مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
بررسی اثر پرایمینگ توأم بذرهای گندم با اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن برای القاء تحمل به شوری
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395 تهران، ایران
2 کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، 3697-19395 تهران، ایران
چکیده
در این پژوهش، اثر پرایمینگ اسید سالیسیلیک، پراکسید هیدروژن و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر بهبود تحمل به شوری دانهرستهای گندم (Triticum aestivum L. cv Mihan) بررسی شد. بذرها به مدت 24 ساعت داخل آب مقطر (شاهد)، غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک (1/0، 5/0 و 1 میلی مولار) و پراکسیدهیدروژن (1، 20 و 200 میلی مولار) خیسانده شدند. پس از گذشت یک هفته، دانهرستها به محیط کشت هیدروپونیک حاوی محلول غذایی هوگلند منتقل شدند. آزمایش در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. شوری 200 میلیمولار وزن خشک اندام هوایی دانهرستهای گندم را 25 درصد کاهش داد. پرایمینگ بذرو با پراکسید هیدروژن 20 میلیمولار باعث کاهش تولید مالون دی آلدئید در شرایط تنش شوری گردید. با کاهش مالون دی آلدئید در دانهرستهای حاصل از پرایمینگ پراکسید هیدروژن، آسیب شوری بر ظرفیت فتوسنتزی و وزن خشک تخفیف یافت. با اینکه تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک نتوانست باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر رشد و فتوسنتز گندم شود، دانهرستهای رشد یافته از پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن مقاومت بیشتری به تنش شوری نشان دادند. این افزایش مقاومت با افزایش 45 درصدی (نسبت به شاهد) مقدار فنل کل و ارتقاء 37 درصدی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز همراه بود. در نتیجه شاخص پراکسیداسیون لیپیدها در تیمار توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن کاهش معنی دار نشان داد. همچنین پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر ظرفیت فتوشیمیایی فتوسیستم II گردید.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Salicylic acid and hydrogen peroxide priming as a means to induce salt stress tolerance of wheat
نویسندگان [English]
- Ghader Habibi 1
- Ozra Hosseini Nejad 2
1 Department of Biology, Payame Noor University (PNU), PO BOX 19395–3697 Tehran, Iran
2 Department of Biology, Payame Noor University (PNU), 19395–3697 Tehran, Iran
چکیده [English]
In this study, we investigated the role of salicylic acid (SA) and hydrogen peroxide (H2O2) priming in ameliorating salinity stress on wheat (Triticum aestivum L. cv Mihan) grown under hydroponic culture. Seeds of wheat were primed in distilled water (control), as well as different solutions of salicylic acid (0.1, 0.5 and 1 mM) and/or H2O2 (1, 20 and 200 mM) for 24 h at 25°C. Seven-day-old seedlings were transferred to Hoagland nutrient solution. Experiments were undertaken in complete randomized block design using 4 independent replications. Salinity stress drastically affected the plants as indicated by decreased biomass of shoots (about 25%). However, H2O2 priming at 20 mM raised free radical scavenging activities of wheat leaf, as evaluated by decrease in malondialdehyde (MDA) levels. These results indicated that H2O2 priming could prevent negative effects of salinity stress on the biomass and photosystem performance. While SA priming could not ameliorate the negative effect of salt on wheat seedlings, the use of both SA and H2O2 as priming agents had the most significant alleviating effect against NaCl stress. This ameliorative effect was achieved through stimulation of catalase activity (about 37%) and non-enzymatic (phenols) antioxidants (about 45%) and lowering tissue MDA contents. These results further confirm that the use of both SA and H2O2 as priming agents participated in the protection of membranes against the destabilizing effect of salt stress. Additionally, the use of both SA and H2O2 as priming agents mitigated the negative effects of salinity on the photochemical efficiency of PSII.
کلیدواژه‌ها [English]
- lipid peroxidation
- photochemical efficiency of PSII
- priming
- salt stress
- Triticum aestivum L
بررسی اثر پرایمینگ توأم بذرهای گندم با اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن برای القاء تحمل به شوری
قادر حبیبی* و عذرا حسینی نژاد
ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست‌شناسی
تاریخ دریافت: 10/6/1397 تاریخ پذیرش: 28/11/97
چکیده
دراین پژوهش، اثر پرایمینگ اسید سالیسیلیک، پراکسید هیدروژن و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر بهبود تحمل به شوری دانهرستهای گندم (Triticum aestivum L. cv Mihan) بررسی شد. بذرها به مدت 24 ساعت داخل آب مقطر (شاهد)، غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک (1/0، 5/0 و 1 میلی مولار) و پراکسیدهیدروژن (1، 20 و 200 میلی مولار) خیسانده شدند. پس از گذشت یک هفته، دانه رست‌ها به محیط کشت هیدروپونیک حاوی محلول غذایی هوگلند منتقل شدند. آزمایش در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. شوری 200 میلیمولار وزن خشک اندام هوایی دانهرستهای گندم را 25 درصد کاهش داد. پرایمینگ بذر و با پراکسید هیدروژن 20 میلیمولار باعث کاهش تولید مالون دی آلدئید در شرایط تنش شوری گردید. با کاهش مالون دی آلدئید در دانهرستهای حاصل از پرایمینگ پراکسید هیدروژن، آسیب شوری بر ظرفیت فتوسنتزی و وزن خشک تخفیف یافت. بااینکه تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک نتوانست باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر رشد و فتوسنتز گندم شود، دانهرستهای رشد یافته از پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن مقاومت بیشتری به تنش شوری نشان دادند. این افزایش مقاومت با افزایش 45 درصدی (نسبت به شاهد) مقدار فنل کل و ارتقاء 37 درصدی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز همراه بود. درنتیجه شاخص پراکسیداسیون لیپیدها در تیمار توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن کاهش معنی‌دار نشان داد. همچنین پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر ظرفیت فتوشیمیایی فتوسیستم II گردید.
واژه‌های کلیدی: پراکسیداسیون لیپید، ظرفیت فتوشیمیایی فتوسیستم II، پرایمینگ، تنش شوری، گندم
* نویسنده مسئول، تلفن: 37828041، پست الکترونیکی: gader.habibi@gmail.com
مقدمه
شوری یکی از مهمترین عوامل تنش‌زای محدود کننده بهره‌وری گیاهان زراعی است. اثر تنش شوری بر گیاهان به غلظت نمک و زمان قرارگرفتن در معرض نمک، ژنوتیپ گیاه و عوامل محیطی بستگی دارد. سازوکارهای تحمل به شوری هنوز به‌طور کامل شناخته نشده و تلاش برای بهبود عملکرد در شرایط تنش شوری، به دلیل منشأ چند ژنی پاسخ‍های سازگاری، تا حد زیادی ناموفق بوده است. شوری می‌تواند با آسیب رساندن به مرکز تولید اکسیژن و تجزیه اجزاء پلیپپتیدی فتوسیستم II در نهایت منجر به غیرفعال شدن PSII شود (۲۴). این تغییر با تحریک تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) باعث مهار فتوسیستم II و بروز آسیب اکسیداتیو در اجزای داخلی سلول‌ها می‌شود (۴). سنجش فلورسانس کلروفیل و انجام آزمون جیپ (JIP) می‌تواند بهعنوان ابزاری تعیین‌کننده در ارزیابی عملکرد فتوسیستم II در شرایط تنش شوری به کار رود (18و 38). گیاهان برای جلوگیری از آسیب رسیدن به فتوسیستم II و همچنین جاروب کردن گونه‌های فعال اکسیژن در تنش شوری، از سازوکارهای دفاع آنتی‌اکسیدانت آنزیمی و غیرآنزیمی بهره می‌برند (17).
در دهه‌های اخیر اثر تخفیف دهنده‌های مهمی ازجمله ترکیبات سازگار اسمزی (پرولین، گلایسین بتائین و ترههالوز)، هورمون‍های گیاهی (اسید جیبرلیک، جاسمونیک اسید، براسینواستروئیدها و سالیسیلیک اسید)، آنتی‌اکسیدانها )اسید آسکوربیک، گلوتاتیون و توکوفرول)، مولکولهای علامت دهنده (نیتریک اکسید و پراکسید هیدروژن)، پلی آمین‌ها (اسپرمیدین، اسپرمین و پوترسین) و عناصر مفید (سلنیم و یدات) برای کاهش آسیب‌های ناشی از شوری در گیاه مورد مطالعه قرارگرفته است (22). یکی از روش‌های مرسوم و مؤثر برای کاهش آسیب‌های ناشی از تنش شوری در گیاهان، روش پرایمینگ می‌باشد (30). در این روش بذر گیاهان در داخل محلول مواد شیمیایی خاص مثل پرولین، پراکسید هیدروژن، هورمون‌ها و نیتریک اکسید خیسانده می‌شود. پرایمینگ باعث ایجاد یک آمادگی اولیه در گیاه برای روبه رو شدن با تنش می‌شود و متناسب با آن تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی در دانهرستهای حاصل از پرایمینگ ایجاد می‌کند (30).
مشخص‌شده است که پرایمینگ بذر گیاهان با پراکسیدهیدروژن باعث تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی در دانهرستهای حاصل از پرایمینگ می‌شود و دانهرستهای رشد یافته از بذرهای پرایمینگ شده با پراکسید هیدروژن مقاومت بالایی به تنش‌ها نشان می‌دهند (11). در پژوهشهای متعدد نقش پرایمینگ پراکسید هیدروژن در کاهش آسیب‌های اکسیداتیو از طریق افزایش فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانت در گیاه ذرت (14) وPanax ginseng (29) نشان داده‌شده است. همچنین تحقیقات زیادی درباره تأثیر پرایمینگ بذر گیاهان با اسید سالیسیلک به‌منظور تخفیف تنش شوری انجام شده است. ولی درباره تأثیر تیمار پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط شوری تحقیقات کمی وجود دارد. از این‌رو مهمترین فرضیه این تحقیق این است که پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بهتر از پرایمینگ اسید سالیسیلیک به‌تنهایی و پراکسید هیدروژن به‌تنهایی باعث تخفیف اثرات مضر شوری می‌شود. در نتیجه برای اولین بار در این تحقیق تأثیر پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر دانهرستهای گندم در شرایط شوری مورد بررسی قرار گرفت. مهمترین هدف این تحقیق یافتن غلظتهای بهینه پرایمینگ اسید سالیسیلیک به‌تنهایی، پراکسید هیدروژن به‌تنهایی و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن به‌منظور تخفیف اثرات مضر شوری در دانهرستهای گندم بود. ازجمله اهداف دیگر این تحقیق یافتن اطلاعات جدیدی درباره سازوکارهای فیزیولوژیک تخفیف شوری توسط پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن و اثرات متقابل اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بود.
مواد و روشها
اعمال تیمارها: بذرهای گندم رقم میهن (Triticum aestivum L. cv Mihan) پس از ضدعفونی، به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد (۱۱) در آب مقطر (شاهد) و یا در محلولهای حاوی غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک (1/0، 5/0 و 1 میلی مولار) و پراکسیدهیدروژن (1، 20 و 200 میلی مولار) خیسانده شدند. سپس بذرهای پرایمینگ شده با آب مقطر یا غلظتهای مختلف پراکسید هیدروژن و اسید سالیسیلیک به روی کاغذ صافی مرطوب منتقل شدند تا جوانه بزنند. پس از انتخاب غلظتهای مناسب اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن از روی شاخص درصد جوانه‌زنی بذرها، در ادامه تحقیق از این غلظتهای بهینه اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن جهت پرایمینگ بذرها استفاده گردید. پس از گذشت یک هفته دانه رست‌ها به محیط کشت هیدروپونیک حاوی محلول غذایی هوگلند تغییر یافته (23)، منتقل و در شرایط کنترل شده آزمایشگاه (فتوپریود 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی، دمای روزانه 24 درجه سانتی‌گراد و شبانه 18 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 68 درصد و شدت نور 210 میکرومول بر مترمربع در ثانیه) کشت شدند. pH محلول غذایی در 5/6 تنظیم گردید. پس از گذشت دو هفته، نمک NaCl در غلظت 200 میلی مولار در محلول غذایی هوگلند تغییر یافته حل شد و در دو مرحله به تیمارهای شوری داده شد. درنهایت پس از گذشت 7 روز از اعمال شوری برداشت نمونهها انجام شد.
سنجش شاخص فلوئورسانس کلروفیل و آزمون جیپ (JIP): جهت تعیین فلوئورسانس کلروفیل، از دستگاه فلوئورسانسسنج (PEA, Hansatech Instruments Ltd., King’s Lynn, Norfolk, PE 32 1JL, England) استفاده شد. شاخص فلوئورسانس کلروفیل در برگهای سازش یافته با تاریکی (به مدت حداقل ۲۰ دقیقه) شامل F0 (فلوئورسانس پایه) و Fm (فلوئورسانس بیشینه) اندازه‌گیری شد. برای رسم منحنی فلورسانس از آزمون جیپ بهره گرفته شد. آزمون جیپ داده‌های ثبت شده اولیه توسط دستگاه فلوئورسانسسنج را به شاخص بیوفیزیکی تبدیل می‌کند و کمیت مراحل جریان انرژی را طی فتوسیستم II تعیین می‌کند. برای تولید منحنی فلورسانس OJIP، از نور قرمز با طول‌موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول/ مترمربع/ثانیه (برای اطمینان از رسیدن به پیک Fm) استفاده به عمل آمد. شاخص‌های زیر در اندازه‌گیری‌های فلورسانس اولیه مورد استفاده قرار گرفت: شدت فلورسانس بیشینه (Fm)، شدت فلورسانس در sµ50 (بهعنوان Fo در نظر گرفته شود)، شدت فلورسانس در sµ300 (F300µs) جهت محاسبه شیب اولیه (Mo) از نسبت فلورسانس متغیر(V) و شدت فلورسانس در ms2 (مرحلهJ) که نشانگر FJ است به کار برده می‌شود. سپس محاسبات لازم برای به دست آوردن سایر پارامترها ازجمله شدت فلوئورسانس بیشینه (Fm)، شدت فلورسانس در ۵۰ میکروثانیه (بهعنوان F0 در نظر گرفته شد)، شدت فلورسانس در ۳۰۰ میکروثانیه (F300µs)، شاخص کارآیی فتوسیستم‌ها (PIABS) و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) انجام شد (۳3).
اندازه‌گیری پروتئین کل: عصارۀ پروتئینی در بافر فسفات سدیم با غلظت mM 50 و 8/6=pH استخراج شده و به مدت ۲۰ دقیقه در g15000 سانتریفوژ شد. از رو شناور حاصل برای سنجش پروتئین کل به روش برادفورد (۸) استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز: فعالیت فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) مطابق روش زوکر (۳8) مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. ابتدا عصارۀ آنزیمی در بافر mM ۵۰ بافر فسفات سدیم با 8/7=pH و حاوی اتیلن دی‌آمین تترااستیک‌اسید (EDTA) با غلظت mM 2، mM 18 مرکاپتواتانول و 1/0 درصد تریتون X-100استخراج شد. عصاره‌ها به مدت ۱۵ دقیقه در g۱۵۰۰۰ سانتریفوژ شده و رو شناور برای سنجش فعالیت مورد استفاده قرار گرفت. ۱۰۰ میکرولیتر از عصاره به یک میلی‌لیتر از محلول واکنشی شامل mM ۵۰ بافر سدیم بورات (8/8=pH) و mM 5 L-فنیل آلانین اضافه شده و مخلوط حاصل به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۳۰ درجه به‌منظور انجام واکنش قرار گرفت. جذب نمونهها در nm ۲۹۰ توسط اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. یک واحد فعالیت آنزیم بر اساس غلظت پروتئین آنزیمی لازم برای تولید یک نانومول سینامیک اسید محاسبه شد.
سنجش فنل کل: از آنجایی که بیشترین ترکیبات فنلی گیاهان از نوع پلی‌فنل‌ها می‌باشد، برای سنجش فنل کل از روش معرف فنلی فولین‌سیو‌کالتو استفاده شد (۲6). برای این منظور، ۵ گرم بافت سبز برگ یا ژل برگ جداسازی شده و پس از پودر شدن توسط هاون در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر به مدت ۳۰ دقیقه جوشانده شد و با استفاده از کاغذ واتمن شماره ۴۲ صاف گردید. غلظت 250 میکرولیتر معرف فولین با 25 میکرولیتر عصاره و 500 میکرولیتر محلول آبی کربنات سدیم 20 درصد مخلوط شد. نمونه‌های شاهد فاقد عصاره بودند. پس از قرار دادن نمونهها در دمای آزمایشگاه به مدت 30 دقیقه جذب آنها در طول‌موج 765 نانومتر اندازه‌گیری شد و غلظت فنل کل بر اساس منحنی استاندارد اسید گالیک به دست آمد. برای هر عصاره این سنجش 4 بار تکرار شد و میانگین فنل کل موجود در عصاره تیمارها به‌صورت میلیگرم اسید گالیک در گرم بافت بیان شد.
سنجش فلاونوئیدها: برای سنجش غلظت فلاونوئیدها، نمونه‌های برگ در متانول حاوی آلومینیوم کلراید دو درصد استخراج شده و پس از سانتریفوژ، رو شناور برداشت و جذب آن در طول‌موج 415 نانومتر قرائت شد. از غلظتهای مختلف کوئرستین (صفرتا 16 میلیگرم در لیتر) بهعنوان استاندارد استفاده گردید و غلظت فلاونوئیدها براساس واحد mg quercetin g-1 FW محاسبه شد (۳2).
سنجش فعالیت آنزیمهای آنتی‌اکسیدانت: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیس موتاز (SOD) مطابق روش جیانوپولیتیس و رایس (۱۳و ۱۶) و براساس درصد ممانعت از احیاء NBT به ترکیب ارغوانی رنگ دی فورمازان بوسیلۀ رادیکال سوپراکسید (O2•-) حاصل از فتولیز ریبوفلاوین، توسط آنزیم موجود در عصاره مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. نمونهها بلافاصله پس از برداشت در ازت مایع، پودر شده و عصارۀ آنزیمی در بافر mM ۲۵ از هیدروکسی اتیل پیپرازین اتان سولفونیک اسید (HEPES) با 8/7=pH و حاوی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) با غلظت 1/0 میلی مولار استخراج شد. عصاره‌ها به مدت 15 دقیقه در 15000 دور سانتریفوژ شده و رو شناور برای سنجش فعالیت مورد استفاده قرار گرفت. 100 میکرولیتر از عصاره به یک میلی‌لیتر از محلول واکنشی شامل 25 میلی مولار HEPES با 6/7=pH، 1/0 میلی مولار EDTA، 50 میلی مولار Na2CO3 (2/10=pH)، 12 میلی مولار L-متیونین، 75 میکرومولار NBT و 1 میکرومولار ریبوفلاوین اضافه شده و مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه در شدت نور 150 میکرومول/ مترمربع/ثانیه به‌منظور انجام واکنش قرار گرفت. برای تهیه نمونه‌های شاهد مخلوط فوق بدون افزودن عصارۀ آنزیمی تهیه گردید و جذب نمونهها در 560 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. یک واحد فعالیت آنزیم بر اساس غلظت پروتئین آنزیمی لازم برای القاء 50 درصد ممانعت از احیاء NBT در مقایسه با نمونه‌های شاهد بدون عصارۀ آنزیمی محاسبه شده و به‌صورت واحد فعالیت بر میلیگرم پروتئین بیان گردید.
فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) مطابق روش سایمون و همکارانش (32) و بر اساس کاهش جذب پراکسید هیدروژن (H2O2) در nm 240 مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. عصارۀ آنزیمی پس از پودر شدن نمونهها در ازت مایع، در بافر فسفات با غلظت mM 50 و 7=pH استخراج شده و به مدت 10 دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ گردید. برای سنجش فعالیت آنزیم غلظت مناسبی از عصاره به محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار (7=pH) و 10 میلی مولار از H2O2 افزوده شده و تغییرات جذب به مدت دو دقیقه توسط اسپکتروفتومتر مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. درنهایت فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی H2O2 (mM-1 cm-1 041/0) برحسب میکرومول پراکسیدهیدروژن بر میلیگرم پروتئین در دقیقه محاسبه گردید.
سنجش پراکسیداسیون لیپیدها و مقدار پراکسید هیدروژن (H2O2): سنجش مالون دی آلدئید (MDA) بهعنوان معیاری برای بررسی میزان پراکسیداسیون لیپیدها براساس روش بومیناتان و دوران (7) صورت گرفت. عصارۀ برگ در محلول 1/0 درصد تری کلرواستیک اسید (TCA) استخراج شده و به مدت پنج دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ گردید. نسبت 1 به 4 از رو شناور با محلول 20 درصد از تری کلرواستیک اسید حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید در لولۀ آزمایش باهم مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس لوله‌ها بهسرعت در یخ سرد شده و به مدت 15 دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ شدند. همزمان با عصاره‌های برگ محلولهای استاندارد در محدودۀ صفرتا 100 نانومول از 1،1،3،3- تترا اتوکسی پروپان تهیه شده و جذب نمونهها در 532 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر مورد اندازه‌گیری قرارگرفت. درنهایت غلظت مالون دی آلدئید نمونهها برحسب نانومول بر گرم وزن‌تر محاسبه شد.
غلظت پراکسید هیدروژن (H2O2) براساس روش ولیکوا و همکاران (35) به دست آمد. محلول استخراج برگها محلول‌تری کلرواستیک اسید (1/0 درصد وزنی به حجمی) بود. عصاره‌ها به مدت 15 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ شده و رو شناور مورد استفاده قرار گرفت. 500 میکرولیتر از عصاره به یک میلی‌لیتر از محلول واکنشی شامل 10 میلی مولار بافر فسفات پتاسیم (7=pH) و یک مولار یدید پتاسیم اضافه شده و مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در تاریکی به‌منظور انجام واکنش قرارگرفت. جذب نمونهها در 390 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. مقادیر براساس منحنی استاندارد H2O2 در محدودۀ صفرتا 50 نانومول محاسبه شد.
طرح آزمایشی و تجزیه داده‌ها: آزمایش در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. تجزیه‌وتحلیل داده‌ها با کمک نرم‌افزار سیگما استات (نسخه 5/3) با استفاده از تست توکی در سطح پنج درصد انجام گردید.
نتایج
تعیین غلظت مناسب اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن جهت پرایمینگ بذرها: برای تعیین غلظت مناسب اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن جهت پرایمینگ بذرها، تأثیر سطوح مختلف اسید سالیسیلیک (1/0، 5/0 و 1 میلی مولار) و پراکسیدهیدروژن (1، 20 و 200 میلی مولار) بر جوانه‌زنی بذرها مطالعه شد. نتایج نشان داد که پرایمینگ بذرها با 1 میلی مولار اسید سالیسیلیک یا 200 میلی مولار پراکسیدهیدروژن باعث کاهش معنی‌دار درصد جوانه‌زنی بذرها گردید (جدول 1). درصد جوانه‌زنی بذرها در تیمار 5/0 میلی مولار اسید سالیسیلیک یا 20 میلی مولار پراکسیدهیدروژن با درصد جوانه‌زنی بذرها در تیمار شاهد تفاوت معنی‌دار نشان نداد. بنابراین در ادامه تحقیق از این غلظتهای اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن جهت پرایمینگ بذرها استفاده گردید.
جدول 1- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر درصد جوانه‌زنی بذرهای گندم. تفاوت بین اعداد که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤).
|
درصد جوانه‌زنی بذرها |
|
تیمار |
|
91±2.5a |
|
شاهد |
|
87±4.3a |
1/0 میلی مولار |
|
|
95±3.2a |
5/0 میلی مولار |
اسید سالیسیلیک |
|
74±4.1b |
1 میلی مولار |
|
|
90±5.7a |
1 میلی مولار |
|
|
96±4.0a |
20 میلی مولار |
پراکسید هیدروژن |
|
35±6.9b |
200 میلی مولار |
|
تأثیر پرایمینگ بذرها با اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن بر شاخص رشد در شرایط شوری: شوری باعث افت معنی‌دار وزن‌تر و خشک ساقه نسبت به شاهد شد (شکل 1). هرچند پرایمینگ پراکسید هیدروژن در غلظت 20 میلی مولار مانع از افت معنی‌دار وزن خشک ساقه در شرایط شوری شد. بررسی تأثیر پرایمینگ بذرهای گندم با اسید سالیسیلیک بر شاخص رشد دانه رست‌های گندم نشان داد که هرچند پرایمینگ اسید سالیسیلیک به‌تنهایی اثری بر وزن خشک ساقه در شرایط شوری نداشت ولی پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن مانع از افت معنی‌دار وزن‌تر و خشک ساقه در شرایط شوری شد و توانست اثر شوری را تخفیف دهد. همچنین پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط غیرشور باعث افزایش معنی‌دار وزن‌تر نسبت به شاهد شد (شکل 1).
شکل 1- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر شاخص رشد دانه رست‌های گندم در شرایط شوری. تفاوت بین اعداد مربوط به ستون‌ها که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤).
تأثیر پرایمینگ بر تغییرات منحنی فلورسانس OJIP برگها در شرایط شوری: برای رسم منحنی فلورسانس از تست JIP بهره گرفته شد. تست JIP داده‌های ثبت شده اولیه توسط دستگاه فلوئورسانسسنج را به شاخص بیوفیزیکی تبدیل می‌کند و کمیت مراحل جریان انرژی را طی فتوسیستم II تعیین می‌کند. بررسی تغییرات منحنی فلورسانس در شرایط شوری نشان داد که شدت فلورسانس در فاز OJ افزایش چشمگیری یافته است. پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن به تنهایی شدت فلورسانس در فاز OJ را به‌صورت چشمگیری افزایش داد (شکل 2). پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست باعث تخفیف اثرات شوری بر منحنی فلورسانس گردد و شدت فلورسانس در فاز IP را نسبت به شاهد افزایش دهد.
شکل 2- تأثیر پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر تغییرات منحنی فلورسانس OJIP (محور عمودی شدت فلورسانس و محور افقی زمان براساس میکروثانیه است) برگهای گندم در شرایط شوری. برای تولید منحنی فلورسانس OJIP، از نور قرمز با طول‌موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول بر مترمربع در ثانیه (برای اطمینان از رسیدن به پیک Fm) استفاده شد.
بررسی شاخص فلورسانس کلروفیل در برگهای شوری دیده نشان داد که هرچند مقدار بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II در برگهای شوری دیده تفاوت معنی‌داری در مقایسه با برگهای شاهد نشان نداد ولی شاخص کارآیی فتوسیستم‌های برگهای شوری دیده در مقایسه با برگهای شاهد کاهش معنی‌دار نشان داد (شکل 3). همچنین شاخص بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II تحت تأثیر هیچ‌کدام از تیمارهای پرایمینگ پراکسید هیدروژن به تنهایی و اسید سالیسیلیک به تنهایی و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن قرار نگرفت. کارآیی فتوسیستم‌های برگهای تیمار شده با پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط غیرشور افزایش معنی‌داری در مقایسه با برگهای شاهد نشان داد. با اعمال تیمار پرایمینگ پراکسید هیدروژن به تنهایی و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط شور، تأثیر منفی شوری بر کارآیی فتوسیستم‌ها تخفیف یافت (شکل 3). هرچند تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک به تنهایی در شرایط شور، نتوانست تأثیر منفی شوری بر کارآیی فتوسیستم‌ها را تخفیف دهد.
شکل 3- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن بر بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) و شاخص کارآیی فتوسیستم‌ها (PIabs) در برگهای گندم در شرایط شوری. تفاوت بین اعداد مربوط به ستون‌ها که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤).
تأثیر پرایمینگ بر متابولیسم فنلی در شرایط شوری: شوری به تنهایی بر فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و غلظت فنل کل و فلاوونوئید اثر نداشت (شکل 4). تیمار پرایمینگ پراکسید هیدروژن به تنهایی در شرایط شور و غیرشور، نتوانست تغییری در فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و غلظت فنل کل ایجاد کند. ولی پرایمینگ بذرها با اسید سالیسیلیک باعث افزایش معنی‌دار غلظت فنل کل نسبت به شاهد گردید (شکل 4). تیمار پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و غلظت فنل کل برگهای گندم را در شرایط شور افزایش دهد.
شکل 4- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و غلظت فنل کل و فلاوونوئید برگهای گندم در شرایط شوری. تفاوت بین اعداد مربوط به ستون‌ها که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤).
اثر پرایمینگ بر فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانت در شرایط شوری: هیچ‌کدام از تیمارهای شوری، تیمارهای پرایمینگ پراکسید هیدروژن به تنهایی و اسید سالیسیلیک به تنهایی و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز اثر نداشتند (شکل 5). بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای شوری مشهود بود. پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست فعالیت آنزیم کاتالاز برگهای گندم را در شرایط شور به‌شدت افزایش دهد.
شکل 5- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز برگهای گندم در شرایط شوری. تفاوت بین اعداد مربوط به ستون‌ها که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤)
اعمال شوری باعث افزایش معنی‌دار غلظت پراکسید هیدروژن (H2O2) و مالون دی آلدئید در برگهای گندم گردید (شکل 6). با اعمال پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط شور، تأثیر منفی شوری تخفیف یافت و غلظت پراکسید هیدروژن (H2O2) و مالون دی آلدئید در برگهای گندم کاهش نشان داد. هرچند تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک در شرایط شور، نتوانست غلظت مالون دی آلدئید حاصل از پراکسیداسیون غشاها را بکاهد.
بحث
تأثیر پرایمینگ بر شاخص رشد در شرایط شوری :
کاهش رشد پس از اعمال شوری بالا در مطالعات مختلف و در گیاهان مختلف به اثبات رسیده است (18و 19).
شکل 6- تأثیر پرایمینگ اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن خارجی بر غلظت مالون دی آلدئید و پراکسیدهیدروژن برگهای گندم در شرایط شوری. تفاوت بین اعداد مربوط به ستون‌ها که با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند معنی‌دار می‌باشد (05/0P ≤)
در همین راستا، تیمار شوری 200 میلی مولار باعث کاهش معنی‌دار وزن‌تر و خشک گندم شد. پرایمینگ بذرهای گندم با پراکسید هیدروژن (20 میلی مولار) باعث تخفیف اثرات مضر شوری بر شاخص رشد شد. تخفیف اثرات مضر شوری بر شاخص رشد در بذرهای ذرت (9) و جو (25) پرایم شده با پراکسید هیدروژن، گزارش شده است. با در نظر گرفتن شاخص رشد، پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست اثر تنش شوری را تخفیف دهد، بطوری که مقدار وزن خشک ساقه‌های شوری دیده در تیمار پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسیدهیدروژن افت نکرد. مشابه اثر کاربرد سایر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاه، که بستگی زیادی به گونه و نیز تعادل هورمونی آن‌گونه در شرایط شاهد و یا تنشی دارد (20)، کاربرد اسید سالیسیلیک بهعنوان یک ترکیب هورمونی نیز به عوامل علامت‌دهی و تعادل سایر تنظیم‌کننده‌ها بستگی دارد (15) و در گندم کاربرد سالیسیلیک اسید فقط در حضور پراکسید هیدروژن باعث تخفیف تنش شوری شد.
تأثیر پرایمینگ بر شاخص فلورسانس کلروفیل در شرایط شوری: با اعمال شوری، منحنی فلورسانس برگهای گندم شکل مسطحی را نشان داد و شدت فلورسانس در فاز IP کاهش شدیدی را نشان داد. کاهش فاز IP که با کاهش شدت فلورسانس بیشینه (Fm) در ارتباط می‌باشد نشان‌دهنده غیرفعال شدن پروتئین‌ها در ساختار فتوسیستم II می‌باشد که در همه برگهای گندم در پاسخ به شوری مشاهده شد (21). پرایمینگ بذرو با پراکسید هیدروژن 20 میلی مولار باعث تخفیف اثرات شوری برشدت فلورسانس در فاز IP شد و شکل منحنی فلورسانس را به شکل منحنی فلورسانس شاهد نزدیک ساخت. پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن باعث تخفیف اثرات شوری برشدت فلورسانس در فاز IP شد و شکل منحنی فلورسانس را به شکل منحنی فلورسانس شاهد نزدیک ساخت. با این حال شدت فلورسانس در فاز J در برگهای تیمار شده با شوری و پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بالا بود. افزایش شدت فلورسانس در فاز J با کاهش ذخایر کوئینونA احیاء (QAH2) و پلاستوکوئینون احیاء (PQH2) مرتبط می‌باشد (18).
شاخص Fv/Fm یکی از شاخص‌های مهم جهت تعیین مقاومت به انواع تنش‌ها ازجمله پاتوژن‌ها (28)، خشکی و دما (10) می‌باشد سنجش Fv/Fm برگهای گیاه گندم نشان داد که این پارامتر در پاسخ به شوری تغییری نشان نداد. هرچند شاخص PIabs در برگهای این گیاه در پاسخ به شوری کاهش معنی‌دار نشان داد. این یافته با نتایج تحقیق زیوسک و همکاران (36) که نشان دادند پارامترPIabs در مقایسه با پارامتر Fv/Fm به تنش‌های محیطی حساس‌تر است، در انطباق می‌باشد. پارامتر PIabs یک پارامتر کمپلکس است که با ظرفیت فتوسنتزی و میزان تثبیت دی‌اکسید کربن در برگها همبستگی دارد (34). درباره نقش پرایمینگ بذرها در تخفیف اثر مضر شوری بر واکنش‌های فتوشیمیایی گیاهی اطلاعات اندکی در دست است و تنها تأثیر مثبت پرایمینگ نیتریک اکسید بر واکنش‌های فتوشیمیایی چغندرقند مطالعه شده است (31). در این تحقیق، افزایش پارامتر PIabs در برگهای شوری دیده تیمار شده با پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن نسبت به برگهای شوری دیده تیمار نشده با پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن نشان داد که کاربرد پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست باعث ترمیم ظرفیت فتوسنتزی و سرعت تثبیت دی‌اکسید کربن در برگهای شوری دیده شود و تأثیر منفی شوری بر کارآیی فتوسیستم‌ها را تخفیف دهد.
تأثیر پرایمینگ بر پتانسیل آنتی اکسیدانتی و متابولیسم فنلی در شرایط شوری: وقتی گیاهان در معرض تنش شوری قرار می‌گیرند تولید مولکولهای اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species, ROS) در آنها افزایش می‌یابد (27). تنش شوری باعث تجمع انباشت انواع اکسیژن فعال در سلول و آسیب رساندن به لیپیدهای غشا و انباشت مالون دی آلدئید، آسیب به پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌شود (1). افزایش مولکولهای H2O2 و مالون دی آلدئید می‌تواند باعث مهار رشد و کاهش توان سازگاری گیاه در برابر تنش شوری شود (17). فدینا و همکاران (12) گزارش کردند که استفاده از تیمار پرایمینگ بذور با پراکسید هیدروژن با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی‌اکسیدانت باعث کاهش غلظت H2O2 و مالون دی آلدئید می‌شود. در توافق با یافته فوق، در این آزمایش نیز کاهش غلظت مالون دی آلدئید بهعنوان معیاری از پراکسیداسیون لیپیدها در تیمار توأم شوری و پرایمینگ پراکسیدهیدروژن نسبت به تیمار شوری نشان داده شد. بر اساس گزارش کیم و همکاران (27) در گیاه کاهو تیمار کوتاه مدت شوری باعث افزایش انباشت فنل‌ها می‌گردد. هرچند در این تحقیق، تیمار شوری تغییری در فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (آنزیم کلیدی بیوسنتز فنل‌ها) و غلظت فلاوونوئید و فنل کل ایجاد نکرد. مطالعات حاکی از نقش اسید سالیسیلیک در کاهش آسیب‌های اکسیداتیو از طریق افزایش فعالیت سیستم آنتی اکسیدانت و کاهش مقدار مالون دی آلدئید و پراکسیداسیون غشاها می‌باشد (3). دراین تحقیق، پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن فعالیت آنزیمهای سیستم آنتی‌اکسیدانت بویژه آنزیم کاتالاز را افزایش داد. کاتالاز یکی از آنزیمهای مهم جارو کننده H2O2 محسوب می‌شود (2). نتایج این تحقیق با نتایج سایر محققان که نقش پرایمینگ پراکسید هیدروژن در کاهش آسیب‌های اکسیداتیو از طریق افزایش فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانت در گیاه ذرت (14) و
Panax ginseng (29) را نشان داده‌اند، در توافق می‌باشد. پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن باعث افزایش معنی‌دار غلظت فنل کل و فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز نسبت به شاهد گردید. با عنایت به اینکه نقش افزایش فنل‌ها در افزایش توان آنتی‌اکسیدانت به اثبات رسیده است (5و 6)، افزایش قابل‌ملاحظه فعالیت کاتالاز و فنل کل در تیمار پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن از انباشت مقادیر بالای H2O2 و پراکسیداسیون لیپیدها در شرایط شوری جلوگیری کرد.
نتیجه‌گیری
بررسی شاخص‌های فلورسانس کلروفیل و پراکسیداسیون لیپیدها در گیاه گندم تیمار شده با شوری 200 میلی مولار نشان داد که این رقم گندم در برابر این سطح از شوری مقاوم نبوده و شوری میزان پراکسیداسیون لیپیدها را افزایش داده و رشد را مهار کرده است. با کاهش مالون دی آلدئید در دانه رست‌های حاصل از پرایمینگ پراکسید هیدروژن 20 میلی مولار، آسیب شوری بر ظرفیت فتوسنتزی و وزن خشک تخفیف یافت و ظرفیت فتوشیمیایی فتوسیستم‌ها در شرایط شوری حفظ گردید. نتایج بررسی اثر پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن نشان داد که اثرات متقابل اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن بر روی اکثریت شاخص سنجش شده معنی‌دار می‌باشد. بااینکه تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک نتوانست باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر رشد و فتوسنتز گندم شود، دانهرستهای رشد یافته از پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن مقاومت بیشتری به تنش شوری نشان دادند. این افزایش مقاومت با افزایش قابل‌ملاحظه توان آنتی‌اکسیدانت (بخاطر افزایش فنل کل و فعالیت کاتالاز) و در نتیجه کاهش شاخص پراکسیداسیون لیپیدها (MDA) مرتبط بود. در نتیجه ظرفیت فتوشیمیایی فتوسیستم‌ها در دانهرستهای حاصل از پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در شرایط شوری حفظ گردید. اینکه چرا پرایمینگ توأم اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن توانست باعث تخفیف اثرات تنش شوری بر رشد و فتوسنتز گندم شود ولی تیمار پرایمینگ اسید سالیسیلیک به تنهایی نتوانست، نیازمند تحقیقات بیشتری است تا ابعاد برهم‌کنش اسید سالیسیلیک و پراکسید هیدروژن در فرآیند پرایمینگ روشن شود.
(علمی)', './data/plant/coversheet/cover_fa.jpg'))
دوره 33، شماره 4
دی 1399صفحه 827-839
- تاریخ دریافت: 10 شهریور 1397
- تاریخ بازنگری: 07 دی 1397
- تاریخ پذیرش: 28 بهمن 1397