نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

القای پلی­پلوئیدی در حالت تری­پلوئید منجر به تولید میوه‌های بی­دانه می­شود. تری­پلوئیدها حاصل ترکیب گیاهان دیپلویید و تتراپلویید هستند. تعداد بیش از حد دانه در میوه مرکبات سبب کاهش استقبال در بازار مصرف می­شود. گیاهان تتراپلوئید یک پیش نیاز مهم برای تولید انواع مرکبات تری­پلوئید بی­دانه هستند. به‌منظور تولید گیاهان تتراپلوئید در لیموترش از روش قطره چکان کلشی‌سین در غلظتهای 2/0، 6/0، 1 و 4/1 درصد بر روی مریستم انتهایی در مرحله دو برگ حقیقی استفاده شد. جهت تعیین سطوح پلوئیدی در گیاهان لیموترش از دو روش فلوسایتومتری و بررسی اندازه و تراکم روزنه استفاده شد. همچنین ویژگی­هایی نظیر ارتفاع، ضخامت برگ، میزان فنل و فلاونوئید کل بین گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید اندازه­گیری و مقایسه شدند. بالاترین بازدهی انگیزش پلوئیدی در گیاه لیموترش برابر 6/48 در غلظت 4/1 درصد کلشی‌سین بود. مقایسه تعداد روزنه­ها و کیسه­های ترشحی برگ نشان داد که تعداد آنها در برگ گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید کاهش یافته، درحالی‌که اندازه روزنه ها و کیسه ترشحی در گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری بزرگتر بود. دو برابر کروموزومها سبب افزایش ضخامت برگ، بافت نرده­ای و اسفنجی شد. در گیاه لیموترش افزایش سطح پلوئیدی تأثیر معنی‌داری در میزان فنل و فلاونوئید تام در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید نداشت.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The effect of polyploidy on some anatomical and antioxidant characteristics of Citrus ourantifulia A

چکیده [English]

Among polyploids, triploids produce seedless fruits. Triploids are produced through combining diploid and tetraploid plants. Reduction of seeds in citrus fruits will increase the customer’s tendency. Tetraploids are the important prerequisite to create seedless triploid citrus fruits.  In this research, colchicine was used to generate tetraploid lemon which is necessary for triploid production. The effect of colchicine at 0.2, 0.6, 1 and 1.4 percent were examined at apical meristem of lemon seedlings. To determine the ploidy level of the plants, two methods are used including flow cytometriy, and analysis of size and density of stomata. In addition, some characteristics such as  plant height, secretory sacs size and density, leaf area and thickness, spongy parenchyma thickness, as well as  the level of total phenol and flavonoid among tetraploid and diploid seedling of Citrus aurantifolia have been compared. The highest ploidy level in C. aurantifolia was 48.6 percent. Ploidy induction led to decrease the height of C. aurantifolia. Comparison of secretory sac and stomata of treated plants showed that the density of secretory sac and stomata decreased in tetraploid plants compared with diploid ones. However, in tetraploid plants the size of secretory sacs and stomata were significantly larger than diploid ones. Doubling of chromosom increased the thickness of leaves, spongy and palisade parenchyma. Increasing ploidy level had no significant effect on total phenol and flavonid content of tetraploid C. aurantifolia.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Polyploidy
  • Colchicine
  • Citrus aurantifolia

بررسی تأثیر پلی­پلوئیدی بر برخی ویژگیهای آناتومیکی و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی گیاه لیموترش 

منصور افشار محمدیان1،*، زینب امیدی1، رقیه پوراکبری1 و اسد اسدی آبکنار2

1 رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

2 رشت، مؤسسه تحقیقات بیوتکنولوژی استان گیلان

تاریخ دریافت: 15/8/90               تاریخ پذیرش: 5/12/90

چکیده

القای پلی­پلوئیدی در حالت تری­پلوئید منجر به تولید میوه‌های بی­دانه می­شود. تری­پلوئیدها حاصل ترکیب گیاهان دیپلویید و تتراپلویید هستند. تعداد بیش از حد دانه در میوه مرکبات سبب کاهش استقبال در بازار مصرف می­شود. گیاهان تتراپلوئید یک پیش نیاز مهم برای تولید انواع مرکبات تری­پلوئید بی­دانه هستند. به‌منظور تولید گیاهان تتراپلوئید در لیموترش از روش قطره چکان کلشی‌سین در غلظتهای 2/0، 6/0، 1 و 4/1 درصد بر روی مریستم انتهایی در مرحله دو برگ حقیقی استفاده شد. جهت تعیین سطوح پلوئیدی در گیاهان لیموترش از دو روش فلوسایتومتری و بررسی اندازه و تراکم روزنه استفاده شد. همچنین ویژگی­هایی نظیر ارتفاع، ضخامت برگ، میزان فنل و فلاونوئید کل بین گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید اندازه­گیری و مقایسه شدند. بالاترین بازدهی انگیزش پلوئیدی در گیاه لیموترش برابر 6/48 در غلظت 4/1 درصد کلشی‌سین بود. مقایسه تعداد روزنه­ها و کیسه­های ترشحی برگ نشان داد که تعداد آنها در برگ گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید کاهش یافته، درحالی‌که اندازه روزنه ها و کیسه ترشحی در گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری بزرگتر بود. دو برابر کروموزومها سبب افزایش ضخامت برگ، بافت نرده­ای و اسفنجی شد. در گیاه لیموترش افزایش سطح پلوئیدی تأثیر معنی‌داری در میزان فنل و فلاونوئید تام در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید نداشت.

واژه­های کلیدی: پلی‌پلوئیدی، کلشی‌سین، لیموترش 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09112323679، پست‌الکترونیکی: afshar@guilan.ac.ir 

مقدمه

 

گیاه لیموترش (Citrus aurantifolia L.) متعلق به خانواده Rutaceae است، پراکندگی این گونه در مناطق خشک و نیمه‌خشک در نواحی نیمه گرمسیری با دمای زمستان بالاتر از 4- درجه سانتی­گراد مشاهده می‌شود (25). روش دو برابر کردن کروموزوم (پلی­پلوئیدی) با استفاده از کلشی‌سین، به طور وسیعی در برنامه­های اصلاحی گیاهان مورد استفاده قرار می گیرد، در گیاهان پلی­پلوئید حاصل، اغلب اندازه گلها، برگها، میوه‌ها و بذرها افزایش می­یابد (12 و13). افزایش اندازه سلول در بیشتر گیاهان حاصل از پلی­پلوئیدی مصنوعی، منجر به تولید اندام­های رویشی و زایشی بزرگ­تر می­شود (4). درختان میوه پلی­پلوئید به دلیل داشتن خصوصیات مطلوب باغبانی، مانند اندازه بزرگ میوه، تنه تنومند، بهره­وری بیشتر، مقاومت به بیماریها و اغلب بی­دانه یا کم دانه بودن، ازجمله رقم­های موفق تجاری محسوب می­شوند (17 و 20). در سالهای اخیر، در بازار مرکبات جهان، توجه ویژه­ای به میوه­های بی‌دانه مرکبات می­شود. ارقام جهشی و تولید ارقام تری‌پلوئید روشهای مرسوم تولید مرکبات بی‌دانه هستند (19). در مرکبات، معمولاً ارقام بی­دانه تری­پلوئید از تلاقی رقم‌های دیپلوئید و تتراپلوئید حاصل می­شوند و این روش بسیار مؤثر می‌باشد (9). گیاهان تتراپلوئید یک پیش نیاز مهم برای تولید انواع مرکبات تری­پلوئید بی­دانه هستند. با این حال تولید گیاهان تتراپلوئید به‌عنوان مانع در آمیزش اینترپلوئیدی محسوب می­شوند (27). القای پلی پلوئیدی در گیاهان به‌عنوان وسیله­ای برای افزایش سازش‌پذیری محسوب می­شود. دو برابر کردن تعداد کروموزومها و ژنهای مرتبط در بعضی موارد بیان ژنها و غلظت متابولیت­های ثانویه و مواد دفاعی شیمیایی را افزایش می‌دهد (24). همچنین دو برابر کردن کروموزومها در گیاهان منجر به افزایش ضخامت برگ، افزایش نسبت عرض به طول برگها، تیره­تر شدن و بزرگتر شدن گلها در گیاهان، (8) Spathiphyllum، Pyrus communis (21) می­شود. چندین روش برای تعیین سطح پلی پلوئیدی در گیاهان وجود دارد که از آن جمله می­توان به شمارش کروموزومی، فلوسایتومتری و اندازه­گیری پارامترهای آناتومیکی و مورفولوژیکی اشاره کرد (6). معمولاً برای اثبات دو برابر شدگی کروموزومها، بررسی ویژگیهای روزنه­ای مورد توجه قرار می‌گیرد. این ویژگی­ها شامل اندازه روزنه، اندازه دهانه روزنه و تراکم آنها می­باشد. گیاهان دیپلوئید، روزنه­های کوچکتری نسبت به مشتقات تتراپلوئید خود دارند. هدف از انجام این تحقیق، تولید گیاهان تتراپلوئید لیموترش با فراوانی بالا و بررسی برخی خصوصیات آناتومیکی و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی گیاهان تتراپلوئید تولید شده در مقایسه با گیاهان دیپلوئید می­باشد که نویسندگان با بررسی منابع گزارشی در این مورد پیدا نکردند.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی: به‌منظور تهیه بذرهای گیاهان لیموترش Citrus aurantifolia))، میوه این گیاهان از باغ تحت کنترل مؤسسه تحقیقات مرکبات واقع در شهرستان تنکابن تهیه شد. پوسته داخلی و خارجی بذرها جدا شد. بذرهای نوسلار (بیش از دو لپه و نامتقارن) از بذرهای جنسی (لپه‌های متقارن) تفکیک و فقط بذرهای نوسلار در داخل پتری‌دیش اتوکلاو شده حاوی دو لایه کاغذ صافی و آب مقطر گذاشته شد. پتری دیشهای حاوی بذرها در انکوباتور در دمای 2 ± 25 درجه سانتی­گراد به مدت دو هفته قرار داده شدند. پس از گذشت 14 روز، با ظهور ریشه­چه، بذرهای جوانه زده به گلدانهایی با نسبت برابر از کود حیوانی، خاک و ماسه (1:1:1) انتقال یافتند.

القای تتراپلوئیدی در گیاهان لیموترش: در این پژوهش به‌منظور القای تتراپلوئیدی، از روش تیمار مریستم انتهایی گیاهچه­ها با غلظتهای مختلف کلشی­سین استفاده شد. به این منظور، مریستم انتهایی 180 گیاهچه­ در مراحل دو برگ حقیقی اولیه در 3 روز متوالی و با استفاده از غلظت­های مختلف محلول آبی کلشی‌سین (4/1، 1، 6/0 و 2/0 درصد)، با روش قطره چکان با استفاده از سمپلر اواسط هر روز که از نظر چرخه سلولی زمان مناسبی به‌منظور اعمال تیمار می­باشد، به میزان 5 میکرولیتر تیمار شدند. لازم به ذکر است، به‌منظور استقرار و جذب بهتر کلشی‌سین در محل مریستم، به تمامی غلظتهای  کلشی‌سین 1 تا 2 قطره تویین 20 افزوده شد.

شناسایی گیاهان تتراپلوئید: تجزیه فلوسایتومتریک هسته­های سلولی به منظور تشخیص گیاهان تتراپلوئید و میکسوپلوئید از گیاهان دیپلوئید، 60 روز پس از تیمار با کلشی‌سین انجام شد. سطح پلوئیدی یک نمونه ناشناخته تنها پس از ترکیب با هسته‌های استاندارد گیاه شاخص با سطح پلوئیدی و محل پیک مشخص می­شود. در این تحقیق برای تشخیص صحیح سطح پلوئیدی گیاهان تتراپلوئید توسط دستگاه فلوسایتومتر، از گیاه جعفری به‌عنوان گیاه استاندارد استفاده شد. برای آنالیز سطح پلوئیدی از دستگاه فلوسایتومتر مدل PA ساخت شرکت Partec کشور آلمان استفاده شد. نحوه تهیه نمونه برای آنالیز سطوح پلوئیدی به این صورت است که جهت تهیه سوسپانسیون هسته‌ای، به مقدار مساوی بافت از برگهای کوچک قسمتهای جوان گیاه تیمار شده با کلشیسین و گیاه استاندارد به اندازه تقریبی 1 سانتی‌متر مربع برداشته شد. 400 میکرولیتر بافر استخراج (به ازای هر 10 میلی لیتر بافر استخراج 100 میلی گرم PVP) به برگها افزوده شده و بعد برگها با استفاده از یک تیغ تیز خرد شدند. پس از این مرحله 1600 میکرولیتر رنگ مخصوص آنالیز فلوسایتومتری DAPI اضافه شد. سپس نمونه از فیلترهای مخصوص به‌منظور حذف تجمع سلولی و قطعات درشت عبور داده شد. نمونه صاف شده به دستگاه تزریق و پس از انجام فرایند تجزیه، هیستوگرام DNA به‌دست آمد. مقدار DNA هر نمونه با بررسی حداقل 10000 سلول مورد مطالعه قرار گرفت. با توجه به اینکه نمونه تهیه شده تزریقی به دستگاه مخلوطی از عصاره گیاه مورد آزمایش و گیاه جعفری بود با داشتن محل پیک ثابت گیاه استاندارد، سطح پلوئیدی نمونه تعیین شد.

مقایسه برخی ویژگیهای کمی و کیفی بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید: پس از شناسایی گیاهان تتراپلوئید حاصل از تیمار گیاهان دیپلوئید با کلشی‌سین توسط دستگاه فلوسایتومتر، خصوصیات روزنه، ارتفاع گیاهان، ضخامت برگها، ویژگیهای کیسه های ترشحی، میزان فنل و فلاونوئید کل بین گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید مقایسه و ارزیابی شد.

استخراج فنل و فلاونوئید کل: به‌منظور استخراج عصاره بافت برگی در سنجش آنتی‌اکسیدانهای غیر آنزیمی شامل فنل و فلاونوئید، برگ دوم نمونه­های گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید جداگانه در هاون چینی با نیتروژن مایع سابیده و خرد شدند. 25/0 گرم از هر نمونه همگن شده با 5 میلی لیتر متانول 80 درصد مخلوط و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور g1500 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سنجش مقدار فنل کل با استفاده از معرف  Folin-Ciocalteu و استاندارد گالیک اسید انجام شد (22).  برای این منظور 250 میکرولیتر عصاره استخراج داخل لوله فالکون ریخته شد. سپس 1250 میکرولیتر فولین به نسبت 1 به 10 (به‌ترتیب آب دیونیزه و فولین) و 1000 میکرولیتر کربنات سدیم 5/7 درصد در غیاب نور اضافه شد. در نهایت نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال‌دار و دمای 4 درجه با دورg 4000 سانتریفیوژ شدند. کنترل نیز به همین ترتیب با 250 میکرولیتر متانول 80 درصد به جای عصاره آماده شد. پس از 20 دقیقه جذب نمونه‌ها در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. برای سنجش فلاونوئید کل عصاره­های برگی استخراج شده، از روش رنگ‌سنجی و استاندارد کاتچین استفاده شد (23). برای این منظور، 250 میکرولیتر از عصاره استخراج شده در داخل لوله فالکون ریخته شد. سپس 1250 میکرو لیتر آب دیونیزه و 75 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد به آن اضافه شد. پس از 6 دقیقه ورتکس و اضافه کردن 150 میکرولیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد،  لوله‌ها مجدداً به مدت 5 دقیقه ورتکس شدند. با اضافه کردن 500 میکرولیتر سود 1 مولار و رساندن آن به حجم 2500 میکرولیتر با آب دیونیزه، جذب نمونه‌ها در طول موج 510 نانومتر خوانده شد.

تحلیل آماری: مراحل مختلف آزمایش با 3 تکرار انجام و بعد تحلیل‌های آماری مربوطه با استفاده از آزمون آماری t در SPSS و آزمون توکی در SAS انجام شد.

جدول 1- میزان مرگ و میر پس از تیمار گیاهان تتراپلوئید و میکسوپلوئید (درصد) حاصل از تیمار گیاهچه‌های لیموترش

غلظت کلشی‌سین

(%)

میزان مرگ و میر

(%)

گیاهان 

تتراپلوئید

(%)

گیاهان میکسوپلوئید

(%)

2/0

73/0

0

44/19

 

6/0

74/1

44/15

64/22

 

1

11/11

66/26

66/24

 

4/1

14/48

6/48

0

 

             

نتایج 

القای تتراپلوئیدی در گیاه لیموترش: نتایج  حاصل از تجزیه فلوسایتومتری در گیاه لیموترش نشان داد که غلظتهای 6/0، 1 و 4/1 درصد محلول کلشی‌سین به طور معنی‌داری در مقایسه با شاهد سبب تولید گیاهان لیموترش تتراپلوئید می­شوند. غلظت 4/1 درصد کلشی‌سین دارای بیشترین اثر در تحریک پلی­پلوئیدی و تولید گیاهان تتراپلوئید در لیموترش بود (جدول 1).

تأثیر تتراپلوئیدی بر میزان فنل و فلاونوئید کل: براساس نتایج حاصله، در گیاه لیموترش، افزایش سطح پلوئیدی تأثیر معنی‌داری (P ≤ 0.05) در میزان فنل و فلاونوئید کل گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید نداشت (جدول 2).

 

جدول 2- مقایسه میانگین برخی از ویژگیها در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید گیاه لیموترش (میانگین و خطای استاندارد ((SE برای هر یک از صفات مشخص شده است). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 درصد است.

گیاهان دیپلوئید

SE ± میانگین

گیاهان تتراپلوئید

± SE میانگین

ویژگیهای بررسی شده

33/0±6/11b

55/0±44/19 a

طول روزنه(mµ)

23/0±1/9b

63/0±1/17a

عرض روزنه(mµ)

a4/0±003/0

b24/0±0004/0

تراکم روزنه(m2µ)

1/1±4/166b

1/2±8/220a

ضخامت کلی برگ(mµ)

6/1±9/137 b

56/1±4/163 a

ضخامت بافت اسفنجی(mµ)

61/0±3/27 b

67/0±1/56 a

ضخامت بافت نرده‌ای(mµ)

09/64±471b

8/169±1884 a

مساحت کیسه ترشحی(mµ)

04/0±09/0a

01/0±04/0b

تراکم کیسه ترشحی (m2µ)

09/0±4/14 a

09/0±6/3 b

میانگین ارتفاع(cm)

5/0±2/26 a

5/1±4/29 a

میزان فلاونوئید کل(µg/ml)

1/5±7/102 a

9/3±9/102a

میزان فنل کل (mg/l)


تأثیر تتراپلوئیدی بر سایر خصوصیات ارزیابی شده: بررسی و مقایسه خصوصیات گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید لیموترش در سطح احتمال 05/0 درصد ((P ≤ 0.05 نشان داد که افزایش سطح پلوئیدی سبب افزایش ضخامت کلی برگ، بافت اسفنجی و بافت نرده­ای در گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید شد. همچنین دو برابر کردن کروموزومها سبب افزایش مساحت کیسه ترشحی و کاهش تراکم آن در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید شد (شکل-1). در برگ گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری اندازه طول و عرض روزنه افزایش ولی تراکم روزنه کاهش یافت (شکل 2). در بررسی و مقایسه ارتفاع بین گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید مشاهده شد که گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری کوتاهتر از گیاهان دیپلوئید بودند (جدول 2).

 

 

شکل 1- مقایسه اندازه و تراکم کیسه‌های ترشحی برگ گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید: A- گیاه دیپلوئید B- گیاه تتراپلوئید.

 

 

شکل 2- مقایسه اندازه و تراکم روزنه گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید: A- اندازه و تراکم روزنه گیاه دیپلوئید B- اندازه و تراکم روزنه گیاه تتراپلوئید


بحث

تولید گیاهان تتراپلوئید:  در مطالعه­ توسطDutt  و همکاران (2009)  روی Citrus reticulate با روش تیمار بر روی سوسپانسیون سلولی به‌عنوان یک روش جدید، حداکثر بازدهی 35 درصد مشاهده گردید (7). همچنین در مطالعه­ Sun و همکاران (2009) روی گلابی، با استفاده از روش‌های کشت درون شیشه، حداکثر تولید گیاهان تتراپلوئید 1/6 درصد گزارش شد (6). در پژوهش حاضر، از روش تیمار بر روی مریستم انتهایی در مرحله دو برگ حقیقی استفاده شد که براساس نتایج حاصله، بالاترین بازدهی انگیزش پلوئیدی در لیموترش برابر  6/48 درصد بود. درصد بالای تولید گیاهان تتراپلوئید در این مطالعه نشان‌دهنده برتری این روش بر روش­هایی است که اساس آنها تیمار گیاهان با استفاده از کلشی‌سین در مراحل تولید بذر، برگهای لپه­ای و یا روش­های کشت درون شیشه­ای می‌باشد. بازدهی تولید گیاهان تتراپلوئید در گیاه بابونه کبیر که از روش تیمار مریستم انتهایی در مرحله برگهای حقیقی انجام شد، 1/88 درصد بود (1).

بررسی میزان فنل و فلاونوئید کل در گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید: گیاهان پلی­پلوئید توانایی افزایش تولید و انباشتگی متابولیت­های ثانویه را دارند (3) که این عمل سبب افزایش مقاومت در برابر تنش‌های غیر زیستی در گیاهان می­شود (15). در گیاه لیموترش افزایش سطح پلوئیدی تأثیری در میزان فنل و فلاونوئید گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید نداشت.  بنابراین می‌توان گفت افزایش تعداد کروموزومها بر روی میزان فنل و فلاونوئید لیموترش اثری نداشته است. این نتیجه مطابق با نتایج لوی (1976) در گیاهPhlox drummondii,  می‌باشد که نشان داد میزان فلاونوئید در گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید تفاوت معنی‌داری نداشت (14). در گیاه گل اطلسی القای پلوئیدی سبب افزایش دو نوع فلاونول شد، اما میزان فلاونوئید کل بین گیاه تتراپلوئید و دیپلوئید این گونه نیز تفاوت معنی­داری نداشت (10). بنابراین می­توان استدلال کرد که گیاه مورد تیمار و گونه آن در میزان تغییر متابولیتهای ثانویه در اثر القای پلوئیدی مؤثر است. افزایش تعداد کروموزومها و مقدار ژنهای وابسته می­تواند در بعضی موارد بیان و غلظت متابولیت­های ثانویه و مواد شیمیایی دفاعی را افزایش دهد، با این حال این مورد در همه گیاهان صادق نیست و ممکن است در بعضی موارد ارتباط مشخصی بین مقدار ژن، خاموش شدن ژن و بیان متابولیتهای ثانویه وجود نداشته باشد (24).

تأثیر تتراپلوئیدی بر سایر صفات ارزیابی شده: در پژوهشی که موریلون و همکاران (2011) بر روی Citrus limonia Osbeck انجام دادند، دریافتند که برگهای گیاهان تتراپلوئید به دلیل داشتن پارانشیم نرده­ای و پارانشیم اسفنجی ضخیم، و سلول­های اپیدرمی و فضاهای بین سلولی بزرگ در پارانشیم اسفنجی بطور قابل توجهی ضخیم­تر از برگهای گیاهان دیپلوئید بودند (16). در پژوهش حاضر نیز برگهای گیاهان تتراپلوئید لیموترش بطور قابل توجهی ضخیم­تر از برگهای گیاهان دیپلوئید بودند. همچنین بافت اسفنجی و بافت نرده­ای برگ گیاهان تتراپلوئید لیموترش بطور معنی‌داری ضخیم‌تر از برگهای گیاهان دیپلوئید بود. سلولهای تتراپلوئید با داشتن حجم بیشتر نسبت به سلولهای دیپلوئید، باعث ضخیم­تر شدن بافت‌ها و بزرگ شدن اندازه اندام‌های گیاه می­شوند (18).

براساس نتایج حاصل از این پژوهش، طول و عرض روزنه گیاهان لیموترش تتراپلوئید به طور میانگین دو برابر طول و عرض روزنه گیاهان لیموترش دیپلوئید بود. همچنین تراکم روزنه بطور معنی‌داری در گیاهان تتراپلوئید لیموترش کمتر از گیاهان دیپلوئید لیموترش بود که این می‌تواند به علت افزایش اندازه سلولها در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید ­و در نتیجه کاهش تراکم روزنه در واحد سطح باشد. این نتایج مشابه با نتایج Ye و همکاران (2009) روی گیاه Lagerstroemia indica L. است که گزارش کردند میانگین اندازه طول و عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری بیشتر از میانگین اندازه طول و عرض روزنه در گیاهان دیپلوئید بود (26). بررسی کیسه‌های ترشحی نشان داد که کیسه‌های ترشحی گیاهان تتراپلوئید بزرگتر از دیپلوئید بوده و تراکم آنها در برگ گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید کاهش یافت. از آنجایی‌که کیسه‌های ترشحی از طریق تحلیل رفتن یک یا چند سلول در لابه‌لای سلولها ایجاد می‌شود، بزرگتر بودن کیسه‌های ترشحی گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید، می‌تواند ناشی از بزرگتر بودن سلولهای گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید ­باشد. البته افزایش اندازه کیسه‌های ترشحی و کاهش تراکم آنها در گیاهان تتراپلوئید برای اولین بار گزارش می­شود.

در پژوهش حاضر القای پلی­پلوئیدی در گیاهان لیموترش سبب کاهش معنی‌دار ارتفاع نسبت به گیاهان دیپلوئید شده است که مطابق با نتایجی است که در انگیزش پلی­پلوئیدی در Zizyphus jujuba  بدست آمد، به‌طوری‌که گیاهان تتراپلوئید بصورت معنی‌داری کوتاهتر از گیاهان دیپلوئید بودند(11). کاهش ارتفاع در گیاهان تتراپلوئید احتمالاً به علت سمیت بالای کلشی‌سین و احتمالا تأثیر منفی آن روی فعالیت‌های فیزیولوژیکی ازجمله تولید و فعالیت هورمونهای رشد گیاه است. در مطالعات انجام شده روی چند گیاه دارویی از جمله Astragalus memberanaceus دلیل رشد آهسته گیاهان تتراپلوئید را اثر تخریبی فیزیولوژیکی کلشی‌سین در کاهش سرعت تقسیم سلولی دانسته‌اند (5). القای پلی­پلوئیدی ضمن افزایش میزان DNA الگو، با تحریک مکانیسم­هایی در سلول نسخه‌برداری و ترجمه را تحت تأثیر قرار داده و با افزایش یا کاهش بیان و یا حتی خاموشی ژنها، بسیاری از صفات فیزیولوژیک و مورفولوژیک گیاه را تغییر می‌دهد (2). البته برای اطمینان از تأثیرات مذکور، تحقیقات بیشتری در این رابطه ضروریست. بنابراین، نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که تیمار کلشی‌سین سبب افزایش معنی‌دار ضخامت برگ، بافت نرده­ای و اسفنجی، افزایش اندازه و کاهش تراکم روزنه در گیاهان تتراپلوئید لیموترش در مقایسه با گیاهان دیپلوئید شد. همچنین افزایش سطح پلوئیدی بطور معنی‌داری سبب کاهش ارتفاع گیاهان و افزایش اندازه کیسه‌های ترشحی برگ و کاهش تراکم آنها در واحد سطح شد. گرچه افزایش سطح پلوئیدی، تأثیر معنی‌داری در میزان فنل و فلاونوئید کل در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید لیموترش نداشت.

سپاسگزاری

از زحمات ارزشمند سرکار خانم دکتر فائزه قناتی (دانشیار محترم دانشکده علوم زیستی دانشگاه تربیت مدرس)، کارکنان محترم پژوهشکده بیوتکنولوژی شمال، به‌ویژه آقای دکتر علیرضا ترنگ و آقای مهندس علی صیاد رمضانی و کارشناسان محترم دانشکده علوم دانشگاه گیلان به‌ویژه آقای مهندس سید ابوالقاسم ناصر علوی و خانم‌ها مهندس فاطمه جمال امیدی، مهوش هادوی و زهرا شایگان تشکر و قدردانی می­شود.

  1. سحرخیز، م. ج.( 1385) تأثیر برخی عوامل اقلیمی و سطوح پلوئیدی بر خصوصیات مورفولوژیکی و  فیزیولوژیکی گیاه دارویی و زینتی بابونه کبیر، رساله دکترا، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران.
    1. Adams, K. L and Wendel, J.F. (2005). Novel patterns of gene expression in polyploidy plants. Trends in Genetics, 10 (21): 539-543.
    2. Berkow S. (2001) Size and alkaloid content of seeds in induced autotetraploids of Datura innoxia, Datura stramonium and Hyoscyamus niger. Pharmaceutical Biology, 39(5): 329–331.
    3. Byrne, M. C., Nelson, C. J. and Randall, D. D. (1981). Ploidy effects on anatomy and gas exchange of tall fescue leaves. Plant Physiology, 68: 891-893.
    4. Chen, L.L. and Gao, Sh. L., (2007). In vitro Tetraploid induction and generation of tetraploids from mixoploids in Astragalus memberanaceus. Scientia Horticulturae, 112: 339-344.
    5. Dhooghe, E. (2010). Mitotic chromosome doubling of plant tissues in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ culture, 104 (3): 359-373.
    6. Dutt M. (2010). In vitro production of autotetraploid Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) using cell suspension cultures. Euphytica, 173: 235-242.
    7. Eeckhaut T, Werbrouck S, Leus L, Van Bockstaele E, Debergh P. (2004). Chemically induced polyploidization in Spathiphyllum wallisii Regel through somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ culture, 78:241–246.
    8. Esen A, Soost RK (1973). Seed development in Citrus with special reference to 29 9 49 crosses. American Journal of Botany 60: 448–452.

 

10.  Griesbach. R, Kam. K, (1995). The effect of inducted polyploidy on the flavonols of Petunia 'Mitchell. Phytochemistry, 42 (2): 361-363.

11.  Gu XF, Yang AF, Meng H, Zhang JR (2005). In vitro induction of tetraploid plants from diploid Zizyphus jujuba Mill. Cv. Zhanhua. Plant Cell Report, 24: 671–676.

12.  Hancock, J. F. (1997). The Colchicine story. Hortscience, 32: 1011–1012.

13.  Hartwell, L. H., Hood, L., Goldberg, M. L., Reynolds, A. E., Silver, L. M. & Veres, R. C. (2004).Genetics from genes to genomes, (2nd ed.). McGraw Hill, Boston. Pp. 324.

14.  Levy, M. (1976). Altered glycoflavone expression in induced autotetraploids of Phlox drummondii. Biochemical Systematics and Ecology. 4 (4): 249 - 254.

15.  Liu H, Zhang S, Wang H. (2002). Breeding an autotetraploid hybrid non-heading Chinese cabbage cultivar Shuyou No. 11 with green stalk, high quality and heat- resistance. Journal of Nanjing Agricultural University, 25: 22–26.

16.  Morillon R, (2011). Large changes in anatomy and physiology between diploid Rangpur lime (Citrus limonia) and its autotetraploid are not associated with large changes in leaf gene expression. Journal of Experimental Botany, 62: 2507–2519.

17.  Predieri S (2001). Mutation induction and tissue culture in improving fruits. Plant Cell Tissue Organ Culture, 64: 185–210.

18.  Rauf, S., H.E. Munir, J. Abdullo and S.M. Basra, (2006).Role of colchicine and plant growth regulators to overcome interspecific incompatibility. General and Applied Plant Physiology, 32: 223-232.

19.  Reforgiato Recupero G, Russo G, Recupero S (2005). New promising citrus triploid hybrids selected from crosses between monoembryonic diploid female and tetraploid male parents. Horticulture Science 40: 516–520.

20.  Sanford JC (1983). Ploidy manipulations. In: Moore JN, Janick J (eds) Methods in fruit breeding. Purdue University Press, West Lafayette, pp 100–123.

21.  Sun QR, Sun HS, Li LG, Bell RL (2009). In vitro colchicine-induced polyploid plantlet production and regeneration from leaf explants of the diploid pear (Pyrus communis L.) cultivar ‘Fertility’. Journal Horticultural Science and Biotechnology, 84 (5): 548–552.

22.  Ting, S.V., and Attaway, J.A. (1971). Citrus fruits. In ‘The biochemistry of fruits and their products.’ Vol. 2. A.C. Hulme ed., Academic Press, New York. pp. 107–179.

23.  Ting, S.V., and Deszyck, E.J. (1961). The carbohydrates in the peel of oranges and grapefruit. J. Food Science. 26: 146–152.

24.  Thomas G. Ranney. (2006). Polyploidy: From Evolution to New Plant Development. Combined Proceedings International Plant Propagators Society, 56: 137-142.

25.  Yelenosky, G. (1985). Cold hardiness in Citrus. Horticultural Reviews, 7: 201–238.

26.  Ye. Y.M. (2009). Morphological and cytological studies of diploid and colchicine-induced tetraploid lines of crape myrtle (Lagerstroemia indica L.). Scientia Horticulturae, 124 (1): 95–101.

27.  Zhang J, Zhang M, Deng X (2007). Obtaining autotetraploids in vitro at a high frequency in Citrus sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ culture, 89:211–216.