نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 کرمان، دانشگاه شهید باهنر ، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
3 تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم، گروه شیمی
چکیده
در خاکهای آلوده به فلزات سنگین، کلونیزاسیون با قارچهای میکوریزی از طریق افزایش جذب مواد غذایی و یا تخفیف سمیت فلز به بهبود رشد گیاه کمک میکند. در پژوهش حاضر، به منظور بررسی و اثبات نقش مثبت و احتمالی همزیستی اکتومیکوریزی گیاه پسته رقم بادامی با قارچ Agaricus bisporus در مقاومت به غلظت های متفاوت از فلز روی ، آزمایشی به حالت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با پنج سطح فلز روی( 0، 30، 60، 90 و 120 میکرولیتر) و دو سطح تلقیح و عدم تلقیح با این قارچ، در سه تکرار اجرا گردید و تاثیر این همزیستی بر پاسخ آنتیاکسیدانی گیاه، پراکسیداسیون لیپیدی و میزان تجمع فلزی در اندام هوایی و ریشههای گیاهان میکوریزی وغیرمیکوریزی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد تحت شرایط تنش فلز سنگین، گیاهان میکوریزی در مقایسه با گیاهان غیرمیکوریزی فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان قویتر و میزان تولید مالون دی آلدئید، به عنوان شاخص تنش اکسیداتیو کمتری داشتند. کاهش محتوای آسکوربات و در مقابل افزایش میزان دهیدروآسکوربات نیز مشاهده شد. همچنین مشخص شد در ریشۀ گیاهان میکوریزی تجمع فلز روی در مقایسه با ریشۀ گیاهان غیرمیکوریزی بیشتر است که این خود نشاندهندة نقش قارچ اکتو میکوریز Agaricus bisporus در ممانعت از انتقال فلز سنگین و جلوگیری از آسیب به بخشهای هوایی گیاه است. بنابراین با توجه به نتایج، میتوان به این نتیجه رسید که قارچ میکوریزی Agaricus bisporus از طریق بهبود سیستم دفاعی آنتی اکسیدان و محدود نمودن جذب فلز سنگین به گیاه، خطرات ناشی از تنش بر رشد گیاه پسته را تعدیل مینماید.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Positive role of Mycorrhizal Fungi in the Alleviation of Zinc Toxicity in in Badami cultivar of pistachio (Pistacia vera L.) trees
نویسندگان [English]
1 payamenoor university of tehran
2 Bahonar university
3 payame noor
چکیده [English]
On metal contaminated soils, ectomycorrhizal( ECM) fungi may improve plant growth through an enhanced nutrition or by alleviation toxicity of the metals. In order to evaluation of alleviating effects of ectomycorrhizal colonization on zn toxicity, a study was performed using pistachio plants and Agaricus bisporus fungus as factorial in a completely randomized design with three replications. The experiment included two factors: mycorrhizal (M) and non-mycorrhizal (NM) pistachio plants and five levels of the zn concentrations (0, 30, 60, 90 and 120 μm) in 3 replicates. In this study experiment was conducted to investigate the effect of ectomycorrhizal colonization in the alleviation of oxidative stress and improvements of the antioxidant enzyme activities, lipid peroxidation and metal accumulation in pistachio trees (Badami cultivar).The results showed that the increase of zinc concentration caused an increase in the malondialdehyde (MDA), and induction in antioxidative enzymes activity in the leaves of the M and NM plants, but it was dramatically more in M plants. A decrease of ascorbate (ASA) content was induced by increasing the zinc concentration where it was higher in M plants but all metal treatments increased dehydroascorbate (DHA) contents in both M and NM plants. The results showed that the Zn translocated from root to shoot in M plants was lower than NM plants. The amelioration of Zn toxicity by A.bisporus may be a result of improving the antioxidant defense system and prevent the absorption of heavy metals.
کلیدواژهها [English]
بررسی نقش مثبت همزیستی اکتومیکوریزی در تخفیف اثرات سمیت ناشی از فلز سنگین روی در گیاه پسته رقم بادامی (Pistacia vera L.)
فرشته محمدحسنی1*، علی احمدی مقدم2، زهرا اسرار2 و سید ضیا محمدی3
1ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2ایران، کرمان، دانشگاه شهید باهنر، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
3ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم، گروه شیمی
تاریخ دریافت: 1/2/96 تاریخ پذیرش: 15/8/97
چکیده
در خاکهای آلوده به فلزات سنگین، کلونیزاسیون با قارچهای میکوریزی از طریق افزایش جذب مواد غذایی و یا تخفیف سمیت فلز به بهبود رشد گیاه کمک میکند. در پژوهش حاضر، بهمنظور بررسی و اثبات نقش مثبت و احتمالی همزیستی اکتومیکوریزی گیاه پسته رقم بادامی با قارچ Agaricus bisporus در مقاومت به غلظتهای متفاوت از فلز روی، آزمایشی به حالت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با پنج سطح فلز روی (0، 30، 60، 90 و 120 میکرولیتر) و دو سطح تلقیح و عدم تلقیح با این قارچ، در سه تکرار اجرا گردید و تأثیر این همزیستی بر پاسخ آنتیاکسیدانی گیاه، پراکسیداسیون لیپیدی و میزان تجمع فلزی در اندام هوایی و ریشههای گیاهان میکوریزی وغیرمیکوریزی مورد بررسی قرارگرفت. نتایج نشان داد تحت شرایط تنش فلز سنگین، گیاهان میکوریزی در مقایسه با گیاهان غیرمیکوریزی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان قویتر و میزان تولید مالون دی آلدئید، بهعنوان شاخص تنش اکسیداتیو کمتری داشتند. کاهش محتوای آسکوربات و در مقابل افزایش میزان دهیدروآسکوربات نیز مشاهده شد. همچنین مشخص شد در ریشۀ گیاهان میکوریزی تجمع فلز روی در مقایسه باریشۀ گیاهان غیرمیکوریزی بیشتر است که این خود نشاندهندة نقش قارچ اکتو میکوریز Agaricus bisporusدر ممانعت از انتقال فلز سنگین و جلوگیری از آسیب به بخشهای هوایی گیاه است. بنابراین باتوجه به نتایج، میتوان به این نتیجه رسید که قارچ میکوریزی Agaricus bisporus از طریق بهبود سیستم دفاعی آنتیاکسیدان و محدود نمودن جذب فلز سنگین به گیاه، خطرات ناشی از تنش بر رشد گیاه پسته را تعدیل مینماید.
واژههایکلیدی: اکتومیکوریز، آنزیم آنتیاکسیدان، پسته بادامی، Agaricus bisporus ، روی
* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی: Fereshtehmhasani@yahoo.com
مقدمه
آلودگی خاک به فلزات سنگین نتیجه بسیاری از فعالیتهای بشری نظیر معدن کاری، استخراج و ذوب فلزات و کاربرد کودها، سموم و قارچ کشهای کشاورزی و غیره میباشد که سلامتی بشر و زیستبوم را به خطر میاندازد (13). اگرچه برخی از این فلزات مانند مس، آهن، منگنز و روی جزء عناصر ریزمغذی ضروری هستند که برای محدوده وسیعی از فرایندهای سلولی مورد نیاز میباشند اما در غلظتهای بالاتر از حد بهینه سبب القای تنش اکسیداتیو و ایجاد رادیکالهای فعال اکسیژن شده و از طریق اختلال در ساختار غشاء و آسیب به ماکرو مولکولهای حیاتی گیاه بر رشد گیاه اثر منفی گذاشته و یا حتی منجر به مرگ گیاه میشوند (17). یکی از روشهایی که بهعنوان ابزار جدیدی برای اصلاح خاک، آبوهوا در حال ظهور میباشد، گیاهپالایی است. موفقیت این روش نه تنها به گیاه، بلکه به اثرات متقابل ریشههای گیاه با میکروارگانیسمهای ریزوسفری و گونه و غلظت فلزات سنگین در خاک بستگی دارد (32). کارایی گیاهپالایی در آزمایشهای گلخانهای و مزرعهای مورد بررسی قرارگرفته است لیکن آنچه کمتر بدان پرداختهشده است بررسی نقش میکروارگانیسمهای همیار و یا همزیست با گیاهان در فرایند گیاهپالایی میباشد .ازجمله مکانیسمهای سلولی برای کاهش سمیت فلزی، غیرمتحرک سازی یونهای فلزی از طریق همزیستی میکوریزی و ازجمله اکتومیکوریز میباشد (12). در ارتباط با نقش قارچ اکتومیکوریز در تحمل فلزات سنگین توسط گیاه میزبان، اکثر مکانیسمهای پیشنهاد شده فرایندهای متنوعی از دفع را شامل میشوند که حرکت فلزات به ریشههای میزبان را محدود میکنند. ین موارد بهطور گسترده بررسی شده است و شامل جذب فلزات توسط غلاف هیفی و کاهش دستیابی به آپوپلاست به دلیل خاصیت هیدروفوب غلاف، کلات شدن توسط ترشحات قارچی و جذب به میسلیوم خارجی میباشد (14). نتایج بررسیها نشان داده است که در خاکهایی که دارای قارچ اکتومیکوریزی بهصورت همزیست با گیاه هستند میزان فلزات سنگین موجود در خاک کمتر از حالتی است که همزیستی اکتومیکوریزی وجود ندارد (24). تعداد بسیار زیادی از قارچهای شرکت کننده در همزیستی اکتومیکوریزی قابلیت تجمع و تحمل مقادیر متفاوت از فلزات سنگین گوناگون را دارا میباشند. قارچهای بازیدیومیست ازجمله قارچAgaricus bisporus ، قارچهایی هستند که علاوه بر همزیستی در اکوسیستمهای طبیعی در بسیاری از آزمایشها مورد استفاده قرارگرفتهاند به طوریکه در بسیاری از بررسیها، قارچهای شرکت کننده در رابطه اکتومیکوریزی در شرایط Invitro کشت شده و تحت تأثیر فلزات سنگین قرارگرفته و میزان تحمل و جذب فلزات سنگین در این قارچها مورد بررسی قرارگرفته است (13و 28). اگرچه نتایج آزمایشهای انجامیافته در زمینۀ قارچهای میکوریز و فلزات سنگین، متنوع و وابسته به شرایط آزمایش ازجمله ویژگیهای بستر رشد، نوع گیاه و گونۀ قارچ همزیست میباشد ولی بهطور کلی، به نظر میرسد قارچهای میکوریز قادر به تعدیل سمیت ایجادشده توسط فلز سنگین برای گیاه میباشند.. این قارچها نقش اکولوژیک قابلتوجهی در تثبیت فلزات سنگین توسط گیاه در خاکهای آلوده به این فلزات با ایجاد کمپلکس، ایفا میکند و به نوبۀ خود به بقای گیاهان میکوریزی کمک میکند (8). نقش قارچهای میکوریز در تعدیل سمیت فلزات سنگین توسط فرناندزفوگو (2017) (17)، هاشم (2016) (21) و ربیع (2005) (33) نیز گزارش شده است.
پسته (Pistacia vera) از خانوادهAnacardiaceae میباشد که گیاهی دوپایه با میوه شفت و تکدانه میباشد (4). محصول این گیاه از عمدهترین محصولات صادراتی غیرنفتی میباشد و ازجمله درختانی میباشد که رابطه همزیستی آنهم بهصورت میکوریز وزیکولارآربوسکولار و هم اکتومیکوریزی گزارش شده است به طوریکه این گیاه با گونههای مختلفی از قارچGlomus و Gigaspora وارد رابطه میکوریزی از نوع وزیکولارآربوسکولار میگردد و اثرات مثبت این همزیستی در بهبود جذب عناصر معدنی توسط کفکاس (2009) (23)، صالحی و همکاران (1387) (2) و افزایش تحمل به تنش شوری توسط فلاحیان و همکاران (1384) (3) به اثبات رسیده است. همچنین اثرات مثبت همزیستی اکتومیکوریزی این گیاه با قارچ Agaricus bisporus در جلوگیری از سمیت منیزیم توسط بهرامی سیرمندی (1389) (1)، در جلوگیری از سمیت فلز سنگین کادمیوم توسط محبوب القلوب (5) و در تخفیف اثرات اشعه UVتوسط نادر نژاد (1392) (6) انجام شده است.
از میان تنشهای محیطی که این گیاه با آن مواجه است تنش فلزات سنگین است که به علت استفاده بیرویه از کودهای شیمیایی و بهمنظور جبران کمبود عناصر غذایی در مناطق پستهکاری میباشد که میتواند پیامدهای منفی هم بر خود گیاه و هم بر مصرف کنندههای آن داشته باشد. ایجاد ارتباط و همزیستی میکوریزی از نوع اکتومیکوریز و نقش آن در افزایش تحمل فلز سنگین در بسیاری از گیاهان گزارش شده است اما تاکنون این مورد در گیاه پسته گزارش نشده است و تنها در مورد عنصر غذایی منیزیم و فلز سنگین کادمیوم کارهای محدودی شده است. ازاینرو در این تحقیق سعی میشود تا به اثبات تأثیر مثبت همزیستی اکتومیکوریزی قارچAgaricus bisporus با گیاه پسته در تحمل یکی از تنشهای رایج در زمینهای کشاورزی پرداخت تا اثر مثبت این رابطه بر گیاه پسته به خاطر اهمیت این محصول ازنظر تغذیهای و اقتصادی بررسی شود که آیا نتیجه این همزیستی مسالمتآمیز به نفع گیاه پسته میباشد و یا خیر.
هدف از این تحقیق پی بردن به تغییر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان بهخصوص پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز و میزان مالون دی آلدئید به منزلهی شاخصی از پراکسیداسیون غشا در گیاهان پسته تحت تنش فلز روی در حضور میکوریز در مقایسه با گیاهان شاهد بود.
مواد و روشها
پس از جمعآوری قارچ (Agaricus bisporu (J. Langes از زیر درختان پسته در باغی واقع در ایستگاه شماره 2 مؤسسه تحقیقات پسته کشور واقع در رفسنجان- کرمان، این قارچ در محیط کشت ملین – نورکرانس آگار(MMN) شامل: ( g5 /0) KH2PO4 ، g)025 /0NaCl( ، ( g 05/0)CaCl2، g) 15/0 MgSO4(، g) 25/0) (NH4)2HPO4،(mg100) کلرید تیامین، (ml2/1) Fe (Cl3)، عصاره مالت(g3) و گلوکز(g10) در شرایطی کاملاً استریل رشد کرد (27).
محیط کشت در 1000 میلیلیتر آب مقطر تهیه شد و پس از اضافه کردن 15 گرم آگار و پس از تنظیم pH محلول به میزان 8/5، مرحله استریل محلول مورد نظر از طریق اتوکلاو به مدت 20 دقیقه و در دمای 121درجه سانتیگراد انجام شد. ظرفهای محیط کشت پس از کشت قارچ در شرایط استریل به مدت چهار هفته در دمای معمولی اتاق قرار داده شدند تا قارچها رشد کند (25). بهمنظور ایجاد نهالهای پسته، بذرهای پسته پس از خیس شدن در آب به مدت دو هفته در دمای 4 درجه قرارگرفتند و در محلول 5/0 درصد هیپوکلرید کلسیم و سپس در محلول توئین یک درصد گذاشته و در نهایت چهار بار با آب مقطر استریل شسته شدند تا استریل شوند. این کار دو بار تکرار شد، سپس بذرهای داخل پتری دیش استریل در دمای آزمایشگاه در تاریکی قرار داده شدند تا جوانه بزنند. پیت و پرلیت چهار بار با آب شیر شسته و خشک شدند و در ارلنهای 500 میلیلیتری ریخته و در دمای 121 درجه و به مدت 20 دقیقه استریل شدند. سه هفته بعد از جوانهزنی، گیاهکها در شرایط استریل به ارلنهای 500 میلیلیتری که حاوی پرلیت به مقدار 54 گرم و پیت ماس به مقدار 5/6 گرم بود، وارد شدند و80 میلیلیتر محلول هوگلند با غلظت2/1 نیز افزوده شد (20). در کنار ریشههای نیمی از ارلنها، قطعات قارچ یک اندازه (10دیسک ( گذاشته شد. هریک از دو گروه از ارلنها که حاوی گیاهان میکوریزی و یا غیر میکوریزی بودند به 4 گروه با حداقل 3 تکرار تقسیم شدند .بعد از 8 هفته از رشد گیاهکها، بهمنظور تشخیص و اطمینان از اکتومیکوریزی شدن نهالها، از ریشههایی که احتمال وجود اکتومیکوریزی را داشته برشهای عرضی گرفته و پس از رنگآمیزی با متیلن بلو یک درصد، در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شدند. پس از اطمینان از ایجاد ارتباط میکوریزی بین نهالها و قارچ و پس از بهینهسازی غلظتهای مورد استفاده از فلز روی جهت تیمار، گیاهان میکوریزی وغیرمیکوریزی به مدت 8 هفته در اتاقک رشد با شرایط کنترل شده تحت دوره نوری 8/16 (تاریکی /نور)، دوره دمایی 18/28 درجه سانتیگراد ( شب/ روز) و رطوبت نسبی 60-50 درصد، تحت تیمار پنج غلظت از فلز روی (0 و30 و 60 و90 و120میکرومولار) با استفاده از نمک سولفات روی قرار گرفتند (10و 36).
سنجشمقدارپراکسیداسیونلیپیدها: برای سنجش مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، غلظت مالوندیآلدهید (MDA) که محصول اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع هستند، اندازهگیری شد. اندازهگیری غلظت مالون دیآلدهید به روش هیس و پاکر (1969) انجام شد (22). برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادلmM-1 Cm-1 155 استفاده شد و نتایج حاصل از اندازهگیری برحسب میکرومول بر وزن تر گیاه محاسبه و ارائه گردید.
سنجشمقداراسیدآسکوربیکواسید دیهیدروآسکوربیک: برای سنجش مقدار اسیدآسکوربیک و اسید دی هیدروآسکوربیک از روش دهپینتو و همکاران (1999) (15) استفاده شد. برای اندازهگیری مقدار آسکوربیک اسید و دی هیدروآسکوربیک اسید، 5/0 گرم بافت تازه وزن شد و در 10 میلیلیتر متافسفریک اسید 5 درصد ساییده شد و به مدت 15 دقیقه در g10000سانتریفیوژ گردید .سپس به محلول رویی بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار، آلفا- آلفا دی پیریدیل 4 درصد، محلول FeCl3 اضافه شده و بعد شدت جذب را در طولموج525 نانومتر خوانده شد. برای سنجش اسید دی هیدروآسکوربات نیز همین مراحل را انجام داده با این تفاوت که به آن محلول دی تیوترایتول هم اضافه نمودیم.
سنجش فعالیت آسکورباتپراکسیداز (APX): فعالیت این آنزیم براساس روش ناکانو و آسادا (30) اندازهگیری شد. دراین روش مخلوط واکنش حاوی بافر پتاسیمفسفات 50 میلیمولار (7pH=)، آسکوربات 5/0 میلیمولار، آباکسیژنه 1/0 میلیمولار و 150 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت آسکوربات براساس اکسیداسیون آسکوربیکاسید و کاهش در جذب، در طولموج 290 نانومتر به مدت 2 دقیقه اندازهگیری شد. برای محاسبه غلظت آسکوربات اکسیدشده از ضریب خاموشی آن معادل 1-Cm 1-mM 8/2 و فرمول bcε=A، استفاده شد. یک واحد فعالیت آنزیمی بهعنوان مقدار آنزیمی است که 1 میلیمول آسکوربیکاسید را در مدت 1 دقیقه اکسید کند.
سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز به روش اسپکتروفتومتری SOD: پس از تهیه عصاره آنزیمی مخلوط واکنشی شامل بافر فسفات 50میلی مولار7PH=،NBT 0.075 میکرومولار، Na-EDTA 0.1 میلیمولار، 75میکرومولار ریبوفلاوین، 13میلی مولارمتیونین و 50میکرولیتر عصارهی آنزیمی تهیه شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر شاهد (برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر) نیاز به نمونه کنترل نیز میباشد. میزان فعالیت آنزیم SOD در نمونهها درمقایسه با کنترل سنجیده میشود.
درلوله کنترل نیز مخلوط واکنش ذکر شده وجود داشت با این تفاوت که به آن عصاره آنزیمی اضافه نشد. بنابراین به دلیل عدم وجود آنزیم در کنترل، احیاء NBT درحضور نور (احیاء نوری) به طور100 درصد در کنترل انجام و تمام نیتروبلوتترازولیوم موجود در مخلوط واکنش درحضور نور به فورمازون تبدیل میشود. میزان جذب کنترل در 560نانومتر نشان دهنده 100 درصد احیاء نوری NBT است ونیمی از آن معادل یک واحد آنزیمی میباشد. بنابراین یک واحد آنزیمی سوپر اکسید دیسموتاز مقدار آنزیمی است که موجب 50 درصد ممانعت از احیاء نوری احیای نیتروبلوتترازولیوم (یا جلوگیری از تبدیل آن به فورمازون) میگردد. اختلاف جذب نمونهها وکنترل در560 نانومتر نشان دهنده مهار احیاء نوری NBT درحضور آنزیم SOD موجود در نمونه میباشد (19). بااستفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونهها محاسبه و فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) در 50 میکرولیتر عصاره حاصل از روش برادفورد (1976) (11) بیان گردید.
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): سنجش فعالیت کاتالاز براساس کاهش جذب آباکسیژنه در طول موج 240 نانومتر صورت گرفت (16). براساس این روش مخلوط واکنش (3 میلیلیتر) شامل بافر پتاسیمفسفات 50 میلیمولار (7pH=)، آباکسیژنه 15 میلیمولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. با اضافه کردن آب اکسیژنه به مخلوط واکنش، واکنش شروع شد و کاهش در جذب آباکسیژنه در مدت 30 ثانیه در طول موج 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری 500 Cary ساخت شرکت Varian اندازهگیری شد. یک واحد فعالیت آنزیمی، مقدار آنزیمی است که یک میلیمول آب اکسیژنه را در مدت 30 ثانیه تجزیه کند. چون میزان فعالیت آنزیم براساس غلظت آب اکسیژنه تجزیه شده محاسبه شد، غلظت آباکسیژنه مصرف شده با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM -1Cm-140 و فرمول A= bcε محاسبه گردید.
سنجشمیزانفلزرویدرریشه و اندام هوایی: به منظور اندازهگیری میزان فلز روی در بافت گیاه از روش جذب اتمی لوزاک (2002) (26) استفاده شد. 5/0 گرم از نمونه گیاهی خشک ( ریشه و اندام هوایی) در 10 میلیلیتر اسید نیتریک غلیظ حل و سوسپانسیون اسیدی حاصل به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد قرارگرفت. محلولها با آب دیونیزه به حجم رسیده و مقدار جذب آنها با به کمک دستگاه جذب اتمی مدل (Varian SpertrAA-220)ساخت ژاپن انجام گرفت. در نهایت با استفاده از منحنی استاندارد و با استفاده از معادله y = 8.425x - 3.6188 غلظت فلز تعیین گردید.
آنالیز آماری: این تحقیق در قالب یک طرح فاکتوریل کاملاً تصادفی با پنج سطح فلز روی ( 0، 30، 60، 90 و 120 میکرولیتر) و دو سطح تلقیح و عدم تلقیح با قارچ و در سه تکرار انجام شد. دادههای حاصل از اندازهگیری پارامترها، با استفاده از نرم افزار SPSS 16.0 تحت آنالیز واریانس یکطرفه قرارگرفتند و میانگین دادهها با آزمون دانکن مقایسه شدند 05/0 P < به عنوان اختلاف معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج حاصل از تاثیر تیماررویبرغلظتمالوندیآلدئید: میزان سنتز مالون دیآلدئید به عنوان شاخصی از پراکسیداسیون لیپیدی در برگهای هر دو گروه از گیاهان میکوریزی و غیرمیکوریزی از غلظت 60 میکرومولار روی به بعد نسبت به گیاهان شاهد طور معنیدار افزایش یافت که البته این میزان در گیاهان غیرمیکوریزی نسبت به گیاهان میکوریزی بیشتر بود. بیشترین میزان MDA در غلظت 120 میکرومولار روی در برگ گیاهان غیرمیکوریزی بود که 65/261 درصد نسبت به گروه شاهد افزایش داشت. این نتایج حاکی از این است که فلز روی موجب القای تنش اکسیداتیو و در نتیجه تولید بیشتر گونههای فعال اکسیژن در گیاه پسته شده است (نمودار 1).
نتایجحاصلاز تاثیر تیمارروی برمحتوایآسکوربیکاسید و دی هیدروآسکوربیک: اثر فلز سنگین روی بر محتوای آسکوربیک اسید و دی هیدروآسکوربیک در نمودار (2و 3) نشان داده شده است. بر اساس نتایج میزان آسکوربات در اندام هوایی گیاه پسته در دو حالت میکوریزی و غیرمیکوریزی، در غلظت های 30 و 60 و 90 میکرومولار تفاوت معنیداری با گیاه کنترل نشان نمیدهد. در حالیکه سمیت روی در غلظتهای بالا (120 میکرومولار) محتوای این ترکیبات آنتیاکسیدان را به طور معنیدار در هردو گروه از گیاهان کاهش داده است در حالی که با افزایش غلظت فلز روی (90 و 120 میکرومولار) در محیط کشت میزان دهیدروآسکوربات در برگ به طور معنی دار نسبت به گیاهان شاهد افزایش نشان داد.
نمودار 1- اثر سطوح مختلف فلز روی بر محتوای مالون دیآلدئید در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. دادهها میانگین 3 تکرار± Sd است. براساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستونهای مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 P<)میباشند
B |
A |
شکل1- ریشه های اکتومیکوریزی شده پسته رقم بادامی در زیر میکروسکوپ تشریحی(A) و میکروسکوپ نوری (B)
شکل2- گیاه پسته رقم بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی تحت تیمار با فلز روی
نمودار 2- اثر سطوح مختلف فلز روی بر محتوای آسکوربیک اسید در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. دادهها میانگین 3 تکرار± Sd است. براساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستونهای مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 P<) میباشند
نمودار 3- اثر سطوح مختلف فلز روی بر محتوای دهیدرو آسکوربیک اسید در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. براساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستونهای مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 (P< میباشند
نتایجحاصلاز اثر روی برفعالیت آنزیمهای آنتی اکسیداتیو در گیاه پسته: روی سبب القای بیشتر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیداتیو در برگ گیاهان میکوریزی نسبت به غیرمیکوریزی شد. نمودار شکل4 A-C)) نشان داد که فعالیت سه آنزیمSOD ، APX و CAT به ویژه در غلظت های بالای تیمار (90 و 120 میکرومولار) به طور معنیداری در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش یافت.
نتایجحاصلاز اثر تیمار روی برمیزان اندوزش فلز در ریشه و بخش هوایی در گیاهان میکوریزی و غیرمیکوریزی پسته: برطبق دو نمودار 5 و 6، کاربرد روی در سطوح مختلف موجب انباشت این فلز در بخشهای ریشهای در مقایسه با بخش هوایی در گیاهان میکوریزی شده است به طوری که بیشترین میزان انباشتگی روی در ریشه گیاهان میکوریزی، در غلظت 120 میکرومولار روی بود که 75/185درصد افزایش را نسبت به گیاهان شاهد داشت. این در حالی است که در گیاهان غیرمیکوریزی میزان انباشت این فلز در بخش هوایی نسبت به ریشه بیشتر بوده است. بیشترین میزان انباشتگی روی در بخش هوایی نیز در غلظت 120 میکرومولار روی و در رقم بادامی غیرمیکوریزی بود به طوری که 88/ 294 درصد افزایش را نسبت به گیاهان شاهد داشت.
نمودار A4- اثر سطوح مختلف فلز روی بر فعالیت آنزیم کاتالاز در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. براساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستون های مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 P<) میباشند
نمودار B4- اثر سطوح مختلف فلز روی بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. بر اساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستون های مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 (P< میباشند
نمودار C4- اثر سطوح مختلف فلز روی بر فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در برگ پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. بر اساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستون های مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 (P< می باشند
نمودار 5- محتوای روی اندام هوایی در پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی در تیمارهای مختلف روی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. براساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستون های مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنیدار (05/0 (P< میباشند
بحث
علیرغم نقش بسیار مهم روی در ساختار و راهاندازی بسیاری از فرایندهای متابولیکی گیاه مشابه با سایر عناصر سنگین تمرکز بالای آن در خاک و در گیاه سبب بروز برخی علائم ناشی از تنش و عدم رشد طبیعی گیاهان میشود. زمانیکه غلظت روی در برگ بیش از 400 میلیگرم در کیلوگرم وزن خشک باشد، علائم سمیت آن به صورت نقاط نکروزه بر روی برگ نمایان میشود و در غلظتهای بالا سبب مرگ گیاه میگردد (35).
نمودار 6- محتوای روی ریشه در پسته بادامی میکوریزی و غیرمیکوریزی در تیمارهای مختلف روی. داده ها میانگین 3 تکرار± Sd است. بر اساس آزمون دانکن حروف متفاوت ستون های مربوط به یک فاکتور نشان دهندهی اختلاف معنی دار (05/0 (P< میباشند.
یکی از مکانیسمهای بروزسمیت در بافتهای گیاهی در حضور فلزات سنگین از قبیل روی تولید رادیکالهای آزاد و ایجاد تنش اکسیداتیو است رادیکالهای آزاد با اثر بر پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع واکنشهای زنجیرهای پراکسیداسیون را تحریک کرده، و به تخریب اسیدهای چرب و تولید مالون دی آلدئید منجر میشوند (33).
دراین تحقیق میزان مالون دیآلدئید در غلظت کم فلز روی (30 میکرومولار) تفاوت معنی داری با گیاه کنترل چه در حالت میکوریزی و چه غیرمیکوریزی نشان نمیدهد ولی غلظتهای بالای این فلز محتوای این ترکیب و در نهایت پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی را افزایش داده است. افزایش غلظت مالون دی آلدئید در پاسخ به تنش فلزات سنگین از قبیل منگنز در شاهی (7)، در پاسخ به تنش روی، مس و کادمیم در گیاه میکوریزی توس سفید (17)، در پاسخ به تنش کادمیوم در گیاه میکوریزی گوجه (21) نیز گزارش شده است. افزایش میزان مالون دی آلدئید در غلظتهای بالای روی به دلیل آسیب غشاهای سلولی گیاه توسط روی میباشد. آسیب غشایی موجب موجب به هم ریختگی وضعیت جذب مواد ضروری از خاک، نقصان هدایت روزنهای و در نهایت کاهش محتوای آب درون سلولها میگردد (8).
ایجاد ارتباط میکوریزی بین قارچ Agaricus bisporus و گیاه پسته سبب کاهش استرس اکسیداتیو و کاهش تولید MDA در گیاهان میکوریزی نسبت به غیرمیکوریزی شد که این نتایج با گزارشات (33)، (8) و (21) مطابقت دارد.
در حالت طبیعی بین میزان تولید رادیکالهای آزاد اکسیژن و میزان نابودی آنها از سطح سلولی گیاه تعادلی وجود دارد اما اگر این تعادل به هم بخورد و میزان رادیکالهای آزاد موجود در سلول از مقدار ترکیبات سمزدا و ظرفیت آنتی اکسیدانی گیاه تجاوز کند تنش اکسیداتیو رخ میدهد (21). گیاهان مکانیسمهای دفاعی متعددی برای کنترل و خنثی کردن رادیکالهای آزاد ناشی از اکسیژن به کار میگیرند. از جمله این مکانیسمها سیستم دفاعی آنتیاکسیدانی با سازوکار آنزیمی و غیرآنزیمی است. بنابراین برای مقابله با تنش اکسیداتیو افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی گیاه ضروری میباشد.
افزایش میزان MDA در گیاه سبب تحریک سیستمهای آنتیاکسیدانی غیرآنزیمی از طریق افزایش فعالیت چرخه آسکوربات- گلوتاتیون میشود که این سیستمها، نقش مهمی را در حفاظت غشاهای بیولوژیکی در برابر تنش اکسیداتیو ناشی از تجمع فلزات سنگین ایفا مینمایند.
برطبق نمودار شکل(2) میزان آسکوربات کل در اندامهای هوایی گیاه پسته چه در حالت میکوریزی و چه غیر میکوریزی در غلظت های پایین روی (90-0 میکرومولار) تفاوت معنیداری با گیاهان کنترل را نشان نداد. در حالی که در غلظتهای بالا (120 میکرومولار) محتوای این ترکیبات آنتیاکسیدانی به طور معنیداری افزایش داشته است. در این تحقیق، با افزایش غلظت روی میزان دهیدروآسکوربات در مقابل آسکوربات افزایش یافت که نتایج ما با یافتههای پاندای (31) در گیاه اسفناج، هاشمی (7) در گیاه شاهی وهاشم (21) در گیاه میکوریزی گوجه مطابقت دارد.
احتمالاً به علت ورود گلوتاتیون احیا در مسیر سنتز فیتوکلاتینها و در نتیجه کاهش سوبسترای کاهنده آسکوربات و یا به علت کاهش فعالیت آنزیمهای درگیر در چرخه اکسید و احیا آسکوربات، نسبت دهیدروآسکوربات به آسکوربات افزایش مییابد (18). کاهش تیولهای پروتینی و غیرپروتئینی، آسکوربات و گلوتاتیون در گیاهان تیمار شده با فلز روی در این تحقیق نشان دهنده این است که گیاه پسته دچار تنش اکسیداتیو شده است.
سیستم دفاعی آنتیاکسیدانی با سازوکار آنزیمی (کاتالاز، آسکورباتپراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز و...) نیز از جمله این مکانیسمها است که میتواند رادیکالهای آزاد اکسیژن را از بین برده و خسارات ناشی از تنش اکسیداتیو را تخفیف دهد (19).
در مطالعهی حاضر مشخص شد که میزان فعالیت این سه آنزیم APX ، CAT و SOD تحت تاثیر فلز روی افزایش یافته است .نتایج حاصل نشان میدهد که افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان SOD,APXوCAT در مقایسه با نمونههای شاهد به ویژه در غلظتهای بالای این فلز در مورد هر سه آنزیم معنیدار است. که این افزایش در گیاهان میکوریزی نسبت به غیرمیکوریزی محسوستر بود.
افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان SOD,APX وCAT در پاسخ به تنش روی، مس و کادمیوم در گیاه میکوریزی لوبیاقرمز و گندم (33) و در پاسخ به تنش کادمیوم در گیاه میکوریزی گوجه (21) نیز گزارش شده است که مطابق با یافتههای ما این افزایش در گیاهان میکوریزی نسبت به غیرمیکوریزی محسوستر بود. علیرغم اینکه تیمار با غلظتهای بالای روی دراین مطالعه فعالیت اکثر آنزیمهای آنتی اکسیدان (SOD، CAT و APX) را در گیاه پسته و به ویژه در گیاهان میکوریزی افزایش داده است، با این وجود به نظر میرسد که این افزایش برای جبران افزایش H2O2 و تنش اکسیداتیو ناشی از تجمع گونههای فعال اکسیژن در اثر سمیت روی کافی نبوده و میزان تولید گونههای فعال اکسیژن از ظرفیت آنتیاکسیدانی گیاهان بیشتر بوده است. بنابراین در گیاهان در معرض روی به خصوص در غلظت بالای آن، تنش اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدها و آسیب به غشا را موجب شده است.
درجه سمیت فلز سنگین و اثرات فیزیولوژیکی ناشی از آن به میزان جذب آن فلز توسط ریشه و میزان انتقال و جابه جایی آن در گیاه بستگی دارد (37). از جمله مکانیسمهای حفاظتی گیاه در مقابل فلزات سنگین جلوگیری از انتقال و تجمع فلز در بخش هوایی میباشد زیرا رشد بخش هوایی در مقایسه با بخشهای ریشهای حساسیت بیشتری در برابر فلزات سنگین از خود نشان میدهد. نتایج به دست آمده نیز موید مطلب فوق است. از جمله دلایل کاهش انتقال فلز روی از ریشه به بخش هوایی باقی ماندن فلز سنگین به صورت کمپلکس فلز- تیول در سلولهای ریشه میباشد (29و 34).
نتایج حاصل نشان میدهد که اندوزش فلزات در ریشههای گیاهان میکوریزی به میزان قابل توجهی نسبت به گیاهان غیرمیکوریزی بالاتر است. انباشت بیشتر فلز در ریشه گیاه میکوریزی و کاهش انتقال آن به بخش هوایی در مطابقت با نتایج ما، در پاسخ به تیمار با سرب در گیاه میکوریزی سویا ( 9)، در پاسخ به تیمار سرب، روی، مس، کادمیم در گندم و لوبیا قرمز میکوریزی ( 33)، نیز گزارش شده است. در چنین مواردی برای همزیستی میکوریزی نقش تثبیت کنندگی عناصر سنگین در بافت ریشه و عدم انتقال آن به اندام هوایی در نظر گرفته شده است که در واقع یکی از مکانیسمهایی است که از طریق آن قارچهای میکوریزی توانایی گیاه را برای رشد در خاکهای آلوده افزایش میدهند.
نتیجه گیری
تنش فلزات سنگین در گیاهان به ایجاد تنش اکسیداتیو و تولید گونههای اکسیژن فعال منجر می شود. گیاهان برای تعدیل این تنش، مکانیسمهای دفاعی متعددی از جمله افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان و جلوگیری از انتقال و تجمع فلز در بخش هوایی را در پیش می گیرند. براساس نتایج، کلونیزاسیون با قارچ Agaricus bisporus موجب القاء افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان و محدود نمودن جذب فلز سنگین توسط گیاه شده و از این طریق به تحمل فلز سنگین کمک میکند.