نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل

2 هیات علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات- دانشکده علوم کشاورزی- دانشگاه محقق اردبیلی

3 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل

4 مرکز تحقیقات گیاهان دارویی، واحد اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی

چکیده

در این تحقیق، تاثیر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مختلف (2,4-D, NAA, Kin, BAP, IBA, TDZ) بر کالوس‌زایی ریزنمونه‌های مختلف، تکثیر درون‌شیشه‌ای فندق با استفاده از ریزنمونه گره و همچنین میزان تاکسول در کالوس مورد بررسی قرار گرفت. ریزنمونه‌های بذر، برگ و ساقه فندق پس از ضدعفونی سطحی، روی محیط کشت MS حاوی 1، 2 و 4 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و NAA در ترکیب با Kin و BAP (5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر) کشت شدند. علاوه ‌بر این، به‌منظور تکثیر درون‌شیشه‌ای، ریزنمونه‌های تک ‌گره فندق تهیه شده و روی محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی کشت شدند. نتایج نشان داد که درصد کالوس‌زایی ریزنمونه برگ به‌طور معنی‌داری بیشتر از بذر و ساقه است. بیشترین درصد کالوس‌زایی و وزن تر کالوس در محیط‌ MS حاوی دو میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. در ریزنمونه‌های تک گره فندق بیشترین درصد ریشه‌زایی در محیط MS حاوی دو میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر Kin و در محیط MS حاوی چهار میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر Kin مشاهده شد. بیشترین تعداد برگ نیز در محیط MS حاوی BAP به‌همراه 05/0 میلی‌گرم در لیتر IBA و محیط MS حاوی 5/2 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 05/0 میلی‌گرم در لیتر IBA مشاهده شد. بیشترین مقدار تاکسول در کالوس‌های حاصل از ریزنمونه بذر و برگ در محیط کشت MS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر 2,4-D به‌همراه 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP به‌دست آمد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of plant growth regulators on in vitro growth of hazelnut and Taxol production in the callus

نویسندگان [English]

  • Roghayeh Hazrati 1
  • Nasser Zare 2

1 University of Mohaghegh Ardebili

2 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Mohaghegh Ardabili

چکیده [English]

In this research, the effects of type and concentration of plant growth regulators (2,4-D, NAA, Kin, BAP, IBA, TDZ) on callus induction from different explants, in vitro micropropagation of hazelnut via single node explants and also amount of taxol in callus were investigated. For this, seed, leaf and stem explants surface sterilized with different treatment and cultured on MS medium containing 2,4-D or NAA (1, 2 and 4 mg/l) in combination with Kinetin and BAP (0.5 and 1 mg/l). In addition, in order to in vitro micropropagation, single node explants were prepared and cultured on MS medium containing different levels of plant growth regulators. The results indicated that the percentage of callus induction from leaf explants was significantly (p≤ 0.01) higher than that of seed and stem. The highest percentage of callus induction and fresh weight of callus was observed on MS medium containing 2 mg/l 2,4-D and 0.5 mg/l BAP. The highest percentage of root induction in single node explants of hazelnut was observed on MS medium containing 2 mg/l NAA and 0.5 mg/l Kin and the MS medium containing 2 or 4 mg/l NAA and 0.5 mg/l Kin. The highest number of leaves was obtained on MS medium containing BAP and 0.05 mg/l IBA and MS medium containing 2.5 mg/l TDZ and 0.05 mg/l IBA. The highest content of taxol was observed in the calli derived from seed and leaf explants on MS medium supplemented with 1 mg/l 2,4-D and 0.5 mg/l BAP.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Corylus avellana
  • micropropagation
  • Secondary metabolite
  • tissue culture

تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر رشد درون­شیشه­ای فندق (Corylus avellana) و تولید تاکسول در کالوس

رقیه حضرتی جهان1، ناصر زارع1*، سارا دژستان1، پریسا شیخ­زاده مصدق1 و منوچهر فرجامی­نژاد2

1 اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه زراعت و اصلاح نباتات 

2 اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، مرکز تحقیقات گیاهان دارویی

تاریخ دریافت: 17/6/94                تاریخ پذیرش: 26/4/95

چکیده

در این تحقیق، تاثیر نوع و غلظت تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی مختلف (2,4-D, NAA, Kin, BAP, IBA, TDZ) بر کالوس‌زایی ریزنمونه‌های مختلف، تکثیر درون‌شیشه‌ای فندق با استفاده از ریزنمونه گره و همچنین میزان تاکسول در کالوس مورد بررسی قرار گرفت. ریزنمونه‌های بذر، برگ و ساقه فندق پس از ضدعفونی سطحی، روی محیط کشت MS حاوی 1، 2 و 4 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و NAA در ترکیب با  Kin و BAP (5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر) کشت شدند. علاوه ‌بر این، بمنظور تکثیر درون‌شیشه‌ای، ریزنمونه‌های تک ‌گره فندق تهیه شده و روی محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی کشت شدند. نتایج نشان داد که درصد کالوس­زایی ریزنمونه برگ بطور معنی­داری بیشتر از بذر و ساقه است. بیشترین درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس در محیط­ MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. در ریزنمونه‌های تک گره فندق بیشترین درصد ریشه­زایی در محیط MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin و در محیط MS حاوی چهار میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده شد. بیشترین تعداد برگ نیز در محیط MS حاوی BAP به­همراه 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA و محیط MS حاوی 5/2 میلی­گرم در لیتر TDZ و 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA مشاهده شد. بیشترین مقدار تاکسول در کالوس­های حاصل از ریزنمونه بذر و برگ در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D به­همراه 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به­دست آمد.

واژه های کلیدی: ریزازدیادی، کشت بافت، متابولیت ثانویه، Corylus avellana 

* نویسنده مسئول: 33510140-045، پست الکترونیکی:   nzare@uma.ac.ir

مقدمه


فندق با نام علمی Corylus avellana متعلق به راسته فاگالیس (Fagales) از خانواده غان (Betulaceae) و از زیرخانواده کوریلوئیده (Coryluideae) می­باشد (12). فندق با سطح پلوئیدی 22=x2=n2 درختچه­ای خزان­کننده، تک پایه و خودناسازگار است و کشورهای ترکیه، ایتالیا و اسپانیا از جمله کشورهای تولیدکننده عمده آن هستند (23). فندق یکی از مهم­ترین محصولات آجیلی در جهان (8) و منبع غنی از انرژی و حاوی 60-40 درصد لیپید می­باشد که به­خاطر روغن زیاد، اسیدهای چرب ضروری، استرول­ها، آنتی­­اکسیدان­ها، مواد معدنی و داشتن ویتامین E در جلوگیری از بیماری­های دیابت و سرطان موثر است (9). همچنین در تحقیقات انجام گرفته وجود ماده تاکسول در برگ­ها و پوسته فندق و همچنین کشت سلولی فندق ثابت شد (5، 7، 16، 27). تاکسول یک ماده ضدسرطان بسیار موثر است که برای درمان انواع سرطان­ها به­­کار گرفته شده (36) و برای اولین بار از پوست درخت سرخدار (Taxus baccata) استخراج شده است. به­علت ارزش اقتصادی بالای تاکسول، کمبود درخت سرخدار، هزینه بالای سنتز آن و به­دلیل تقاضای رو به رشد برای این دارو، منابع طبیعی دیگری مانند فندق جهت تولید این ترکیب مورد بررسی قرار گرفته­ است (7). امروزه با شناخت بهتر این گیاه، کاربردهای ویژه­ای در صنعت و پزشکی برای آن در نظر گرفته شده است تا جایی که از آن در بیودیزل، بیوپلاستیک، درمان سرطان و غیره استفاده می­گردد (15).

اولین گام در دستیابی به متابولیت ثانویه، تولید گیاه مناسب و به­مقدار کافی است که نیازمند زمان و هزینه بالا می­باشد. تکثیر در شرایط درون­شیشه­ای زمان دستیابی به تعداد زیاد گیاه با ژنوتیپ یکسان را کوتاه­تر می­کند و همچنین تولید متابولیت ثانویه در کشت درون­شیشه­ای نسبت به استخراج آن از گیاهان موجود در طبیعت دارای بهره­وری بیشتری است (34). استخراج متابولیت ثانویه موردنظر از کالوس نسبت به استخراج آن از گیاه کامل باصرفه­تر و مفیدتر است (25). کالوس توده سلولی گیاهی است که از سازمان­یافتگی کمی برخوردار بوده و در اثر زخم‌ در بافت‌ها و اندام­های تمایزیافته به­وجود می‌آید. ژنوتیپ گیاه، نوع ریزنمونه، نوع و غلظت تنظیم­­کننده­های رشد گیاهی از عوامل مهمی هستند که تشکیل کالوس در محیط کشت را تحت تاثیر قرار می­دهند. غلظت تنظیم­­کننده­های رشد گیاهی برای هر گونه گیاهی متفاوت است و بستگی به منبع ریزنمونه یا گیاه موردنظر دارد (2 و 3).

هافمن و همکاران (15) تاکسول و تاکسان­های مربوط به آن را در شاخه، ساقه و برگ گیاه فندق شناسائی و گزارش کرده اند. تحقیقات بعدی نشان داده­اند که گیاه فندق و کشت سلولی آن نیز ترکیبات تاکسان از جمله تاکسول تولید می­کند (7 و 16). بستوسو و همکاران (7) با کشت جدا­کشت­های مختلف از فندق و تولید کالوس تحت تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف از نظر غلظت و ترکیبات، تولید کالوس جهت ایجاد کشت سلولی را بررسی کردند و سطوح تاکسول به­دست آمده از کشت فندق را مشابه کشت سرخدار قابل ملاحظه دانستند. آن­ها نتیجه گرفتند که فندق نیز دارای آنزیم­هایی برای تولید تاکسول است که تا­ به ­حال به­عنوان مسیر منحصر به­فرد جنس سرخدار در نظر گرفته می­شد. رضایی و همکاران (5) جهت القا و تولید کالوس از بذرهای تازه فندق، از محیط MS حاوی تنظیم­کننده­های رشد 2¸4-D و BAP به ترتیب با غلظت­های 1 و 5/0 میلی­گرم در لیتر استفاده کردند. ایشان از کالوس نرم تولید شده برای تهیه کشت سوسپانسیون در محیط کشت MS با ترکیبات تنظیم­کننده­های رشد گیاهی ذکرشده استفاده کرده و گزارش نمودند که تولید و آزادسازی تاکسول تحت تاثیر محرک‌ها قرار می‌گیرد (5 و 27).

در کشت بافت درختان مشکلاتی وجود دارد که در کشت بافت گیاهان علفی از اهمیت چندانی برخوردار نیست. به­عنوان مثال، در تهیه ریزنمونه از درختی مانند فندق در اغلب موارد باید از درختان باغی یا جنگلی استفاده کرد. به­دلیل اینکه شرایط آب و هوایی قابل کنترل نیست، اختلافات آب و هوایی در زمان­های متفاوت نمونه­گیری باعث می­گردد که ریزنمونه­های انتخاب­شده از درختان در زمان­های متفاوت، واکنش­های فیزیولوژیکی متفاوتی را در کشت بافت نشان دهند. این امر باعث بروز مشکلاتی در پاسخ کشت بافتی می­گردد (6). میزان بالای آلودگی میکروبی از عوامل اصلی دیگر محدود­کننده موفقیت در کشت بافت درختان است.آلودگی مواد گیاهی (ریزنمونه) در کنار قابلیت کم ریخت‌زایی از محدودیت‌های عمده ریزازدیادی درون­‌شیشه‌ای فندق می­باشد. بطوریکه گزارش­شده حدود 95 درصد ریزنمونه‌های جمع‌آوری­شده از باغ­ها یا رویشگاه‌های طبیعی احتمال آلودگی دارند (10). بنابراین، یکی از مهم­ترین جنبه­های کشت بافت گونه­های چندساله انتخاب ریزنمونه و ضدعفونی آن­ها و به­دست آوردن ریزنمونه‌ها و کشت‌های بدون آلودگی و در حال رشد است (6).

با توجه به کمبود مطالعه در مورد کشت بافت فندق بومی جنگل فندقلو، این پژوهش به­منظور بررسی تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و غلظت­های مختلف آن­ها بر کالوس­زایی ریزنمونه­های مختلف فندق و همچنین مقدار تولید تاکسول در کالوس انجام گرفت. علاوه ­بر این، تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر ریزازدیادی درون­شیشه­ای فندق با استفاده از ریزنمونه تک گره مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی: در این پژوهش، سرشاخه­های حاوی برگ و ساقه رشد سالانه گیاه فندق که جوان و در حال رشد بودند، از اواسط بهار تا اواخر تابستان و بذور رسیده و تازه فندق نیز در اواسط تابستان از جنگل فندقلو (رویشگاه جنگلی فندقلو مستقر روی تپه­ای به­نام آرپاتپه در فاصله 25 کیلومتری شهرستان اردبیل و 10 کیلومتری جنوب شهر نمین در خط­الراس گردنه حیران جنب روستای فندقلو قرار گرفته است) جمع­آوری گردید.

ضدعفونی نمونه­های گیاهی: نمونه­های گیاهی به­مدت پنج دقیقه با مایع ظرفشویی شستشو شده و 20 دقیقه آبشویی شدند و پس از یک دقیقه غوطه­ورسازی در الکل 96 درصد، به­مدت 20 دقیقه با هیپوکلریت سدیم ضدعفونی گردیدند و در نهایت سه بار با آب استریل شستشو شدند. به­منظور تعیین غلظت مناسب هیپوکلریت سدیم برای ضدعفونی سطحی ریزنمونه‌های مختلف (برگ، ساقه و بذر)، غلظت‌های 1، 5/2 و 5 درصد هیپوکلریت سدیم مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه غلظت‌های مختلف هیپوکلریت سدیم از محلول وایتکس خانگی (حاوی 5 درصد هیپوکلریت سدیم فعال) استفاده شد. 

تهیه ریزنمونه و کشت آن­ها: برگ­ها و ساقه­ها به قطعات 5/0 تا 1 سانتی­متری برش داده شده و به­عنوان ریزنمونه روی محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی­­ طبق جدول 1 برای تولید کالوس کشت شدند. کشت­ها در اتاقک رشد در شرایط تاریکی و دمای 2±24 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. حدود 6 هفته پس از کشت، درصد کالوس­زایی و میزان رشد کالوس­ها (وزن تر کالوس) اندازه­گیری شدند.

جدول 1- تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی استفاده ­شده در کالوس­زایی ریز نمونه های بذر، برگ و ساقه فندق

شماره محیط کشت

2,4-D (mg/l)

NAA

 (mg/l)

Kin

(mg/l)

BAP

 (mg/l)

1

1

-

5/0

-

2

1

-

1

-

3

1

-

-

5/0

4

1

-

-

1

5

2

-

5/0

-

6

2

-

1

-

7

2

-

-

5/0

8

2

-

-

1

9

4

-

5/0

-

10

4

-

1

-

11

4

-

-

5/0

12

4

-

-

1

13

-

1

5/0

-

14

-

1

1

-

15

-

1

-

5/0

16

-

1

-

1

17

-

2

5/0

-

18

-

2

1

-

19

-

2

-

5/0

20

-

2

-

1

21

-

4

5/0

-

22

-

4

1

-

23

-

4

-

5/0

24

-

4

-

1

25

-

-

-

-

برای تهیه ریزنمونه بذری، بذور تهیه شده از جنگل فندقلو ضدعفونی­شده به چهار قسمت تقسیم و در محیط کشت MS حاوی تنظیم­کننده­های رشد گیاهی طبق جدول 1 کشت گردید. پس از گذشت 4 تا 5 هفته صفات درصد کالوس­زایی، ریشه­دهی، ساقه­دهی و وزن تر کالوس­ یادداشت شدند.

باززایی: به­منظور بررسی امکان باززایی درون­شیشه­ای، کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های بذر، برگ و ساقه که در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP رشد کرده بودند به محیط­های MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP، MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر BAP، و MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر Kin منتقل شدند و در اتاقک رشد با 16 ساعت روشنایی با شدت نور 1500 تا 2000 لوکس و 8 ساعت تاریکی در دمای 2  ±24 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند.

تکثیر درون­شیشه­ای ریزنمونه­های تک گره فندق: بذرهای رسیده فندق پس از ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم 5 درصد روی محیط کشت MS جامد کشت شدند. پس از جوانه­زنی و رشد گیاهچه‌ها، ریزنمونه­های تک گره تهیه شده و روی محیط کشت MS حاوی تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی NAA، IBA و TDZ، BAP و Kin کشت شدند (جدول 2). کشت­ها در اتاقک رشد با 16 ساعت روشنایی با شدت نور 1500 تا 2000 لوکس و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±24 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. صفات رشدی شامل تعداد برگ تازه رشد کرده و ریشه‌زایی ریزنمونه‌ها حدود 4 هفته پس از کشت یادداشت شدند.


جدول 2- تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی استفاده ­شده در تکثیر درون­شیشه­ای ریزنمونه­های تک­گره فندق

شماره محیط کشت

NAA (mg/l)

Kin

 (mg/l)

BAP (mg/l)

IBA

 (mg/l)

TDZ

 (mg/l)

1

4

1

-

-

-

2

2

1

-

-

-

3

2

5/0

-

-

-

4

4

5/0

-

-

-

5

1

5/0

-

-

-

6

-

-

-

05/0

-

7

-

-

5/2

05/0

-

8

-

-

5

05/0

-

9

-

-

5/7

05/0

-

10

-

-

-

05/0

5/2

11

-

-

-

05/0

5

12

-

-

-

05/0

5/7

13

-

-

-

3

-

14

-

-

2

-

-

15

-

-

-

-

1/0

16

-

-

-

-

-


استخراج تاکسول و اندازه­گیری آن با استفاده از HPLC: بمنظور بررسی میزان تاکسول در بافت کالوس حاصل از ریزنمونه­های مختلف، از کالوس­های رشدکرده در محیط کشت­های MS حاوی تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی مختلف (جدول 3) تاکسول استخراج و اندازه­گیری شد. عصاره­گیری مطابق روش خسروشاهی و همکاران (17) انجام شد. 10 میلی­لیتر متانول به 5/0 گرم کالوس وزن ­شده اضافه­ شده و 3-2 دقیقه در هاون له گردید و به­مدت 40 دقیقه تحت امواج فراصوت به­طور کامل لیز شد. سپس از فیلتر 22/0 میکرومتر عبور داده شد و در آون و در دمای 45 درجه سانتی­گراد تغلیظ شد. عصاره تغلیظ ­شده در دو میلی­لیتر متانول فیلتر­شده حل گردید. برای اندازه­گیری میزان تاکسول از دستگاه HPLC (Agilent HPLC system 1200 Series, Diode Array Detector) و ستون
 (Eclipse XDB-C18, 5mm, 4.6-150 mm) استفاده شد. فاز متحرک شامل ترکیب استونیتریل و آب به نسبت 60 به 40 بود که با شدت جریان یک میلی­لیتر در دقیقه از ستون عبور می‍کرد. میزان تاکسول هر نمونه، با استفاده از شناساگر در طول موج 227 نانومتر و مقایسه با استاندارد تاکسول (شرکت Sigma) اندازه­گیری شد.

جدول 3- تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی در محیط کشت­ برای ریزنمونه‌های کالوس مورد استفاده برای بررسی محتوای تاکسول

شماره محیط کشت

تنظیم کننده­های رشد گیاهی

ریزنمونه

2,4-D

Kin

BAP

1

1

5/0

-

بذر

2

2

-

1

ساقه

3

1

-

5/0

بذر

4

2

-

5/0

بذر

5

1

-

5/0

برگ

6

4

5/0

-

بذر

طرح آزمایشی و تجزیه و تحلیل آماری: آزمایش­های مربوط به تیمارهای ضدعفونی، کالوس­زایی و باززایی به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام گرفت. تکثیر درون­شیشه­ای و اندازه­گیری تاکسول به­صورت طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم­افزار19  SPSS و مقایسه میانگین با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.

نتایج

تعیین روش مناسب ضدعفونی ریزنمونه­ها: اثر غلظت‌های مختلف هیپوکلریت سدیم و نوع ریزنمونه بر ریزنمونه دارای آلودگی قارچی، درصد ریزنمونه­های زنده غیرآلوده، درصد ریزنمونه­های قهوه­ای شده و برهمکنش آنها بر ریزنمونه دارای آلودگی قارچی و درصد ریزنمونه­های قهوه­ای­شده در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود (جدول 4).

نتایج حاصل از مقایسه میانگین نشان داد که درصد آلودگی قارچی در ریزنمونه­های برگ و ساقه بطور معنی­داری بیشتر از ریزنمونه بذری بوده و از طرف دیگر درصد ریزنمونه­های زنده غیرآلوده بذری بطور معنی­داری بیشتر از ریزنمونه­های برگ و ساقه بود (جدول 5).


جدول 4- تجزیه واریانس تاثیر تیمارهای مختلف ضدعفونی بر میزان آلودگی و پاسخ رشدی ریزنمونه­­های فندق

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

ریزنمونه دارای آلودگی قارچی

ریزنمونه زنده و غیرآلوده

ریزنمونه قهوه­ای­شده

تیمار ضدعفونی

2

**24/11848

**06/2863

**513/64

ریزنمونه

2

**21/1141

**9/3243

**744/5

تیمار ضدعفونی × ریزنمونه

4

**5/282

ns47/34

**010/1

خطا

18

62/25

502/113

161/0

ضریب تغییر (درصد)

-

7/10

64/32

16/6

         **: معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد؛ ns: غیرمعنی­دار


بیشترین درصد ریزنمونه­های زنده غیرآلوده در ریزنمونه بذر و ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (33/68 درصد)، و همچنین هیپوکلریت سدیم 5 درصد (33/58 درصد) مشاهده شد. بیشترین درصد آلودگی قارچی (100 درصد و 97 درصد) و همچنین کمترین ریزنمونه­های زنده و غیرآلوده (صفر درصد و 33/3 درصد) در ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 1 درصد و بترتیب در ریزنمونه­های برگ و ساقه مشاهده شد. کمترین درصد آلودگی قارچی در تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5 درصد و بترتیب در ریزنمونه بذر (66/11 درصد) و ساقه (33/13 درصد) مشاهده شد. بیشترین ریزنمونه­های قهوه­ای­شده در تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5 درصد و بترتیب در ریزنمونه­های برگ (66/57 درصد) و ساقه (50 درصد) به­دست آمد (جدول 5).


جدول 5- اثر غلظت هیپوکلریت سدیم بر درصد ریزنمونه­های زنده و غیرآلوده، قهوه­ای­شده و دارای آلودگی قارچی در تیمارهای ضدعفونی مختلف ریزنمونه­های فندق در شرایط درون شیشه­ای

تیمار ضدعفونی

نوع ریزنمونه

ریزنمونه دارای آلودگی قارچی

(درصد)

ریزنمونه زنده و غیرآلوده

(درصد)

ریزنمونه قهوه­ای­شده

(درصد)

هیپوکلریت سدیم 5 درصد

بذر

 g66/11

ab33/58

 b00/30

برگ

 ef66/21

 de66/20

 a66/57

ساقه

 fg33/13

 cd66/36

 a00/50

هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد

بذر

 e33/27

a33/68

 c33/4

برگ

 d00/40

 cd89/29

 b11/30

ساقه

 c13/51

 bc2/42

 c66/6

هیپوکلریت سدیم 1 درصد

بذر

 b88/63

 cd44/34

 c66/1

برگ

 a00/100

 f00/0

 c00/0

ساقه

 a00/97

 ef33/3

 c00/0

      میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5% اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند


کالوس­زایی: کالوس­زایی ریزنمونه­های مختلف تحت تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف (2,4-D، NAA، Kin و BAP) مورد بررسی قرار گرفت. در اکثر محیط­های کشت ریزنمونه­های برگ و ساقه بعد از گذشت 3 تا 4 هفته و ریزنمونه­های بذر بعد از گذشت 10 تا 15 روز، شروع به آماس و تولید کالوس (معمولاً از ناحیه برشی) نمودند (شکل 1). نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها (جدول 6) نشان داد که تاثیر ترکیبات تنظیم­کننده­های رشد گیاهی، نوع ریزنمونه و اثر متقابل بین آن­ها بر درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار است. به­طور کلی درصد کالوس­زایی ریز نمونه برگ و ساقه بیشتر از ریزنمونه بذر بود، درحالی­که وزن تر کالوس در ریزنمونه بذر بیشتر از ریزنمونه­های برگ و ساقه بود (جدول 7). نتایج حاصل از مقایسه میانگین (جدول 7) نشان داد که درصد کالوس­زایی ریزنمونه بذر در محیط­های دارای 2,4-D بطور معنی­داری بیشتر از محیط­های دارای NAA بود. بطوریکه بیشترین درصد کالوس­زایی (100 درصد) در محیط­ MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin، محیط­ MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP، محیط­ MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر Kin، محیط­ MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP، محیط­ MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیترBAP  و محیط­ MS حاوی چهار میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. بیشترین وزن تر کالوس (48/2، 68/2 و 59/2 گرم) در ریزنمونه بذر و محیط­­هایMS  حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin، محیط­ MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و محیط­ MS حاوی چهار میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده شد (جدول 7).

در اغلب مطالعات از وزن تر کالوس به­عنوان شاخصی برای اندازه­گیری میزان رشد کالوس استفاده می­شود. در ریزنمونه برگ بیشترین عملکرد (وزن تر) کالوس (522/0 و 41/0 گرم) بترتیب در محیط­ MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D در ترکیب با 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP یا 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin ولی در ریزنمونه ساقه (675/0 گرم) در محیط MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید (جدول 7).


 

 

ه

 

ج

 

د

 

ب

 

الف

 

ز

 

ط

 

ح

 

و 

 

شکل 1- کالوس­زایی درون­شیشه­ای فندق؛ الف) شروع کالوس­زایی ریزنمونه­های بذر در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP، 10 روز پس از کشت؛ ب) کالوس ایجاد شده در محل­های برش ریزنمونه بذر دو هفته پس از کشت در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP؛ ج) کالوس­های حاصل از ریزنمونه بذر در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin، سه هفته پس از کشت؛ د) شروع کالوس­زایی ریزنمونه ساقه در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP سه هفته پس از کشت؛ ه و و) کالوس­های حاصل از ریزنمونه ساقه در محیط MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر BAP؛ ز) شروع کالوس­زایی ریزنمونه برگ در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP؛ ح و ط) کالوس­های حاصل از ریزنمونه برگ در محیط MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP.

 

جدول 6- تجزیه واریانس درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس ریزنمونه­های فندق تحت تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد کالوس­زایی

وزن تر کالوس

تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی

24

**454/3763

**708/12

نوع ریزنمونه

2

**222/11976

**343/191

تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی × نوع ریزنمونه

48

**634/1160

**396/7

خطا

150

463/513

039/0

ضریب تغییر (درصد)

-

36/28

1/6

                    ** : معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد

جدول 7- اثر نوع ریزنمونه و تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی بر درصد کالوس­زایی، وزن تر کالوس و درصد ریشه­زایی ریزنمونه های بذر، برگ و ساقه

ریزنمونه

تنظیم­کننده‌ رشد گیاهی (mg/l)

درصد کالوس­زایی

وزن ترکالوس(gr)

درصد ریشه­زایی

2,4-D

NAA

Kin

BAP

بذر

1

-

5/0

-

a100

48/2

-

1

-

1

-

ab66/91

529/1

-

1

-

-

5/0

a100

04/2

-

1

-

-

1

abcdef10/61

67/0

-

2

-

5/0

-

abcd66/71

765/0

-

2

-

1

-

a100

584/0

-

2

-

-

5/0

a100

681/2

-

2

-

-

1

a100

466/1

-

4

-

5/0

-

abcd77/77

594/2

-

4

-

1

-

abc88/88

01/2

-

4

-

-

5/0

abc88/88

287/1

-

4

-

-

1

a100

466/1

-

-

1

5/0

-

efgh25

359/0

-

-

1

1

-

gh33/8

026/0

-

-

1

-

5/0

abcd22/72

3/0

-

-

1

-

1

bcdefg33/83

045/0

-

-

2

5/0

-

efgh22/22

088/0

-

 

-

2

1

-

cdefg44/44

829/0

-

 

-

2

-

5/0

abcde66/66

187/0

-

 

-

2

-

1

bcdefg50

266/0

-

 

-

4

5/0

-

cdefg44/44

226/0

-

 

-

4

1

-

abcd66/86

22/1

-

 

-

4

-

5/0

efgh55/55

866/0

-

 

-

4

-

1

abcdef11/61

619/0

-

 

-

-

-

-

fgh66/16

003/0

-

 

1

-

5/0

-

a100

41/0

-

 

1

-

1

-

a100

276/0

-

 

1

-

-

5/0

a100

522/0

-

 

1

-

-

1

a100

363/0

-

برگ

2

-

5/0

-

100a

126/0

-

 

2

-

1

-

 a100

 193/0

-

 

2

-

-

5/0

 ab66/91

 136/0

-

 

2

-

-

1

 a100

 341/0

-

 

4

-

5/0

-

 a100

 247/0

-

 

4

-

1

-

ab44/94

154/0

-

 

4

-

-

5/0

abc88/88

286/0

-

 

4

-

-

1

abcde66/66

215/0

-

 

-

1

5/0

-

 a100

 153/0

20

 

-

1

1

-

 a100

 069/0

20

 

-

1

-

5/0

 abcd95/80

 119/0

-

 

-

1

-

1

abcde 66/66

 136/0

-

برگ

-

2

5/0

-

 a100

 208/0

-

 

-

2

1

-

 a100

 146/0

40

 

-

2

-

5/0

 abc88/88

 314/0

-

 

-

2

-

1

 abc88/88

 11/0

-

 

-

4

5/0

-

 a100

 37/0

-

 

-

4

1

-

 a100

375/0

66/16

 

-

4

-

5/0

 a100

 133/0

-

 

-

4

-

1

 a100

 156/0

-

 

-

-

-

-

h 0

0

-

 

1

-

5/0

-

a100

138/0

-

 

1

-

1

-

a100

086/0

-

 

1

-

-

5/0

100a

115/0

-

 

1

-

-

1

a100

063/0

-

 

2

-

5/0

-

ab66/91

129/0

-

 

2

-

1

-

a100

058/0

-

 

2

-

-

5/0

a100

112/0

-

 

2

-

-

1

a100

675/0

-

 

4

-

5/0

-

a100

12/0

-

 

4

-

1

-

bcdefg 07/49

214/0

-

 

4

-

-

5/0

 abc88/88

 125/0

-

ساقه

4

-

-

1

 abcdef55

 108/0

-

 

-

1

5/0

-

 a100

 095/0

-

 

-

1

1

-

 abcdef33/58

12/0

-

 

-

1

-

5/0

 abcde66/66

 1/0

-

 

-

1

-

1

 a100

 056/0

-

 

-

2

5/0

-

 defgh66/41

 048/0

-

 

-

2

1

-

 a100

 133/0

-

 

-

2

-

5/0

 abcd33/83

 144/0

-

 

-

2

-

1

 abcd55/55

 11/0

-

 

-

4

5/0

-

 abcd33/83

 241/0

-

 

-

4

1

-

 a100

 112/0

-

 

-

4

-

5/0

 a100

 119/0

-

 

-

4

-

1

 a100

 108/0

-

 

-

-

-

-

 h0

 0

-

 

LSD

 

 

 

 

316/0

 

   میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5% اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند


در آزمایش کالوس­زایی در برخی از تیمارها ریشه­زایی نابجا از ریزنمونه برگ مشاهده شد (شکل 2). از جمله این تیمارها می­توان به محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin، یک میلی­گرم در لیتر  NAAو یک میلی­گرم در لیتر Kin، دو میلی­گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر Kin، چهار میلی­گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر Kin که بترتیب 20 درصد، 20 درصد، 40 درصد و 66/16 درصد ریشه­زایی نابجا در آن­ها مشاهده شد، اشاره نمود (جدول 7). این نتایج نشان می­دهد که ترکیب تنظیم­کننده­های رشد NAA و Kin در القاء ریشه نابجا در ریزنمونه برگ موثر هستند.


 

ج

 

الف

 

ب 

 

شکل 2- ریشه­های به­وجود­آمده از ریزنمونه برگ در محیط­ MS حاوی الف) دو میلی­گرم در لیتر NAA به­همراه یک میلی­گرم در لیتر Kin؛ ب و ج) یک میلی­گرم در لیتر NAA به­همراه 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin سه هفته پس از کشت


در ریزنمونه­های بذری در برخی از محیط­های کشت به­جای تولید کالوس یا علاوه­بر آن، ساقه یا ریشه و یا هر دو رشد کردند (شکل 3). نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 8) نشان داد که بین تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف از نظر ساقه­دهی و ریشه­دهی ریزنمونه بذری اختلاف معنی­داری در سطح احتمال یک درصد وجود دارد.


 

الف

 

ب 

 

شکل 3- ریشه­دهی و ساقه­دهی درون­شیشه­ای ریزنمونه بذری فندق. الف) ساقه­دهی در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر BAP؛ ب) ریشه­دهی در محیط کشت MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP 10 روز پس از کشت.

جدول 8- تجزیه واریانس ساقه­دهی و ریشه­دهی ریزنمونه بذری در تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

ساقه­دهی

ریشه­دهی

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی

24

**369/0

**207/1

خطا

50

145/0

065/0

ضریب تغییر (درصد)

-

45/51

37/22

**: معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد


در محیط کشت­های حاوی 2,4-D، به­جز محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر Kin رشد ریشه‌زایی مشاهده نشد ولی در تمام محیط­های حاوی NAA ریشه­دهی مشاهده گردید که بیشترین آن (100 درصد) در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر BAP و محیط کشت MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و همچنین 66/91 درصد در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin به­دست آمد (شکل 4).


 

شکل 4- ساقه­دهی و ریشه­دهی ریزنمونه بذری فندق در شرایط درون­شیشه­ای در تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف (میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند)


ساقه­دهی در مقایسه با کالوس­زایی و ریشه­دهی با درصد کمی در محیط­های حاوی  NAAمشاهده شد. بیشترین میزان ساقه­دهی (100 درصد) در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. در محیط MS فاقد تنظیم­کننده رشد گیاهی (شاهد) نیز 66/16 درصد ریشه­دهی و ساقه­دهی مشاهده شد (شکل 4). می­توان گفت  NAAبا تحریک بهتر و موثر در مرحله القای ریشه باعث رشد بهتر آن­ها در مرحله رشد ریشه می­گردد. علت این اثر مثبت NAA بر ریشه­دهی را می­توان به تاثیر آن در تحریک تقسیم اولین سلول آغازگر ریشه مربوط دانست (18). 

باززایی: در کالوس­های منتقل­شده به محیط­های کشت فاقد اکسین و دارای سایتوکینین در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر  BAPاشکال متورمی (شبیه به ساختارهای پیش­جنینی) تشکیل و مشاهده شد (شکل 5) ولی تولید جنین سوماتیکی، اندام ساقه یا ریشه در آن صورت نگرفت.


 

ب

 

ج

 

الف 

 

شکل 5- تشکیل ساختارهای کروی شکل شبه پیش­جنینی روی کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های بذر (الف)، برگ (ب)، ساقه فندق (ج) پس از انتقال به محیط MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP 


نتایج حاصل از مقایسه میانگین (شکل 6) نشان داد که بیشترین رشد کالوس و در نتیجه وزن تر کالوس (2/1 گرم) در ریزنمونه بذر و محیط کشت MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر BAP و کمترین وزن تر کالوس (584/0 و 595/0 گرم) بترتیب در ریزنمونه برگ در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و ریزنمونه ساقه در محیط کشت MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر Kin وجود دارد.


 

شکل 6- رشد کالوس حاصل از ریزنمونه­های مختلف فندق پس از انتقال به محیط­های فاقد اکسین (میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند)


تکثیر درون­شیشه­ای: پس از آن که ریزنمونه­های تک گره در محیط­های دارای ترکیبات تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مورد نظر برای رشد و تکثیر قرار گرفتند، پاسخ­های رشدی متفاوتی ایجاد نمودند. بطوریکه برخی ریشه و برخی ساقه و برگ تولید کردند و یا هر دو را نشان دادند (شکل 7). نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها (جدول 9) نشان داد که بین ترکیبات تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف از نظر درصد ریشه­زایی و تعداد برگ رشدکرده اختلاف معنی­دار وجود دارد. گیاهچه‌های دارای رشد طولی بیش از 5 سانتی‌متر و حاوی برگ‌های کاملا توسعه یافته، از محیط درون­شیشه­ای خارج شده و پس از انتقال به گلدان مرحله­ی سازگاردهی با محیط طبیعی صورت گرفت (شکل 7- ه).


 

شکل 7- رشد درون­شیشه­ای ریزنمونه­های تک گره فندق. الف و ب) ریشه­دهی و رشد ریشه در ریزنمونه­های کشت­شده روی محیط MS حاوی دو میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin؛ ج و د) رشد ساقه و تولید برگ­های تازه در ریزنمونه­های کشت­شده روی محیط MS حاوی پنج میلی­گرم در لیتر BAP و 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA؛ ه) گیاهچه انتقال­یافته به شرایط گلخانه­ای پس از سازگارسازی.

جدول 9- میانگین مربعات شاخص­های رشدی اندازه­گیری­شده ریزنمونه­های تک گره فندق در محیط­های حاوی تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

تعداد برگ

درصد ریشه­دهی

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی

15

**54/3

**410/1480

خطا

32

521/0

240/94

ضریب تغییر (درصد)

-

19/46

24/46

** : معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد


بیشترین درصد ریشه­زایی (22/72 درصد و 55/55 درصد) بترتیب در محیط کشت MS حاوی دو یا چهار میلی­گرم در لیتر NAA و در ترکیب با 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده شد. در حالیکه در محیط­های کشت حاوی TDZ به­تنهایی یا در ترکیب با IBA و محیط­های کشت حاوی BAP (دو میلی­گرم در لیتر) و IBA (سه میلی­گرم در لیتر) به تنهایی هیچ گونه ریشه­زایی مشاهده نشد. در محیط بدون تنظیم­کننده رشد تنها 66/6 درصد ریشه­زایی مشاهده شد. در بین سایتوکنین­های به­کار­رفته تاثیر Kin بر ریشه­زایی بطور معنی­داری بیشتر از BAP و TDZ بود (شکل 8).


 

شکل 8- میانگین درصد ریشه­زایی ریزنمونه­های تک گره­ فندق در تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف (میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند)


بیشترین تعداد برگ تازه­ رشد کرده در محیط MS حاوی 5/2، 5 و 5/7 میلی­گرم در لیتر BAP به­همراه 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA و محیط MS حاوی 5/2 میلی­گرم در لیتر TDZ و 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA به­دست آمد. در محیط MS حاوی 05/0 میلی­گرم در لیتر IBA و محیط MS بدون تنظیم­کننده رشد هیچ برگ تازه­ای رشد نکرد (شکل 9). با افزایش غلظت TDZ از 5/2 میلی­گرم در لیتر به 5 و 5/7 میلی­گرم در لیتر رشد ساقه و تعداد برگ­ها بطور معنی­داری کاهش یافته است. در حالیکه در محیط کشت­های حاوی BAP با افزایش غلظت از 5/2 میلی­گرم در لیتر به 5 و 5/7 میلی­گرم در لیتر تعداد برگ­های تازه رشدکرده افزایش یافت، هر چند که این افزایش از نظر آماری معنی­دار نبود (شکل 9).


 

شکل 9- میانگین تعداد برگ تازه رشد کرده از ریزنمونه­های تک­گره­ فندق در تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف (میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند)


اندازه­گیری تاکسول: نتایج تجزیه واریانس نشان داد (جدول 10) که بین تیمارهای مورد بررسی از نظر میزان تاکسول در سطح احتمال یک درصد اختلاف معنی­داری وجود دارد.

جدول 10- تجزیه واریانس مقدار تاکسول در ریزنمونه­ها و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

تیمار

5

**392/7

خطا

6

642/0

ضریب تغییر (درصد)

 

53/14

** : معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد

بطوریکه بیشترین مقدار تاکسول با مقادیر 92/7 و 29/7 میلی­گرم در لیتر و عملکرد ویژه 68/31 و 16/29 میکروگرم در گرم وزن تر کالوس بترتیب در کالوس­های حاصل از ریزنمونه بذر و برگ در محیط کشت MS حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4-D به­همراه 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به­دست آمد. کمترین مقدار تاکسول (با میانگین 97/2 میلی­گرم در لیتر و عملکرد ویژه 88/11 میکروگرم در گرم وزن تر کالوس) نیز در کالوس حاصل از ریزنمونه بذر روی محیط کشت MS حاوی 4 میلی­گرم در لیتر 2,4-D به­همراه 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin مشاهده شد (جدول 11).


جدول 11- میانگین تاکسول به­دست­آمده در  عصاره ریزنمونه­ها، در حضور تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف محیط کشت

شماره محیط کشت

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی

ریزنمونه

غلظت تاکسول

 (میلی­گرم در لیتر)

عملکرد ویژه

 (میکروگرم در گرم کالوس)

2,4-D

Kin

BAP

1

1

5/0

-

بذر

 bc91/4

 bc64/19

2

2

-

1

ساقه

 b15/5

 b6/20

3

1

-

5/0

بذر

 a92/7

 a68/31

4

2

-

5/0

بذر

 bc86/3

 bc44/15

5

1

-

5/0

برگ

 a29/7

 a16/29

6

4

5/0

-

بذر

 c97/2

 c88/11

میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5% اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند


بحث

نتایج ضدعفونی ریزنمونه­های مختلف نشان داد که برای حصول نتیجه مطلوب بسته به ریزنمونه مورد استفاده بهتر است غلظت‌های بهینه هیپوکلریت سدیم استفاده شود. بطوریکه در ریزنمونه برگ و ساقه هرچند در ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5 درصد، درصد ریزنمونه­های دارای آلودگی قارچی کمتر است ولی با توجه به بافت حساس­تر آن­ها این تیمار باعث ایجاد سوختگی و از بین رفتن ریزنمونه شده و درصد ریزنمونه­های قهوه­ای­شده بیشتر است. بنابراین ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد مناسب­تر می­باشد. در ریزنمونه بذر درصد ریزنمونه­های قهوه­ای­ شده در ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5 درصد بیشتر از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد ولی بطور معنی­داری کمتر از ریزنمونه­های برگ و ساقه بود. علاوه ­بر این، بین هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد و 5 درصد از نظر درصد ریزنمونه زنده و غیرآلوده بذر تفاوت معنی­داری وجود نداشته و درصد آلودگی قارچی در تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5 درصد بطور معنی­داری کمتر از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد بود، بنابراین تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5 درصد در ریزنمونه بذر مناسب­تر به­نظر می­رسد (جدول 5).

کالوس­زایی در ریزنمونه­های برگ و ساقه در تمام ترکیبات تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی مورد استفاده به­جز محیط MS حاوی چهار میلی­گرم در لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم در لیتر Kin با 07/49 درصد و دو میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kin با 66/41 درصد در ریزنمونه ساقه و محیط MS بدون تنظیم­کننده‌های رشد گیاهی، که در آن­ هیچ کالوس­زایی مشاهده نشد، در بقیه تیمارها درصد کالوس­زایی تفاوت معنی­داری با 100 درصد نداشت ولی از نظر عملکرد (وزن تر) کالوس تفاوت زیادی بین تیمارها وجود داشت (جدول 7). تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مورد استفاده یکی از عوامل بسیار مهم است که کالوس­زایی و رشد سلول­های گیاه در شرایط درون شیشه ای را تحت تاثیر قرار می­دهد ولی نوع و غلظت موردنیاز برای هر گیاه و یا حتی برای هر ژنوتیپ باید بهینه­سازی شود. در این تحقیق، در بین اکسین­های مورد استفاده، 2,4-D در ترکیب با Kin یا BAP در مقایسه با ترکیب NAA با این سایتوکنین­ها شرایط مساعدتری را برای القاء تقسیم و تکثیر سلول­های فندق مهیا کرد. برای تقسیم و ریخت­زایی سلول­ها و همچنین موقع انتقال سلول­ها از مرحله G1 به S و از مرحله G2 به M حضور اکسین­ها و سایتوکینین­ها لازم است. در گیاهان مختلف گزارش شده که مهم­ترین عامل در القای کالوس اکسین­ها هستند و سایتوکنین­ها این نقش را تسهیل می­نمایند. اکسین­ها با تحریک اسیدی شدن دیواره سلولی انبساط­پذیری (extensibility) آن را افزایش می­دهند. همچنین اکسین­ها رونویسی mRNAهای رمزکننده پروتئین­های دخیل در رشد سلولی را القاء می­کنند. سایتوکنین­ها نیز از طریق تنظیم تولید پروتئین­های درگیر در رشته­های دوک، به­طور مستقیم چرخه سلولی را تحت تاثیر قرار می­دهند (26، 32، 31).

ابراهیمی و همکاران (1) با هدف بررسی شرایط کالوس­زایی در فندق با استفاده از ریزنمونه­های دمبرگ و جوانه جانبی فندق، ترکیب غلظت­های مختلف 4-D،2 و BA را بررسی نموده و گزارش کردند که تمام تنظیم­کننده­های رشد گیاهی حداکثر تاثیر را روی کالوس­زایی جوانه داشتند. بیشترین وزن تر و خشک در تیمار­های 5/0 میلی گرم در لیتر 4-D،2 در ترکیب با 5/0 میلی­گرم در لیتر BA به­دست آمد. رضانژاد و طراحی (4) نیز در مطالعه کالوس زایی رز گالیکا (Rosa gallica L.) بیان کردند که نوع، غلظت ونسبت تنظیم­کننده­های رشد در تولید کالوس موثر هستند و نسبت 2 تا 3 میلی­گرم در لیتر BAP برای تحریک کالوس­زایی جداکشت­های مختلف موثر بودند. تحقیق حاضر نیز همانند نتایج مطالعات دیگر مانند گیبسون و همکاران (14) و فرنس (13) در کشت سلولی سرخدار و بستوسو و همکاران (7) در کشت سلولی فندق نشان می‌دهد که ترکیب تنظیم­کننده­های رشد گیاهی گروه اکسین‌ به­ویژه 2,4-D در تمایز‌زدایی، تحریک تقسیم و تکثیر سلولی و تولید کالوس نقش مهمی دارند و همراه با سایتوکینین‌ها از جمله BAP در تولید و رشد کالوس فندق مؤثرتر هستند.

نتایج حاصل از تکثیر درون­شیشه­ای نشان داد که حضور NAA به­همراه Kin در محیط کشت موجب تحریک ریشه­زایی می­گردد ولی تعداد برگ کمتری را ایجاد می­کنند. حضور IBA در غلظت کم در کنار غلظت بالای BAP بیشترین تاثیر را در رشد ساقه و تولید برگ تازه از ریزنمونه­های تک گره داشت. این در حالی است که در محیط کشت حاوی فقط IBA با همان غلظت هیچ برگی تولید نشده و حدود 42 درصد از ریزنمونه­ها ریشه تولید نمودند (شکل‌های 8 و 9). در محیط کشت حاوی فقط BAP به­تنهایی نیز اگرچه برگ رشد کرده ولی کمتر از هنگامی است که در ترکیب با IBA بوده است. به­نظر می­رسد IBA اثر BAP در تحریک و رشد ساقه و ایجاد برگ را تقویت می­کند. دامیانو و همکاران (10) نیز در مطالعه­ای روی رقم­های مختلف فندق در ایتالیا گزارش کردند دو میلی­گرم در لیتر BAP و 01/0 میلی­گرم در لیتر IBA برای مرحله شاخه­زایی مناسب می­باشد. همچنین پیوندی و همکاران (3) در ریزازدیادی گیاه اسطوخودوس (Lavandula vera) بیان کردند که سرعت رشد ریزنمونه­ها در محیط کشت دارای BAP  افزایش معنی­داری را نشان داده است و موجب افزایش در تعداد نوساقه­ها و جداکشت شده است. سایتوکنین­ها در تشکیل مستقیم یا غیرمستقیم شاخساره بسیار موثر هستند و معمولاً در ترکیب با اکسین­ها به­کار می­روند. تعادل بین اکسین و سایتوکنین به­طور معمول در ریخت­زایی سلول‌های گیاهی و همچنین در گیاه کامل نقش بسیار مهمی دارد (31 و 32).

تولید متابولیت­های ثانویه در سلول­های کالوس و کشت سوسپانسیون تحت تاثیر عوامل مختلفی مانند ژنوتیپ سلول­ها، ترکیب محیط کشت به­ویژه از نظر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و شرایط رشد قرار می­گیرد (2). در مطالعه حاضر، مقایسه میزان تاکسول در کالوس رشدکرده روی محیط کشت­های حاوی سطوح مختلف 2,4-D نشان می­دهد که با افزایش غلظت 2,4-D میزان تاکسول بطور معنی­داری کاهش پیدا کرد. طبق نتایج به­دست آمده به­نظر می‍رسد کالوس حاصل از محیط کشت MS حاوی BAP و غلظت­های کم 2,4-D، تاکسول بیشتری تولید می­کند. برای مثال در دو محیط کشت شماره 3 و 4 (جدول 11) مقدار BAP ثابت بوده و با افزایش غلظت 2,4-D از یک میلی­گرم در لیتر در محیط کشت شماره 3 به دو میلی­گرم در لیتر در محیط کشت شماره 4، مقدار تاکسول تقریباً به نصف کاهش یافته است. همچنین در درجه­ی بعدی در محیط­های شماره 1 و 6 که در هر دو غلظت Kin یکسان است، با افزایش غلظت 2,4-D از یک میلی­گرم در لیتر به چهار میلی­گرم در لیتر مقدار تاکسول 5/39 درصد کاهش نشان داد (جدول 11). بستوسو و همکاران (7) نشان دادند که فندق دارای آنزیم­هایی برای تولید تاکسول است که به­عنوان یک مسیر خاص فقط در جنس سرخدار در نظر گرفته می­شد و می­تواند به­عنوان منبع تجاری تولید تاکسان‌ها مورد استفاده قرار گیرد. تاثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر میزان تولید متابولیت ثانویه در مطالعات زیادی گزارش شده است. لوو و همکاران (19) در کشت سلولی Panax ginseng تعاملی مخالف بین متیل جاسمونات و 2,4-D را گزارش کردند بطوریکه اثرات بهینه وقتی به­دست آمد که این تنظیم­کننده رشد از محیط کشت حذف شد. عملکرد camptothecin در کشت­های مایع توسعه یافته از کشت­های کالوس Camptotheca acuminateکه روی محیط کشت MS حاوی 2,4-D و Kin به­وجود آمده بودند حدود 0025/0 درصد وزن خشک بود (29). وقتی کالوس­ها روی محیط MS حاوی NAA رشد کردند تجمع camptothecin به 998/0 میلی­گرم در لیتر رسید (35). در اکثر موارد غلظت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی فاکتور تعیین کننده­ای در تجمع متابولیت­های ثانویه است (11). نوع و غلظت اکسین یا سایتوکنین یا نسبت اکسین به سایتوکنین رشد سلول­های گیاهی کشت شده و تولید محصول را به­طور چشمگیری تحت تاثیر قرار می­دهد (20). در بسیاری از موارد مشاهده گردیده که تنظیم­کننده رشد گیاهی 2,4-D مانع تولید متابولیت­های ثانویه می­شود. برای مثال، حذف 2,4-D و یا جایگزینی آن با NAA یا IAA باعث افزایش تولید آنتوسیانین در کشت سوسپانسیون carota Daucus، نیکوتین در کشت سوسپانسیون Nicotiana tabacum، شیکونین در کشت سوسپانسیونPortulaca grandiflora  می­شود (28، 33، 24). با این وجود، تحریک توسط 2,4-D در بیوسنتز کارتنوئید در کشت سوسپانسیون Daucus carota و تولید آنتوسیانین در کشت کالوس Oxolis linearis گزارش شده است (22، 21). سایتوکنین­ها بسته به نوع متابولیت و گونه گیاهی اثرات متفاوتی دارند. برای مثال، Kin تولید آنتوسیانین را در کشت Haplopappus gracilus تحریک می­کند ولی مانع تولید آن در کشت سلول Populus می‍شود (22، 30).

 

1- ابراهیمی، چ، سلوکی، م، امیدی، م، فروتن، م، 1391. بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نوع ریزنمونه بر کالزایی فندق (Corylus avellana). ویژه­نامه دوازدهمین کنگره ژنتیک ایران، تهران، 5-1.

2- باقری، ع، صفاری، م، 1376. مبانی کشت بافت­های گیاهی. دانشگاه فردوسی مشهد، 406 ص.

3- پیوندی، م، کاظمی، ل، مجد، ا، 1394. تاثیر سیتوکینین­های مختلف بر ریزازدیادی گیاه اسطوخودوس (Lavandula vera)، مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 28 (2): 263-257.

4- رضانژاد، ف، طراحی، ر، 1392. اثر نور و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر کالوس­زایی و تجمع آنتوسیانین در کالوس­های حاصل از جداکشت­های مختلف در رز گالیکا (Rosa gallica L.)، مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 26 (2): 195-184.

5- رضایی، ا، قناتی، ف، بهمنش، م، 1390. افزایش تولید و آزادسازی تاکسول توسط متیل جاسمونات، امواج فراصوت و دی­بوتیل فتالات در کشت سلولی فندق، مجله زیست­شناسی گیاهی، 3 (7): 55-27.

6- فارسی، م، باقری، ع، 1383. اصول اصلاح نباتات. مشهد: انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد، صص 243-239.

 

7- Bestoso F, Ottaggio L, Armirotti A, Balbi A, Damonte G, Degan P, Mazzei M, Cavalli F, Ledda B, Miele M (2006). In vitro cell cultures obtained from different explants of Corylus avellana produce taxol and taxanes. BMC Biotechnilogy 6 (45): 1-11.

8- Carlos Bada J, Leon- Camacho M, Prieto M, Alonso L (2004). Characterization of oils of hazelnut oils from Asturias, Spain. European Journal of Lipid Science and Technology 106: 294-300.

9- Crews C, Hough P, Godward J, Brereton P, Lees M, Guiet S, Winkelmann W (2005). Study of the main constituents of some authentic hazelnut oils. Journal of Agricultural Food Chemistry 53: 4843-4852.

10- Damiano C, Catenaro E, Ginovinazzi A, Caboni E (2005). Micropropagation of hazelnut (Corylus avellana). Acta Horticulturae 686: 227-226.

11- DiCosmo F, Towers GHN (1984). Stress and secondary metabolism in cultured plant cells. In: Timmerman BN, Steelink FA, Loewus FA. Recent advances in phytochemistry,. New York: Plenum 18: 97 – 175.

12- Erdogan V, Mehlenbacher S. A (2000). Interspecific hybridization in hazelnuts. Journal of the American Society for Horticultural Science 125: 489-497.

13- Frense D (2007). Taxanes: perspectives for biotechnological production. Applied Microbiology and Biotechnology 73: 1233-1240.

14- Gibson DM, Ketchum REB, Vance NC¸ Christen AA (1993). Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific Yew). Plant Cell Reports 12: 479-482.

15- Hoffman A, Khan W, Worapong J, Strobel G, Griffin D, Arbogast B (1998). Bioprospecting for taxol in angiosperm plant extracts-using high performance liquid chromatography- Thermospray Mass Spectrometry to Detect the Anticancer Agent and its Related Metabolites in. Spectroscopy-Eugene 13(6): 22-32.

16- Hoffman A, Shahidi F (2009). Paclitaxel and other taxanes in hazelnut. Journal of Functional Foods 1: 33-37.

17- Khosroshahi A, Valizadeh M, Ghasempour A, Khosrowshahli M, Naghdibadi H, Dadpour MR, Omidi Y (2006). Improved taxol production by combhnation of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata. Cell Biology International 30: 262-269.

18- Loach K (1996). Enviromental conditions for rooting cutting: importantce, measurment and control. Acta Horticulturae 374: 632-636.

19- Lu M.B, Wong HL, Teng WL (2001). Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of Panax ginseng. Plant Cell Reports 20:674–677.

20- Mantell SH, Smith H (1984). Cultured factors that influence secondary metabolite accumulation in plant cell and tissue cultures. Plant biotechnology. Cambridge University Press 75-108.

 21 - Meyer HJ, Van Staden J (1995). The in vitro  production of a anthocyanin from callus culture of Oxalis linearis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 55-58.

22- Mok MC, Gabelman WH, Skoog F (1976). Carotenoid synthesis in tissue cultures of Daucus carota. Journal of the American Society for Horticultural Science 101: 9-442.

23- Olsen J (2003). Growing hazelnuts in the Pacific Northwest. Published by Oregon State University, Extension service 1-45.

24- Rajendran L, Ravishankar GA, Venkataraman LV, Prathiba KR (1992). Anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota L. as influenced by nutrient stress and osmoticum. Biotechnology Letters. 14: 14-707.

25- Rao SR, Ravishankar GA (2002). Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.

26- Richard D, Lescot M, Inze D, De Veylder L (2002). Effect of auxin, cytokinin, and sucrose on cell cycle gene expression in Arabidopsis thaliana cell suspension cultures. Plant Cell Tissue and Organ Culture 69: 167–176.

27- Safari M, Ghanati F, Hajnoruzi A, Rezaei A, Abdolmaleki P, Mokhtari-Dizaji M (2012). Maintenance of membrane integrity and increase of taxanes production in hazel (Corylus avellana L.) cells induced by low-intensity ultrasound. Biotechnology Letter 34: 1137-1147.

28- Sahai OP, Shuler ML (1984). Enviromental parameters influencing phenolics production by batch cultures of Nicotiana tabacum. Biotechnology and Bioengineering 26: 20-111.

29- Sakato K, Misawa M (1974). Effects of chemical and physical conditions on growth of Camptotheca acuminate cell cultures. Agricultural and biological chemistry 38: 491-497.

30- Seitz HU, Hinderer W (1988). Anthocyanins. In: Constabel F, Vasil I. Cell culture and osmotic cell genetics of plants. San Diego: Academic Press 5: 49-76.

31- Silveira V, Floh EIS, Handro W, Pedro Guerra M (2004). Effect  of  plant  growth regulators  and  levels  of  intracellular  protein,  starch  and  polyamines  in  embryogenic suspension cultures of Pinus taeda . Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76: 53-60.

32- Stals  H, Inze  D  (2001). When  plant  cells  decide  to  divide. Trends  Plant  Science 8: 359–364.

33- Tabata M, Fujita Y (1985). Production of shikonin by plant cell cultures. Biotechnology in Plant Science. Orlando: Academic Press 18-207.

34- Tripathi L, Tripathi JN (2003). Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2: 243-253.

35- Van Hengal AJ, Harkes MP, Witchers HJ, Hesselinic PGM, Buitglaar RM (1992). Characterization of callus formation and camptothecin production by cell lines of Camptotheca acuminate. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28: 11-18.

36- Woo DD, Miao SY, Pelayo JC, Woolf AS (1994). Taxol inhibits progression of congenital polycistic kidney disease. Nature 368:750-753.