نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد-گروه زیست شناسی- دانشگاه شاهد

2 عضو هیات علمی دانشگاه شاهد-گروه زیست شناسی- دانشگاه شاهد

3 عضو هیات علمی-گروه زیست شناسی - دانشگاه الزهرا

4 عضو هیات علمی-گروه زیست شناسی-دانشگاه بوعلی سینا

5 دانشگاه کاشان-گروه زیست فناوری

چکیده

مریم¬گلی (.Salvia L)، یکی از بزرگ¬ترین جنس¬های تیره نعناعیان (Lamiaceae) با 58 گونه در ایران است. روغن¬های اسانسی، ترپنوئیدها، مشتقات اسیدهای فنلی و فلاوونوئیدها متابولیت¬های ثانوی اصلی گونه¬های مریم¬گلی را تشکیل می¬دهند و خواص دارویی این گیاهان به طور عمده مربوط به فعالیت¬های پاد¬اکسایشی این ترکیبات می¬باشد. در این پژوهش، برخی اسیدهای فنلی (رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسیدهای A و B)، در برگ و ریشه 4 گونه مریم¬گلی خودروی ایران برای اولین بار به روش HPLC جداسازی و سنجش شدند. بر طبق نتایج حاصل، S. verticillata با بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در برگ و ریشه ( به ترتیب 88/0±53/41 و 19/0±99/5 میلی¬گرم بر گرم وزن خشک)، به عنوان غنی¬ترین منبع این اسید فنلی شناسایی شد. مقدار سالویانولیک اسید B از 95/4±89/26 میلی¬گرم بر گرم وزن خشک در برگ S. officinalis ، تا 74/2±71/75 میلی¬گرم برگرم وزن خشک در برگ S. nemorosa، متغیر بود. همچنین بیش¬ترین محتوای سالویانولیک اسیدB (12/3±68/10 میلی¬گرم برگرم وزن خشک) در ریشه S. nemorosa برآورد شد. برگ S. officinalis و ریشه S. nemorosa به ترتیب با 77/0±55/4 و 85/1±68/6 میلی¬گرم برگرم وزن خشک، بیش¬ترین محتوای سالویانولیک اسید A را به خود اختصاص دادند. نتایج نشان داد که برگ¬ها نسبت به ریشه¬ها از اسید¬های فنلی غنی¬تر بودند و در بین آن¬ها سالویانولیک اسیدB بیشترین مقدار را تشکیل می¬دهد؛ رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسیدA در مراتب بعدی قرار داشتند. نتایج این مطالعه نشان داد که S. verticillata و S. nemorosa با توان بالای تولید و ذخیره¬سازی اسیدهای فنلی می¬توانند به عنوان گونه¬های شاخص برای مصارف دارویی معرفی شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Comparative Analysis of Rosmarinic Acid and Salvianolic Acids A and B Contents in Four Wild Growing Salvia Species from Iran

نویسندگان [English]

  • Marzieh Fotovvat 1
  • Tayebeh Radjabian 2
  • Azra Saboora 3
  • Massoud Ranjbar 4
  • Roghayeh Sadat Ejtahed 5

1 MSc student-Department of Biology-Shahed University

2 Assistant Professor-Department of Biology-Shahed University

3 Assistant Professor-Department of Biology- Alzahra University

4 Associate Professor-Department of Biology-Bu-Ali Sina University

5 Department of Biotechnology, University of Kashan

چکیده [English]

Salvia L. is a large genus of Lamiaceae with 58 species in Iran. Essential oils, terpenoids, derivatives of phenolic acids and flavonoids are the main secondary metabolites constituents of Salvia species. Pharmaceutical properties of the Salvia plants are mainly due to antioxidant activities of these metabolites. In this project, for the first time some phenolic compounds (rosmarinic acid, salvianolic acids A and B) of the leaves and roots from four Iranian wild species of salvia were isolated and measured by HPLC method. Based on our results, leaves and roots of S. verticillata were the richest sources of rosmarinic acid (41.53±0.88 and 5.99±0.19 mg/g DW, respectively). Salvianolic acid B varied from 26.89±4.95 mg/g DW in the leaves of S. officinalis to 75.71±2.74 mg/g DW in the leaves of S.nemorosa. Also, the highest content (10.68±3.12 mg/g DW) of this phenolic compound was determined in the roots of S. nemorosa. The leaves of S. officinalis and the roots of S. nemorosa with values of 4.55±0.77 and 6.68±1.85 mg/g DW had the highest contents of salvianolic acid A. The results showed that the leaves were rich in phenolic acids and among them, salvianolic acid B was the most abundant constituent and rosmarinic acid and salvianolic acid A were in the next place. In conclusion, our results suggested that some Iranian wild species such as S. verticillata and S. nemorosa with high capacity of production and storage of phenolic acids can be introduced as potent natural sources for medicinal purposes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Phenolic acids
  • Rosmarinic acid
  • Salvia L
  • Salvianolic acid A
  • Salvianolic acid B

بررسی مقایسه­ای محتوای رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسید­های A و B در 4 گونه مریم­گلی (.Salvia L) خودروی ایران 

مرضیه فتوت1، طیبه رجبیان1*، عذرا صبورا2، مسعود رنجبر3 و رقیه السادات اجتهد4

1 تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

2 تهران، دانشگاه الزهرا، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی 

3 همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

4 کاشان، دانشگاه کاشان، دانشکده شیمی، گروه زیست­فناوری

تاریخ دریافت: 16/9/92               تاریخ پذیرش: 2/11/92 

چکیده

مریم­گلی (.Salvia L)، یکی از بزرگ­ترین جنس­های تیره نعناعیان (Lamiaceae) با 58 گونه در ایران است. روغن­های اسانسی، ترپنوئیدها، مشتقات اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها، متابولیت­های ثانوی اصلی گونه­های مریم­گلی را تشکیل می­دهند و خواص دارویی این گیاهان به طور عمده مربوط به فعالیت­های پاد­اکسایشی این ترکیبات می­باشد. در این پژوهش، برخی اسیدهای فنلی (رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسیدهای A و B)، در برگ و ریشه 4 گونه مریم­گلی خودروی ایران برای اولین بار به روش HPLC جداسازی و سنجش شدند. بر طبق نتایج حاصل، S. verticillata با بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در برگ و ریشه ( به ترتیب 88/0±53/41 و 19/0±99/5 میلی­گرم بر گرم وزن خشک)، به عنوان غنی­ترین منبع این اسید فنلی شناسایی شد. مقدار سالویانولیک اسید B از 95/4±89/26 میلی­گرم بر گرم وزن خشک در برگ S. officinalis ، تا 20/9±03/59 میلی­گرم برگرم وزن خشک در برگ S. nemorosa، متغیر بود. همچنین بیش­ترین محتوای سالویانولیک اسیدB  (12/3±68/10 میلی­گرم برگرم وزن خشک) در ریشه S. nemorosa برآورد شد. برگ S. officinalis و ریشه S. nemorosa به ترتیب با 77/0±55/4 و 10/0±67/0 میلی­گرم برگرم وزن خشک، بیش­ترین محتوای سالویانولیک اسید A را به خود اختصاص دادند. نتایج نشان داد که برگ­ها نسبت به ریشه­ها از اسید­های فنلی غنی­تر بودند و در بین آن­ها سالویانولیک اسیدB  بیشترین مقدار را تشکیل می­دهد؛ رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسیدA  در مراتب بعدی قرار داشتند. نتایج این مطالعه نشان داد که
 S. verticillata و S. nemorosa با توان بالای تولید و ذخیره­سازی اسیدهای فنلی می­توانند به عنوان گونه­های شاخص برای مصارف دارویی معرفی شوند.

واژه های کلیدی: اسید­های فنلی، رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسید A، سالویانولیک اسیدB ، مریم­گلی

* نویسنده­ مسئول، تلفن: 51212244-021، پست الکترونیکی: rajabian@shahed.ac.ir

مقدمه

 

مریم­گلی (Salvia L.)، یکی از  بزرگ­ترین جنس­های تیره نعناعیان (Lamiaceae)، شامل حدود 900 گونه علفی، بوته­ای، چند ساله، به ندرت یک ساله یا دو ساله می­باشد، که اغلب به شدت معطرهستند و در مناطق گرم و معتدل جهان رشد می­کنند (6 و 16). اعضای این جنس در منطقه مدیترانه، جنوب شرق آسیا و آمریکای مرکزی انتشار دارند (19). 58 گونه از این جنس درمناطق مختلف ایران یافت شده است که از این تعداد  17  گونه  بومی  می­باشند  (6،

16و20).

کلمه Salvia از واژه یونانی"Salvere" به معنی شفا­دهنده یا شفا­بخش مشتق شده است و به کاربردهای دارویی چندگانه گیاهان این تیره اشاره دارد (6و7). شهرت گونه­های مریم­گلی به علت خواص دارویی آن­ها می­باشد و در طب سنتی برای درمان سرماخوردگی، جراحت­ها و عفونت­های پوستی، سردرد، کم­خونی مغزی، اختلال حافظه و همچنین هپاتیت استفاده می­شوند (19). بسیاری از گونه­های مریم­گلی به عنوان چای گیاهی و طعم­دهنده غذا، همچنین در صنایع آرایشی، عطر سازی و دارویی استفاده می­شوند (3).

ترپنوئیدها (دی و تری­ترپنوئیدها) و فلاونوئیدها از اجزای اصلی متابولیت­های ثانوی گونه­های مریم­گلی می­باشند (2و15). اسیدهای فنلی و مشتقات آن­ها درتمامی گونه­ها وجود دارند و در فعالیت­های زیستی متعددی شرکت می کنند (24). کافئیک اسید در بیوشیمی تیره نعناعیان نقش محوری دارد و در گونه­های مریم­گلی، واحد سازنده انواع متابولیت­های فنلی از مونومرهای ساده تا انواع فراورده­های الیگومری می­باشد. رزمارینیک اسید فراوان­ترین دیمر کافئیک اسید و مهمترین ترکیب فنلی است که فعالیت پاد­اکسایشی گونه­های مریم­گلی را به طور عمده به علت وجود این ترکیب می­دانند. شکل­های تری­مر و تترامر کافئیک اسید به علت داشتن خصوصیات منحصر به فرد زیستی از اهمیت دارویی قابل توجهی برخوردار هستند. تری­مرهای مشتق شده از کافئیک اسید، بزرگترین گروه متابولیت­های ثانوی را در مریم­گلی تشکیل می­دهند و سالویانولیک اسید A با خواص پاداکسایشی، پادتوموری و حفاظت ازغشاهای زیستی، در این گروه جای دارد. سالویانولیک اسید B که  دیمری از رزمارینیک اسید و تترامری از کافئیک اسید می­باشد، اغلب به صورت نمکهای آمونیوم، پتاسیم و منیزیم یافت می­شود(12و14). این مشتقات کافئیک اسید فراوان­ترین ترکیبات آب­دوست گونه­های مریم­گلی هستند (شکل1) که دارای فعالیت­های زیستی متنوعی شامل: پاد­اکسایشی، پاد­پلاکتی، پاد­توموری و پاد­ویروسی می باشند (15). مقدار تولید این ترکیبات در اندام­های هوایی به طورگسترده­ای به عوامل ژنتیکی و شرایط محیطی وابسته است (2).

براساس اطلاعات موجود، به­طورعمده مطالعات برروی محل سنتز و مسیرهای بیوسنتزی (مسیر شیکیمیک اسید و مسیر فنیل­پروپانووئیدها) اسیدهای فنلی محدود به ریشه­ها، برگ­ها، ساقه­ها و ریشه­های مویین S. miltiorrhiza می باشند (22). همچنین تعداد معدودی از گزارش­ها نیز بر روی تولید رزمارینیک اسید در اندام­های نوپدید (نوشاخه و نوریشه­های باززایی شده)، کالوس و کشت­های تعلیقی سلولی S. officinalis ارائه شده­اند (18). مسیر بیوسنتزی رزمارینیک اسید در گونه­ای از حسن­یوسف (Coleus blumei) از تیره نعناعیان مورد مطالعه قرارگرفته ­است و بررسی­ها نیز نشان داده­اند که تمامی اندام­ها در شرایط کشت  in vitroتوان سنتز و ذخیره این اسید فنلی را دارند و مقدار تولید آن می­تواند تحت تاثیر عواملی چون گونه، مرحله نموی و سن، نوع اندام، رده سلولی و شرایط کشت تغییر نماید (8).

با توجه به گزارش­های موجود در مورد وجود ترکیبات دارویی ارزشمند و اهمیت و مصارف متعدد آن­ها در پزشکی و صنایع غذایی، بهداشتی و آرایشی و با توجه به انتشار گسترده­ی گونه­های مریم­گلی در ایران و محدود بودن اطلاعات در ارتباط با آن­ها، هدف اصلی این پژوهش، شناسایی واندازه­گیری برخی ترکیبات فنلی دارویی در تعدادی از گونه­های خودروی مریم­گلی ایران تعیین شد.

مواد و روشها

نمونه­های گیاهی و آماده سازی آنها: نمونه­های گیاهی از مناطق مختلف ایران و در زمان گلدهی کامل ( تابستان 1391) جمع آوری و یک نمونه هرباریومی از هر گونه در هرباریوم مرکزی دانشگاه همدان (BASUH) نگهداری شد. در جدول 1 مشخصات مربوط به گونه­های مورد مطالعه ذکر شده است. اندام­های برگ و ریشه از نمونه­های گیاهی جداسازی و در دمای اتاق خشک شدند، سپس تا زمان انجام آزمایش در دمای 4 درجه سانتی­گراد و در تاریکی نگهداری شدند.

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

    

 

 

 

 

شکل1- ساختار شیمیایی کافئیک اسید و برخی مشتقات آن (14).


استخراج ترکیبات فنلی از نمونه­ها:  نمونه­های پودر شده برگ و ریشه (1گرم) به طور مجزا در متانول (2×10 میلی­لیتر) برای مدت 24 ساعت، در دمای اتاق و در تاریکی خیسانده شدند. سپس حلال هر یک از عصاره­ها بعد از فیلتر شدن در شرایط خلاء و دردمای40 درجه سانتی­گراد تبخیر شد. عصاره­های خشک شده تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی­گراد و در تاریکی نگهداری شدند (17).

 

 

جدول1- نام، ویژگی­های جغرافیایی محل جمع­آوری و شماره هرباریومی گونه­های مورد مطالعه مریم­گلی ایران.

شماره هرباریومی

میانگین رطوبت سالیانه (%)

میانگین بارش سالیانه (میلی­متر)

میانگین دمای سالیانه

(درجه سانتی­گراد)

ارتفاع از سطح دریا (متر)

مشخصات جغرافیایی

محل جمع آوری

        نام گونه

33995BASU

55-50

300-250

28

5/937

N:36 °14 '93/17 ''

E:59 °40 '48/25 ''

استان خراسان رضوی: مشهد، جاده سرخس، تنگلشور

S. officinalis L. 

32965 BASU

65-60

350-300

25

1889

N: ″66/11 ′23 °37

E:  ″32/37 ′2 °57

استان خراسان شمالی: رئین

S. sclarea L. 

33996 BASU

65-60

400-380

24

2200

N:36 ° 22'''19

E: 50° 32'''10

استان قزوین: الموت شرقی، بعداز روستای جولادک

S. verticillata L. 

33997 BASU

65-60

310-280

24

1940

N: 36° 26' 1''

E: 49° 9' 53''

استان قزوین: شهرستان طارم، جنگل علی­آباد

S. nemorosa L. 

 

                                                                                                                                                                                     


آماده­سازی محلول­های استاندارد: محلول­های ذخیره نمونه­های استاندارد رزمارینیک اسید (آلدریچ)، سالویانولیک اسید B و سالویانولیک اسید A (سیگما) در اتانول خالص تهیه و برای رسم منحنی استاندارد در محدوده­ای از غلظت­های مناسب رقیق شدند؛ سپس به دستگاه HPLC تزریق و سطح زیر منحنی قله جذبی هر نمونه در طول موج 280 نانومتر تعیین گردید. منحنی استاندارد مربوط به هر اسید فنلی بر اساس غلظت محلول­های استاندارد و سطح زیر قله آن­ها رسم و از معادله حاصل، برای سنجش مقدار اسیدهای فنلی در نمونه­های مورد مطالعه استفاده شد (مشخصات مربوط به  منحنی­های استاندارد اسیدهای فنلی مورد مطالعه  در  جدول  2  نشان

داده شده است).

 

 

جدول2- مشخصات مربوط به منحنی­های استاندارد تهیه شده برای سه اسید فنلی مورد مطالعه.

ضریب رگرسیون   (r²)

معادله منحنی استاندارد

محدوده غلظت مورد استفاده (میکروگرم بر میلی­لیتر)

غلظت محلول ذخیره
(میلی­گرم بر میلی­لیتر)

نام اسید فنلی

996/0

y = 41606x

100-0

1

رزمارینیک اسید

988/0

y = 58/537x

1000-0

1

سالویانولیک اسید B

996/0

y = 19497x

80-0

9/0

سالویانولیک اسید A

 


تفکیک اجزای فنلی به روش HPLC: مقدار اسیدهای فنلی با روش HPLC سنجیده شد. بدین منظور از دستگاه HPLC مدل Smartline (Kenuer ، آلمان) مجهز به پمپ­های چهارگانه و ستون فاز معکوس C18 Eurospher-100
(mm 4× mm125 با اندازه ذراتμm 5) و یک آشکارساز UV-VIS(مدلD-14163) استفاده شد. داده­ها با نرم افزار  ChromGate (ویرایش 1/3) پردازش شدند. تمامی حلال­های مورد استفاده در این روش مخصوص HPLC بودند. برای شستشوی ستون از یک برنامه زمانی با شیب خطی استفاده شد. فاز متحرک شامل دو سیستم آب اسیدی شده با استیک اسید 2% (حلال A) و استونیتریل(حلال B) بود. ابتدا شستشوی ستون با نسبت 90:10 (v/v) از دو حلالB : A آغاز شد، سپس این نسبت در دقیقه 15 به صورت خطی به 75:25 (v/v) تغییر یافت. بعد از آن نسبت حلال  A تا دقیقه 40 به 20% کاهش یافت و در دقیقه 45 به صفر رسید. این نسبت تا دقیقه 50 ثابت ماند و در 5 دقیقه پایانی، حجم فاز متحرک A به طور خطی به 90% افزایش یافت. آشکارسازی نمونه­ها در طول موج 280 نانومتر و با جریان عبوری یک میلی­لیتر بر دقیقه انجام شد و حجم هر تزریق 20میکرولیتر (4 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره) بود. هر نمونه با 3 بار تکرار به دستگاه تزریق شد.

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها: برای تعیین معنی­دار بودن تفاوت بین میانگین­ها، ابتدا داده­ها به کمک آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) توسط نرم افزار SPSS (ویرایش17) تجزیه و تحلیل شدند؛ سپس میانگین­ها با کمک آزمون چند دامنه­ای دانکن مقایسه و گروه­بندی و تفاوت بین آن­ها در سطح05/0 P<تعیین شد. نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel رسم شدند.

نتایج 

اسیدهای فنلی رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسید A و سالویانولیک اسید B به روش HPLC در اندام­های ریشه و برگ چهار گونه مریم­گلی شناسایی و تعیین مقدار شدند. همان طور که در شکل a2 نشان داده شده است، کروماتوگرام اسیدهای فنلی استاندارد، 3 قله مشخص با زمان­های بازداری 72/19، 18/21 و 75/22 دقیقه را  آشکار ساختند که به ترتیب مربوط به رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسید B و سالویانولیک اسید A بودند. همچنین آنالیز کیفی عصاره­های اتانولی اندام­های گونه­های مورد مطالعه به روش HPLC حضور این ترکیبات فنلی را در آن­ها تائید نمود. HPLC کروماتوگرام­های عصاره اتانولی برگ  S. sclarea و ریشه S. nemorosa  به عنوان نمونه در شکل­های b2 و c2 نشان داده شده­اند (شکل2). 

نتایج حاصل از تعیین محتوای رزمارینیک­ اسید و سالویانولیک اسید­های A و B، تفاوت معنی­داری را در محتوای این اسیدهای فنلی در دو اندام برگ و ریشه­ی چهار گونه مریم­گلی مورد مطالعه نشان داد (شکل 3).

 

 

 

شکل2-  HPLCکروماتوگرام­های محلول­های اتانولی اسیدهای فنلی استاندارد(a)، عصاره اتانولی برگ S. sclarea (b) و عصاره اتانولی ریشه
  S. nemorosa (c)، رزمارینیک اسید (RA)، سالویانولیک اسید B (Sal B) و سالویانولیک اسید A (Sal A).

 

 



 

 

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3- نمودار حاصل از مقایسه میانگین محتوای 3 اسید فنلی رزمارینیک اسید (a)، سالویانولیک اسید B (b) و سالویانولیک اسید A (c) در برگ و ریشه چهار گونه مریم­گلی مورد مطالعه. حروف غیرمشابه در مورد هر اندام نشان­دهنده وجود تفاوت معنی­دار بین میانگین­ها در سطح احتمال
05/0  P< می­باشد.

 

بر طبق نتایج حاصل بیش­ترین میزان رزمارینیک اسید به مقدار88/0±53/41 میلی­گرم بر گرم وزن خشک در برگ­های گونه  S. verticillata برآورد شد و بعد از آن گونه
S. officinalis با 3/0±02/15 میلی­گرم بر گرم وزن خشک قرار داشت. کمترین مقدار رزمارینیک اسید در برگ
 S. sclarea (12/0±43/5 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) بدست آمد که تفاوت معنی­داری با مقدار بدست آمده برای این اسید فنلی در برگ S. nemorosa نداشت.

همچنین میانگین محتوای این اسید فنلی در ریشه­ گونه­های مورد مطالعه تفاوت معنی­داری نشان داد، به طوری­ که ریشه­های S. verticillata و S. nemorosa به ترتیب با 19/0±99/5 و14/0±92/4 میلی­گرم بر گرم وزن خشک، حاوی بیش­ترین میزان رزمارینیک اسید بودند. هرچند، ریشه­های S. officinalis (25/0±31/2 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) وsclarea S. (21/0±38/1 میلی­گرم برگرم وزن خشک) حاوی مقادیر کمتری از این اسید فنلی بودند.

 نتایج حاصل از بررسی مقدار سالویانولیک اسید B در دو اندام گونه­های مریم­گلی نشان داد که برگ­ها نسبت به ریشه­ها از این اسید فنلی غنی­تر می­باشند. مقدار این ترکیب فنلی از 20/9±03/59 میلی­گرم برگرم وزن خشک در برگ S. nemorosa تا 95/4±89/26 میلی­گرم بر گرم وزن خشک در برگ S. officinalis متغیر بود. برگ­ گونه­های S. sclarea (47/4± 27/40 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) وS. verticillata (59/1±71/41 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) از نظر محتوای این اسید فنلی تفاوت معنی­داری را نشان ندادند (شکل 3). بیش­ترین مقدار سالویانولیک اسید B در ریشه S. nemorosa (12/3±68/10 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) سنجش شد که تفاوت معنی­داری را با مقدار این اسید فنلی در ریشه
S. verticillata (55/2±57/9 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) نشان نداد. این ترکیب در ریشه S. sclarea شناسایی نشد.

محتوای سالویانولیک اسید A نسبت به سایر ترکیبات فنلی در اندام­های مورد مطالعه کمتر بود. در برگ­ها، بیش­ترین میزان این اسید فنلی در S. officinalis (77/0±55/4 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) گزارش شد اما بین میانگین­های محتوای سالویانولیک اسید A برگ سایر گونه­ها تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (شکل b3).

بر اساس نتایج حاصل، به استثنای ریشه­ S. nemorosa که حاوی مقدار نسبتا قابل توجهی از سالویانولیک اسیدA  (1/0± 67/0 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) بود، محتوای این اسید فنلی در ریشه 3 گونه دیگر اندک بوده و تفاوت معنی­داری بین مقادیر برآورد شده، مشاهده نشد.

بحث

با توجه به اهمیت دارویی اسیدهای فنلی رزمارینیک اسید، سالویانولیک اسید A و سالویانولیک اسید B، در پژوهش حاضر مقدار این ترکیبات فنلی در 3 گونه­ی خودروی مریم­گلی در مقایسه با گونه­ی دارویی(S. officinalis) مورد مطالعه قرار گرفت. بر طبق نتایج حاصل از آنالیز نمونه­ها به روش HPLC، حضور هر سه اسید فنلی در تمام نمونه­های مورد مطالعه تائید شد و مقادیرآن­ها در دو اندام برگ و ریشه در بین گونه­های مختلف تفاوت معنی­داری را نشان ­داد. سالویانولیک اسید B با بیش­ترین محتوا، فراوان­ترین اسید فنلی را در نمونه­های مورد مطالعه تشکیل می­داد و رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسید A به ترتیب در مراتب بعدی قرار داشتند. همچنین برگ­ها نسبت به ریشه­ها از نظر مقدار این اسیدهای فنلی غنی­تر بودند.

 براساس اطلاعات ما و مروری بر گزارش­های موجود (1، 15، 21 و 25)، محتوای رزمارینیک اسید در اندام­های هوایی و برگ­ها در گونه مریم­گلی دارویی با توجه به نوع عصاره­ تهیه شده و محل جمع­آوری نمونه­ها، بین 5/5 تا 3/39 میلی­گرم بر گرم وزن خشک برآورد شده است. در پژوهش حاضر، مقدار رزمارینیک اسید در برگ این گونه مریم­گلی (53/0±02/15میلی­گرم بر گرم وزن خشک) با مقادیر گزارش شده در مطالعات فوق قابل مقایسه بود، اما محتوای این اسید فنلی در ریشه­ها (25/0±31/2 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) تقریبا 4 برابر کمتر از مقدار گزارش شده در ریشه  S. officinalis(36/0±18/8 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) مورد مطالعه توسط Grzegorczyk و همکاران بود (9). مقدار این اسید فنلی در ریشه این گونه دارویی در مطالعه حاضر قابل مقایسه با مقدار گزارش شده (35/3 میلی گرم بر گرم وزن خشک) در گزارش Min-Hui و همکاران می­باشد (15).

مقدار رزمارینیک اسید در برگ­های جمعیت S. sclarea ایران در پژوهش حاضر، تقریبا 7 برابر کمتر از مقدار گزارش شده برای این اسید فنلی در نمونه مورد مطالعه توسط Bandoniene وهمکاران (9/1±1/41 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) بود (1). در حالی­که محتوای رزمارینیک اسید برگ گونه فوق در پژوهش حاضر با مقدار گزارش شده (90/3 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) برای برگ نمونه­ی کشت شده توسط Janicsák و همکاران (11) در یک مزرعه آزمایشگاهی در مجارستان، به روش چگالی سنجی با کروماتوگرافی لایه نازک قابل مقایسه بود.

 با توجه به نتایج مطالعه حاضر، محتوای رزمارینیک اسید در برگ­های جمعیت S. verticillata جمع­آوری شده از استان قزوین (88/0±53/41 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) تفاوت معنی­داری را با مقادیر گزارش شده برای این اسید فنلی در دو زیرگونه­ی S. verticillata رویش یافته در ترکیه (89/0±7/28 و 67/1±1/24 میکروگرم بر میلی­گرم وزن خشک) نشان داد (23).

بر طبق یافته­های این پژوهش، محتوای رزمارینیک اسید در برگ S. nemorosa (13/0±07/7 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) تفاوت معنی­داری را با محتوای این اسید فنلی (69/2 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) در گزارش Coisin و همکاران (4) بر روی جمعیتی از این گونه در رومانی نشان داد.

در مجموع بین گونه­های مورد مطالعه در این پژوهش،
 S. verticillata با بیش­ترین محتوای رزمارینیک اسید در برگ (5/2 تا 8 برابر) و ریشه (بیش از دو برابر)، نسبت به سایر گونه­ها تفاوت معنی­داری را نشان داد.

تعداد گزارش­های منتشر شده در مورد سالویانولیک اسیدها در گونه­های مریم­گلی اندک بوده و اغلب محدود به گونه­ی S. miltiorrhiza می­باشد. در پژوهشی که در سال 2008 توسط یک تیم تحقیقاتی چینی صورت گرفت، محتوای 9 اسید فنلی درچند گونه مریم­گلی موجود در چین سنجش شد (15). بر خلاف نتایج این گروه که موید عدم حضور سالویانولیک اسیدها در S. officinalis بود، حضور این ترکیبات فنلی در برگ و ریشه این گونه مریم­گلی در پژوهش پیش­رو تائید شد. همچنین براساس نتایج محققان فوق،  S. bowleyana غنی­ترین گونه در بین گونه­های مورد مطالعه از نظر محتوای سالویانولیک اسیدB ( مقدار52/82 میلی­گرم بر گرم وزن خشک ریشه) معرفی شد. در حالی­که در بین گونه­های مورد مطالعه در این پژوهش شاخص­ترین گونه از نظر محتوای این اسید فنلی، S. nemorosa (20/9±03/59 میلی­گرم بر گرم وزن خشک برگ) بود. در فارماکوپه­های دارویی چین (2005 و 2010)، محتوای سالویانولیک اسید B به عنوان نشانگر و شاخص برای تعیین کیفیت ریشه S. miltiorrhiza (Danshen) معرفی شده است و ریشه­هایی که محتوای این اسید فنلی در آن­ها کمتر از 3%  وزن خشک نباشد، برای مصارف دارویی مناسب می­باشند(5،10 و13).

براساس نتایج Min-Hui و همکاران (15) حضور سالویانولیک اسید A تنها محدود به ریشه
S. miltiorrhiza بود، همچنین براساس مشاهدات این محققان اسیدهای فنلی به طور عمده در ریشه­ی گونه­ها­ی مریم­گلی وجود داشتند. در صورتی ­که تمام گونه­های مریم­گلی مورد مطالعه در پژوهش حاضر واجد سالویانولیک اسید A بودند و بیشترین مقدار آن در ریشه­ی  S. nemorosa(1/0±67/0 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) گزارش شد. بین محتوای سالویانولیک اسید A در برگ
S. officinalis (3 تا 4 برابر بیشتر) و ریشه
S. nemorosa (تقریبا 2 تا 9 برابر بیشتر) با مقادیر این اسید فنلی در سایر گونه­ها تفاوت معنی­داری مشاهده شد. علاوه براین، برگ گونه­های مریم­گلی ایرانی نسبت به ریشه­ها از نظر محتوای اسیدهای فنلی غنی­تر بودند.

همچنین ارتباط بین عوامل محیطی (ارتفاع از سطح دریا، میانگین دما، بارش و رطوبت سالیانه) مناطق جمع­آوری گونه­های مریم­گلی و محتوای سه اسید فنلی در ریشه و برگ آنها مورد مطالعه قرار گرفت و همبستگی معنی­داری بین تغییرات در محتوای آن­ها و این عوامل مشاهده نشد. لذا به ­نظر می­رسد که تفاوت­های مشاهده شده بین میانگین محتوای اسید­های فنلی در این پژوهش بیشتر ناشی از تفاوت­های ژنتیکی بین گونه­های مورد مطالعه باشند.

نتیجه­گیری

در پژوهش انجام شده حضورسالویانولیک اسیدهای A و  Bو رزمارینیک اسید برای اولین بار در تعدادی از گونه­های مریم­گلی خودروی ایران تایید و مقادیر آن­ها مورد سنجش قرار گرفت. نتایج نشان داد که برگ­ها نسبت به ریشه­ها از این ترکیبات غنی­تر بودند و در بین این سه اسید­ فنلی، سالویانولیک اسید B بیشترین مقدار را تشکیل می­داد و رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسید A در مراتب بعدی قرار می­گرفتند. با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد که محل اصلی سنتز و ذخیره سازی این اسیدهای فنلی در برگ­ها باشد، چراکه برگ گونه­های مورد مطالعه نسبت به اندام ریشه حاوی اسیدهای فنلی بیش­تری بودند. اما برای اظهار نظر قطعی در این زمینه، نیاز به تحقیقات و مطالعات بیش­تری می­باشد. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد که علاوه بر گونه دارویی S. officinalis، گونه­های خودرویی چون S. verticillata و S. nemorosa، با توان بالای تولید و ذخیره­سازی اسیدهای فنلی رزمارینیک اسید و سالویانولیک اسیدهای A و B می­توانند به عنوان گونه­های شاخص که قابلیت اهلی شدن در مقیاس صنعتی و مصارف دارویی را دارند، معرفی شوند.

درمجموع طبق نتایج حاصل از این پژوهش و با توجه به تعداد، تنوع و انتشار جمعیت­های مختلف گونه­های خودروی مریم­گلی در ایران، انجام تحقیقات بیش­تر در زمینه­های فیتوشیمی، بیوشیمی، فیزیولوژی، ژنتیک و مولکولی به منظور افزایش محتوای متابولیت­های دارویی و اهلی کردن این گیاهان، پیشنهاد می­شود. همچنین، از آنجایی که کمیت و کیفیت متابولیت­های ثانوی از جمله ترکیبات فنلی در گیاهان می­تواند تحت تاثیر عوامل درونی و محیطی از جمله ژنتیک، شرایط آب و هوایی و جغرافیایی زیستگاه قرار گیرد، بررسی جمعیت­های مختلف گونه­های مریم­گلی در مناطق مختلف به منظور دست یافتن به بهترین منابع طبیعی این ترکیبات، امری ضروری به نظر می­رسد.

تشکر و قدردانی 

نگارندگان این مقاله لازم می دانند تا مراتب قدردانی و سپاس خود را از کلیه مسئولین و همکاران محترم در دانشکده علوم پایه دانشگاه شاهد به جهت مساعدت و فراهم آوردن امکانات لازم برای انجام این پژوهش، اعلام دارند.

1- Bandoniene, D., Murkovic, M. and Venskutonis, P. R., 2005, Determination of rosmarinic acid in sage and borage leaves by high-performance liquid chromatography with different detection methods. Journal of Chromatographic Science, 43(7): 372-376.

2- Başkan, S., Öztekin, N. and Erim, F. B., 2007, Determination of carnosic acid and rosmarinic acid in sage by capillary electrophoresis. Food Chemistry, 101: 1748-1752.

3- Bettaieb, I., Zakhama, N., Aidi Wannes, W., Kchouk, M.E. and Marzouk, B., 2009, Water deficit effects on Salvia officinalis fatty acids and essential oils composition. Scientia Horticulturae, 120: 271-275.

4- Coisin, M., Necula, R., Grigoraş, V., Gille, E., Rosenhech, E., and Magdalena Zamfirache, M., 2012, Phytochemical evaluation of some Salvia species from Romanian flora. Scientific Annals of Alexandru Ioan Cuza University of Iasi. New Series, Section 2. Vegetal Biology, 58(1):35-44.

5- Dong, J., Wan, G., and Liang, Z., 2010, Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture. Journal of Biotechnology, 148: 99-104.

6- Ebrahimabadi, A. H., Mazoochi, A., JookarKashi, F., Djafari-Bidgoli, Z. and Batooli H., 2010, Essential oil composition and antioxidant and antimicrobial properties of the aerial parts of Salvia eremophila Boiss. from Iran. Food and Chemical Toxicology, 48:1371-1376.

7- Gören, A.C., Kilic, T., Dirmenci, T. and Bilsel, G., 2006, Chemotaxonomic evaluation of Turkish species of Salvia: Fatty acid compositions of seed oils. Biochemical Systematics and Ecology, 34:160-164.

8- Grzegorczyk, I., Bilichowski, I., Mikiciuk-Olasik, E. and Wysokińska, H., 2005, In vitro cultures of Salvia officinalis L. as a source of antioxidant compounds. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 74(1): 17-21.

9- Grzegorczyk, I., Matkowski, A. and H., Wysokińska, 2007, Antioxidant activity of extracts from in vitro cultures of Salvia officinalis L. Food Chemistry, 104: 536-541.

10- He, C-E., Wei, J., Jin, Y., and Chen, S., 2010, Bioactive components of the roots of Salvia   miltiorrhiza: Changes related to harvest time and germplasm line. Industrial Crops and Products, 32: 313-317.

11- Janicsák, G., Máthá, I., Miklóssy-Vári V. and Blunden, G., 1999, Comparative studies of the rosmarinic and caffeic acid contents of Lamiaceae species. Biochemical Systematics and Ecology, 27: 733-738.

12- Kamatou, G. P. P., Makunga, N. P., Ramogola, W. P. N. and Viljoen, A. M., 2008, South African Salvia species: A review of biological activities and phytochemistry. Journal of Ethnopharmacology, 119: 664-672.

13- Li, X-B., Wang, W., Zhou, G-J., Li, Y., Xie, X-M., and Zhou, T-S., 2012, Production of salvianolic acid B in roots of Salvia miltiorrhiza (Danshen) during the post-harvest drying process. Molecules, 17: 2388-2407.

14- Lu, Y. and Foo, L.Y., 2002, Polyphenolics of Salvia-a review. Phytochemistry, 59: 117–140.

15- Min-Hui, L., Jian-Min, C., Yong, P. and Pei-Gen, X., 2008, Distribution of phenolic acids in Chinese Salvia plants. World Science and Technology, 10(5): 46-52.

16- Mozaffarian, V., 1996, Dictionary of Iranian plant names. Farhang Moaser, Tehran, p. 477.

17. Öztürk, M., Duru, M.E., Ince, B., Harmandar, M. and Topçu, G., 2010, A new rapid spectrophotometric method to determine the rosmarinic acid level in plant extracts. Food Chemistry, 123:1352-1356.

18- Petersen, M., 2013, Rosmarinic acid: New aspects. Phytochemistry Reviews, 12:207-227.

19- Rauter, A. P., Dias, C., Martins, A., Branco, I., Neng, N. R., Nogueira, J. M., Goulart, M., Silva, F. V. M., Justino, J., Trevitt, C. and Waltho, J. P., 2012, Non-toxic Salvia sclareoides Brot. extracts as a source of functional food ingredients: Phenolic profile, antioxidant activity and prion binding properties. Food Chemistry, 132: 1930-1935.

20- Sepehry Javan, Z., Rahmani, F. and Heidari, R., 2012, Assessment of genetic variation of genus Salvia by RAPD and ISSR markers. Australian Journal of Crop Science, 6(6): 1068-1073.

21- Shekarchi, M., Hajimehdipoor, H., Saeidnia, S., Gohari, A. R. and Hamedani, M. P., 2012, Comparative study of rosmarinic acid content in some plants of Labiate family.  Pharmacognosy Magazine, 8(29): 37-41. 

22- Zhao S.J, Zhang J.J, Yang L, Wang Z.T and Hu Z.B., 2011, Determination and biosynthesis of multiple salvianolic acids in hairy roots of Salvia miltiorrhiza. Acta Pharmaceutica Sinica, 46 (11): 1352-1356.

23- Tepe, B., Eminagaoglu, O., Akpulat, H. A. and Aydin, E., 2007, Antioxidant potentials and rosmarinic acid levels of the methanolic extracts of Salvia verticillata (L.) subsp. verticillata and S. verticillata (L.) subsp. amasiaca (Freyn & Bornm.) Bornm. Food Chemistry, 100: 985-989.

24- Wang, D., Song, Y., Chen, Y., Yao, W., Li, Z., Liu, W., Yue, S. and Wang, Z., 2013, Metabolic pools of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza are enhanced by co-expression of Antirrhinum majus Delila and Rosea1 transcription factors. Biochemical Engineering Journal, 74:115-120.

25- Wang, H., Provan, G. J., and Helliwell, K., 2004, Determination of rosmarinic acid and caffeic acid in aromatic herbs by HPLC. Food Chemistry, 87: 307-311.