نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد

2 هیات علمی دانشگاه ارومیه

3 هیات علمی

چکیده

بابونه(Matricaria chamomilla L.) ، گیاه دارویی مشهور خانواده آستراسه است که نام آن در دارونامه‌های 26 کشور ذکر شده است. تحقیق حاضر به منظور شناسایی، بهترین نوع و ترکیب تنظیم‌کننده رشد در چهار توده بومی مورد مطالعه و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون شیشه‌ای آن انجام گردید. در این آزمایش اثر دو نوع تنظیم‌کننده رشد شاملN6- Benzyl amino purine (BAP) و (TDZ) Thidiazuron در غلظت های (4/4 و 8/8 میکرومولار) در ترکیب با 2/2 میکرومولار3- Indol Acetic Acid ( IAA) بر باززایی مستقیم شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه در چهار توده بابونه آلمانی اصفهان، ارومیه، اشنویه و شاهین‌دژ بررسی شد. نتایج آنالیز داده‌ها نشان داد که بیشترین درصد باززایی در توده اصفهان (48/92 درصد)، در محیط کشت پایه MS حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAAو حداکثر میانگین باززایی شاخساره در هر ریزنمونه (25 شاخساره) در توده ارومیه، در تیمار 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده گردید. ریشه‌زایی گیاهچه‌های باززایی شده ، در محیط کشت پایه MSو MS2/1 عاری از تنظیم ‌کننده‌های رشد و همچنین در ترکیب با غلظت‌های 5/0 و 1 میکرومولارIBA و 5/0 و 1 میکرومولارIAA بررسی گردید. نتایج تجزیه واریانس نشان داد حداکثر درصد ریشه‌زایی (100 درصد) در محیط‌های MS2/1 (2/1 غلظت عناصر محیطMS ) عاری از تنظیم‌کننده رشد و MS تکمیل شده با 5/0 و 1 میکرومولار IBA قابل مشاهده می‌باشد. بیش از 90 درصد گیاهچه‌ها به شرایط گلخانه سازگار شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effects of Plant Growth Regulators on Direct Shoot Regeneration from Shoot Apical Explants in Four Genotypes of Matricaria chamomillaL.

چکیده [English]

Chamomile (Matricaria chamomilla L.) is a well-known medicinal plant species from Asteraceae family mentioned in 26 countries pharmacopoeia. The aim of this research is to find the best landrace, explants, hormonal combination and environmental condition for the possibility of German chamomile regeneration under in vitro conditions. In this experiment the effect of different concentrations of BAP (4.4 and 8.8µM) and Thidiazuron (TDZ) (4.4 and 8.8µM) in combination with 2.2 µm IAA were evaluated with different landraces (Isfahan, Urumia, Oshnavieh and Shahindegh). The results indicated that Isfahan landrace had the highest regeneration rate (92.48%) on media supplemented with BAP (4.4 µm) in combination with IAA (2.2 µm). The maximum mean number of shoots (25 shoots per explants) obtained in genotype landrace on media containing BAP (4.4 µm) in combination with IAA (2.2 µm). For evaluating of Basal media and plant growth regulators on rooting of regenerated shoots, MS and 1/2 MS medium with (0.5, 1 mg/l) IBA and IAA were used. Result of rooting experiment showed that maximum rooting rate (100%) was occurred on hormone free 1/2 MS medium and MS medium supplemented with 0.5 1mg/l IBA. More than 90% of the regenerated plants were successfully acclimatized and transferred to the greenhouse.

کلیدواژه‌ها [English]

  • German chamomile
  • direct regeneration
  • landrace
  • BAP
  • TDZ

اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر باززایی مستقیم ریزنمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ از گیاه بابونه آلمانی(Matricaria chamomilla L.)

الهام مرادی پور 1، بهمن حسینی1* و علیرضا پیرزاد2 

1ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

2ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت 

تاریخ دریافت: 14/4/94                تاریخ پذیرش: 16/9/94

چکیده

بابونه(Matricaria chamomilla L.) ، گیاه دارویی مشهور خانواده آستراسه است که نام آن در دارونامه­های 26 کشور ذکر شده است. تحقیق حاضر به منظور شناسایی، بهترین نوع و ترکیب تنظیم­کننده رشد در چهار ژنوتیپ بومی مورد مطالعه و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون شیشه­ای آن انجام گردید. در این آزمایش اثر دو نوع تنظیم­کننده رشد شامل N6- Benzyl amino purine (BAP) و (TDZ) Thidiazuron در غلظت­های (4/4 و 8/8 میکرومولار) در ترکیب با 2/2 میکرومولار3- Indol Acetic Acid ( IAA)  بر باززایی مستقیم شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ بابونه آلمانی اصفهان، ارومیه، اشنویه و شاهین­دژ بررسی شد. نتایج آنالیز داده­ها نشان داد که بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اصفهان (48/92 درصد)، در محیط کشت پایه MS حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار  IAAو حداکثر میانگین باززایی شاخساره در هر ریزنمونه (25 شاخساره) در ژنوتیپ ارومیه، در تیمار 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده گردید. ریشه­زایی گیاهچه­های باززایی شده، در محیط کشت پایه  MSو  MS2/1 عاری از تنظیم ­کننده­های رشد و همچنین در ترکیب با غلظت­های 5/0 و 1 میکرومولارIBA  و 5/0 و 1 میکرومولارIAA  بررسی گردید. نتایج تجزیه واریانس نشان داد حداکثر درصد ریشه­زایی (100 درصد) در محیط­های  MS2/1 (2/1 غلظت عناصر محیطMS ) عاری از تنظیم­کننده رشد و MS تکمیل شده با 5/0 و 1 میکرومولار IBA قابل مشاهده می­باشد. بیش از 90 درصد گیاهچه­ها به شرایط گلخانه سازگار شدند.

واژه های کلیدی: بابونه آلمانی، باززایی مستقیم، ژنوتیپ، BAP و TDZ. 

* نویسنده مسئول، تلفن: 04432775035، پست الکترونیکی:  b.hosseini@urmia.ac.ir

مقدمه

 

بابونه آلمانی با نام علمی Matricaria chamomilla L. گیاهی علفی، یک ساله و متعلق به تیره کاسنی است. اسانس گل­های آن در صنایع داروسازی، آرایشی، بهداشتی و صنایع غذایی کاربرد فراوان دارد (2 و 6). منشأ اصلی این گیاه مدیترانه، ولی امروزه پراکندگی وسیعی در اروپا، آسیای غربی، آفریقای­شمالی و آمریکای­شمالی دارد (4 و 21). اسانس گل­های بابونه آبی رنگ و مقدار آن بین 2/0 تا 9/5 درصد در گل­ها متغیر می­باشد (23و 29). در اسانس بابونه حدود 40 نوع ترکیب شیمیایی شناسایی شده است که مهمترین آنها کامازولن، بیسابولول، بیسابولول­اکسید، پاراسیمن، بتا اوسیمن، بتا-فارنزن می­باشد که در مجموع 75 درصد از ترکیب اسانس را به خود اختصاص داده­اند (11 و 22). با توجه به اینکه امروزه روش­های قدیمی و سنتی تکثیر و اصلاح گیاهان به تنهایی جوابگوی بسیاری از نیازها نمی­باشد، لازم است روش­های جدیدتری جایگزین یا تکمیل­کننده روش­های قبلی، مورد استفاده قرار گیرد. یکی از وسیع­ترین کاربردهای زیست فن­آوری، در زمینه کشت بافت است (9). از میان جنبه­های مختلف کشت بافت، ریزازدیادی از اهمیت بسیار زیادی برخوردار می­باشد. این تکنیک از نظر صرفه­جویی در زمان، راندمان بیشتر، امکان تولید گیاهان عاری از بیماری و مواد تکثیر­شده خالص، بسیار کارآمد می­باشد. همچنین این روش حفظ و انتقال ایمن­تر ژرم پلاسم را بین کشورها، مطمئن و راحت­تر کرده است (13). در ارتباط با موفقیت تولید گیاهان در شرایط درون شیشه­ای، فاکتورهای متعددی نظیر ژنوتیپ، نوع ریزنمونه، نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشد، مکمل­های رشد و اسید­های آمینه مؤثر می­باشند (3 و 25). Rout و همکاران (24) گزارش کردند که کاربرد غلظت­های پایین اکسین در ترکیب با سایتوکینین میزان تکثیر شاخساره را افزایش می­دهد. پرآوری شاخساره بیشتر تحت تأثیر سایتوکینین است و نتایج نشان داده است که عدم حضور سایتوکینین­هایی مانند BAP(N6-benzylaminopurine)، Kin(Kinetin) و حضور IAA(Indol acetic acid) به تنهایی تأثیری در پرآوری شاخساره ندارد. نتایج اولیه Cellarova و همکاران (1982) نشان داد که جهت القای باززایی از کالوس­های القاء شده بابونه در محیط کشت درون شیشه­ای، حداکثر باززایی در محیط کشت حاوی 1/0 میلی­گرم در لیتر  BAP ثبت گردید (9). در گیاه دارویی نعناع فلفلی ((Mentha piperita L.، حداکثر میزان تولید شاخساره از نمونه گره­های کشت شده در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار BAP 8/49 درصد گزارش شده است (30). در مطالعه دیگر جهت ازدیاد درون شیشه­ای گیاه Pentanema indicum بهترین محیط تنظیم­کننده رشدی 4 میکرومولار BAP در ترکیب با 1 میکرومولار IAA گزارش شد (28). مطالعات Murck و همکاران (2000)، در بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد شامل BAP و TDZ(Thidiazuron) در ترکیب با IAA بر روی باززایی مستقیم گل راعی (HyppericumPerforatum) گزارش گردید که بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط کشت پایه MS حاوی 5 میکرومولار TDZ به­دست آمد (18). برای باززایی مستقیم در گیاه Arnebiae uchroma بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ در محیط حاوی 5 میکرومولار TDZ مشاهده شد (16).

دامنه وسیعی از ظرفیت تولید­مثلی در سلسله گیاهان وجود دارد. معمولا تولید مثل گیاهان دولپه­ای نسبت به تک لپه­ای­ها بهتر می­باشد. بین گیاهان یک گونه نیز تفاوت­های زیادی در تقسیم سلولی و توان تولیدمثلی وجود دارد (3). در تحقیقی که به منظور بررسی اثرات ژنوتیپ و تنظیم­کننده­های رشد در کشت ریزنمونه­های زوفا
(Hyssopus officinalis) انجام گرفته بود، نشان داده شد که در بین ژنوتیپ­های موجود، ریزنمونه­های ژنوتیپ­های همدان و مشهد با 86 درصد شاخساره­زایی دارای بیشترین درصد باززایی می­باشند (7). نتایج این تحقیق مشخص ساخت که ترکیب­های تنظیم­کننده رشدی 4/4 و 2/2 میکرومولار در لیتر BAP به ترتیب برای ژنوتیپ­های همدان و مشهد بهترین ترکیب برای باززایی شاخساره از ریزنمونه گره هستند. در ژنوتیپ شیراز، بهترین نتیجه (80 درصد) با ترکیب تنظیم­کننده رشدیBAP  با غلظت 4/4 میکرومولار گزارش گردید.

ریشه­زایی توسط عوامل مختلفی مانند وجود تنظیم­کننده­های رشد در محیط، سن و مرحله نموی گیاه، ترکیب نمک­های پایه، ژنوتیپ و شرایط کشت کنترل می­شود (3). اکثر گیاهان برای باززایی مؤثر ریشه به اکسین نیازمندند. برای ریشه­دهی گیاهان علفی اغلب از اکسین ضعیف (IAA) در غلظت­های بین 10- 1/0 میلی­گرم در لیتر استفاده می­شود. گیاهان چوبی نسبت به گیاهان علفی، به غلظت بالاتر اکسین نیازمندند. بهترین اکسین­های مؤثر IBA در غلظت­های بین 3- 5/0 میلی­گرم در لیتر و NAA در غلظت­های بین 1- 05/0 میلی­گرم در لیتر هستند (14). Pavendan  و Rajasekaran (2011) گزارش کردند که در گیاه Eugenia singampattiana بالاترین درصد ریشه­زایی (98درصد) و بیشترین تعداد ریشه در هر ریزنمونه و طویل­ترین ریشه در محیط MS شامل 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد (20).

با توجه به اهمیت گیاه بابونه و کاربرد روز افزون آن در صنایع داروسازی، آرایشی و بهداشتی، عطر سازی و تهیه چاشنی­های غذایی و لزوم تولید کلون­های یکنواخت با درصد بالای متابولیت­های ثانویه از طریق ریزازدیادی، تحقیق حاضر به منظور شناسایی بهترین ژنوتیپ، نوع و ترکیب تنظیم­کننده رشد و شرایط مناسب محیطی و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون شیشه­ای آن انجام گرفته است.

مواد و روشها

مواد گیاهی: در این پژوهش چهار ژنوتیپ گیاه بابونه آلمانی در پژوهشکده زیست فن­آوری دانشگاه ارومیه مطالعه گردید. بذور ژنوتیپ اصفهان از شرکت پاکان بذر واقع در شهر اصفهان خریداری شد. بذور ژنوتیپ­های ارومیه، اشنویه و شاهین دژ توسط دکتر علیرضا پیرزاد از زیستگاه­های طبیعی (جدول 1) جمع­آوری گردید.

 

 

جدول 1- مختصات جغرافیایی نمونه­های جمع آوری شده

شهر

شمال

شرق

ارتفاع

ارومیه

36O 25´ 47"

46O 04´ 25"

1585

اشنویه

37O 09´ 01"

45O 08´ 15"

1650

شاهین­دژ

36O 47´ 42"

45O 08´ 48"

1610

 


محیط کشت پایه و شرایط رشد: در این مطالعه از محیط کشت پایه MS (17) حاوی ویتامین B5 (نیکوتینیک اسید، تیامین و پیریدوکسین) شرکت زیست آرمان سبز استفاده گردید. 30 گرم ساکارز و 7 گرم آگار به محیط کشت پایه اضافه وpH  محیط کشت بین 6/5 تا 8/5 تنظیم گردید. کلیه محیط­های کشت و گیاهچه­ها در اتاق رشد با دمای 2±24 درجه سانتی­گراد و در شرایط دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 3000 لوکس نگهداری شدند.

ضد عفونی و کشت بذرها: به‌منظور حذف آلودگی‌های سطحی بذرها در زیر آب جاری به‌مدت نیم ساعت قرار گرفتند و سپس جهت سترون­سازی در زیر هود لامینارفلو از اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه و هیپوکلریت سدیم NaClO3)) در غلظت 5 درصد حجمی (v/v) به مدت 10 دقیقه استفاده گردید و سپس سه مرتبه آبشویی با آب مقطر سترون انجام شد. بذرها در محیط کشت MS حاوی ویتامین­های B5 درون پتری­دیش کشت شدند. بذرها پس از 9 روز جوانه زدند و بعد از گذشت 3 هفته از کاشت بذور در شیشه، ریزنمونه نوک شاخه از گیاهچه­ها تهیه شد.

بررسی اثر ترکیب­های مختلف هورمونی بر باززایی شاخساره 4 ژنوتیپ بابونه آلمانی: این آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار اجرا شد. تیمارهای آزمایش نوع ژنوتیپ در چهار سطح (اصفهان، ارومیه، اشنویه و شاهین دژ) و تنظیم­کننده رشد در دو نوع  BAP)و  (TDZ و غلظت­های مورد استفاده از   TDZو BAP در دو سطح (4/4 و 8/8 میکرومولار در لیتر) به همراه 2/2 میکرومولار IAA در محیط کشت MS حاوی ویتامین­های B5 بودند. پس از گذشت 9 هفته و انجام 3 بار واکشت، درصد و میانگین باززایی مستقیم شاخساره در هر ژنوتیپ در هر تیمار آزمایش و حداکثر شاخه­زایی در هر تیمار ثبت گردید.

ریشه­زایی: این آزمایش به­منظور بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد IBA و IAA بر میزان ریشه­زایی گیاهچه­های باززایی شده ژنوتیپ اصفهان در آزمایشگاه انجام گرفت و سه ژنوتیپ باقی مانده مورد بررسی آزمایش ریشه­زایی قرار نگرفتند. ریشه­زایی گیاهچه­های باززایی شده، در دو محیط پایه  MSو  MS2/1 (حاوی نصف غلظت عناصر محیط MS) حاوی غلظت­های0، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر IBA و 0، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر IAA  بررسی گردید. آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. در پایان واکشت­ها درصد ریشه­زایی و طول ریشه­ها اندازه­گیری گردید.

سازگاری

به­منظور استقرار گیاهچه­های ریشه­دار شده ژنوتیپ اصفهان از مرحله باززایی، از بستر پرلیت اتوکلاو شده استفاده گردید. در ابتدا گیاهچه­ها را داخل لیوان­های پلاستیکی حاوی پرلیت قرار داده و سپس به منظور حفظ رطوبت، داخل جعبه پلاستیکی درب­دار قرار داده و جعبه به گلخانه انتقال داده شد. برای آبیاری برگی گیاهچه­های در حال سازگاری از محلول  MS2/1 استفاده شد و کف جعبه دو الی سه سانتی­متر آب ریخته تا گیاه بتواند از کف جعبه آب جذب کند. روزانه دو الی سه ساعت درپوش جعبه پلاستیکی برداشته شد تا گیاه به شرایط گلخانه با دمای 25 درجه سانتی­گراد با رطوبت نسبی 90 درصد سازگار شود. سازگاری به تدریج و طی 4 هفته صورت گرفت و گیاهچه­ها از داخل جعبه به داخل گلدان حاوی خاک سبک منتقل و در فضای گلخانه با دمای 25 درجه سانتی­گراد و طول دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی استقرار یافتند.

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها و نرم_افزارهای مورداستفاده: تجزیه واریانس داده­های آزمایش بر­اساس امید ریاضی طرح پایه و با استفاده از نرم­افزار آماری SAS   ورژن 1/9 و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام گرفت.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر غلظت‌های مختلف هورمون، ژنوتیپ و اثرات متقابل آن­ها بر درصد باززایی شاخساره درسطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود (جدول 2). این نتایج نشان داد که اختلاف معنی­داری در بین ژنوتیپ­های مورد استفاده جهت ازدیاد در شرایط درون شیشه وجود دارد.

 

 

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس باززایی گیاه بابونه آلمانی

منابع تغییرات

درجات آزادی

میانگین مربعات

درصد باززایی

میانگین باززایی

ژنوتیپ (a)

3

**69/304

**742/347

تیمار هورمونی (b)

4

** 34/12259

**822/571

اثر متقابل (a×b)

12

**39/493

**57/49

اشتباه آزمایشی

 

40

47/2

ضریب تغییرات (درصد)

 

561/6

64/11


اثر ترکیب­های هورمونی و نوع ژنوتیپ بر درصد باززایی شاخساره بابونه آلمانی: آنالیز داده­ها نشان داد که ژنوتیپ­های مورد استفاده از نظر میزان درصد باززایی دارای اختلاف معنی­داری می­باشند (جدول 2 و 3). حداکثر باززایی در ژنوتیپ اصفهان و حداقل باززایی در ژنوتیپ شاهین­دژ ثبت گردید. در ژنوتیپ اصفهان بیشترین درصد باززایی 48/92 درصد و کمترین درصد باززایی 47/58 درصد به ترتیب در محیط کشتMS  حاوی 4/4 میکرومولارBAP  و محیط کشتMS  حاوی 8/8 میکرومولار TDZ مشاهده گردید (شکل 1). در ژنوتیپ ارومیه حداکثر درصد باززایی با 21/84 درصد در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار TDZ و کمترین درصد باززایی73/54 درصد در محیط MS حاوی 8/8 میکرومولار TDZ مشاهده گردید. در ژنوتیپ اشنویه بیشترین درصد باززایی با 32/88 درصد در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار BAP و کمترین مقدار آن 26/49 درصد در محیط کشت MS حاوی 8/8 میکرومولار TDZ به­دست آمد. در ژنوتیپ شاهین­دژ بیشترین درصد باززایی 55/86 درصد در محیط کشت حاوی 4/4 میکرومولار BAP و کمترین درصد باززایی 31/36 درصد در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار TDZ مشاهده گردید (جدول 3).

اثر ترکیب­های هورمونی و نوع ژنوتیپ بر میانگین باززایی شاخساره بابونه آلمانی: در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه­ژنوتیپ اشنویه با میانگین، 5/16 گیاهچه در هر ریزنمونه در مجموع 4 تیمار هورمونی حداکثر شاخه­زایی را در بین ژنوتیپ­های مورد نظر نشان داد. ژنوتیپ­های ارومیه، شاهین­دژ و اصفهان به ترتیب با میانگین 13/15، 04/11 و 27/6 گیاهچه در هر ریزنمونه در 4 تیمار آزمایش در رده­های بعدی قرار گرفتند (شکل 2).

 

 

جدول 3-  بررسی اثر ژنوتیپ، نوع و غلظت تنظیم کننده ­های رشد بر میزان باززایی ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی.

غلظت تنظیم­کننده­های رشد در محیط کشتMS  

ژنوتیپ

درصد باززایی شاخساره(%)

میانگین باززایی شاخساره (گیاهچه در هر ریزنمونه)

4/4 BAP + 2/2 IAA

اصفهان

48/92 a

33/10d

4/4 BAP + 2/2 IAA

ارومیه

80e

23ab

4/4 BAP + 2/2 IAA

اشنویه

32/88b

25a

4/4 BAP + 2/2 IAA

شاهین دژ

55/86c

5/16c

8/8 BAP + 2/2 IAA

اصفهان

42/75f

40/8e

8/8 BAP + 2/2 IAA

ارومیه

04/73g

21b

8/8 BAP + 2/2 IAA

اشنویه

25/81e

23ab

8/8 BAP + 2/2 IAA

شاهین دژ

06/76c

5/14cd

4/4 TDZ + 2/2 IAA

اصفهان

59/89b

83/3fg

4/4 TDZ + 2/2 IAA

ارومیه

21/84d

10d

4/4 TDZ + 2/2 IAA

اشنویه

20/86c

5/10d

4/4 TDZ + 2/2 IAA

شاهین دژ

31/36l

15/5f

8/8 TDZ + 2/2 IAA

اصفهان

47/58i

5/2g

8/8 TDZ + 2/2 IAA

ارومیه

73/54j

5/6ef

8/8 TDZ + 2/2 IAA

اشنویه

26/49k

6f

8/8 TDZ + 2/2 IAA

شاهین دژ

70h

8e

                       حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد می­باشند.


 

شکل 1- تأثیر ژنوتیپ­های مختلف و محیط هورمونی بر درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه بابونه آلمانی. حروف  غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد می باشد.

 

شکل 2- تأثیر ژنوتیپ­های مختلف بر میانگین باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح احتمال 1 درصد می باشند.

در میان دو نوع هورمون سیتوکینینی BAP و TDZ، بیشترین میانگین باززایی شاخساره با 72/17 گیاهچه در هر ریزنمونه به هورمون BAP اختصاص داشت. هورمون TDZ دارای میانگین 56/6 گیاهچه در هر ریزنمونه در تیمارهای مورد مطالعه بود (شکل 3). این مطالعه آشکار ساخت که در بابونه آلمانی هورمون­های مورد استفاده دارای اثرات متفاوت معنی­دار در میانگین باززایی شاخساره می­باشند.

اثر متقابل بین محیط کشت پایه، نوع و غلظت­های مختلف تنظیم­کننده رشدی بر درصد باززایی شاخساره در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود، اما اثر ژنوتیپ، نوع و غلظت­های مختلف تنظیم­کننده رشدی هر کدام به تنهایی بر میانگین باززایی شاخساره در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود.

 

شکل 3- مقایسه میانگین باززایی شاخساره ازریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی تحت تاثیر سیتوکینین­های BAP و TDZ. حروف غیر مشابه نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد می­باشند.

آنالیز غلظت­های مختلف هورمونی نیز نشان داد که اختلاف معنی­داری در بین غلظت­های مورد استفاده برای دو هورمون مورد استفاده TDZ و BAP وجود دارد. غلظت 4/4 میکرومولار با 04/13 گیاهچه در هر ریزنمونه نسبت به غلظت 8/8 میکرومولار با 24/11 گیاهچه در هر ریزنمونه، غلظت بهینه جهت تولید شاخساره در بابونه آلمانی از ریزنمونه نوک شاخه مشخص گردید (شکل های 4 و 5).

 

 

شکل -4 تأثیر غلظت­های مختلف هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی. A: غلظت 4/4 میکرومولار دو هورمون BAP و TDZ، B: غلظت 8/8 میکرومولار دو هورمون BAP و TDZ. حروف غیر مشابه نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد می­باشند.

 

 

 

 

الفالف 

 

ب 

 

ج 

 

د 

شکل 5- مقایسه باززایی ژنوتیپ­های مختلف بابونه آلمانی در محیط MS حاوی4/4 میکرومولار  .BAPالف: ژنوتیپ اصفهان   ب: ژنوتیپ اشنویه   ج: ژنوتیپ ارومیه  د:شاهین دژ

جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر متقابل بین دو محیط MS  وMS 2/1 )غلظت نمک) و مقادیر مختلف تنظیم­کننده رشدی IBA و IAAو اثر متقابل آن­ها بر درصد ریشه­زایی در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود (جدول 4).

درصد ریشه­زایی: مقایسه میانگین داده­های آزمایش نشان داد که حداکثر درصد ریشه­زایی 100 درصد در محیط کشت MS، حاوی 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر  IBAو محیط کشت MS 2/1 فاقد هورمون و کمترین درصد ریشه­زایی 83 درصد در محیط کشت MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر IAA مشاهده شد (جدول 5).


جدول 4- تجزیه واریانس درصد ریشه­زایی و طول ریشه در پاسخ به انواع غلظت نمک و تیمارهای تنظیم­کننده رشد.

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات (MS)

درصدریشه زایی

میانگین طول ریشه(cm)

غلظت نمک((A

1

** 70/14

ns516/4

غلظت هورمونی(B)

5

**64/81

ns566/0

A×B

5

**17/133

ns506/0

اشتباه آزمایشی

20

70/0

694/0

برش دهی اثر متقابلA×B))

1/2 MS

5

** 176/49

ns539/0

MS

5

**636/165

ns534/0

ضریب تغییرات (CV%)

 

889/0

251/23

ns،**: به ترتیب نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد می­باشد.


 

میانگین طول ریشه: جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر تیمارهای مختلف تنظیم­کننده­های رشدIBA  و IAA و اثر متقابل آن با غلظت نمک­های ماکرو و میکرو محیط کشت MS، بر طول ریشه­های تشکیل شده در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار نمی­باشد و تنها اثر غلظت نمک در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود (جدول 4). میانگین طول ریشه در محیط1/2 MS  و MS به ترتیب 93/3 و12/3 سانتی­متر گزارش شد (شکل های 6 و 7).

 

شکل 6- مقایسه میانگین­های طول ریشه تحت تأثیر غلظت نمک درگیاهچه­های بابونه آلمانی ژنوتیپ اصفهان. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد در بین میانگین­ها می­باشند.

سازگاری به شرایط گلخانه به تدریج و طی 4 هفته صورت گرفت. بیش از 90 درصد از گیاهچه­ها در شرایط سازگاری زنده مانده و پس از انتقال به گلدان در شرایط گلخانه قرار گرفتند (شکل 8).

 

 

الف 

 

ب 

 

شکل 7- مقایسه محیط­های مختلف از لحاظ ریشه زایی در گیاه بابونه آلمانی

الف: گیاهچه ریشه­دارشده در محیط MS 1/2 پس از سه هفته ب: گیاهچه ریشه­دار شده در محیط  MSپس از سه هفته

 

 

شکل 8- گیاهچه در حال سازگاری بابونه آلمانی ژنوتیپ اصفهان در شرایط سازگاری.

 

بحث

در ارتباط با موفقیت تولید گیاهان در شرایط درون شیشه­ای، فاکتورهای متعددی نظیر ژنوتیپ، نوع ریز نمونه، نوع تنظیم­کننده­های رشد و غلظت و ترکیب آنها، مکمل­های رشد و اسید­های آمینه مؤثر می­باشند (3). سیتوکینین­ها باعث تسریع تقسیم سلولی، تشکیل اندام هوایی و ریخت­زایی می­شوند. در حالی که اکسین­ها برای القای رشد و طویل­شدن در سلول و به شکل متداول برای ریشه­زایی مورد استفاده قرار می­گیرد. سیتوکینین­های مورد استفاده اغلب کینتین یا BAP می­باشند (8).

جدول 5- تأثیر غلظت نمک­ها و تیمارهای مختلف تنظیم­کننده­های رشد بر درصد ریشه­زایی گیاهچه­های بابونه آلمانی  ژنوتیپ اصفهان.

تیمار هورمونی

درصد ریشه زایی

MS

IAA0

88c

IAA0.5

95b

IAA1

83d

IBA0

88 c

IBA0.5

100a

IBA1

100a

1/2 MS

IAA0

100a

IAA0.5

88 c

IAA1

95b

IBA0

100a

IBA0.5

95b

IBA1

95b

حروف غیر مشابه نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد در بین میانگین­ها می­باشند.

ترکیب­های اکسین به­طور متداول در ترکیب با سیتوکینین مورد استفاده قرار می­گیرند. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسین­ها و سیتوکینین­ها در محیط کشت، امکان القای رشد­های تمایز نیافته و با ریخت­زایی فراهم می­گردد (10). هورمون­های سیتوکینینی نظیر،  BAPوKin در ترکیب با غلظت­های خیلی کم از هورمون­های اکسینی مانند، IAA و  NAAبرای شاخساره­زایی تعداد بی­شماری از گیاهان مورد استفاده قرار گرفته است (12،20و33).

در این پژوهش بیشترین نرخ باززایی مستقیم شاخساره در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA و کمترین نرخ باززایی در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار TDZ در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده شد. در ازدیاد درون شیشه­ای گیاه علفی Pentanema indicum، بهترین محیط هورمونی 4 میکرومولار BAP در ترکیب با 1 میکرومولار IAA گزارش شد (28). جهت باززایی مستقیم در گیاه
Centaurium eryyhraeaبالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه مریستم انتهایی در محیط حاوی 4/4 میکرومولار  BAPمشاهده شد که با نتایج این بررسی مطابقت داشت (31). باززایی یک فرآیند فوق العاده پیچیده است که عوامل متعدد کمی و کیفی مانند خصوصیات ژنتیکی گیاه، موقعیت اولیه قلمه روی گیاه، سن قلمه، فصل، سال، میزان هورمون­های درون­زا، اندازه قلمه، مقدار مواد تنظیم­کننده رشد و غیره بر آن تأثیر می­گذارند هورمون BAP به عنوان یک هورمون سیتوکینی قوی در مطالعات شناخته شده است و در اغلب تحقیقات کشت بافت گیاهی جهت بهبود باززایی مستقیم مورد استفاده قرار می­گیرد.

Murck و همکاران (2000)، در بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد شاملBAP ، IAA و TDZ بر روی باززایی مستقیم گل راعی گزارش کردند که بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط هورمونی حاوی 5 میکرومولار TDZ به دست آمد (18). TDZ نسبت بهBAP  وIAA  در باززایی مؤثرتر بودکه با نتایج این مطالعه مغایرت داشت. جهت باززایی مستقیم در گیاه Arnebia euchroma، بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ در محیط حاوی 5 میکرومولار  TDZثبت گردیدکه با نتایج این مطالعه مغایرت نشان داد (16). این مغایرت عمدتا به تفاوت­های ژنتیکی گیاهان مورد مطالعه میتواند مربوط باشد و اثر مهم ژنوتیپ در قابلیت باززایی در شرایط درون شیشه باشد. در تحقیقی که به­منظور بررسی اثر TDZ بر روی پرآوری شاخساره از ریزنمونه گره گیاه علفی Psoralea corylifoliaصورت گرفته بود از غلظت­های مختلف (5,3,2,1 ,5/0میکرومولار) TDZ استفاده شد. بیشترین تعداد شاخساره 6/13 در هر ریزنمونه در محیط حاوی 2 میکرومولارTDZ  مشاهده گردید که با نتایج ما مطابقت داشت (15). یکی از فاکتورهای مؤثر بر روی رشدونمو در کشت درون شیشه­ای، تأثیر مواد گیاهی به ویژه ژنوتیپ می­باشد. دامنه وسیعی از ظرفیت تولید­مثلی در سلسله گیاهان وجود دارد. معمولا تولید مثل گیاهان دولپه­ای نسبت به تک­لپه­ای­ها بهتر می­باشد. بین گیاهان یک گونه نیز تفاوت­های زیادی در تقسیم سلولی و توان تولیدمثلی وجود دارد (3). در ژنوتیپ اصفهان بیشترین درصد باززایی در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولارBAP  در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA به دست آمد. بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ ارومیه در محیط حاوی 4/4 میکرومولار TDZ در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA گزارش شد. بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اشنویه در محیط 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA گزارش شد. در ژنوتیپ شاهین­دژ بیشترین درصد باززایی در محیط حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده شد. در همین راستا، اصغری (1389) نشان داد که اثر ژنوتیپ­های مختلف ریحان (Ocimum basilicum) بر درصد و میانگین باززایی معنی­دار می­باشد که مشابه همین نتایج در این مطالعه نیز مشاهده گردید (1). مطالعه 4 ژنوتیپ مختلف از ریحان شامل ارومیه، همدان، اردبیل و مجارستان در محیط MS تکمیل شده با غلظت­های متفاوت BAP (صفر، 5/2، 5 و 5/7 میلی­گرم در لیتر) بیشترین درصد باززایی را در ژنوتیپ مجارستان و در غلظت 5/2 میلی­گرم در لیتر BAP با 90 درصد و میانگین 1/7 گیاهچه در هر ریزنمونه ثبت کردند. کالوس­زایی در ریزنمونه های مختلف رز گالیکا نیز تحت تأثیر هورمونی تغییر یافت و بالاترین درصد کالوس زایی در تیمارهای حاوی 3-2 میلی­گرم توفوردی مشاهده گردید (5). در تحقیقی که به منظور بررسی اثرات ژنوتیپ و تنظیم­کننده­های رشد در کشت ریزنمونه­های زوفا (Hyssopus officinalis) انجام گرفته بود، نشان داده شد که در بین ژنوتیپ­های موجود، ریزنمونه­های ژنوتیپ­های همدان و مشهد با 86 درصد شاخساره­زایی دارای بیشترین درصد باززایی می­باشند. نتایج این تحقیق مشخص ساخت که ترکیبات هورمونی 4/4 و 2/2 میکرومولار در لیتر BAP به ترتیب برای ژنوتیپ­های همدان و مشهد بهترین ترکیب برای باززایی شاخساره از ریزنمونه گره هستند. در ژنوتیپ شیراز بهترین نتیجه (80 درصد) با ترکیب هورمونیBAP  با غلظت 4/4 میکرومولار BAP گزارش گردید که با نتابج این مطالعه مطابقت دارد (7). به­نظر می­رسد وجود تفاوت­های ژنتیکی در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه و تاثیر غیر قابل انکار ژن­های دخیل در فرآیند باززایی باعث وجود تغییرات متنوع درصد باززایی در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه باشد.

اکثر گیاهان برای القای مؤثر ریشه­زایی به اکسین نیازمندند. برای ریشه­دهی گیاهان علفی اغلب از اکسین ضعیف (IAA) در غلظت­های بین 10-1/0 میلی­گرم در لیتر استفاده می­شود. گیاهان چوبی نسبت به گیاهان علفی، به غلظت بالاتر اکسین نیازمندند. به­منظور القای ریشه در گیاهان علفیIBA  در غلظت­های بین 3-5/0 میلی­گرم در لیتر و NAA در غلظت­های بین 1-05/0 میلی­گرم در لیتر مؤثر هستند (14).

بیشترین درصد ریشه­زایی، در محیط­های حاوی  MS2/1 فاقد هورمون ،MS  حاوی 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر  IBA مشاهده شد. بین MS و  MS2/1 اختلاف معنی­داری ملاحظه می شود. در مطالعه روی ریشه­زایی گیاهچه­های تولید شده کشت بافتی گیاه Alpinia officinarumبا سه نوع هورمون IAA، NAA و IBA در محیط 1/2 MS مشخص گردید بیشترین درصد ریشه­زایی مربوط به هورمون IBA با غلظت 5/0 میلی­گرم در لیتر بود که با نتایج ما مطابقت داشت (26). در ریشه­زایی گیاهچه­های ریز­ازدیادی شده  Hemides musindicus، Spilanthes acmella و Naringi crenulata، محیط کشت 1/2 MS حاوی 1 میکرومولار IBA استفاده شد که با نتایج ما مطابقت داشت (19، 25 و 27).Pavendan  و Rajasekaram (2011)،گزارش کردند که در گیاه
Eugenia singampattiana، بالاترین درصد ریشه­زایی (98 درصد) و بیشترین تعداد ریشه در هر ریزنمونه (6/11 عدد) و بلندترین طول ریشه (3/6 سانتیمتر) در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد(20). در ریشه­زایی گیاهچه­های پرآوری شده Hydrastis camadensis از غلظت­های مختلف هورمون IBA استفاده شد. نتایج نشان داد بیشترین میزان توسعه ریشه در محیط 1/2 MS تکمیل شده با 1 الی 2 میکرومولار IBA به دست آمد. بیشترین درصد ریشه­زایی (5/63 درصد) در غلظت 2 میکرومولار با حدود 8/3 ریشه در هر ریزنمونه با متوسط 4/8 میلی­متر به دست آمد. غلظت بهینه IBA برای ریشه­زایی در این گیاه 1 میکرومولار با 2/58 درصد ریشه­زایی و بیش از 4 ریشه در هر ریزنمونه به طول متوسط 2/13 میلی­متر بوده است که با نتایح این مطالعه مطابقت دارد (27).

نتیجه­گیری نهایی

نتایج این مطالعه نشان داد که هم ژنوتیپ­های مورد مطالعه و هم نوع و غلظت هورمون­های مورد استفاده از نظردرصد، میانگین باززایی و القای ریشه دارای تفاوت معنی­دار می­باشند. در بین ژنوتیپ­های مورداستفاده، ژنوتیپ اصفهان دارای حداکثر باززایی شاخساره وژنوتیپ شاهین­دژ دارای حداقل باززایی شاخساره بودند. در بین ترکیب­های مورد استفاده جهت القای باززایی نیز، ترکیب 4/4 میکرومولار BAP، دارای قابلیت باززایی بالاتری نسبت به سایر ترکیب­های مورد استفاده می­باشد. همچنین محیط کشت پایه MS حاوی هورمون IBA، بالاترین درصد ریشه­زایی را درژنوتیپ اصفهان تولید نمود.

1- اصغری، ف. 1389. بررسی اثر ژنوتیپ، ریزنمونه و ترکیب­های هورمونی مختلف در باززایی گیاه ریحان (Ocimum basilicum). رساله کارشناسی ارشد. گروه باغبانی، دانشگاه ارومیه.

2-امیدبیگی، ر. 1387. رهیافت­های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد سوم. انتشارات آستان قدس رضوی، 400 صفحه.

3- باقری، ه. و آزادی، پ. 1381. کشت بافت گیاهی: تکنیک­ها و آزمایش­ها (تالیف رابرتا اچ. اسمیت). چاپ اول. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد، 154.

4- رضانژاد، ف. و طراحی ، ر. 1392. اثر نور و تنظیم کننده های رشد گیاهی بر کالوس­زایی و تجمع آنتوسیانین در کالوسهای حاصل از جداکشت­های مختلف در رز گالیکا. پژوهشهای گیاهی. 2(26): 195-184.

5-صمصام شریعت، ه. 1382. پرورش و تکثیر گیاهان دارویی. انتشارات مانی، 200 صفحه. 

6-عزیزی، م. 1385. مطالعه چهاررقم بابونه Matricaria chamomilla L.)) اصلاح شده در شرایط آب و هوایی ایران. مجله تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 22(4): 394-386.

7- علیزاده، م. 1390. بررسی فاکتورهای مؤثر در باززایی درون شیشه­ای گیاه زوفا Hyssopus officinalis L.)). پایان نامه کارشناسی ارشد. گروه باغبانی، دانشگاه ارومیه.

8- فارسی، م. و ذولعلی، ج. 1384. بیوتکنولوژی گیاهی. انتشارات دانشگاه مشهد، 570 صفحه.

9- مشایخی، ک. 1386. جنین زایی رویشی گیاهی. انتشارات فراغی. 483 صفحه.

 

10- Čellárová, E., Greláková, K., Repčák, M. and Hončariv, R., 1982. Morphogenesis in callus tissue cultures of some Matricaria Achillea Species. Biologia Plantarum. 24(6): 430-433.

11- Cemek, M., Kaga, S., Simsek, N., Buyukokuroglu, M.E. and Konuk, M., 2008. Antihyperglycemic and antioxidative potential of Matricaria chamomilla L. in streptozotocin- induced diabetic rats. The Japanese Society of Pharmacognosy and Springer. 62(3): 284-293.            

12- Chen, D.H., Ye, H.C. and Li, G.F., 2000. Expression of chimeric arnesyl diphophate synthase genes in artemisiaannua transgenic plant via Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Plant Science. 155: 179-185.

13- Dixon, R.A. and Gonzales, R.A., 1996. Handbook of Plant Tissue and Cell culture. Department of Botany, Mehta, A. R. MS. Univesity, BARODA. Plant Cell Culture, 800.

14- Edwin, R.F. and Paul, D.S., 1984. Plant propagation by tissue culture. Handbook and Directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd. Eversley, Basingstok, Hants. RG27OQY, England, 700.

15- Faisal, M. and  Anis, M., 2006. Thidiazuron induced high frequency axillary shoot multiplication in Psoralea corylifolia. Biologia Plantarum. 50(3): 437-440.

16- Malik, S., Sharma, S.h., Sharma, M. and Singh, A P., 2010. Direct shoot regeneration from intact leaves of Arnebiae uchroma (Royle) Johnston using thidiazuron. Cell Biology International. 34: 537–542. 

17- Murashige, T. and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant. 15: 473-497.

18- Murck, S.J., Choffe, K.L.,Victor, J.M.R., Slimmon, T.Y., KrishnaRaj, S. and Saxena, P.K., 2000. Thidiazuron-induced plant regeneration from hypocotyl cultures of St. John's wort (Hypericum perforatum. cv 'Anthos'). Plant Cell Reports. 19(6): 576-581.

19- Patnaik, J. and Debata, B. K., 1996. Micropropagation of Hemides musindicus (L.) R. Br. through axillary bud culture. Plant Cell Report. 15: 427– 430.

20- Pavendan, P. and Rajasekaran, C.S., 2011. Effect of Different Concentrations of Plant Growth Regulators for Micropropagation of Eugeniasingam pattiana Beddome Endangered Tree Species. Research Journal of Botany. 6: 122-127.

21- Pirkhezri, M., Hassani, M.E. and Hadian, J., 2010. Genetic Diversity in Different populations of Matricaria chamomilla L. Growing in Southwest of Iran, Based on Morphological and RAPD Markers. Research Journal of Medicinal plant. 4(1): 1-13.

22- Rezaie, A., Mohajeri, D., Zarkhah, A. and Nazeri, M., 2012. Comparative assessment of Matricaria chamomilla and zink oxid on healing of experimental skin wounds on rats. Annals of Biological Research. 3(1): 550-560.

23- Roberson, D., Cristiane, L., Francine, L., Henrique, K. and Marguerite, Q., 2005. Plant regeneration from cotyledonary explants of Eucalyptus cammaldulensis. Agricultural Science. 62: 406-.

24- Rout, G.R., Saxena, C., Samantaray, S. and Das, P., 1999. Rapid clonal propagation of Plumbago zeylanica L. Plant Growth Regulators. 28: 1-4.

25- Saritha, K.V. and Naidu, C.V., 2008. Direct shoot regeneration from leaf explants of Spilanthesacmella. Biologia Plantarum. 52(2): 334-338.

26- Selvakkumar,C., Balakrishnan, A. and Lakshmi,B., 2007. Rapid in vitro micropropagation of Alpinia officinarum Hance, an important medicinal plant, through rhizome bud explants. Academic Journals Inc, USA. 6(8): 1251-1255.

27- Shan-shan, H., Chun-zhao, L. and Praveen, S., 2007. Plant regeneration of an endangered medicinal plant Hydrastis Canadensis L. Scientia Horticulturae. 113: 82-86.

27- Singh, N., Meena, M.K. and Patni, V., 2011. Effect of plant growth regulators, explants type and efficient plantlet regeneration protocol through callus induction in Naringi crenulata (Roxb.) Nicolson and it biochemical investigation. African Journal of Biotechnology. 10(77): 17769-17777.

28- Sivanesan, I. and Jeong, B.R., 2007. Micropropagation and in vitro flowering in pentanema indicum ling. Plant Biotechnology. 24(5): 527-532.                                      .

29- Sunil, B., Abdullah, J.O., Sreeramanan, S. and Karuthan, C., 2009. Shoots Induction from Hibiscus Rosa-sinensis Nodal Explant Using N6-benzyl amino purine (BAP), research Journal agriculture Biology Science. 5(4): 403– 410.

30- Van Eck, J. M. and Kitto, S.L., 1992. Regeneration of peppermint and organ mint from leaf disks. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 30: 41-49.

31- Wyosokinsk, H. and Piatczak, E.2003. In vitro regeneration of Centaurium eryyhraea from shoot tips and other seedling explants. Acta Soietatis Botanicrum Poloniae. 72(4): 283-288.