نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

سرخارگل گیاهی علفی و چندساله بوده و به لحاظ تجاری گونه­ای بسیار ارزشمند محسوب می­شود. ترکیبات فعال دارویی آن عمدتاً شامل اسیدهای فنولیک و آلکامیدها هستند. به منظور بررسی شرایط ریزازدیادی این گیاه، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه عامل ریزنمونه (هیپوکوتیل و کوتیلدون)، هورمون BAP (0، 2/0، 4/0، 2/1 و 4/2 میلی­گرم در لیتر) و هورمون NAA (0، 05/0، 1/0، 3/0 و 6/0 میلی­گرم در لیتر) در سه تکرار اجرا گردید. نتایج تجزیه واریانس ساده برای صفات کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه­ها بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین برخی از عوامل مورد مطالعه بود. نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل بین عوامل مورد مطالعه نشان داد که بیشترین میزان کالوس­زایی در ریزنمونه کوتیلدون و با تیمار ترکیبی BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) و NAA (0 میلی­گرم در لیتر) به میزان 97 درصد و در ریزنمونه هیپوکوتیل با تیمار ترکیبی BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) وNAA  (6/0 میلی­گرم در لیتر) به میزان 91 درصد بود. تیمار BAP (4/0 میلی­گرم در لیتر) و NAA (0 میلی­گرم در لیتر) با میانگین 3/5 نوساقه در هر ریزنمونه، بیشترین درصد باززایی نوساقه (5/31 و 5/32 %) را به ترتیب در ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل داشت. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Micropropagation of Medicinal Purple Coneflower (Echinacea purpurea L.) Using Cotyledon and Hypocotyl Segments

چکیده [English]

Purple coneflower is a herbaceous and perennial flowering plant and described as a traditional valuable species. It has several active compounds including phenolic acids and alkamides. In order to survey of micropropagation condition of this plant, an experiment was conducted as a factorial arrangment in completely randomized design with three replications. The factors were including explant type (hypocotyl and cotyledon), BAP hormone (0, 0.2, 0.4, 1.2 and 2.4 mg l-1) and NAA hormone (0, 0.05, 0.1, 0.3 and 0.6 mg l-1). Analysis of variance revealed significant differences among some studied treatments for callus induction and regeneration in explants. Results of means comparison for triple interaction among factors indicated that the highest percentage of callus induction occurred on a MS medium containing 0.2 mg l-1 BAP and 0 mg l-1 NAA (97%) in cotyledon and 0.2 mg l-1 BAP and 0.6 mg l-1 NAA (91%) in hypocotyl explant. Moreover, no significant differences observed between two explants. Combination of 0.4 mg l-1 BAP and 0 mg l-1 NAA) has the most effective, providing the highest frequency of shoot regeneration (31.5%) and (32.5%) in cotyledon and hypocotyl explants respectively.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Purple coneflower
  • micropropagation
  • Cotyledon
  • Hypocotyl
  • NAA
  • BAP

ریز­ازدیادی گیاه دارویی سرخارگل (L. Echinacea purpurea) با استفاده از قطعات کوتیلدون و هیپوکوتیل

علیرضا زبرجدی1،2و*، محمد جواد معتمدی1و4، الهام طراوت3 و احمد اسماعیلی5 و 6

1 کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

2 کرمانشاه، دانشگاه رازی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی

3 کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

4 کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، باشگاه پژوهشگران جوان

5 خرم آباد، دانشگاه علوم پزشکی لرستان، مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی 

6 خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 23/1/89               تاریخ پذیرش: 8/5/90 

چکیده 

سرخارگل گیاهی علفی و چندساله بوده و به لحاظ تجاری گونه­ای بسیار ارزشمند محسوب می­شود. ترکیبات فعال دارویی آن عمدتاً شامل اسیدهای فنولیک و آلکامیدها هستند. به منظور بررسی شرایط ریزازدیادی این گیاه، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه عامل ریزنمونه (هیپوکوتیل و کوتیلدون)، هورمون BAP (0، 2/0، 4/0، 2/1 و 4/2 میلی­گرم در لیتر) و هورمون NAA (0، 05/0، 1/0، 3/0 و 6/0 میلی­گرم در لیتر) در سه تکرار اجرا گردید. نتایج تجزیه واریانس ساده برای صفات کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه­ها بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین برخی از عوامل مورد مطالعه بود. نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل بین عوامل مورد مطالعه نشان داد که بیشترین میزان کالوس­زایی در ریزنمونه کوتیلدون و با تیمار ترکیبی BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) و NAA (0 میلی­گرم در لیتر) به میزان 97 درصد و در ریزنمونه هیپوکوتیل با تیمار ترکیبی BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) وNAA  (6/0 میلی­گرم در لیتر) به میزان 91 درصد بود. تیمار BAP (4/0 میلی­گرم در لیتر) و NAA (0 میلی­گرم در لیتر) با میانگین 3/5 نوساقه در هر ریزنمونه، بیشترین درصد باززایی نوساقه (5/31 و 5/32 %) را به ترتیب در ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل داشت.

واژه­های کلیدی: سرخارگل، ریزازدیادی، کوتیلدون، هیپوکوتیل، NAA، BAP.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09181321809 ، پست الکترونیکی:Zebarjadiali@yahoo.com 

مقدمه

 

سرخارگل ارغوانی با نام علمی Echinacea purpurea L.  عضو خانواده Asteraceae بوده و به لحاظ جغرافیایی بومی آمریکای شمالی است. تولید کنندگان عمده آن در اروپا، کشورهای آلمان، سویس، هلند، ایتالیا و اسپانیا هستند. فروش جزئی محصولات این گیاه در آمریکا سالانه بالغ بر 158 میلیون دلار است و در سطح جهانی سالانه 3/1 میلیون دلار تخمین زده شده است. پژوهشهای اخیر مؤسسه NAPRALERT، حضور 216  ترکیب فعال دارویی در E. purpurea را اثبات کرده است (4).  سه گونه از جنس Echinacea  که عموماً دارای مصارف دارویی هستند عبارتند از: E. purpurea ( با مصرف ریشه و قسمتهای هوایی)، E. angustifolia  (با مصرف ریشه) و E. pallida  (با مصرف ریشه) (17). اسیدهای فنولیک، آلکامیدها ، پلی استیلن­ها ، گلیکوپروتئین­ها و پلی ساکاریدها به عنوان ترکیبات فعال بیولوژیکی در گونه­های مختلف Echinacea شناسایی شده­اند (5 و 8). به لحاظ دارویی، عقیده بر این است که گیاه سرخارگل می­تواند سیستم ایمنی را از طریق تحریک تولید سلولهای T و تنفس سلولی (خاصیت آنتی اکسیداسیونی) در برابر سلولهای تومورزا، فعال کند (5).

 برای تحقق بخشیدن به افزایش تقاضا برای این گیاه دارویی مهم، روش­ها و راهکارهای مختلفی ابداع شده است که شامل تکثیر سریع گیاه در شرایط استریل و به دست آوردن گیاهان سالم و معرفی سریع­تر ارقام جدید با صفات مطلوب است (19). در این خصوص، تکنیکهای کشت بافت در محیط in vitro  بسیار ارزشمند هستند. اندامهای تمایز یافته در کشت بافت، سیستم کارآمدی را برای تولید مواد فیتوشیمیایی گیاه سرخارگل ارائه کرده است. در کل، سلول، کالوس و ریشه­های مویی کشت شده در محیط in vitro  می­توانند برای مطالعه مسیر بیوسنتزی مواد فیتوشیمیایی مهم، مورد بهره­برداری قرار گیرند (8).

مطالعات متعددی در زمینه جنبه­های مختلف بهینه­سازی سیستم کشت بافت سرخارگل وجود دارد.  Koroch و همکاران (10 و 11) کالوس­زایی و اندام­زایی غیر مستقیم از ریزنمونه برگ E. purpurea و  E. pallidaرا در غلظتهای مختلف نفتالن استیک اسید (NAA) و 6-بنزیل آمینو پورین (BAP) مورد بررسی قرار دادند. در گزارش دیگر، Mechanda و همکاران (14)، باززایی مستقیم ساقه از قطعات برگی گیاهان بالغ E. purpurea را با استفاده از هورمونهایNAA  و  BAPمورد مطالعه قرار دادند. آنها دریافتند که باززایی در تمامی غلظتهای BAP  که در ترکیب با غلظتهای پایین NAA بوده رخ داده و غلظتهای بالاتر NAA  نیز کاهش تولید کالوس و عدم باززایی را به دنبال داشته است.  باززایی از طریق هورمون TDZ نیز در مورد گیاه سرخارگل در سیستمهای کشت مایع و جامد گزارش شده که هدف، بررسی نقش هورمون TDZ در القاء باززایی و همچنین توسعه ریزازدیادی در شرایط کشت مایع و جامد برای این گیاه بود (9).

هدف از تحقیق حاضر که برای اولین بار در کشور اجرا شده است، بهینه­سازی شرایط ریزازدیادی و  مطالعه تأثیر غلظتهای مختلف هورمونهای اکسین (NAA) و سیتوکنین (BAP) در میزان کالوس­زایی و باززایی گیاه سرخارگل به منظور بررسی پتانسیل نوع ریزنمونه­های این گیاه برای مطالعات آتی در زمینه انتقال ژن به این گونه دارویی مهم بود.

مواد و روشها

برای ضد عفونی، ابتدا بذرهای سرخارگل (جمع آوری شده از ناحیه مرکزی ایران) در  اتانول 70 درصد بمدت 2 دقیقه و پس از شستشو با آب مقطر به مدت 7 دقیقه در محلول کلرید جیوه (HgCl2) 1/0 درصد قرار گرفتند. پس از ضد عفونی، بذور 3 الی 4 مرتبه با آب مقطر استریل در فواصل زمانی 5 دقیقه­ای، تحت شرایط استریل شستشو داده شدند. بذرهای این گیاه روی محیط کشت MS (Murashige and Skoog medium)(16) حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و 7 گرم در لیتر آگار با pH  برابر 8/5  قرار گرفتند. سپس، نمونه­ها به اتاقک رشد تحت شرایط 25 درجه سانتی­گراد و شدت نور 400 لوکس و 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل گردیدند. مراحل این تحقیق در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام گرفت. در فاصله زمانی 15 تا 20 روز، گیاهچه­هایی به طول 8-5 سانتیمتر به دست آمدند. گیاهچه­های مذکور به زیر لامینار ایرفلو منتقل شده و سپس ریزنمونه هیپوکوتیل به قطعات 1-5/0 و کوتیلدون به قطعات 1×1 سانتیمتری برش داده شده و به طور متوسط در هر پتری­دیش، 10 عدد ریز نمونه کشت داده شد (هر تکرار شامل 6 پتری­دیش). تمامی تیمارها پس از 14 روز در محیط مشابه واکشت شدند. پس از گذشت 10 روز  از واکشت و ایجاد کالوس، کالوسها به محیط باززایی (تولید نوساقه) منتقل شدند (شکل 1). میزان کالوس­زایی با شمارش تعداد قطعات کال داده به تعداد کل ریزنمونه­های کشت شده به دست آمد.  کالوسها به مدت 15 روز در محیط­های باززایی نگه داشته شدند و سپس نوساقه­های باززایی شده (شکل 2) به طور متناوب تحت شرایط استریل از کالوسها جدا و به محیط کشت MS عاری از هورمون منتقل شدند تا در این محیط به حداکثر رشد خود برسند. فراوانی باززایی نوساقه با شمارش تعداد نوساقه تولید شده به تعداد ریزنمونه کشت شده در هر پتری دیش محاسبه گردید. پس از 25-35 روز، گیاهچه­هایی با طول حدود 10 سانتیمتر به دست آمدند. گیاهچه­های مذکور به منظور تولید ریشه تحت شرایط استریل به محیط کشت MS حاوی هورمون اندول بوتیریک اسید (IBA به میزان 2 میلی­گرم در لیتر) منتقل شدند (شکل 3 الف).

 

           
     
 
   
 
     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



سرانجام، پس از گذشت 6-4 هفته، گیاهان ریشه دار­شده به آرامی از شیشه خارج شده و در زیر شیر آب شستشو داده شدند تا هیچ گونه آگار و بقایای محیط کشت روی آنها باقی نماند و سپس به گلدانهایی به قطر 10 سانتیمتر شامل ماسه، پرلایت و خاک (به صورت استریل) منتقل شده و در شرایط کنترل شده از نظر میزان رطوبت و حرارت نگهداری شدند (شکل 3 ب). قابل ذکر است که در چند روز اول می­بایست مقدار رطوبت نسبی محفظه بالا نگه داشته شود (90-80 درصد) و از آب مقطر استریل جهت آبیاری گلدانها، استفاده گردد.

محیط کالوس­زایی و باززایی شامل ترکیبات مختلف هورمون 6- بنزیل آمینوپورین (;BAP 0، 2/0، 4/0، 2/1 و 4/2 میلی­گرم در لیتر) هر کدام در سه سطح (برای هر یک از آزمایشات) و هورمون نفتالین استیک اسید (;NAA 0، 05/0، 1/0، 3/0 و 6/0 میلی­گرم در لیتر) هر کدام در سه سطح (برای هر یک از آزمایشات) به عنوان عاملهای اول و دوم و نوع ریزنمونه (هیپوکوتیل و کوتیلدون) به عنوان عامل سوم بود. این تحقیق به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجراء گردید. تجزیه و تحلیل آماری داده­ها با استفاده از نرم افزارهای SPSS و MSTAT-C انجام شد. قبل از انجام تجزیه واریانس نرمال بودن داده­ها مورد بررسی قرار گرفت و تبدیل داده­ها (Arcsin √X) انجام شد. برای انجام آزمون مقایسات میانگین نیز از آزمون چند دامنه­ای دانکن استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس ساده برای صفات کالوس­زایی و باززایی ریزنمونه­ها در جدول 1 ارائه شده است. این نتایج نشان داد که از نظر میزان کالوس­زایی بین ریزنمونه­ها، انواع هورمون­ و برخی اثرات متقابل آنها از جمله اثر متقابل سه گانه (ریز­نمونه × NAA × BAP) تفاوت معنی­داری وجود دارد. بر اساس این جدول فقط برای اثر متقابل ریز­نمونه × NAA از نظر کالوس­زایی اختلاف معنی­دار دیده نشد. این در حالی است که از نظر باززایی نوساقه بین ریزنمونه­ها اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید امّا بین سطوح مختلف هورمونهای مورد استفاده، اثر متقابل ریز­نمونه × BAP و اثر متقابل هورمونهای NAA × BAP اختلاف معنی­داری وجود دارد (جدول 1).

 

جدول 1- تجزیه واریانس برای صفات میزان کالوس­زایی و باززایی

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

 

 

کالوس زایی

باززایی

ریز­نمونه

1

**210/0

ns 031/0

NAA

2

** 224/0

** 133/3

BAP

2

** 191/0

** 757/14

ریز­نمونه × NAA

2

ns 033/0

ns 003/0

ریز­نمونه × BAP

2

** 133/0

*460/1

NAA × BAP

4

* 062/0

**271/5

ریز­نمونه × NAA × BAP

4

** 084/0

ns 251/0

خطای آزمایش

36

021/0

411/0

ضریب تغییرات ( CV%)

 

25/10

12/10

                ns عدم وجود اختلاف معنی­دار،  * و ** بترتیب اختلاف معنی دار در سطح 05/0 و 01/0  

جدول 2- اثر ترکیبات مختلف هورمونهای NAA و BAP روی کالوس­زایی ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل

غلظت هورمون­ (میلی­گرم در لیتر)

ریزنمونه­های تولید کننده کالوس (%)

NAA

BAP

کوتیلدون

هیپوکوتیل

0

0

  f *33/27

 def *00/52

 

2/0

a00/97

 bcde67/63

 

2/1

 abc67/88

 ef67/38

1/0

0

 cde67/60

 bcde33/63

 

2/0

 a33/94

de30/55

 

2/1

 abcd67/77

 abcd67/74

6/0

0

 abc67/85

 abcd00/80

 

2/0

 ab33/91

 ab00/91

 

2/1

 abcd67/77

 abcd33/69

                * اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­دار با هم ندارند.

جدول 3- اثر ترکیبات مختلف هورمونهای NAA و BAP روی باززایی نوساقه­های گیاه سرخارگل

غلظت هورمون­ (میلی­گرم در لیتر)

ریزنمونه­های تولید کننده نوساقه (%)

NAA

BAP

کوتیلدون

هیپوکوتیل

0

0

 e 2/4

e 6/2

 

4/0

a 5/31

a 5/32

 

4/2

bc 7/21

bc 3/21

05/0

0

de 3/7

de 7/6

 

4/0

cd 2/17

cd 8/15

 

4/2

b 9/25

b 1/24

3/0

0

de 6/7

de 4/5

 

4/0

c 9/20

c 1/19

 

4/2

cd 9/17

cd 1/16

            * اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­دار با هم ندارند.


با توجه به نتایج جدول فوق به­منظور فهم بهتر اثر عوامل مورد بررسی اقدام به مقایسه میانگین بروش دانکن شد که نتایج آن برای کالوس­زایی (جدول 2) و باززایی (جدول 3) ارائه شده است. میانگین کل کالوس­زایی در ریزنمونه کوتیلدون 81/77 درصد و در هیپوکوتیل 33/65 درصد بود. در این رابطه، بیشترین میزان کالوس­زایی در ریزنمونه کوتیلدون در تیمار BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) و NAA (0 میلی­گرم در لیتر) به میزان 97 درصد و در ریزنمونه هیپوکوتیل در تیمار BAP (2/0 میلی­گرم در لیتر) وNAA  (6/0 میلی­گرم در لیتر) بمیزان 91 درصد مشاهده گردید (جدول2).

در رابطه با اثر هورمونهای BAP و NAA در میزان باززایی، بیشترین تأثیر در غلظت (0) NAA و (4/0) BAP مشاهده گردید. هورمون BAP به تنهایی یا در ترکیب با غلظتهای مختلف NAA ، تولید نوساقه های متعدد کردند که از این میان تیمار (4/0 میلی­گرم در لیتر) BAP و (0 میلی­گرم در لیتر) NAA با بیشترین میزان باززایی (5/31 درصد و 5/32 درصد ) بترتیب در ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل، موثرترین تیمار در باززایی نوساقه­ها بوده است (جدول 3).

پس از پنج هفته، نوساقه­های متعددی از هر کالوس ایجاد گردید (شکل 2). پس از سازگار نمودن گیاهان با شرایط طبیعی به مدت 2-1 هفته، آن­ها به گلدانهای بزرگ­تر با قطر 20 سانتیمتر منتقل شدند (شکل 3). سطوح و نوع تنظیم کننده­های رشد گیاهی به کار رفته در محیط کشت، موفقیت یک کار کشت بافت را تعیین می کنند. با استفاده از محرکهای رشدی برون زا یا کاربرد تنظیم کننده های رشد درون زا به محیط کشت می­توان تقسیم سلولی، رشد سلولی و تمایز بافتها را تحریک کرد. از طرفی، تعادل بین اکسین و سیتوکنین یک فاکتور مورفوژنیک مهم محسوب می­شود و رشد اولیه ریشه و نوساقه و همچنین فرآیند تمایززایی از بافتهای سازمان نیافته مانند کالوس، توسط غلظت نسبی اکسین و سیتوکنین در محیط کشت تنظیم می شوند (18).  در این رابطه، Murashige (15) اظهار داشته است که نسبت اکسین/سیتوکنین نزدیک به 10 برای رشد سریع کالوسهای تمایز نیافته، نسبتهای نزدیک به 100 برای نمو ریشه و نسبتهای نزدیک به 4 برای رشد نوساقه­ها مناسب هستند. 

پدیده شیشه­ای شدن کالوسها در غلظت 4/2 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید؛ این مشکل قبلاً توسط Ziv (21)، Koroch و همکاران (10 و 11) و موافقی و همکاران (3) در رابطه با غلظتهای بالای هورمون BAP گزارش شده است و کالوسها در این غلظت بالا هورمون قهوه­ای رنگ شده و شروع به نکروزه شدن کردند. قهوه­ای شدن محیط کشت در نتیجه اکسیداسیون پلی فنولهای ترشح شده توسط ریزنمونه­ها می­باشد که یکی از راههای غلبه بر این مشکل، واکشت کردن ریزنمونه­ها در فواصل منظم است (18). همچنین، در مقایسه­ای که بین نحوه قرارگرفتن دو سطح ریزنمونه کوتیلدون روی محیط کشت و تأثیر آن بر باززایی نوساقه­ها این گیاه انجام گرفت، سطح پشتی کوتیلدون بسیار مؤثرتر از سطح رویی عمل کرد. در این تحقیق صحت این پدیده به صورت تجربی مشاهده گردید و مطابق با نتایج Zobayed and Saxena (22) در مورد گیاه سرخارگل می­باشد. علت این امر، تا حدودی به وجود سلولهای مریستمی تولیدکننده جوانه ساقه در سطح رویی کوتیلدون برمی­گردد. در واقع، تقسیمات مکرر سلولهای زیرپوستی برگی اولیه منجر به تشکیل سلولهای مریستمی و متعاقب آن جوانه­های ساقه می­شوند (13).

نتایج به دست آمده در این تحقیق به لحاظ نوع ریزنمونه مورد استفاده با نتایج Koroch و همکاران (10 و 11) مطابقت داشت و این مسئله را اثبات می­کند که ریزنمونه کوتیلدون گیاه سرخارگل پتانسیل ارگانوژنیکی زیادی برای تولید نوساقه دارد و ترکیب هورمونهای رشد برون­زا در محیط کشت روی باززایی ریزنمونه­ها دارای تأثیر به سزایی است. زبرجدی و همکاران (1 و 20) از ریزنمونه­های برگهای لپه­ای (کوتیلدون) و هیپوکوتیل جهت ریزازدیادی گیاه کلزا استفاده نموده­اند. طبق گزارشات ایشان کوتیلدون نسبت به هیپوکتیل برتری نشان داده است. به نظر می­رسد که نوع ریزنمونه به طور قابل ملاحظه­ای روی واکنش باززایی گونه­های Echinaceae تأثیر داشته باشد. در این خصوص، اختلافات مشاهده شده می­تواند در نتیجه اختلاف در روشهای کشت، زمینه ژنتیکی گیاهان والد و وضعیت فیزیولوژیکی بافت ریزنمونه مورد استفاده باشد (1). در این خصوص، سلمانیان و کهریزی (2) گزارش کردند نوساقه­های حاصل از کشت کوتیلدون گیاه کلزا  ناشی از اندام­زایی مستقیم از انتهای بریده می­باشد و انتظار می­رود که کمترین تنوع سوماکلونال را داشته و در حقیقت گیاهچه­های ایجاد شده یکنواختی ژنتیکی بالایی داشته باشند اما نوساقه­هایی که از کشت هیپوکوتیل ایجاد می شوند، ابتدا مرحله کالوس­زایی را طی کرده و سپس هنگام استقرار در محیطهای مناسب گیاهچه های سبز ایجاد می­کنند که می­تواند گیاهچه­هایی با ساختار ژنتیکی متفاوت ایجاد نمایند. در واقع، انواع مختلف ریزنمونه­های یک گیاه و سلولهای مختلف موجود در یک ریزنمونه در موقعیتهای متفاوتی به لحاظ رقابت مورفوژنیکی قرار دارند و در نتیجه نیازمند سیگنالهای متفاوتی برای ورود به یک مسیر مورفوژنیکی خاص می­باشند. پس منطقی به نظر می­رسد که واکنشهای باززایی متفاوت ریزنمونه­ها نسبت به ترکیبات اکسین و سیتوکنین نیز حاصل موقعیتهای مختلف در رقابت مورفوژنیک سلولهای کوتیلدون، هیپوکوتیل و سایر بافتها باشد (12). همچنین، یکی از نتایج به دست آمده در تحقیق حاضر، تأثیر هورمون BAP در مقادیر پایین روی باززایی ریزنمونه­ها بود. نتایج این تحقیق با نتایج Choffe و همکاران (7) مطابقت داشت. آنها در بخشی از آزمایش خود به این نتیجه رسیده بودند که هورمون BAP در مقادیر پایین مؤثرترین تنظیم کننده رشد گیاهی در باززایی ریزنمونه­ها نسبت به سایر سیتوکنین­ها در کشت بافت سرخارگل، محسوب می­شود. در این زمینه Bhatti و همکاران (6) دریافتند که ترکیبهای فاکتوریل BAP ، NAA در القاء اندام زایی ساقه از ریز نمونه های کوتیلدون گونه های E. angustifolia ، E. purpurea ، E. pallida  مؤثر بوده است که نتایج تحقیق حاضر مشابه و در تأیید آزمایش فوق بوده است. در تحقیقی دیگر، Koroch و همکاران (10) با مطالعه ترکیبات مختلف هورمونهای NAA و BAP را روی اندام­زایی غیرمستقیم گونه E. purpurea گزارش کردند که استفاده از BAP به تنهایی در غلظتهای پایین (1-5/0 میلی­گرم در لیتر) تشکیل نوساقه­های نابه جا را تحریک کرده و تولید کالوس را افزایش داده است، در حالی که همزمان با افزایش غلظت NAA درصد باززایی نوساقه­ها کاهش پیدا کرده است.  در این رابطه، موافقی و همکاران (3) اظهار داشتند که تولید مستقیم نوساقه­های حاصل از قطعات هیپوکوتیل در محیط کشت حاوی 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شده است و افزایش مقدار NAA تولید نوساقه را مهار کرده و موجب تشکیل کالوس گردیده است. نتایج به دست آمده در این تحقیق (که برای اولین بار در کشور انجام شده است) در راستای تحقیقات قبلی اثبات کرده است که استفاده از ریزنمونه کوتیلدون، باززایی سریع و آسان را از گیاهان جوان برای اصلاح گران و همچنین بررسی متابولیتهای ثانویه این گیاه را فراهم می­کند و زمینه را برای توسعه کاربرد روشهای انتقال ژن با واسطه آگروباکتریوم، هموار می­سازد.  

  1. زبرجدی، ع.، جلالی جواران، م.، سلمانیان، ع. ه.، کریم زاده، ق. و موسوی، ا. 1385. جداسازی و تهیه ساختار Antisense ژن fae و انتقال آن به گیاه کلزا (Brassica napus). مجله علوم کشاورزی ایران. جلد 1-37، شماره 2. ص: 257-271.
  2. سلمانیان، ع. ه.، کهریزی، د. 1386. مطالعه تأثیر ژنوتیپ و نوع ریزنمونه بر روی باززایی نوساقه گیاهچه­های کلزا (.Brassica napus L). مجله زیست شناسی ایران. جلد 20، شماره 3. ص: 179-171.
  3. موافقی، ع.، حبیبی، ق.، علی اصغر پور، م. 1387. باززایی گیاه دارویی کور Capparis spinosa L. با استفاده کشت قطعات هیپوکوتیل. مجله زیست شناسی ایران. جلد 21، شماره 2. ص: 297-289.
    1. Abbasi, B., Saxena, P. K., Murch, S. J. and Liu, C. Z. 2007. Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 43: 481–492.
    2. Bauer, R. and Wagner, H. 1991. Echinacea species as potential immunostimulatory drugs. In: Wagner, H. and Farnsworth, N. R. (Eds.). Economic and medicinal plant research. Academic, New York, pp. 253–321.
    3. Bhatti, S. M., Myles, E. L., Long, D. E. and Sauve, R. 2002. In vitro regeneration of St. Johns wort and coneflowers. SNA research conference, 47: 340–342.
    4. Choffe, K. L., Murch, S. J. and Saxena, P. K. 2000. Regeneration of Echinacea purpurea: Induction of root organogenesis from hypocotyl and cotyledon explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 62: 227–234.
    5. Harborne, J. B. and Williams, C. A. 2004. Phytochemistry of the genus Echinacea. In: Miller, S. (Eds.). Echinacea. The genus Echinacea. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 55–71.
    6. Jones, M. P. A., Yi, Z., Murch, S. J. and Saxena, P. K. 2007. Thidiazuron-induced regeneration of Echinacea purpurea L.: Micropropagation in solid and liquid culture systems. Plant Cell Rep. 26: 13–19.
    7. Koroch, A. R., Juliani, H. R., Kapteyn, J. and Simon, J. E. 2002. In vitro regeneration of Echinacea purpurea from leaf explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 69: 79–83.
    8. Koroch, A. R., Kapteyn, J., Juliani, H. R. and Simon, J. E. 2003. In vitro regeneration of Echinacea pallida from leaf explants. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 39: 415–418.
    9. Lakshmanan, P., Danesh, M. and Taji, A. 2002. Production of four commercially cultivated Echinacea species by different methods of in vitro regeneration. J. Hortic. Sci. Biotechnol. 77: 158–163.
    10. Mandal, A. K. A. and Gupta, S. D. 2001. Direct shoot organogenesis and plant regeneration in safflower. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 37(1): 50-54.
    11. Mechanda, S. M., Baum, B. R., Johnson, D. A. and Arnason, J. T. 2003. Direct shoot regeneration from leaf segments of mature plants of Echinacea purpurea (L.) Moench. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 39: 505–509.
    12. Murashige, T. 1980. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In: Skoog, F. (Eds). Plant Growth Substances. Berlin: Springer-Verlag, pp. 426–434.
    13. Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: 473-497.
    14. Perry, B., Burges, E. and Glennie, V. 2001. Echinacea standardization: analytical methods for phenolic compounds and typical levels in medicinal species. J. Agric Food Chem. 49:1702–1706.
    15. Rout, G. R., Samantaray, S. and Das, P. 2000. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnol. Advances. 18: 91–120.
    16. Yu, H. C. and Kaarlas, M. 2004. Popularity, diversity, and quality of Echinacea, In: Miller, S. (Eds.). Echinacea. The genus Echinacea. CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 29–52.
    17. Zebarjadi, A. R., Jalali Javaran, M., Salmanian, A. H., Karimzadeh, GH.,  Moeini, A. and Mousavi, A.  2006. Transformation of rapeseed (Brassica napus L.) plants with sense and antisense constructs of the fatty acid elongase gene. Iranian Journal of Biotechnology, 4 (2): 79-87.
    18. Ziv, M. 1991. Vitrification: Morphological and physiological disorders of in vitro plants. In: Debergh, P. C. and Zimmerman, R. H. (Eds.). Micropropagation. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
    19. Zobayed, S. M. A. and Saxena, P. K. 2003. In vitro regeneration of Echinacea purpurea L.: Enhancement of somatic embryogenesis by indolebutyric acid and dark pre-incubation. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 39: 605–612.