نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم جنگل، گروه جنگل‌شناسی و اکولوژی جنگل

2 استادیار دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان.

3 دانشیار. سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات پنبه کشور، گرگان

4 استادیار دانشکده علوم پایه، گروه شیمی، دانشگاه گلستان، گرگان

چکیده

تاکسول به عنوان یک ترکیب طبیعی بسیار کارآمد با سمیت پایین در کنترل و درمان طیف گسترده‌ای از سرطان-ها شامل سرطان پستان، رحم، تخمدان و سایر انواع آن معرفی شده است که منبع اولیه تولید آن، گیاه سرخدار (Taxus sp) می‌باشد. محدود بودن تعداد درختان سرخدار و عدم امکان تهیه مستقیم تاکسول از اندام‌های طبیعی به دلیل ممنوعیت قانونی قطع این درختان باعث شده از کشت‌های درون شیشه‌ای به عنوان جایگزین مناسب جهت تهیه تاکسول استفاده شود. امروزه کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی می‌تواند امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی را فراهم آورد. تحقیق حاضر به منظور بررسی، تعیین و مقایسه میزان تاکسول موجود در کالوس‌های حاصل از شرایط درون شیشه‌ای با برخی از بافت‌های طبیعی گیاهانTaxus baccata و T. berevifolia انجام گرفت. بدین منظور برای القای کالوس از ریزنمونه ساقه و برگ و محیط کشت پایه WPM به همراه هورمون‌های D-2,4 و کینتین استفاده شد و میزان تاکسول موجود با استفاده از تکنیک HPLC اندازه‌گیری شد. میزان تاکسول بافت‌های طبیعی شامل پوست، ساقه و برگ نیز پس از انجام مراحل عصاره‌گیری، اندازه‌گیری و مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد میزان تاکسول در بافت‌های طبیعی هر دو گونه دارای روند مشابهی بود به طوری که در برگ بیشتر از ساقه و سپس پوست بود اما مقادیر آن در دو گونه با هم متفاوت و در گونه T. baccata بیشتر بود. همچنین میزان تاکسول محاسبه شده در کالوس هر دو گونه T. baccata و berevifolia T. بیشتر از بافت‌های طبیعی بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Compare production of taxol in natural tissues of Taxus baccata L. and Taxus berevifolia Nutt. with in vitro condition

نویسندگان [English]

  • zeinab Rahmati 1
  • Vahide Payam Nour 2
  • Kamal Ghasemi Bazdi 3
  • Pouneh Ebrahimi 4

1 Gorgan University

2 Assistant professor of facutty of forest sciences,University of agricultural sciences and natural resources of Gorgan.

3 Assistant professor Cotton ReseaAssociate Professor, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Cotton Research Institute of Iranrch Institute of Iran, Gorgan, I.R. of Iran.

4 Assistant Professor, Faculty of Sciences, Department of Chemistry, University of Golestan, Gorgan.

چکیده [English]

Taxol has been introduced as an efficient natural compound with low toxicity in the control and treatment of a wide range of cancers, including breast, uterine, ovarian and other types that its production primary source is yew trees. Indeed, the limited number of yew trees and the impossibility of direct procurement of taxol from organs natural due to the legal ban on felling of these trees have been led to use in vitro cultures as a suitable alternative for the preparation of taxol. Nowadays, plant cell, tissues and organs cultures can provide the massive and rapid propagation of many medicinal plants. The present study focused on investigating, determining and comparing the amount of produced taxol with natural tissues of Taxus baccata L. and Taxus berevifolia Nutt., in vitro. In order to induce callus, stem and leaf explants were used in WPM medium enriched with 2,4-D and Kinetin hormones. The available Taxol was measured using HPLC techniques. After the extraction process, taxol was measured and compared in normal tissues including the skin, stems and leaves. The result showed that the amount of taxol in normal tissues of both species had a similar trend so that in the leaves was more than in the stem and then in the skin, but its amounts was different in both mentioned species. It was further observed that the amount of taxol was higher in T. baccata. Moreover, the amount of taxol in calluses of T. brevifolia and T. baccata were higher than normal tissues.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Callus
  • Taxol
  • Taxus baccata
  • Taxus berevifolia
  • tissue culture

مقایسه میزان تاکسول تولید شده در شرایط درون شیشه­ای با بافت­های طبیعی گیاه  

Taxus baccata L. وTaxus berevifolia Nutt. 

زینب رحمتی1*، وحیده پیام نور1،کمال قاسمی بزدی2 و پونه ابراهیمی3

1 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم جنگل، گروه جنگل‌شناسی و اکولوژی جنگل

2 گرگان، مؤسسه تحقیقات پنبه کشور، بیوتکنولوژی

3 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 31/1/94                تاریخ پذیرش: 29/3/95

چکیده

تاکسول به‌عنوان یک ترکیب طبیعی بسیار کارآمد با سمیت پایین در کنترل و درمان طیف گسترده­ای از سرطان­ها شامل سرطان پستان، رحم، تخمدان و سایر انواع آن معرفی شده است که منبع اولیه تولید آن، گیاه سرخدار (Taxus sp) می‌باشد. محدود بودن تعداد درختان سرخدار و عدم امکان تهیه مستقیم تاکسول از اندام­های طبیعی بدلیل ممنوعیت قانونی قطع این درختان باعث شده از کشت­های درون شیشه­ای به‌عنوان جایگزین مناسب برای تهیه تاکسول استفاده شود. امروزه کشت سلول، بافت­ها و اندام­های گیاهی می­تواند امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی را فراهم آورد. این تحقیق بمنظور بررسی، تعیین و مقایسه میزان تاکسول موجود در کالوس­های حاصل از شرایط درون شیشه­ای با برخی از بافت­های طبیعی گیاهانTaxus baccata  وT. berevifoliaانجام شد. بدین‌منظور برای القای کالوس از ریزنمونه ساقه و برگ و محیط کشت پایه WPM بهمراه هورمون های D-2,4 و کینتین استفاده شد و میزان تاکسول موجود با استفاده از تکنیک HPLC اندازه­گیری شد. میزان تاکسول بافت­های طبیعی شامل پوست، ساقه و برگ نیز پس از انجام مراحل عصاره­گیری، اندازه­گیری و مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان تاکسول در بافت­های طبیعی هر دو گونه دارای روند مشابهی بود، به‌طوری‌که در برگ بیشتر از ساقه و بعد پوست بود اما مقادیر آن در دو گونه با هم متفاوت و در گونه T. baccata بیشتر بود. همچنین میزان تاکسول محاسبه شده در کالوس هر دو گونه T. baccataو berevifolia T.بیشتر از بافت­های طبیعی بود.

واژه­های کلیدی: تاکسول، کالوس، کشت بافت، سرخدار ایرانی، سرخدار برگ ریز.

* نویسنده مسئول، تلفن:09183453247، پست الکترونیکی:z.rahmati65@yahoo.com

مقدمه

 

تاکسول (Taxol) یک نوع آلکالوئید دی­ترپن است که از گونه­های مختلف جنسTaxusبدست می­آید و یکی از مهمترین داروهای ضد سرطانی است که تاکنون شناسایی شده است و امروزه بعنوان یکی از امید بخش­ترین داروهای ضد سرطان در علم پزشکی مطرح می­باشد (16). نام علمی آن پاکلی تاکسول است (18) و فرمول شیمیایی آن به صورتC47H51NO14 و وزن مولکولی آن92/853 دالتون می­باشد که دارای نقطه ذوب 158-160 درجه سانتیگراد است (13). ساختمان شیمیایی این ماده دارویی دارای دو بخش است و شامل هسته باکاتین و یک زنجیره جانبی مشتق شده از فنیل آلانین که به کربن 13 متصل شده است (13).

تاکسول برای اولین بار در سال 1971 توسط وانی و همکاران از پوست، ریشه و سایر بخش­های درخت T. brevifolia و دیگر گونه­های جنس سرخدار یافت شد (19). تولید تاکسول بوسیله کالوس­های کشت شده سرخدار اولین بار توسط کریستن و همکاران در سال 1989 گزارش شد و پس از آن محققان دیگری فعالیت خود را در این زمینه آغاز کردند (11). تاکسول در تمامی بخش­های درخت سرخدار بجز میوه تازه آن وجود داشته و مقادیر آن در اندام­های مختلف و حتی گونه­های متفاوت یکسان نیست و از 01/0 تا 03/0 درصد وزن خشک متفاوت است (15). در اندام­های مختلف اکثر گونه­های سرخدار مقادیر متفاوتی از تاکسول وجود دارد که این مقدار می­تواند علاوه بر گونه تحت تأثیر عواملی مانند سن و جنس گیاه، شرایط اقلیمی و آب و هوایی، وضعیت خاک محل رویش و میزان دسترسی گیاه به نور باشد (17). دلاور (1377) به بررسی و مقایسه غلظت تاکسول در اندام­های مختلف T. baccata در دو منطقه گرگان و نور با لحاظ کردن تغییرات فصلی پرداخت. نتایج بدست آمده نشان داد که بالاترین غلظت تاکسول در بین بخش­های مختلف درخت در برگ­ها (بین 0285/0 تا 055/0 درصد وزن خشک) و ریشه­ها (023/0 تا 047/0 درصد وزن خشک) وجود دارد و پوست ساقه­های جوان در مرتبه بعدی قرار دارند. کمترین غلظت تاکسول هم در شاخه­ها (بین0013/0 تا 005/0درصد وزن خشک) مشاهده شد. قربانلی و دلاور (1380) محتوای تاکسول در جداکشت­های ساقه (بین021/0 تا 056/0 درصد وزن خشک) بطور مشخصی از کشت برگ­ها (018/0 تا 034/0 درصد وزن خشک) بیشتر می­باشد. Ahadi و همکاران (8) مقدار کمی تولید تاکسول را در کشت کالوس و سوسپانسیون سلولی گونه­های T. baccata و T. berevifolia مورد بررسی قرار دادند و با توجه به نتایج بدست آمده بیان کردند که گونه T. baccataدارای پتانسیل و توانایی بیشتری نسبت به گونه T. berevifoliaبرای تولید داروی ضد سرطان، تاکسول است.

با توجه به کند رشد و رو به انقراض بودن درختان سرخدار، تولید و عرضه تاکسول خالص و مطمئن­تر به بازار با هزینه کمتر و سرعت بالا، همچنین عدم تأثیرپذیری از محیط، قدرت تنظیم، کنترل و امکان مکانیزه کردن و همچنین کیفیت پایدار فرآورده حاصل باعث شده است که کشت سلولی سرخدار یکی از مهمترین راه­کارهای تولید بلند مدت و پایدار تاکسول باشد (22). با وجود آن که مواد تولیدی توسط سلول­های کشت شده در بیورآکتورها یا کشت­های سوسپانسیون سلولی لزوماً مشابه مواد تولیدی توسط گیاه کامل نخواهد بود ولی معمولاً عملکرد آنها بیشتر است (20). امروزه برای تولید تاکسول از کالوس­های حاصل از شرایط درون شیشه­ای یا سوسپانسیون سلولی استفاده می­شود (12). با توجه به اهمیت موضوع، این تحقیق با هدف مقایسه میزان تاکسول موجود در کالوس­های حاصل از شرایط درون شیشه­ای با برخی از بافت­های طبیعی T. baccata (سرخدار ایرانی)وT. berevifolia (سرخدار برگ ریز) انجام شد.

مواد و روشها

مراحل آماده­سازی ریز نمونه­ها، کشت کالوس و عصاره­گیری: این تحقیق در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در سال 1391 انجام شد. نمونه برداری از ساقه و برگ قسمت­های جوان و سالم درختانTaxus baccata  واقع در دره زیارت گرگان با مختصات طول جغرافیایی 35ً´27°54 و عرض جغرافیایی ً12´40°36 (شکل1) و درختان  T. berevifoliaواقع درباغ گیاه شناسی جنگل آموزشی- پژوهشی گرگان با مختصات طول جغرافیایی ً30´22°54 و عرض جغرافیایی ً12 َ46 °36 (شکل2) بصورت تصادفی از درختان بالغ 35 ساله انجام شد.

 

 

شکل 1- موقعیت مکانی آبشار زیارت و گونه T. baccata

 

شکل 2- موقعیت مکانی باغ گیاه­شناسی و گونه T. berevifolia

 

شستشوی اولیه ریز نمونه­ها با آب معمولی حاوی چند قطره مایع ظرفشویی بمدت سه تا چهار دقیقه انجام شد. پیش سترون سازی ریز نمونه­ها با قرار دادن در محلول قارچ کش بنومیل به غلظت چهار گرم در لیتر بمدت 2 ساعت انجام گردید. سترون سازی نهایی ریز نمونه­ها با استفاده از محلول کلرید جیوه یک دهم درصد بمدت 5 دقیقه و در نهایت چندین مرتبه شست‌و‌شو با آب مقطر استریل در زیر هود لامینار فلو انجام شد. برای القای کالوس ریزنمونه­های استریل شده در محیط کشت جامد WPM با تیمار هورمونی 2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 2/0 میلی­گرم در لیتر کینتین کشت شده و برای القای کالوس در شرایط تاریکی و دمای 2±24 درجه سانتی­گراد در انکوباتر قرار داده شدند. ریزنمونه­ها پس از تشکیل کالوس، هر 20 روز یکبار واکشت شده و پس از گذشت 2 ماه از زمان کشت برای انجام مراحل عصاره­گیری مورد استفاده قرار گرفتند. برای انجام مراحل عصاره گیری از روش یاری خسروشاهی و همکاران (2011) با اندکی تغییر استفاده شد (21). ابتدا میزان 5 گرم از کالوس­ها بمدت 3 روز در آون با دمای 40 درجه سانتی­گراد قرار داده شد تا خشک شود و در شرایط نسبتاً تاریک در هاون چینی تمیز ریخته شد و میزان 50 میلی­لیتر متانول مخصوصHPLC به آن اضافه و کوبیده شد، بطوری‌که در نهایت عصاره غلیظ و یکنواختی از کالوس بدست آمد. عصاره برای حباب‌زدایی بمدت 15 دقیقه در دمای20 درجه سانتی­گراد در دستگاه اولتراسوند و بمدت 2 ساعت بر روی شیکر مغناطیسی بدون حرارت قرار داده شد و بعد بمدت 10 دقیقه با 4000 دور در دقیقه بر روی دستگاه سانتریفیوژ قرار گرفت. عصاره نمونه­ها از کاغذ صافی عبور داده شد و برای تبخیر حلال نمونه، در دستگاه روتاری قرار گرفت. حجم عصاره کاراملی شکل با اضافه کردن متانول به 3 میلی­لیتر رسانده شد و بعد از فیلتر 42/0 میکرون عبور داده شد.

مراحل آماده سازی و عصاره­گیری از بافت­های طبیعی: بافت­های طبیعی شامل پوست، ساقه و برگ از درختان مورد نظر جدا گردیدند. نمونه­ها برای خشک شدن بمدت 2 هفته در دستگاه آون با درجه حرارت 40 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از خشک شدن، نمونه­ها خرد شده و به ذراتی به اندازه کمتر از یک میلی­متر تبدیل شدند. 9 گرم از قطعات پودر شده خشک، وزن شده و با 90 میلی­لیتر متانول مخصوصHPLC مخلوط و بمدت 15 دقیقه در دستگاه اولتراسوند قرار داده شدند و بمدت 2 ساعت بر روی شیکر مغناطیسی بدون حرارت قرار گرفته و پس از آن بمدت 10 دقیقه بر روی دستگاه سانتریفیوژ با 4000 دور در دقیقه قرار گرفتند. برای جدا­سازی فاز مایع که روی نمونه­ها قرار گرفته بود، نمونه­ها از کاغذ صافی عبور داده شدند و برای تبخیر حلال نمونه، در دستگاه روتاری قرار داده شدند تا عصاره کاملاً خشک شده و ماده کاراملی شکلی باقی بماند (مدت زمان لازم برای خشک شدن نمونه­ها 40 تا60 دقیقه بود). عصاره به جای مانده با اضافه کردن متانول مخصوصHPLC به حجم 5 میلی­لیتر رسانده و از فیلتر 42/0 میکرون عبور داده شد.

اندازه­گیری محتوای تاکسول موجود در نمونه­ها: برای سنجش تاکسول موجود در نمونه­ها از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا HPLC (Merck ،Germany) استفاده شد. سنجش­ها با استفاده از ستون 18C با ابعاد 6/4×250 و فاز متحرک شامل متانول و آب به نسبت 50 به 50 و با شدت جریان یک میلی­متر بر دقیقه انجام شد. طول موج UV مورد استفاده 270 نانومتر و میزان تزریق برای استاندارد و نمونه ها 20 میکرولیتر بود. نمونه­ها قبل از تزریق با استفاده از فیلتر 42/0 میکرون دو بار صاف شدند. استاندارد تاکسول با کمک شرکت ایرانی پژوهش خزر از شرکت Sigma تهیه گردید. پس از کالیبره کردن ستون­ها، میزان تاکسول موجود در هر نمونه با استفاده از تزریق محلول استاندارد و بدست آمدن منحنی کالیبراسیون و با مقایسه زمان بازداری ظاهر شدن پیک تاکسول خالص تزریق شده با غلظت­های مختلف و پیک­های حاصل از عصاره­های تزریقی انجام شد. برای تعیین میزان تاکسول هر یک از عصاره­ها، سطح زیر پیک مربوطه در زمان مورد نظر اندازه­گیری شد و با قرار دادن این سطح در معادله حاصل از منحنی کالیبراسیون، میزان تاکسول موجود بر حسب میلی­گرم در یک گرم وزن خشک از هر نمونه تخمین زده شد. تعداد دفعات تزریق برای هر نمونه3 تکرار در نظر گرفته شد و استاندارد تاکسول نیز بصورت روزانه به دستگاه تزریق شد.

آنالیز داده­ها و محاسبات آماری: داده­های بدست آمده بر اساس آزمایش فاکتوریل دو عامله مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. رسم نمودار در Excel، مقایسه میانگین‌ داده­ها با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن و آنالیز داده­ها نیز با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد.

نتایج

با تزریق استوک استاندارد تاکسول (شکل 3- الف) به دستگاه HPLC، پس از گذشت مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پیک­هایی ظاهر شدند که این پیک­ها بیانگر غلظت تاکسول بودند. معادله حاصل از منحنی کالیبراسیون حاصل از تزریق استاندارد تاکسول به صورت ( y=0.5031x-16.341وR2=0.9967  ) بدست آمد. نمونه­های عصاره­گیری شده از بافت­های طبیعی پوست، ساقه و برگ گونه T. baccata (شکل 4- الف، ب و ج) و بافت­های طبیعی پوست، ساقه و برگ گونه T. berevifolia(شکل 5- الف، ب و ج) به دستگاه HPLC تزریق و با استفاده از معادله بدست آمده (شکل3- ب)، میزان تاکسول موجود بصورت میلی­گرم در یک گرم وزن خشک برای هر نمونه تعیین گردید.

 

ب

 

الف

 

شکل 3- کروماتوگرام حاصل از تزریق استاندارد تاکسول (الف) و منحنی کالیبراسیون حاصل از تزریق استاندارد تاکسول (ب)

ج

 

ب

 

الف

 

شکل 4- کروماتوگرام حاصل از تزریق عصاره پوست (الف)، ساقه (ب) و برگ (ج) گونه T. baccata

ج

 

ب

 

الف

 

شکل 5- کروماتوگرام حاصل از تزریق عصاره پوست (الف)، ساقه (ب) و برگ (ج) گونه T.berevifolia

 

نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تأثیر داده‌های مربوط به نوع گونه Taxusو نوع بافت طبیعی در جدول 1 اراِئه شده است. نتایج نشان داد که اثر هریک از عوامل گونه Taxus، نوع بافت طبیعی و همچنین اثر متقابل دو فاکتور گونهTaxus  × نوع بافت طبیعی در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود.

نتایج مقایسه میانگین حاصل از گونه Taxusبر میزان تاکسول در شکل 6 ارائه شده است. با توجه به نتایج حاصل بین مقدار تاکسول موجود در گونه T. baccata با گونه  T. berevifoliaاختلاف معناداری وجود دارد. همان گونه که مشاهده می­شود، مقدار تاکسول موجود در گونه T. baccata(044/0) میلی­گرم در یک گرم و مقدار آن در گونه T. berevifolia (031/0) میلی­گرم در یک گرم بود.

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر گونه Taxus، نوع بافت طبیعی و اثر متقابل آنها بر میزان تاکسول (میلی­گرم در یک گرم)

منبع تغییرات

(SOV)

درجه آزادی

(df)

میانگین مربعات

(MS)

      مقدارF

سطح معنی‎داری

گونه Taxus

1

001/0

337/51

000/0

نوع بافت طبیعی

2

001/0

288/68

000/0

گونه  Taxus× نوع بافت طبیعی

        2

000/0

037/18

000/0

اشتباه

       12

00001333/0

 

 

       کل

            18

 

 

 

                   

 

 

 

شکل 6- نتایج مقایسه میانگین میزان تاکسول تحت تأثیر فاکتور نوع گونه Taxus

نتایج مقایسه میانگین حاصل از نوع بافت طبیعی بر میزان تاکسول در شکل7 ارائه شده است. بر اساس این نتایج، از نظر میزان تاکسول بین بافت­های طبیعی مورد مطالعه اختلاف معنی‌داری وجود دارد. بر این اساس بیشترین میزان تاکسول در برگ (049/0 میلی­گرم در یک گرم) وجود داشت، در حالی که بافت پوست با مقدار (024/0 میلی­گرم در یک گرم) دارای کمترین مقدار تاکسول بود و بافت ساقه نیز با مقدار( 039/0 میلی­گرم در یک گرم) در حالتی بین این دو قرار داشت. بطور کلی میزان تاکسول در بافت­های طبیعی پوست، ساقه و برگ بدین ترتیب پوست <  ساقه <  برگ می‌باشد.

نتایج مقایسه میانگین حاصل از اثر متقابل گونه Taxus و نوع بافت طبیعی در جدول 2 و شکل 8 اراِئه شده است.

 

شکل 7- نتایج مقایسه میانگین میزان تاکسول تحت تأثیر فاکتور نوع بافت طبیعی

بر اساس این نتایج در هر دو گونه مورد مطالعه
 T. baccata و T. berevifolia بیشترین میزان تاکسول در بافت برگ وجود دارد. با وجود این بافت پوست دارای مقدار تاکسول کمتری بوده و بافت ساقه نیز بین این دو قرار دارد. بطور کلی میزان تاکسول در بافت­های طبیعی پوست، ساقه و برگ گونه  T. baccataو T. berevifoliaبه ترتیب پوست <  ساقه <  برگ می‌باشد.

متأسفانه بدلیل آلودگی فراوان و طولانی بودن زمان کالوس­دهی ریز نمونه­های برگ و رشد بسیار کم آنها، مراحل عصاره­گیری و تخمین میزان تاکسول موجود در کالوس­های برگ انجام نشد.

 

جدول 2- درصد تاکسول موجود در بافت­های طبیعی درخت T. baccata و T. berevifolia 

 

گونه Taxus

 

 

نمونه

تاکسول

میلی­گرم در یک گرم بافت خشک

 

 

T. baccata 

پوست

025/0

 

ساقه

044/0

 

برگ

062/0

 

 

T. berevifolia 

 

                پوست

024/0

 

                 ساقه

034/0

 

              برگ

                036/0

           

 

و نوع بافت طبیعی Taxus اثر متقابل گونه

شکل 8 - نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل گونه Taxus و نوع بافت طبیعی بر میزان تاکسول

 

بدین جهت از کالوس ریزنمونه ساقه هر دو گونه (شکل 9) برای عصاره­گیری و تخمین میزان تاکسول موجود در آن استفاده گردید.

 

شکل 9- کالوس ریزنمونه ساقه T. baccata 

با انجام آنالیز کروماتوگرام کالوس ساقه گونه T. baccata (شکل10- الف) و گونه  T. berevifolia(شکل10- ب) و محاسبه داده­های مرتبط، بر اساس نتایج بدست آمده، میزان تاکسول موجود در کالوس گونه T. berevifolia(241/0) میلی­گرم در یک گرم وزن خشک کالوس، بیشتر از کالوس گونه T. baccata (239/0) میلی گرم در یک گرم وزن خشک بود ( جدول 3).

بحث و نتیجهگیری

با توجه به افزایش جمعیت کره زمین و عدم کفایت وسعت اراضی کشاورزی برای کشت انواع گیاهان بمنظور تأمین مواد اولیه دارویی، استفاده از روش­های کشت بافت می­تواند روش جایگزین مناسبی باشد (1). توسعه روش­های بیوتکنولوژی مانند ریزازدیادی، کشت بافت، کشت سلول و ریشه­های موئین یکی از مهمترین شیوه­های حل مشکلات مربوط به اثرات مخرب قطع گیاهان و درختان با خصوصیات غذایی، صنعتی و دارویی است (7).


 

ب

الف

 


شکل10- کروماتوگرام حاصل از تزریق عصاره کالوس ساقه T.baccata(الف) و T.berevifolia(ب)

 

جدول 3- درصد تاکسول موجود کالوس ریزنمونه ساقه محیط کشت WPM در گونه T. baccata و T .berevifolia

نمونه کالوس

تاکسول

میلی­گرم در یک گرم بافت خشک

T. baccata

239/0

T. berevifolia

241/0

     

با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت­های ثانویه کند می­باشد، استفاده از روش­های بیوتکنولوژی در شرایط درون شیشه­ای این موقعیت را فراهم می­سازد که تولید در شرایط کنترل شده و در زمان کوتاه‌تری انجام شود (3). در این راستا توسعه سیستم­های سریع کشت و تکثیر درون شیشه­ای فرصتی بی­نظیر برای تولید محصولات مختلف متابولیت ثانویه در آزمایشگاه و بدون نیاز به محدودیت زمانی و زمین­های قابل کشت و عرصه­های جنگلکاری خواهد بود. اصولاً ساده­ترین روش دستیابی به تاکسول، استخراج آن از منابع گیاهیست (20). درختان مناسب برای استخراج تاکسول درختان چند صد ساله هستند. با توجه به محدود بودن تعداد درختان سرخدار و حتی در معرض خطر انقراض بودن این درختان و پائین بودن عملکرد این روش بدلیل مقدار اندک تاکسول موجود در آنها، می­تواند منجر به نابودی این منبع طبیعی گردد (6). از این رو بنظر می­رسد که کشت سلولی سرخدار یکی از مهمترین روش­های جایگزین برای تولید تاکسول در دنیا باشد (4). زیرا جداسازی تاکسول و دیگر تاکسوئید­های مفید از کشت سلولی گیاه سرخدار به مراحل کمتری نسبت به جداسازی آن از بافت­های طبیعی نیاز دارد و میزان ترکیبات تداخل کننده در سلول­های حاصل از کشت سلولی کمتر است (14). در این تحقیق کالوس­زایی در شرایط درون شیشه­ای نمونه­های گیاهی در محیط کشتWPM ، القا و میزان تاکسول آنها با مقادیر موجود در بافت­های طبیعی در دو گونه T. baccataو T .berevifoliaمقایسه گردید. بر اساس نتایج بدست آمده میزان تاکسول تولید شده از کالوس جدا کشت­های ساقه دو گونه مورد مطالعه بین 239/0 تا 241/0 میلی­گرم در یک گرم بافت خشک کالوس در نوسان بود که این مقادیر در مقایسه با میزان تاکسول بدست آمده از بخش­های مختلف درخت سرخدار قابل توجه می­باشد. با ارزیابی مقدار تاکسول موجود در کالوس­های درون شیشه­ای، میزان تاکسول موجود در کالوس­های ساقه حاصل از محیط کشت WPM در گونه T. berevifolia بیشتر از گونه T. baccata بود. با این حال این مقدار در هر دو گونه بیشتر از میزان تاکسول در بافت­های طبیعی بدست آمد. نوع محیط کشت پایه یا به عبارت دیگر نوع و غلظت عناصر غذایی می­تواند بر میزان تولید تاکسول اثر قابل توجهی داشته باشد. علاوه بر آن، می­تواند بر میزان ترشح و مبادله محصولات از غشای سلول نیز مؤثر باشد (10).  Ahadiو همکاران (9) میزان تاکسول موجود در کالوس­های حاصل از کشت سوسپانسیون گونه T. baccata با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا را برابر با 25/0 میلی­گرم در لیتر بدست آوردند. محیط کشت WPM نسبت به محیط کشت­های پایه دیگر، دارای مقادیر بالاتری از پتاسیم به شکل  K2SO4و نیز مقادیر قابل توجهی نیترات آمونیوم[(NH4)NO3]  است که ممکن است بطور مستقیم یا غیرمستقیم بر مسیر متابولیکی تاکسول و سنتز آن مؤثر باشد و به همین دلیل باعث افزایش تاکسول در کالوس­های این دو گونه نسبت به بافت­های طبیعی شده باشد. Ahadi و همکاران (8) اعلام کردند که گونه T. baccata دارای پتانسیل و توانایی بیشتری در تولید تاکسول نسبت به گونه T. berevifolia است که با این نتایج متفاوت می­باشد. از دلایل ایجاد این اختلاف می­توان به محیط کشت پایه و غلظت­های هورمونی مورد استفاده اشاره کرد.

نتایج بدست آمده نشان داد که مقدار تاکسول موجود در بافت­های پوست، ساقه و برگ هر دو گونه به‌ترتیب شامل پوست < ساقه < برگ می­باشد. اما با وجود این روند یکسان، میزان تاکسول بین دو گونه سرخدار مورد مطالعه با هم متفاوت بود. میزان تاکسول در بافت­های طبیعی پوست، ساقه و برگ گونه T. baccata بیشتر از گونه T. berevifolia بود. تفاوت در میزان تاکسول علاوه بر تفاوت گونه­ها ممکن است به اختلاف محل رویشگاه، فاکتورهای محیطی، سن گیاه، شرایط اقلیمی و آب و هوایی، وضعیت خاک محل رویش و میزان دسترسی گیاه به نور مرتبط باشد. حضور T. baccata در رویشگاه طبیعی خود و سن نسبتاً زیاد آن در مقایسه با غیر بومی بودن T. berevifolia و سن پایین­تر و همچنین دست کاشت بودن آن می­تواند از دیگر عوامل اساسی این اختلاف باشد. دلاور (1377) گزارش کرد که بالاترین غلظت تاکسول در بین بخش­های مختلف درخت در برگ­ها بین 0285/0 تا 055/0 درصد وزن خشک بوده و ساقه­ها در مرتبه بعدی قرار دارند. با توجه به نتایج بدست آمده مقدار تاکسول موجود در یک گرم بافت خشک برگ دو گونه مورد مطالعه بین مقادیر 062/0 تا 034/0 قرار داشت که با نتایج تحقیق فوق مطابقت دارد. Nadem و همکاران (17) اعلام کردند که در بین اندام­های مختلف اکثر گونه­های سرخدار، بیشترین مقدار تاکسول در بافت پوست وجود دارد که با نتایج این تحقیق مغایرت دارد. با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میزان تاکسول موجود در بافت­های طبیعی دو گونه، در بین سه بافت مورد مطالعه کمترین مقدار تاکسول در بافت پوست مشاهده شد و بافت برگ دارای میزان بیشتری بود. با توجه به مراحل مختلف اجرای این تحقیق، بهینه سازی تیمارهای سترون­سازی، محیط کشت و تیمارهای هورمونی برای تولید کالوس در ریزنمونه ساقه حدود 4 تا 5 ماه به طول انجامید. با انجام محاسبات و آنالیز داده­ها، میزان تاکسول موجود در کالوس­های هر دو گونه مورد مطالعه بیشتر از بافت­های رویشی درختان بدست آمد. با در نظر قرار دادن این موضوع که سرخدار درختی همیشه سبز بوده و بدست آوردن کالوس­های تمایز نیافته در شرایط آزمایشگاهی در تمام فصول سال بدون محدودیت امکان پذیر است، بنظر می­رسد که استخراج تاکسول از کالوس­های حاصل از این تکنیک، جایگزین بسیار مناسب و مقرون بصرفه­ای برای تولید این داروی ضد سرطان با ارزش در صنعت داروسازی کشور و تأمین نیاز بیماران باشد. همچنین با توجه به اینکه عوامل متعددی از جمله تیمارهای نور و تاریکی، تغییرات هورمونی، افزایش محرکهای زیستی و غیرزیستی و غیره سبب تغییراتی در میزان متابولیت ثانویه در درختان و گیاهان می‌شود، مناسب است تحقیقات تکمیلی دیگری در جهت افزایش این ماده مؤثره انجام شود تا بتوان از این منابع با ارزش طبیعی و دارویی کشورمان بصورت بهینه با استفاده از تکنولوژی روز بدون قطع آنها در جنگل بهره­مند شد.

سپاسگزاری

از مسئولان محترم دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، به پاس فراهم کردن امکانات لازم برای اجرا و پییشبرد این تحقیق که همکاری صمیمانه­ای با اینجانب داشته­اند، کمال تشکر و قدردانی را دارم.

1- آذر مهر، ب.، کریمی، ف.، تقیزاده، م.، و موسوی گرگری، ل. 1392. مقایسه رشد و توان تولید متابولیت­های ثانویه در دودمان­های ریشه مویی تراریخت حاصل از کاسنی (Cichorium intybus). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی گیاهی ایران)، جلد 26، شماره 4، صفحه 476-485. 

2- دلاور، ک. 1377. بررسی اثر عوامل مختلف محیطی بر روی غلظت تاکسول در گیاه کامل و کشت بافت سرخدار (Taxus baccata). پایان نامه دوره کارشناسی ارشد. دانشگاه تربیت مدرس.

3- شیرازی، ز.، پیری، خ.، میرزایی اصل، ا.، حسنلو، ط و قیاسوند، ط. 1393. اثر محرک­های اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات بر میزان تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در ریشه­های مویین شیرین بیان (Glycyrrhiza glabra L.). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 27، شماره 3، صفحه 440-449.

4- عباسی کجانی، آ.، مفید، م.، و اطرشی، م. 1391. بررسی تأثیر نوع محیط کشت پایه بر تولید داروی ضد سرطان تاکسول در کشت سوسپانسیون سلولی سرخدار (Taxus baccata L). مجله زیست شناسی گیاهی، سال 4، شماره 12، صفحه 83-88.

5- قربانلی، م.، و دلاور، ک. 1380. بررسی اثر نوع و غلظت قندها بر میزان تولید تاکسول در کشت بافت سرخدار (Taxus baccata L). مجله علوم کشاورزی ایران، جلد32، شماره3، صفحه 575-583.

6- یاری خسروشاهی، آ . 1383. بررسی پاسخ به کشت بافت در سرخدار و میزان تاکسول تولیدی در شرایطin vitro . پایان نامه دوره کارشناسی ارشد. دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، 131 صفحه.

7- مهری راد، ن.، پیام نور، و.، و نظری، ج.1394. اثر سن پایه و نور برکالزایی توس (Betulalitwinowii)و بتولین القاء شده در شرایط درونشیشه­ای. دو فصلنامه علمی-پژوهشی تحقیقاتژنتیکو اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، جلد 23، شماره 1، صفحه 93-102.

 

8- Ahadi, H., Mirjalili, M.H., Farzaneh, M., shirshekan, M., and Ghassempour, A. 2013. Quantification of Taxol in wild mature and in vitro cell suspension cultures ofTaxus baccata and Taxus berevifolia: A Comparatives study.2 nd National Congre on Medicinal Plants,Tehran, 1409 p.

9- Ahadi, H., Mirjalili, M.H., Farzaneh, M., shirshekan, M., and Ghassempour, A. 2013. Cell suspension culture establishment of Taxus baccata for the production of the anticancer drug taxol. 2nd National Congress on Medicinal Plants,Tehran, 1148 p.

10- Abbasi Kajani, A., Moghim, S., and Mofid, M.R. 2012. Optimization of the basal medium for Improving production and secretion of taxanes from suspension cell culture of Taxus baccata L. Darul Journal of Pharmaceutical Sciences, 1-6.

11- Christen, A.A., Bland, J., and Gibson, D.M. 1989. Cell culture as a means to produce taxol Produce taxol. Proc. Am.Axxoc .Cancer, 30: 2252.

12- Denis, J.N., Greene, E., Guenard, D., Gueritt, F., Managatal, L., and Poiter, P. 1988. A highly efficient approach to natural taxol. JournalAmerican Chemical, 110: 5917 - 5919.

13- Jennwein, S., and Croteau, R. 2001. Taxol: biosynthesis, molecular genetics, and biotechnological applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 57(2-1): 9-13.

14- Ketchum, R.B.E., and Croteau, R. 1998. Recent progress toward an understanding of taxol biosynthesis in plant cell cultures. Elsevier Science, Amsterdam, 339-348.

15- Lesani, MR. 1999. Yew. Tehran: Mministry of Jahade Sazandegi Publicathion. 8-17.

16- Mihaljevic, S., and Bjedow, I. 2002. Effect of explant source and growth regulators on in vitro callus growth of Taxus baccata L. washingtonii. Food Technology. Biotechnology, 40(4): 299-303.

17- Nadeem, M., Rikhari, H.C., Anil Kumar, L., Palni, M.S., and Nandi, S.K. 2002. Taxol content in the bark of Himalayan Yew in relation to tree age and sex. Phytochemistry, 60: 627–631.

18- Nicolaou, K. C., Guy, R. K., and Potier, P. 1996. Taxoids: New weapons against cancer. Journal Scientific American: 84-86.

19- Wani ,M.C., Taylor, H.L., wall, M.E., Coggon, P., and Mcphail, A.T. 1971. Plant antitumor agens The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus berevifolia. Journal of the American Chemical Society , 93: 2325-2327.

20- Yari khosroshahi, A., Habibi khaniani, B., and Naghdi Badi, H. 2006. Review Taxol as the main anticancer natural compound. Journal of Medicinal Plants , 18 :1-9.

21- Yari Khosroushahi, A., Naderi-Manesh, H., and Toft Simonsen, H. 2011. Effect of Antioxidants and Carbohydrates in Callus Cultures of Taxus berevifolia: Evaluation of Browning, Callus Growth, Total Phenolics and Paclitaxel Production. BioImpacts, 1(1): 37-45.

22- Zhang, C.H., Mei, X.G., LiuaL, L., and Yu, J. 2000. Enhancend paclitaxel induced by the combination of elicitors cell suspension culture of Taxus chinesis Biotechnology Letters, 22: 1561–1564.