نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، ایران
2 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
3 گروه زیست شناسی سلولی و تکوینی گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه بیله فلد، آلمان
چکیده
طول موجهای UV-B عمیقتر از هر طول موج دیگری به آب نفوذ میکنند. موجودات یوکاریوتی پیچیده از طریق بیان انتخابی بخش ویژهای از ژنوم یکسان در انواع مختلف سلول، در پاسخ به نشانههای نموی و محیطی از قبیلUV-B تکامل یافتهاند. تشکیل موجودات پرسلولی به مسیرهای سیگنالینگ ژنتیکی از پیش تعریف شده در انواع مختلف سلول نیاز دارد. انواع مختلف سلول باید بتوانند پاسخهای سازشی مناسب را نسبت به محیط در حال تغییر پیرامون خود، تنظیم کنند. جلبک سبز پرسلولیVolvox carteri تنها از دو تیپ سلولی با تقسیم بارز کار تشکیل شده است.
در اینجا، از تکنیکRNA-seq برای بررسی پروفایل ترنسکریپتوم دو تیپ سلولی تفکیک شده V. carteri تحت یک ساعت تابش UV-B استفاده شد. نتایج نشان داد که تقریبا یک سوم از ژنها (8392 ژن از 23778 ژن) بهطور معنیداری بین دو تیپ سلولی بیان متفاوتی داشتهاند. برای شناسایی نحوه عملکرد هر یک از سلولها در پاسخ به تابش UV-B، ژنهای اختصاصی آنها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در سلولهای سوماتیک، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودیاستراز RNA فعال شدهاند. درحالیکه در سلولهای زایشی، ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، گردایش نوکلئوزوم و کروموزوم بعد از تابش UV-B رخدادهاست. فرایند بیوسنتزDNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بوده است. هر دو تیپ سلولی در مجموع سازوکارهای دفاعی را آغازکردهاند و باعث کاهش حساسیت جلبک به این اشعه شدهاند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Investigation of cell- type specific gene expression pattern in Volvox carteri alga under light stress conditions
نویسندگان [English]
1 Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran
2 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
3 Department of Cellular and Developmental Biology of Plants, Faculty of Natural Sciences, University of Bielefeld, Bielefeld, Germany
چکیده [English]
UV-B radiation can penetrate into water deeper than each light wavelength. Complex eukaryotic organisms evolved in response to developmental and environmental signs such as UV-B radiation through the selective expression of a specific section of the same genome in different cell types. The foundation of multicellular organisms needs genetically predefined signaling pathways in diverse cell types. Cell types should be enabled to modulate appropriate adaptive reactions in ever-changing comprehensive environment. The multicellular green alga Volvox carteri consists of only two types with a distinct division of function. Here, the RNA-seq technique was employed to investigate transcriptome profiling of two separated cell types of V. carteri under 1h UV-B treatment. Our results revealed that almost one-third of the V. carteri genes (8392 genes out of 23778 genes) were significantly differentially expressed between the two cell types. The results showed that in somatic cells, potassium ion transmembrane transport and RNA phosphodiester bond hydrolysis were activated. However, in reproductive cells, mismatch repair (MMR), nucleosome assembly and chromosome assembly occurred after UV-B radiation. RNA-dependent DNA biosynthetic process was a common response of both cells to UV-B radiation. The cell type-specific genes were examined to determine cell function in response to UV-B radiation. Overall, two cell-types have initiated defense mechanisms and decreased the sensitivity of alga to UV-B radiation.
کلیدواژهها [English]
بررسی الگوی بیان ژن ویژه تیپ سلولی در جلبک Volvox carteri تحت شرایط تنش نوری
سولماز اخطاری1، کریم حسنپور2، جعفر رازقی1*، آرش کیانیان مومنی3 و علی موافقی1
1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی
2 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه ژنتیک و اصلاح نژاد دام
3 آلمان، بیله فلد، دانشگاه بیله فلد، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی سلولی و تکوینی گیاهی
تاریخ دریافت: 13/11/97 تاریخ پذیرش: 11/2/98
چکیده
طول موجهای UV-B عمیقتر از هر طول موج دیگری به آب نفوذ میکنند. موجودات یوکاریوتی پیچیده از طریق بیان انتخابی بخش ویژهای از ژنوم یکسان در انواع مختلف سلول، در پاسخ به نشانههای نموی و محیطی از قبیلUV-B تکاملیافتهاند. تشکیل موجودات پرسلولی به مسیرهای سیگنالینگ ژنتیکی از پیش تعریف شده در انواع مختلف سلول نیاز دارد. انواع مختلف سلول باید بتوانند پاسخهای سازشی مناسب را نسبت به محیط در حال تغییر پیرامون خود، تنظیم کنند. جلبک سبز پرسلولی Volvox carteri تنها از دو تیپ سلولی با تقسیم کار بارز تشکیل شده است. در اینجا، از تکنیک RNA-seq برای بررسی پروفایل ترنسکریپتوم دو تیپ سلولی تفکیک شده V. carteriتحت یک ساعت تابش UV-B استفاده شد. نتایج نشان داد که تقریبا یک سوم از ژنها (8392 ژن از 23778 ژن) بطور معنیداری بین دو تیپ سلولی بیان متفاوتی داشتهاند. برای شناسایی نحوه عملکرد هر یک از سلولها در پاسخ به تابش UV-B، ژنهای اختصاصی آنها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در سلولهای سوماتیک، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودیاستراز RNA فعال شدهاند. درحالیکه در سلولهای زایشی، ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، گردایش نوکلئوزوم و کروموزوم بعد از تابش UV-B رخدادهاست. فرایند بیوسنتز DNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بودهاست. هر دو تیپ سلولی در مجموع سازوکارهای دفاعی را آغازکردهاند و باعث کاهش حساسیت جلبک به این اشعه شدهاند.
واژه های کلیدی: Volvox carteri، تابش UV-B، ترنسکریپتوم، RNA-seq، سلولهای زایشی و سوماتیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 09144033450، پست الکترونیکی: Jafar_razeghi@tabrizu.ac.ir
مقدمه
در زیست شناسی همواره این سوال مطرح بوده است که چگونه موجودات پرسلولی، فرایندهای سلولی و فیزیولوژی خود را در پاسخ به نشانههای محیطی مانند نور در روش ویژه نوع بافت/سلول (Tissue/cell-type specific-manner) تنظیم میکنند. انواع مختلف سلول مطابق با نیازهایشان میتوانند مسیرهای متمایز سیگنالینگ نوری را راهاندازی کنند. بنابراین، مسیرهای سیگنالینگ نور از پیش تعریف شده ویژه تیپ سلولی (Cell type-specific)، در طول تکامل توسعه یافتهاند. تنظیم پاسخهای نموی و سازشی بوسیله نور پدیدهای است که همواره مورد توجه بودهاست. با اینحال، در مورد مکانیسمهای مولکولی که سیگنالینگ نوری ویژه تیپ سلولی را سازماندهی میکنند، شناخت کمی وجود دارد.
تابش UV-B خورشیدی که به سطح زمین میرسد تنها مربوط به درصدی جزئی از کل انرژی خورشیدی است، اما تغییرات قابل توجهی را در محیط زیست اعمال میکند. اثرات مخرب UV در جلبکها بر رشد (32)، مورفولوژی (56)، تکثیر (10)، تحرک (16)، تنفس (23)، photobleaching کلروفیلa، کاهش فتوسنتز (44)، کاهش محتوای کلروفیل (59)، تخریب پروتئینهای دریافت کننده نور (40)، تغییر پروفایل پروتئین (3)، مهار آنزیمهای متابولیسم نیتروژن (49) و سایر فعالیتهای آنزیمی(48) گزارش شده است. اشعه UV-B براحتی توسط اسیدنوکلئیک و کروماتوفورهای پروتئین جذب میشود و مشارکت این ترکیبات در پاسخ موجودات به اشعه UV-B مستند شدهاست (22). دخالت این ترکیبات در پاسخهای بیولوژیکی به UV-B نشان میدهد که اگر سیستمهای بیولوژیکی در معرض تابش UV-B قرار گیرند، سنتز پروتئین و فعالیتهای آنزیمی میتواند تحت تاثیر قرارگیرد (51). در حال حاضر، جلبکها نهتنها برای اینکه سپری محافظ را در برابر اشعههایUV توسعه دادهاند بلکه بعنوان یکی از قدیمیترین موجودات تولید کننده اکسیژن برای درک بهتر سازگاری به UV-Bمورد توجه هستند. اشعهUV-B میتواند منجر به فعالسازی سازوکارهای دفاعی شود که در سطح رونویسی تنظیم شدهاند (33).
Volvox carteriاز سادهترین موجودات پرسلولی متشکل از دو تیپ سلولی، با سازمانیابی منحصر بفرد، فتواتوتروف، متحرک، با قطر 0.5 تا 2 میلیمتر و دوگانگی جنسی نر- ماده است (17 و 28). در طبیعت، در حوضچههای آب شیرین، گودالها و نهرآبها زندگی میکند و تا زمانیکه شرایط مطلوب است بصورت رویشی تکثیر میشود. هر دو جلبک نر و ماده شامل تقریبا 4000-2000 سلول سوماتیک کوچک، با تمایزیابی نهایی و دو تاژکی هستند که در سطح جسم کروی شفافی از ماتریکس خارج سلولی غنی از گلیکوپروتئین قرار دارند. علاوه بر این، تقریبا 16 سلول زایشی بزرگ (گونیدی) (Reproductive cells (Gonidia)) و غیرمتحرک در زیر صفحات سلولی سوماتیک واندکی در زیر سطح اسفروئید قرار دارند. هر سلول یک کلروپلاست جامی شکل بزرگ برای انجام فتوسنتز دارد (28). سلولهای سوماتیک (Somatic cells) برای حرکت و نورگرایی تخصص یافتهاند، توانایی تقسیم شدن را از دست دادهاند و دستخوش مرگ برنامهریزی شده میشوند. در حالیکه، سلولهای زایشی برای زادآوری تخصص یافتهاند و بصورت بالقوه فنا ناپذیرند (30 و 31). موجودات آبزی متحرک مانند Euglena gracilis در سرتاسر ستون آبی مهاجرت میکنند تا با استفاده از ترکیبات گراویتاکسیس (Gravitaxis) و فتوتاکسیس (Phototaxis) موقعیت بهینهای را برای رشد فتواتوتروف شناسایی کنند درحالیکه از تنش نوری بالقوه اجتناب نمایند (45). بنابراین، اگرچه ممکن است V. carteri استراتژیهای متحرک اجتناب از UV-B را نشاندهد اما در مورد سازش به تابش UV-B در آب، این ارگانیسم میبایست اطمینان حاصل نماید که سلولهایش از تابش فعال موثر برای فتوسنتز جلوگیری نمیکنند (18). طول موجهای UV-B عمیقتر از نورهایی با طول موجهای بلندتر به آب نفوذ میکنند. از طرفی، UV-B در سیستمهای آب شیرین بواسطه مقدار بسیار بالای مواد آلی محلول، معمولا سریعتر از سیستمهای دریایی تقلیل مییابد. با اینحال، هنوز ممکن است که UV-B به عمق قابل توجهی نفوذ کند و در سیستمهای آب شیرین اهمیت یابد (11). بنابراین، برای درک تغییرات فیزیولوژیکی در سطح مولکولی در پاسخ به اثرات تابش UV-B با دوز پایین(0.056 mw.cm-2) ، تغییرات بیان ژن در سلولهای تفکیک شده جلبک V. carteri، در مقایسه با هم با استفاده از تکنیک RNA-seq مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. انتظار میرود که پاسخ و عملکرد تیپهای سلولی زایشی و سوماتیک در جهت سازش به تابش UV-B باشد.
مواد و روشها
شرایط کشت و رشد جلبک: جلبک Volvox carteri f.nagariensis female strain Eve 10 تیپ وحشی از دانشگاه بیلهفلد، آلمان بدست آمد و مورد استفاده قرارگرفت. کشتها در محیط کشت ولوکس (43) در دمای 30-28 درجه سانتیگراد، چرخه 8-16 ساعت تاریکی- نورسفید فلورسنت (10000 لوکس) با میانگین100 μmol photons m-2s-1 تابش فعال فتوسنتزی نگهداری شدند.
تفکیک سلولهای زایشی و سوماتیک: کمی قبل از آغاز تقسیم شکافتگی، سلولها جداسازی شدند. برای بدست آوردن سلولهای زایشی، اسفروئیدها در دستگاه (B. Braun, Melsungen, Germany) Dounce homogenizer 50 μm شکسته شد. سوسپانسیون سلولی بترتیب، ازفیلترهایμm 100و μm 40 عبور داده شد. سلولهای زایشی با استفاده از سانتریفیوژ جدا شدند (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo). فیلتر μm 10برای جداسازی سلولهای سوماتیک باقیمانده بکار بردهشد. در مرحله بعد سلولهای زایشی باقیمانده بر روی فیلتر چندین مرتبه با محیط کشت Volvox شسته شد و بررسی نهایی برای اطمینان از جداسازی با میکروسکوپ نوری انجام شد. برای بدست آوردن سلولهای سوماتیک، اسفروئیدها در دستگاه Dounce homogenizer 50 μm شکسته شد. سوسپانسیون سلولی بدست آمده با محیط کشت رقیق شد و در دمای اتاق نگهداری شد. در این مدت قطعات درشت سلولی رسوب کردند. جداسازی سلولهای سوماتیک با میکروسکوپ نوری بررسی شد (41).
اعمال تیمار نوری: پرتودهی اشعه UV-Bبا شدت نور 0.056 mw/cm-2 و با استفاده از لامپهای کم باند UV-B (Philips TL40W/12RS) و برای یک ساعت انجام شد.
استخراج RNA کل: برای نمونهبرداری از سلولهای تفکیک شده، سه تکرار زیستی به ازای گروههای تیمار و کنترل در نظر گرفته شد. استخراج RNA ازهر نمونه با روش (Invitrogen, Carlsbad, CA) TRIzol Reagent مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بررسی کمیت و کیفیتRNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز الکتروفورز 1 درصد و اسپکتروفوتومتر Ultrospec 2100 pro UV/Visible spectrophotometer (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) صورت گرفت.
آمادهسازی کتابخانه و RNA-Seq: بطور خلاصه، 1 میکروگرم RNA کل برای هر نمونه در معرض انتخاب پلیA قرار گرفت. قطعه قطعه شدن mRNA ها و سنتز cDNA و اتصال به آداپتورها انجام شد. با استفاده از توالییابی با پلتفرم Illumina HiSeq-2500، خوانشهای تکانتهایی به طول 51 نوکلئوتید تولید شد (شماره دسترسی GSE124346).
آنالیز بیوانفورماتیک: از نرم افزار FastQC(4) و Trimmomatics (v0.32) (5) برای کنترل کیفیت و پیش پردازش خوانشها استفاده شد. مکانیابی خوانشها بر روی ژنوم رفرنس V. carteri (v2) موجود در سایت فیتوزوم (https://phytozome.jgi.doe.gov) (14) با استفاده از نرم افزار TopHat2 (v2) (27) و پارامترهای پیشفرض انجام شد. سپس، با استفاده از نرم افزارCufflinks (v2.0.1) با پارامترهای پیشفرض اسمبلی رونوشتها برای هر نمونه انجام شد. برای بررسی تفاوت بیان ژن بین سلولهای زایشی و سوماتیک تحت تابش UV-B، نرم افزار Cuffdiff (v2)(27) مورد استفاده قرارگرفت.
انوتیشن: انوتیشن عملکردی ژنهای با تفاوت بیان میان سلولهای زایشی و سوماتیک تحت تابش UV-B، بوسیله ترمهای ژنانتولوژی با استفاده از برنامه تحت وب Blast2GO آنالیز شد (9) و ژنهای با تفاوت بیان در سه گروه مولفه سلولی (Cellular component)، عملکرد مولکولی (Molecular function) و فرایند بیولوژیکی (Biological process) طبقهبندی شدند. نتایج توزیع امتیاز (Score distribution) فرایند بیولوژیکی برای آنالیز غنیسازی مسیر مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج
بررسی تفاوت بیان ژن و سایر ویژگیهای ژنی در مقایسه پروفایل بیان سلولهای زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: در آنالیز تفاوت بیان در مقایسه سلولهای زایشی با سوماتیک تعداد 23778 ژن، 59068 ایزوفرم، 37240TSS (transcription start site)، 15205(coding DNA sequences) CDS ، 23778 پروموتر، 37240 اسپلایسینگ در مجموع نمونهها مورد بررسی قرارگرفت. نتایج آنالیز تفاوت بیان نشان داد که از مجموع تعداد ژنها و سایر ویژگیهای ژنی ذکر شده در شرایط القایی UV-B، تعداد 8392 ژن، 6380 ایزوفرم، 7817 TSS و 2225 CDS با بیان متفاوت در بین دو نمونه سلولی زایشی و سوماتیک وجود داشته است. سطح معنیداری برای تعیین تفاوت بیان 5 درصد (p-value≤5) در نظر گرفته شد. در مقایسه تفاوت بیان بین این دو تیپ سلولی از بین 8392 لوکوس با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3871 لوکوس افزایش و سطح بیان تعداد 4521 لوکوس دیگر کاهش نشان داد. از بین 6380 ایزوفرم با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3015 ایزوفرم افزایش و تعداد 3365 ایزوفرم دیگر کاهش داشت. از بین 7817 TSS با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3725 TSS افزایش و تعداد 4092 TSS دیگر کاهش داشت. همچنین از بین 2225 CDS با بیان متفاوت، سطح بیان 910 CDS مورد افزایش و سطح بیان 1315تای دیگر کاهش یافته بود. در شکل 1 نمودار فراوانی ژنها، ایزوفرمها، TSSها و CDSهای معنیدار در دو دسته بیشبیان و کمبیان نشان داده شدهاند. بر اساس شکل مشهود است که کاهش بیان نسبت به افزایش بیان، سهم بیشتری از ژنها را شامل شدهاست. شکل 2 نمودار توزیع آتشفشانی تفاوت بیان ژن بین این دو تیپ سلولی را در شرایط القایی UV-B نشان میدهد. تیمار UV-B سطح بیان ژن را در هر دو تیپ سلولی تغییر دادهاست. نقاط قرمز (در بالای خط آستانه)نشاندهنده ژنهایی با بیان متفاوت هستند.
شکل 1 - نمودار ستونی ویژگیهای مختلف ژنی با بیان متفاوت بین سلولهای زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B. نکته: N تعداد کل ویژگیهای ژنی با بیان متفاوت، New تعداد ویژگیهای ژنی انوتیت نشده، Down-regulated تعداد ویژگیهای ژنی کمبیان و Up-regulated تعداد ویژگیهای ژنی بیشبیان.
شکل 2- نمودار توزیع آتشفشانی تفاوت بیان ژن بین سلولهای زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B. نقاط قرمز بالای خط آستانه مقطع بیانگر ژنهای با بیان متفاوت و نقاط سیاه زیر آن بیانگر ژنهای با بیان مشابه است.
بررسی ژنهای اختصاصی سلولهای زایشی و سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: برای بدست آوردن ژنهای اختصاصی هر یک از سلولها، ژنهای دیفرنشیال را دو بار تحت فیلتر قرار داریم. به این ترتیب که ابتدا ژنهای دیفرنشیالی که حداقل در یکی از دو گروه بیان بالای 1 (RPKM>1) داشتند، انتخاب شدند. در مرحله بعد این ژنها بر اساس توزیع طول لوکوس بررسی و فیلتر شدند. در نهایت، 110 ژن منحصرا در سلول زایشی و 35 ژن منحصرا در سلول سوماتیک بیان شدند، بعبارت دیگر تحت تیمار UV-B بیان ویژه تیپ سلولی را نشان دادند و 7312 ژن بصورت مشترک در هر دو تیپ سلولی بیان شده بودند. در شکل 3 نمودار ون، تفاوت بیان ژن بین دو تیپ سلولی زایشی و سوماتیک و همچنین ژنهای مشترک بین آنها را نشان میدهد. نمودار نقشه گرمایی مربوط به ژنهای مشترک بین این دو تیپ سلولی در شکل 4 نشان داده شدهاست.
شکل 3 - نمودار ون همپوشانی ژنهای دیفرنشیال را بین دو تیپ سلولی زایشی (G) و سوماتیک (S) تحت تیمارUV-B نشان میدهد.
طبقهبندی عملکردی ژنهای با بیان متفاوت معنیدار در سلولهای زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: اطلاعات ژن انتولوژی (Gene ontology) و رده عملکردی ژنهای با بیان متفاوتمعنیدار در هر تیپ سلولی، از طریق آنالیز عملکردی ژنانتولوژی با استفاده از الگوریتم Blast2GO (http://www.blast2go.com) بدست آمد، که به درک ویژگیهای توزیع عملکردی ژن در نمونهها در سطح ماکرو کمک میکند. آنالیز عملکردی ژن انتولوژی در سه گروه عملکردی (P≤0.05) غنی شده بود. 110 و 35 ژن با تفاوت بیان معنیدار، بترتیب در سلولهای زایشی و سوماتیک در پایگاه داده GO انوتیت شدند.
شکل 4 - نمودار نقشه گرمایی بیان ژن. تفاوت بیان ژن بر اساس معیار RPKM در ژنهای مشترک دو تیپ سلولی (Gonidi-Somatic) در میان تکرارهای هر سلول نمایش داده شده است. قرمز: ژنهای بیشبیان؛ زرد: ژنهای کمبیان.
در شکل 5 غنیسازی عملکردی ژن انتولوژی نشان داد که بعد از یک ساعت تیمار UV-B، 19 ترم بطور معنیداری تغییر کردهاند. در ژن انتولوژی مولفه سلولی، تنها 2 ترم یعنی غشا و فضای غشایی در هر دو سلول غنی بودهاند، در حالیکه محصول ژنهای دیفرنشیال سلول زایشی در 8 ترم یعنی لومن محصور شده با غشا، سیمپلاست، اتصالات سلولی، کمپلکس محتوی پروتئین، فضای اندامکی، سلول، اندامک، فضای سلولی غنی بودهاند. در ژن انتولوژی عملکرد مولکولی، فعالیت اتصال، فعالیت کاتالیزوری در هر دو سلول غنی بودهاند. درحالیکه، ترم فعالیت انتقالی تنها در سلول سوماتیک بصورت قابلتوجهی غنی بودهاست. ژن انتولوژی فرایند بیولوژیکی نشان داد که هر دو تیپ سلولی در فرایند متابولیکی، فرایندسلولی و مکانیابی غنی بودهاند. سه فرایند تنظیم زیستی، سازمانیابی مولفهسلولی یا بیوژنز و پاسخ به محرک تنها در سلول زایشی غنی بودهاند. بررسی مسیرهای بیولوژیکی مبتنی بر توزیع امتیاز با استفاده از آنالیز Blast2GO انجام شد. نتایج نشان داد که در سلولهای سوماتیک در معرض UV-B، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودیاستراز RNAفعال شدهاند. درحالیکه در سلولهای زایشی پاسخ به کمبود (تنش) آبی، ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، یکپارچگی DNA، بستهبندی DNA، تنظیم رونوشتبرداری با الگوبرداری از DNA، آغاز رونوشتبرداری از DNA، بیوژنز مولفهسلولی، انتقال رتروگراد- اندوزوم به گلژی، گردایش نوکلئوزوم، گردایش کروموزوم و بیان ژن بعد از تابش UV-B رخدادهاست. فرایند بیوسنتزDNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بودهاست.
بحث
هدف از پژوهش حاضر بررسی پروفایل بیان ژن و تغییرات فیزیولوژیکی در سلولهای جلبک V. carteri درپاسخ به تابشUV-B بود. مطالعات نشان دادهاند که تنظیم بیان ژن گام موثری در تعیین تیپ سلولی و تمایز یابی میباشد. در واقع موجودات یوکاریوتی پیچیده از طریق بیان انتخابی بخش ویژهای از ژنوم یکسان در انواع مختلف سلول، در پاسخ به نشانههای نموی و محیطی تکامل یافتهاند (36). در Volvox برای مثال هر دو تیپ سلولی زایشی و سوماتیک دارای الگوی بیان متفاوتی هستند و ژنهایی از ردههای عملکردی مختلف را نمایش میدهند (41 و 50). با این حال راجع به تغییرات بیان ژن ویژه تیپ سلولی در پاسخ به سیگنالهای نوری، که یکی از مهمترین سیگنالهای محیطی برای کنترل رشد و نمو در Volvox است، شناخت کمی صورتگرفتهاست.
شکل 5 - آنالیز عملکردی ژنهای با تفاوت بیان در سلولهای زایشی (G) و سوماتیک (S) تحت تیمار UV-B بر اساس انتولوژی ژن. طبقهبندی انتولوژی ژن در سه دسته عملکردی یعنی فرایند بیولوژیکی، عملکرد مولکولی و مولفه سلولی نشان داده شدهاست.
مطالعات بیان ژن تحت شرایط نور مرئی نشان دادهاست که الگوی ترنسکریپتوم هر تیپ سلولی میتواند بصورت متفاوتی در پاسخ به نور محیطی تغییر کند (25، 26 و 29). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که الگوی ترنسکریپتوم این دو تیپ سلولی در پاسخ به نور نامرئی UV-B نیز بصورت متفاوتی تغییر کردهاست. بطور جالب توجهی، تعداد ژنهایی که اختصاصاً در سلول زایشی بیان معنیدار دارند، بیشتر از سلولهای سوماتیک است. با اینحال، شمار بالای ژنهای مشترک بین این دو تیپ سلولی، بیانگر تقسیم ابتدایی کار در این جلبک کلونال است. برای شناخت بیشتر عملکرد این دو تیپ سلولی در پاسخ به تیمار، مسیرهای بیولوژیکی پاسخگو مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی مسیرهای بیولوژیکی مبتنی بر توزیع امتیاز با استفاده از آنالیز Blast2GO نشان داد که بطور کلی سلولهای تفکیک شده در معرض تابش UV-B، دستخوش آسیب شدهاند و به دنبال آن پاسخ به آسیب DNA آغاز شده است. فرایند بیوسنتزDNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بوده است. حضور شکستهای دو رشتهایDNA= DNA double-strand break (DSBها) در DNA شدیدترین رویدادی است که سلول میتواند متحمل شود.DSB ها یکپارچگی ژنوم را به مخاطره میاندازند که بهدنبال آن جهش، بازآرایی کروموزومی و در صورت عدم ترمیم مرگ سلولی رخ میدهد (19). برای مبارزه با این تهدیدات، سلولها دو مکانیسم اصلی ترمیم را ایجاد کردهاند: نوترکیبی همولوگی (HR= Homologous Recombination) و اتصال پایانههای غیرهمسان (NHEJ= None Homologous End-Joining) (8). سوبستراهای همولوگ DNA که سبب تسهیل ترمیم میشوند، در مقایسه با سوبستراهای همولوگی که به شکل رونوشت RNA حضور دارند، فراوانی کمتری دارند (35). مولکولهای RNA با رونوشتبرداری معکوس بهcDNA، میتوانند بوسیله مکانیسم غیرالگوبرداری توسط NHEJ یا یک مکانیسم الگوبرداری توسط HR در سایتهای DSB در DNA وارد شوند (39، 42 و 58). علاوه بر این، مطالعات در سیستم مدل مخمر نشان دادهاند که نسخه رونوشت RNA درون زاد، نه تنها بطور غیرمستقیم از طریق تشکیل واسطه کپی DNA (cDNA)، بلکه همچنین بطور مستقیم در مکانیسم محرک همولوژی در جوانه زنی مخمر میتواند بعنوان الگویی برای ترمیم DSBمورد استفاده قرارگیرد (24).
در سلول های سوماتیک در معرض UV-B، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودیاستراز RNA فعال شده، جذب Na + و خروجK + از سلولها (شار یونی) تسهیل میگردد. تابش UV در مخمر باعث افزایش گرادیان غلظت بین داخل و خارج سلول و در نهایت افزایش شار خالص یونی شدهاست (46). علاوه بر این، اشعه UV از طریق فعال شدن کانال K + غشایی باعث ایجاد آپوپتوز درسلولهای لوسمی میلوبلاست انسان و سلولهای اپیتلیال قرنیه خرگوش شدهاست (53 و 54). این پدیده یک واکنش اولیه در پاسخ به اشعه UVاست .مطالعات نشان دادهاند که اشعه UV موجب ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﺑﻴﺶ از ﺣﺪ کانالهای K+در غشا میشود که یک رویداد زودهنگام است که میتواند انتقال سیگنال را میانجیگری کند و موجب آپوپتوز در پاسخ به اشعه UV گردد (53).
اشعه UVمیتواند باعث ایجاد آسیبهای مختلفی مانند تغییرات فتوشیمیایی، کراسلینک و آسیب اکسیداتیو به RNA شود. جذب مستقیم UV-B توسط اسیدهای نوکلئیک photoproductهای بسیار ناکارآمدی را تولید میکند که در فعالیت مولکولهای حساس به نور در داخل سلول دخالت میکنند (1، 2 و 6). اشعه UVباعث هیدرولیز پیوند 5′فسفو دی استر به photoproduct میشود. پایداری پیوند فسفودیاستر به نوکلئوتیدهای جانبی بستگی دارد (15). تغییرات RNA میتواند عملکرد هر دو RNAکدکننده و غیر کدکننده را در روشهای متعددی از جمله مداخله در میانکنشهای جفت باز در رونویسی و ترجمه mRNA ها و یا با تغییر خصوصیات شیمیایی نوکلئوتیدهای RNA ریبوزومی مورد نیاز برای کاتالیز RNA در ریبوزوم، تحت تاثیر قرار دهد. از عواقب عملکردی آسیب RNAمیتوان به کاهش سنتز پروتئین و تولید پپتیدهای متراکم و کوتاه و در نتیجه کراسلینک ریبوزومی و یا اکسیداسیون mRNA اشارهکرد (47). تحت تابش UV-B کراس لینکهایی میان -RNAپروتئین در تخمهای حشرات (21)، و همچنین در ذرت (7) مشاهده شدهاست. آسیب اکسیداتیو به RNA در مدلهای جانوری سالخورده، بهنگام انحطاط عصبی انسان و سلولهای در معرض UV گزارش شدهاست. بطور خلاصه، آسیب RNA به مهار عملکرد سلول میانجامد و ممکن است بر زیستایی سلول تأثیر منفی داشتهباشد. به دنبال آن، سلول ممکن است با مکانیسمهای دفاعی متفاوت از جمله مکانیسمهای تعمیر اختصاصی برای اشکال خاصی از آسیب و همچنین مسیرهای برگشت طبیعی، به آسیب RNA پاسخ دهد (57).
مهمترین مسیرهای بیولوژیکی فعال شده در سلولهای زایشی بعد از تابش UV-B بشرح زیر بوده است: ترمیم برشی عدم تطابق (MMR= Miss Match Repair)، گردایش نوکلئوزوم و کروموزوم. سیستم ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، علاوه بر نقشهای آن در ویرایش خطاهای همانندسازی و سایر عملکردها، همچنین در ترمیم و رفع سمیت سلولی حاصل از ضایعات DNA که ناشی از شرایط نامطلوب ژنوتوکسیک مانند نور UV و برخی مواد سرطانزا میباشد، درگیر میشود (12، 20 و 32). علاوه بر NER= Nucleotide Excision Repair ، MMR به ضایعات ناشی از UV حداقل در مرحله G1 پاسخ میدهد. هر دو مسیر ممکن است بصورت افزایشی برای ترمیم ضایعات عمل کنند یا با یکدیگر رقابت کنند. مطالعات نشان داده اند که به دنبال اشعه UV مسیرهای تعمیر چندگانه در سلول القا میشوند، که با فعال کردن برخی از اعضای خانواده پروتئینی لیگازهای یوبیکویئتین، پروتئینهای هدف را در فاز G1 چرخه سلولی تخریب میکنند (51). بهاینترتیب، با ترمیم کارآمد آسیب DNA، یکپارچگی ژنوم و زیستایی سلول حفظ میشود. دریافت و سیگنالینگ حضور آسیب DNA به دستگاه بازرسی چرخه سلولی برای حفظ یکپارچگی ژنومی و تنظیم پیشروی چرخه سلولی بسیار مهم است (55). نقاط بازرسی پاسخ به آسیب DNA با متوقف کردن چرخه سلولی، زمان لازم برای ترمیم DNA را فراهم میکنند. این استراتژی از تکثیر و تفکیک کروموزومهای آسیب دیده جلوگیری میکند که در غیر این صورت میتواند منجر به بیثباتی ژنوم شود. یکپارچگی DNA یا پیشروی چرخه سلولی را می توان با علامتگذاری در سطح کروماتین مشاهده کرد. علاوه بر این، بین ترمیمDNA و گردایش کروماتین، اتصال مکانیکی مشاهده شدهاست (13). انکوباسیونDNA آسیب دیده توسط اشعه UV در عصارههای آزاد سلولی که دستخوش ترمیم شدهاند، نشان داد که گردایش de novo نوکلئوزوم با ترمیم برش نوکلئوتیدی (NER) همراه میشود (13). برای NER ضایعاتDNA در کروماتینیک مدل کلی پیشنهاد شده است که در آن unfolding ساختارهای نوکلئوزومی، دسترسی به آنزیمهای ترمیمDNA را تسهیل میکند که بوسیله refolding سریع دنبال میشود (37). تنظیم مجدد ساختار کروماتینی پیشین در طول NER می تواند به ارتباط مکانیکی بین NER و گردایش کروماتین مرتبط باشد. عملکرد دیگرگردایش de novo کروماتین ممکن است مشارکت در ادراک آسیبDNA باشد. در طی پردازش آسیب DNA، گسترش ساختارهای کروماتینی بسیار حفاظت میشود که برای سیگنالینگ به دستگاه چرخه سلولی پراهمیت است. بطور خلاصه، پیامدهای عملکردی اتصال مسیر مشترک گردایش کروماتین به وقایع متفاوت پردازش آسیب DNA عبارتند از 1- تشکیل ساختاری که بوسیله دستگاه بازرسی چرخه سلولی تشخیص داده میشود؛ 2- سرکوبی یا دخالت در میانکنشهای DNA؛ و 3- بازآرایی مجدد ساختار کروماتین پیشین (38).
نتیجهگیری
نتایج این پژوهش نشان داد که هر دو تیپ سلولی بطور فعال و موثری به تیمار پاسخ دادهاند و در مجموع سازوکارهای دفاعی را آغاز کردهاند. از طرفی، بررسی این پاسخها نشان داد که الگوی ترنسکریپتوم هر یک از این سلولها بصورت متفاوتی در پاسخ به نور محیطی تغییر یافتهاست. بعنوان مثال میتوان به فعالیت کانالهای K+ در سلولهای سوماتیک در معرض تابش UV-B اشارهکرد. با توجه به اینکه عملکرد ممانعتی موثر سلولهای سوماتیک به حفظ یکپارچگی غشا و اتصالات محکم بین سلولها وابسته است، میتوان تصور کرد که این سلولها بعنوان فیلتر عمل میکنند تا با حفاظت از سلولهای زایشی به بقای ارگانیسم کمکنمایند. البته در حال حاضر نمیدانیم که کدام مسیر سیگنالینگ بواسطه UV-B باعث فعالشدن کانالهای K+در این سلولها شده است .سایر پاسخها در هر یک از سلولها بمنظور حفظ یکپارچگی ژنوم میباشد. بطور خلاصه، هر یک از سلولها با ترمیم آسیب ناشی از UV-B باعث کاهش حساسیت جلبک به این اشعه شده است.
سپاسگزاری
این پروژه با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاریهای علمی بینالمللی انجام شدهاست و از این طریق از مسئولین مربوطه سپاسگزاری میشود.