نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران

3 عضو هیئت علمی دانشگاه مراغه

چکیده

خواص دارویی سیر (Allium sativum) عمدتاً مربوط به آلیسین با اثرات زیستی گسترده‌، هدف از این مطالعه بررسی اثر سولفات آهن بر رشد، محتوای آلیسین، پروتئین و سیستئین ریز نمونه‌های سیر بود. بخش صفحه پایگاهی حبه‌های سیر پس از ضدعفونی سطحی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) کشت و پس از یکماه به محیط‌های‌ کشت حاوی غلظت‌های مختلف سولفات آهن به مدت 10 و 20 روز منتقل شدند. در پایان هر بازه زمانی، میزان رشد گیاهچه‌ها و محتوای آلیسین با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و مقدار پروتئین و سیستئین به روش اسپکتروفتومتری تعیین شد. بیشترین میزان آلیسین و پروتئین در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی در هر دو بازه زمانی در تیمار 12/11 میلی‌گرم در لیتر مشاهده شد. بیشینه میزان آلیسین و پروتئین به ترتیب در بخش‌های ریشه (62/16 میلی مولار در گرم وزن تر) و اندام‌های هوایی (8 میلی‌گرم در گرم وزن تر) گیاهچه‌های تیمار شده به‌وسیله 12/11 میلی‌گرم در لیتر سولفات آهن بعد از بیست روز اندازه‌گیری شد. در تیمار 56/5 میلی‌گرم در لیتر افزایش معنی‌دار وزن تر و طول ریشه و میزان سیستئین نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد. هم چنین تفاوت معنی-دار وزن تر و طول بخش هوایی در غلظت 39/1 میلی‌گرم در لیتر در مقایسه با سایر تیمارها اندازه‌گیری شد. با توجه به نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر، احتمالاً سولفات آهن می‌تواند محرک مناسبی برای افرایش محتوای آلیسین ریزنمونه‌های سیر باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of the effect of iron sulfate on growth and some biochemical parameters of garlic plantlets under in vitro culture condition

نویسندگان [English]

  • Parisa Fathi Rezaei 1
  • Marya Mohammadnezhad 2
  • Ahmad Aghaee 3

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Maragheh, Maragheh, Iran

3 Biology department, Faculty of Science, University of Maragheh, Prof. Ghannadi Boulevard, Mother Square, Maragheh, Iran

چکیده [English]

Allicin as the best-known active compound of garlic (Allium sativum) has a vast variety of biological effects.
The effect of iron sulfate was evaluated on allicin, cysteine, growth and protein contents of Allium sativum explants.
Garlic bulbs were surface-sterilized and cultured on Murashige and Skoog (MS) medium for 1 month then transferred to the medium supplemented with different concentrations of iron sulfate for 10 and 20 day periods. At the end, shoot and root samples were gathered and fresh weighted and length of plantlets measured. Allicin content was determined by HPLC method, cysteine and total protein contents were determined by spectrophotometry.
The highest amount of allicin and protein was observed for 11.12 mg/L treatment of root and shoot at both endpoints. The maximum content of allicin and protein were determined respectively on the root (16.62 mM/g FW) and shoot (8 mg/g FW) of 11.12 mg/L-treated explants after 20 days. On 5.56 mg/L-treated explants, a significant increase of fresh weight and length of root and cysteine content were observed in comparison with other treatments.
In addition, on the shoot of 1.39 mg/L-treated explants, a significant difference in fresh weight and length were measured compared with the other treatments.
Because of the important role of allicin on medicinal features of Allium sativum, probably iron sulfate could be a good elicitor for the elevation of allicin content of garlic explants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Allicin
  • cysteine
  • fresh weight
  • garlic
  • protein

ارزیابی اثر سولفات آهن بر رشد و برخی شاخص­های بیوشیمیایی ریزنمونه­های گیاه سیر در شرایط کشت درون شیشه­ای

پریسا فتحی رضایی*، ماریا محمدنژاد و احمد آقایی

ایران، مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 24/7/97                تاریخ پذیرش: 25/2/98

چکیده

خواص دارویی سیر (Allium sativum) عمدتاً مربوط به آلیسین با اثرات زیستی گسترده­، هدف از این مطالعه بررسی اثر سولفات آهن بر رشد، محتوای آلیسین، پروتئین و سیستئین ریز نمونه­های سیر بود. بخش صفحه پایگاهی حبه­های سیر پس از ضدعفونی سطحی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) کشت و پس از یکماه به محیط­های­ کشت حاوی غلظت­های مختلف سولفات آهن به مدت 10 و 20 روز منتقل شدند. در پایان هر بازه زمانی، میزان رشد گیاهچه­ها و محتوای آلیسین با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و مقدار پروتئین و سیستئین به روش اسپکتروفتومتری تعیین شد. بیشترین میزان آلیسین و پروتئین در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی در هر دو بازه زمانی در تیمار 12/11 میلی­گرم در لیتر مشاهده شد. بیشینه میزان آلیسین و پروتئین به ترتیب در بخش­های ریشه (62/16 میلی مولار در گرم وزنِ تر) و اندام­های هوایی (8 میلی­گرم در گرم وزنِ تر) گیاهچه­های تیمار شده به­وسیله 12/11 میلی­گرم در لیتر سولفات آهن بعد از بیست روز اندازه­گیری شد. در تیمار 56/5 میلی­گرم در لیتر افزایش معنی­دار وزنِ تر و طول ریشه و میزان سیستئین نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد. هم چنین تفاوت معنی­دار وزنِ تر و طول بخش هوایی در غلظت 39/1 میلی­گرم در لیتر در مقایسه با سایر تیمارها اندازه­گیری شد. با توجه به نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر، احتمالاً سولفات آهن می­تواند محرک مناسبی برای افرایش محتوای آلیسین ریزنمونه­های سیر باشد.

واژه های کلیدی: آلیسین، پروتئین، سیر، سیستئین، وزنِ تر

* ﻧﻮﻳﺴﻨﺪه ﻣﺴﺌﻮل، ﺗﻠﻔﻦ: 37273060-041، پست اﻟﻜﺘﺮونیکی: parisafathirezaei@gmail.com

مقدمه

 

سیر با نام علمی Allium sativum گیاهی از راسته مارچوبه‌ای‌ها (Asparagales) و متعلق به خانواده Liliaceae است. سیر گیاهی است سنتی که نه فقط بعنوان چاشنی، بلکه بخاطر داشتن خواص زیستی متنوع از دیرباز مورد استفاده بوده است. سیر بعلت داشتن ترکیبات ارگانوسولفوره در صنایع داروسازی استفاده شده و داروهای زیادی از آن تهیه می‌شود. پژوهش‌های گسترده­ای در مورد خواص دارویی سیر در حال انجام است. مواد مؤثره سیر شامل دو گروه ترکیبات گوگردی و غیر گوگردی می­باشند. اثرات دارویی این گیاه مربوط به ترکیبات سولفوردار می­باشد. ترکیبات عمده حاوی سولفور در سیر سالم از طریق واکنش‌های آنزیمی، دمایی و شیمیایی در هنگام برش یا خرد شدن سیر به تیوسولفینات تبدیل می‌شوند. مهمترین ترکیب شیمیایی سیر اسید‌آمینه غیر‌پروتئینی آلیین (Alliin) می­باشد که در اثر جویدن، له شدن، برش و عصاره‌گیری، آنزیم آلییناز موجود در آن آزاد و به سرعت باعث لیز شدن آلیین و تبدیل آن به آلیسین (دی آلیل تیو سولفینات) می­شود (7 و 22). آلیسین دارای خواص زیستی و دارویی وسیعی از جمله ضد‌میکروبی، ضد‌سرطانی، ضد‌فشارخون، ضد‌آرتریت، تعدیل‌‌کننده سیستم ایمنی، ضد‌پیری، سم‌زدایی فلزات سنگین و کاهنده قند و چربی خون می­باشد (6 و 1).

گیاهان و سلول­های گیاهی پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی به عوامل میکروبی، شیمیایی و فیزیکی به عنوان الیسیتورها نشان می­دهند. استفاده از الیسیتورها موجب القاء یا افزایش سنتز متابولیت­های ثانوی به وسیله گیاهان برای حفظ بقاء، مقاومت و رقابت می­شود (8). الیسیتورها ترکیباتی هستند که از طریق القای پاسخ­های دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیت­های ثانوی می­شوند. امروزه با پیشرفت فناوری، روش­های متعددی برای تولید متابولیت­های ثانوی مانند استفاده از الیسیتورها به وجود آمده است. الیسیتور­ها ممکن است با فعال­سازی ژن­های برخی از آنزیم­ها در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را القاء نمایند و  موجب تشکیل متابولیت­های ثانوی شوند. عوامل مختلفی مانند سن گیاه، محیط کشت، غلظت و زمان افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که گیاه در معرض الیسیتور قرار می­گیرد، بر میزان تولید متابولیت­های ثانوی تأثیر می­گذارد (5).

گوگرد در بین عناصر غذایی، پس از نیتروژن، فسفر و پتاسیم، به­ عنوان چهارمین عنصر غذایی اصلی معرفی و نقش آن در تولید محصولات کشاورزی به خوبی شناخته شده و تأثیر آن در شکل­گیری اسیدهای آمینه­ی متیونین و سیستئین، سنتز پروتئین، کلروفیل II و محتوای دانه­های روغنی به اثبات رسیده ­است. بطور کلی ترکیبات زیستی حاوی گوگرد، بسیار متنوع می­باشند، برای مثال گوگرد در ساختار ویتامین­ها (بیوتین و تیامین)، کوفاکتورها، کوآنزیم­آ، اسید لیپوئیک، لیپیدهای کلروپلاست، پروتئین­های خاص (گلوتاردوکسین تیوردوکسین، دی­سولفید ایزومراز) و بسیاری از متابولیت­های ثانویه­ دیده می­شود. یکی از ویژگی­های مهم این ترکیبات، تأثیر مستقیم گوگرد در عمل کاتالیزوری و یا فعالیت شیمیایی آنهاست (26).

آهن بخشی از ساختار پروتئین­های دارای آهن-گوگرد و هم­­چنین پروتئین­های غیرهم (Non-heme iron proteins) می­باشد که در طی فتوسنتز، تنفس و تثبیت نیتروژن در گیاه مورد نیاز می­باشد. نتایج تحقیقات انجام شده نشان می­دهد که بیوسنتز کلروفیل توسط آهن تنظیم می­شود و تحت شرایط کمبود آهن، فعالیت فتوسنتزی گیاهان بشدت کاهش می­یابد. هم چنین فعالیت­ آنزیم­هایی نظیر سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیدازها در چنین شرایطی دستخوش تغییر می­شود. از این رو تحت شرایط کمبود آهن فرایندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی طبیعی گیاهان دچار اختلال می­گردد. بنابراین افزودن آهن در محیط کشت گیاهان می­تواند در بهبود شرایط فیزیولوژیکی آنها مؤثر باشد (19). آهن بعنوان یک عنصر ضروری برای فرآیندهای متابولیک گیاه، برای فرایندهایی مانند سنتز DNA، فتوسنتز و تنفس ضروری بوده و نقش کلیدی در واکنش­های سوخت و سازی دارد (11).

بهره­برداری پایدار از توان و ظرفیت منابع طبیعی کشور نیازمند به­کارگیری روش­های نوین علمی و سازگار با محیط‌زیست به خصوص در زمینه زیست­فناوری است. بر همین اساس، در این تحقیق با به کارگیری اصول و روش­های زیست­فناوری گیاهی، برای اولین بار اثر سولفات آهن بعنوان منبع گوگرد بر رشد، میزان آلیسین، سیستئین و پروتئین گیاهچه­های سیر بررسی شد.

مواد و روشها

کشت و آماده­سازی نمونه­های گیاهی و اعمال تیمارها: صفحه پایگاهی (Stem disc) بوته­های سیر شهرستان آذرشهر (واقع در استان آذربایجان­شرقی) پس از ضدعفونی سطحی با توئین و محلول هیپوکلریت سدیم 50% و الکل اتیلیک 70% به­ترتیب به مدت 30 و 10 دقیقه و شستشو با آب مقطر استریل در محیط کشت جامد موراشیگ و اسگوک (MS) کشت شدند. به­منظور بررسی اثر سولفات آهن بر میزان آلیسین گیاهچه­های سیر، پس از 4 هفته به محیط­های کشت حاوی غلظت­های مختلف سولفات آهن (12/11، 34/ 8، 56/5، 78/2، 39/1 میلی­گرم در لیتر) واکشت شدند. قابل ذکر است که میزان سولفات آهن در استوک آن مورد استفاده برای محیط کشت معمول MS، 56/5 میلی­گرم در لیتر می­باشد. در طول مدت زمان کشت، تمامی ریز­نمونه­ها در داخل فیتوترون با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و دمای 27 درجه سانتی­گراد نگهداری، در دو بازه زمانی 10 و 20 روز نمونه­برداری و نمونه­های جمع­آوری شده بمنظور انجام آزمایش­های بعدی در فریزر نگهداری شدند.

اندازه­گیری رشد ریزنمونه­های سیر: قبل از جمع­آوری، ویژگی­های مورفولوژیکی نمونه­ها بررسی شد. میزان وزنِ تر نمونه­ها با استفاده از ترازو ثبت شد. طول شاخساره و ریشه بر حسب سانتی­متر و با استفاده از خط­کش سانتی­متری اندازه­گیری شد.

عصاره­گیری از نمونه­های گیاهی به منظور بررسی محتوی آلیسین: ­عصاره­گیری از نمونه­های گیاهی و بررسی محتوی آلیسین به روش ایبرل انجام شد (24). جهت عصاره­گیری، یک گرم از بافتِ ­تر گیاهی ساییده شده و با افزودن 30 میلی­لیتر آب در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. سپس نمونه­ها در دمای 4 درجه سانتی­گراد با سرعت rcf 28980 در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. در ادامه 400 میکرولیتر از فاز رویی با فاز متحرک به حجم 1 میلی­لیتر رسانده و مجدداً به مدت 5 دقیقه با سرعت rcf 8243 در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. در انتها محلول رویی به منظور سنجش میزان آلیسین در فریزر 80- درجه سانتی­گراد نگهداری شد. بررسی میزان آلیسین نمونه­های سیر با استفاده از دستگاه HPLC و ستون C18 در طول موج 254 نانومتر، سرعت جریان حلال 1 میلی­لیتر بر دقیقه و فاز متحرک شامل متانول، آب و استونیتریل به نسبت 9 : 41 : 50 با انجام شد. در نهایت 20 میکرولیتر عصاره­ی گیاهی به دستگاه تزریق شد. محتوای آلیسین در نمونه­های مورد بررسی بر اساس زمان بازداری به دست آمده از ترکیب استاندارد و سطح زیر منحنی پیک­های مربوط به هر نمونه، با استفاده از نمودار استاندارد آلیسین محاسبه شد.

سنجش میزان سیستئین کل: میزان سیستئین محلول کل به روش گایتوند اندازه­گیری شد (21)، به این صورت که ابتدا 50 میلی­گرم از نمونه گیاهی با 1 میلی­لیتر اسید پرکلریک 5% بمدت 6 دقیقه در سونیکاتور قرار داده شد. سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد و با سرعت rcf 12880 سانتریفوژ شده، بعد از اتمام زمان مورد نظر، محلول رویی جمع­آوری و برای سنجش مورد استفاده قرار گرفت. برای اندازه­گیری، ابتدا 200 میکرولیتر از عصاره گیاهی با 200 میکرولیتر معرف نین هیدرین و 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال مخلوط و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم 90 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. بعد از اتمام زمان مورد نظر، سریعاً به حمام آب سرد انتقال داده و میزان جذب نمونه­ها در طول موج 560 نانومتر بوسیله اسپکتروفتومتر قرائت شد. منحنی استاندارد با استفاده از غلظت­های مختلف سیستئین(15 و 10، 8، 6، 4، 2، 1 میکرو­گرم در لیتر) رسم و در نهایت غلظت سیستئین محلول نمونه­های گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد بر حسب میکروگرم بر گرم بافتِ ­تر گیاهی محاسبه شد.

استخراج پروتئین از گیاهچه­های سیر: مقدار نیم گرم از بافتِ ­تر گیاهی در هاون چینی با افزودن 50 میلی­گرم پلی وینیل پیرولیدن و 5/1 میلی­لیتر از بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار (pH=7) ساییده و با سرعت rcf 28980 در دمای 4 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد (3). سپس فاز رویی در ویال­های کوچکتر تقسیم و ویال­ها در فریزر 80- درجه سانتی­گراد به منظور انجام مطالعات بعدی نگهداری شد.

سنجش پروتئین محلول کل: میزان پروتئین محلول کل در این بررسی به روش بردفورد تعیین شد (18). به این ترتیب که میزان 25 میکرولیتر از عصاره پروتئینی با 750 میکرو لیتر معرف بردفورد (X1) مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس میزان جذب نمونه­ها، در طول موج 595 نانومتر بوسیله اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. غلظت پروتئین محلول نمونه­ها با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA=Bovine Serum Albumin) بر حسب میلی گرم بر میلی­لیتر تعیین شد.

آنالیز آماری: به منظور مقایسه نتایج به­دست آمده و تعیین اهمیت تفاوت­های مشاهده شده در آزمایشات از نرم افزار SPSS (ویرایش 19) استفاده شد. رسم نمودارها به وسیله Microsoft Excel انجام گرفت. جهت تفسیر نتایج و تعیین تفاوت­های بین گروه­های آزمایش از آنالیز واریانس یک طرفه (one-way ANOVA) استفاده شد. نتایج آزمایش­ها به صورت .Mean±S.D ارائه و نتایج آنالیزهای آماری با مقدار P کوچک­تر از 05/0 معنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج

اثر تیمار­های مختلف بر رشد ریز نمونه­های سیر: بر اساس نتایج حاصل (شکل 1- الف) در گیاهانی که بمدت 10 روز با غلظت­های مختلف سولفات آهن تیمار شده بودند در بخش ریشه با افزایش غلظت، افزایش وزن تر تا غلظت 56/6 میلی­گرم در لیتر (99/0 گرم) مشاهده شد که بعد از این غلظت میزان وزنِ تر روند کاهشی داشت. میزان وزن تر در غلظت 12/11 میلی­گرم در لیتر تقریباً مشابه غلظت 78/2 میلی­گرم در لیتر بود. در مقابل در بخش هوایی نمونه­ها نتایج عکس مشاهده شد. به این ترتیب که بیشترین میزان وزنِ تر در غلظت 39/1 میلی­گرم در لیتر (15/1 گرم) مشاهده شد که با افزایش غلظت روند نزولی داشت. الگوی مشاهده شده در مورد رابطه وزنِ تر با غلظت سولفات آهن در نمونه­های تیمار شده به مدت 20 روز نیز مشابه نمونه­های تیمار شده بمدت 10 روز بود که بیشترین میزان وزنِ تر ریشه و اندام هوایی به ترتیب برابر با 98/0 و 43/1 گرم بود (شکل 1- ب).

 

 

 

شکل 1- اثر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر وزنِ تر گیاهچه­ها.وزنِ تر ریشه و اندام هوایی 10 روز بعد از اعمال تیمار (الف) وزنِ تر ریشه و اندام هوایی 20 روز بعد از اعمال تیمار (ب). داده­های نمایش داده­ شده میانگین داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

 

بر اساس نتایج بدست آمده، بیشترین میزان طول ریشه در تیمار 56/5 میلی­گرم در لیتر در بازه زمانی 10 و 20 روز به ترتیب 2 و 4 سانتی­متر و طول بخش هوایی در تیمار 39/1 میلی­گرم در لیتر در بازه زمانی 10 و 20 روز به ترتیب 17 و 5/23 سانتی­متر مشاهده شد (شکل 2- الف و ب).

 

 

 

شکل 2 - اثر غلظت‌های مختلف سولفات آهن بر طول ریشه و اندام هوایی گیاهچه‌های سیر. طول اندام هوایی و ریشه 10 روز بعد از اعمال تیمار (الف) طول اندام هوایی و ریشه 20 روز بعد از اعمال تیمار (ب). داده‌های نمایش داده‌ شده میانگین داده‌های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p< است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

 

تأثیر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان تولید آلیسین: میزان آلیسین نمونه­های مورد بررسی توسط دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با استفاده از استاندارد آلیسین مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 3). بیشترین میزان آلیسین در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی در بازه زمانی 10 و 20 روز در غلظت 12/11 میلی­گرم در لیتر به ترتیب (8/8 و 3/5 میلی­مولار در گرم وزنِ تر) و (4/16 و 3/3 میلی­مولار در گرم وزنِ تر) اندازه­گیری شد (شکل 3- الف و ب). شایان ذکر است که این روند صعودی در کروماتوگرام مربوط به بخش ریشه چشمگیرتر بود. افزایش میزان آلیسین بخش هوایی با افزایش غلظت تیمار کند بود.

 

 

 

 

شکل 3 - اثر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان آلیسین گیاهچه­های سیر. میزان آلیسین بخش هوایی و ریشه 10 روز بعد از اعمال تیمار (الف) میزان آلیسین ریشه و بخش هوایی 20 روز بعد از اعمال تیمار (ب). داده­های نمایش داده­ شده میانگین داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

 

تأثیر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان سیستئین: بر اساس نتایج حاصل از اندازه­گیری میزان اسید آمینه سیستئین، بیشترین میزان این اسید آمینه در غلظت 56/5 میلی­گرم در لیتر در هر دو بازه زمانی ثبت شد. مقادیر اندازه­گیری شده در بخش­های ریشه و اندام هوایی در مدت زمان 10 و 20 روز به ترتیب (66 و 72 میکروگرم در گرم وزنِ تر) و (52 و 65 میکروگرم در گرم وزنِ تر) بود (شکل 4- الف و ب). مقادیر اندازه­گیری شده در تمام غلظت­ها برای اندام هوایی بیشتر از مقادیر بخش ریشه بود. میزان سیستئین نمونه­ها در مدت زمان 10 روز بطور معنی­داری بیشتر از 20 روز بود.

 

 

 

شکل 4- اثر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان سیستئین گیاهچه­ها. میزان سیستئین ریشه و اندام هوایی 10 روز بعد از اعمال تیمار الف) میزان سیستئین ریشه و اندام هوایی 20 روز بعد از اعمال تیمار (ب). داده­های نمایش داده­ شده میانگین داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

تأثیر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان پروتئین محلول کل: بر اساس نتایج حاصل از سنجش میزان پروتئین کل به روش بردفورد در گیاهانی که پس از 10 روز تیمار با غلظت­های مختلف سولفات آهن جمع­آوری شده بودند (شکل 5- الف) میزان پروتئین محلول کل در بخش ریشه (2/5 میلی­گرم در گرم وزنِ تر) و اندام هوایی (5/6 میلی­گرم در گرم وزنِ تر) گیاهچه­های تیمار شده با غلظت 12/11 میلی­گرم در لیتر افزایش معنی­داری نسبت به سایر غلظت­ها نشان داد. علاوه بر این، در گیاهانی که بعد از 20 روز تیمار جمع­آوری شده بودند (شکل 5- ب) در بخش ریشه (8/4 میلی­گرم در گرم وزنِ تر) و اندام هوایی (8 میلی­گرم در گرم وزنِ تر) بیشینه میزان پروتئین کل در غلظت 12/11 میلی­گرم در لیتر سولفات آهن اندازه­گیری شد.

 

 

شکل5- اثر غلظت­های مختلف سولفات آهن بر میزان پروتئین کل گیاهچه­ها. میزان پروتئین کل ریشه و اندام هوایی 10 روز بعد از اعمال تیمار الف) میزان پروتئین کل ریشه و اندام هوایی 20 روز بعد از اعمال تیمار (ب). داده­های نمایش داده­ شده میانگین داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

بحث

با توجه به عقیم بودن گل‌ها و عدم امکان تولید بذر سیر، کشت این گیاه از طریق کشت سیر و به طریقه غیرجنسی انجام می­شود که از این طریق گیاهان حاصل آلوده به ویروس می­باشند. ابزارهای زیست­فناوری مانند ریزازدیادی مریستم، تنوع سوماکلونال و ترانسفورماسیون ژنتیکی برای تکثیر و نگهداری سیر استفاده می­شود لذا بخش عمده مطالعات انجام شده در زمینه افزایش میزان تولید کالوس گیاه سیر در کشور متمرکز شده است (27).

علیرغم برهمکنش­های بسیار دو عنصر آهن و گوگرد، در ارتباط با اثرات آهن بر میزان تولید ترکیبات گوگردی نظیر سیستئین و آلیسین در گیاهان، اطلاعات چندانی وجود ندارد. به همین دلیل، تحقیق حاضر جهت ارزیابی اثرات ترکیب سولفات آهن بر میزان تولید ترکیبات گوگردی سیستئین و آلیسین در گیاه سیر انجام شده است.

مطالعات انجام شده به خوبی نشان داده­اند که عوامل محیطی قادرند تولید متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی را تحت تأثیر قرار دهند. به عنوان نمونه، در شرایط محدودیت عناصر غذایی، میزان متابولیت­های فاقد نیتروژن نظیر اسیدهای فنولیک، لیگنین، تانن­ها و آنتوسیانین­ها که از مسیر شیکیمات تولید می­شوند، در گیاهان چوبی افزایش می­یابد. این افزایش در محتوای متابولیت­های ثانویه کربن­دار، عموماً در شرایط محیطی خاصی ایجاد می­شود که تجمع کربوهیدرات­های غیر ساختاری بیشتر می­گردد. مطالعات نشان داده است که در شرایط افزایش دی­اکسید کربن اتمسفری، میزان کربوهیدرات­های غیر ساختاری افزایش یافته و این شرایط به نوبه خود موجب تحریک تولید متابولیت­های ثانویه می­گردد (17).

در تحقیقی بیدشکی و همکاران اثر متیل‌جاسمونات و ایندول 3-بوتیریک ‌اسید (IBA) را بر رشد، پارامترهای بیوشیمیایی و میزان آلیسین سیر تحت تنش خشکی در مزرعه بررسی کردند (15). بررسی اثر اسید سالیسیلیک‌، ایندول 3-بوتیریک ‌اسید و تنش خشکی بر رشد و محتوای آلیسین سیر در مزرعه نشان داد که ترکیب متیل جاسمونات و IBA بدون تنش خشکی بر رشد و میزان آلیسین بسیار مؤثر بود اما تحت تنش خشکی فقط متیل جاسمونات مؤثر بود (14). در مطالعه­ای دیگر این گروه اثر اسید سالیسیلیک و خشکی را بر پارامترهای رشد و میزان آلیسین بررسی نمودند که تحت تیمار اسید سالیسیلک 5/0 میلی­مولار میزان آلیسین بیشتر از تیمار اسید سالیسیلک و خشکی بود (13). برخی از مطالعات نیز تأثیر شرایط محیطی بر میزان محتوای آلیسین را اثبات کرده است. برای مثال مشخص شده است که میزان آلیسین سیر نگهداری شده در مقایسه با سیر تازه برداشت شده بیشتر است و همچنین در ارتباط با تأثیر رطوبت و درجه حرارت مشخص شده است که دمای پایین محیط (6-4 درجه­ی سانتی­گراد) و رطوبت بالا باعث افزایش چشمگیر میزان آلیسین می­شود. طبق گزارش­های انجام شده، دلیل این افزایش فعالیت حداکثری آنزیم گاما-گلوتامیل ترانس پپتیداز (آنزیم مرحله­ی نهایی تشکیل آلیین) در دمای 4 درجه­ی سانتی­گراد است (35). در پژوهشی هوگس و همکاران مریستم حبه‌های سیر را در محیط کشت موراشیک و اسکوگ واجد هورمون‌های نفتالین و اسید استیک کشت نمودند سپس مسیرهای بیوسنتز آلیسین را با افزودن حدواسط‌ها به محیط کشت کالوس‌های تمایز نیافته سیر بررسی نمودند. بر اساس نتایج بررسی آنها بافت­های کشت شده سیر توانایی سنتز آلئین از آلیل تیول و ترکیبات سیستئین مانند آلیل سیستئین را داشتند (23). تشکیل آلیسین از طریق اکسیداسیون اس-آلیل‌سیستئین در نمونه‌های سیر کشت شده در شرایط کشت درون شیشه‌ای گزارش شده است (32). در مطالعه­ای بر روی 24 واریته سیر جمع­آوری شده از نقاط مختلف ایران که با استفاده از اسید فرمیک­، متانول و آب عصاره­گیری شده بودند، میزان آلیسین اندازه­گیری شده به روش HPLC در تمام اکوتیپ­های بررسی­شده بیشتر از استانداردهای بین­المللی (5/4 میلی­گرم بر گرم وزنِ تر) گزارش شده ­است (10). در مطالعه­ای آرنولت و همکاران (2003) حبه­های سیر کاشته شده در مزرعه را تحت تأثیر غلظت‌های مختلف سولفات‌کلسیم قرار دادند و بیشترین میزان آلیسین را در تیمار 200 کیلوگرم در هکتار سولفات کلسیم گزارش نمودند. هم چنین برای اولین بار روش HPLC سریع و ساده‌ای را برای سنجش همزمان آلیین، داکسی‌آلیین، آلیسین و دی‌پپتیدهای پیش‌ساز دیگر در سیر ارائه نمودند (9).

در بررسی اثر گوگرد (ترکیبی از سولفات پتاسیم، سولفات منیزیوم و اسید سولفوریک) بر گیاه Allium roseum L. از گونه­های بومی آفریقای شمالی در مزرعه، افزایش قابل توجه میزان آلیسین و فنول کل مشاهده شد اما میزان کربوهیدرات­های احیا شده در بالاترین غلظت کاهش یافت (25). در تحقیقی زینالی و مرادی (2015) تأثیر محلول­پاشی اسید هومیک و آمونیوم سولفات به تنهایی و با هم را در مزرعه بر گیاه سیر بررسی نمودند. بر اساس نتایج حاصل از مطالعه آنها میزان آلیسین را از 79/4 میلی­گرم در گرم به 41/5 میلی­گرم در گرم وزنِ تر در تیمار سولفات آمونیوم 200 کیلوگرم در هکتار رسید. تیمار اسید هومیک با غلظت 3 گرم در لیتر میزان آلیسین از 79/4 میلی­گرم در گرم به 31/5 میلی­گرم در گرم افزایش یافت. میزان آلیسین در اندرکنش این دو تیمار با غلظت­های ذکر شده 61/5 میلی­گرم در گرم اندازه­گیری شد (38).

مطالعات پیشین نشان داده است که بیوسنتز متابولیت­های ثانویه نه تنها تحت کنترل عوامل ژنتیکی است بلکه به شدت تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می­گیرد. تغذیه گیاهان با عناصر مغذی نیز به عنوان یکی از این متغیرهای محیطی می­تواند میزان تولید متابولیت­های ثانویه را تحت تأثیر قرار دهد. کربوهیدرات­ها منبع انرژی و تأمین­کننده اسکلت کربنی برای بیوسنتز متابولیت­های ثانویه محسوب می­شوند. فرآیندهایی نظیر تثبیت دی­اکسید کربن فتوسنتزی و میزان متابولیت­های اولیه، جزء عواملی هستند که در ارتباط با تولید متابولیت­های ثانویه می­باشند. با توجه به اینکه عنصر آهن در فرآیند فتوسنتز و تنفس نوری و نیز فعال­سازی بسیاری از آنزیم­ها دخالت دارد، لذا تصور می­شود نقش این عنصر در تحت تأثیر قرار دادن میزان تولید متابولیت­های ثانویه بسیار زیاد باشد. بنابراین، اعمال تغییرات غلظت آهن در محیط کشت نیز به عنوان یکی از متغیرهای محیطی می­تواند تولید متابولیت­های ثانویه نظیر ترکیب آلیسین در گیاهان دارویی را تحت تأثیر قرار دهد. اگرچه عنصر آهن یکی از فراوان­ترین عناصر موجود در پوسته زمین می­باشد، با این وجود، میزان در دسترس بودن آن برای گیاهان در خاک­های قلیایی و آهکی به دلیل رسوب آهن به شدت کاهش می­یابد. عنصر آهن یکی از عناصر ضروری برای رشد گیاهان محسوب می­شود زیرا نقش­های مهمی در فرآیندهای متابولیسمی مانند فتوسنتز، تنفس و بیوسنتز DNA ایفاء می­نماید. از سوی دیگر، آهن کوفاکتور بسیاری از آنزیم­ها در گیاهان است. آهن در سلول­های گیاهی در بسیاری از موارد برهمکنش­های زیادی با عنصر گوگرد دارد که از آن جمله می­توان به کمپلکس­های آهن–گوگرد اشاره نمود (20). تقریباً 80 درصد آهن در سلول­های فتوسنتزی گیاهان در بیوسنتز سیتوکروم­ها و ترکیباتی نظیر کلروفیل و اجزای سیستم انتقال الکترون فتوسنتزی مورد استفاده قرار می­گیرد. به همین دلیل آهن نقش بسیار مهمی در فعالیت فتوسنتزی گیاهان و در نتیجه عملکرد آنها دارد. با توجه به ویژگی­های اکسایش–کاهش (ردوکس) آهن و توانایی آن در ایجاد کمپلکس با بسیاری از لیگاندها و نیز مشارکت در ساختار بسیاری از ناقل­های زنجیره الکترون و آنزیم­ها، این عنصر نقش حیاتی در متابولیسم گیاهان ایفاء می­نماید (34). با توجه به اهمیت عنصر آهن در فتوسنتز گیاهان، احتمالاً بتوان یکی از دلایل افزایش متابولیت ثانویه آلیسین در گیاه سیر در تحقیق حاضر را به افزایش غلظت کربوهیدرات­های غیر ساختاری در این گیاه نسبت داد.

بررسی منابع مرتبط با اثر آهن بر شاخص­های رشد و میزان متابولیت­های ثانویه گیاهان دارویی مختلف نشان می­دهند که نتایج این تحقیقات بسیار ضد و نقیض می­باشد (37).

فراوانی آهن در زمین نزدیک به میزان اکسیژن در اتمسفر می­باشد، با این حال، در دسترس بودن زیستی آهن به دلیل حلالیت پایین آن در حضور اکسیژن به شدت کاهش می­یابد. در خاک­ها، آهن تشکیل کمپلکس­هایی غیر متحرک با فسفات­ها و سایر اجزای خاک می­دهد و بدین ترتیب موجب کاهش عملکرد گیاهان و کاهش ارزش تغذیه­ای آنها می­گردد. کمبود آهن یکی از شایع­ترین دلایل کاهش رشد و عملکرد گیاهان در سراسر جهان می­باشد. گوگرد در محیط کشت به شکل سولفات توسط گیاهان جذب می­شود. این عنصر بخش مهم تشکیل­دهنده تمامی پروتئین­های گیاهی و برخی فیتوهورمون­ها می­باشد. گوگرد توسط برخی از گیاهان مانند خانواده پیازیان جهت تولید ترکیبات فرّار مورد استفاده قرار می­گیرد (31).

غلظت و میزان آلیسین کل در گیاه با افزایش وزن خشک گیاه به دلیل افزایش غلظت آهن، بیشتر شده است. افزایش غلظت آهن موجب افزایش غلظت کربوهیدرات­ها شده و در نتیجه احتمالاً موجب تحریک متابولیسم ثانویه شده است.

ترکیب آجوئن می­تواند به مقدار زیاد صرفاً توسط یک بازآرایی پایدار در ساختار آلیسین تولید شود. در نتیجه شرایط محیطی می­تواند میزان آجوئن در گیاه سیر را به شدت تحت تأثیر قرار دهد. از جمله Naznin و همکاران در سال­های 2010 و 2015 میلادی دریافته­اند که افزایش میزان اکسیژن محلول در منطقه ریشه گیاه سیر و نیز افزایش میزان غلظت دی­اکسید کربن اتمسفری در همین گیاه موجب افزایش تولید آجوئن می­گردد (31).

گزارش شده است مصرف گوگرد همراه با آهن و روی باعث افزایش زیست­توده، عملکرد دانه و جذب عناصر غذایی نیتروژن، فسفر، پتاسیم، گوگرد، آهن و روی در آفتابگردان می­شود (33). درصد پروتئین به تغذیة گیاه بستگی دارد و تحت تأثیر تیمارهای کودی قرار می­گیرد و استفاده از کودهای کم­مصرف باعث افزایش پروتئین می­شود. آهن در سنتز پروتئین دخالت دارد و از طریق افزایش فرودوکسین، باعـث افزایش احیای نیترات و تبدیل هیدرات­های کربن به پروتئین می­شود (28). نشان داده است که افزایش غلظت آهن در محیط پونه کوهی سبب کاهش زیست­توده می­شود. با این وجود هنوز اطلاعات اندکی در رابطه با نقش آهن در تولید متابولیت­های ثانویه وجود دارد (36). در شرایط سمیت آهن، عدم خنثی شدن رادیکال­های اکسیژن و باقیماندن پر اکسید هیدروژن در گیاه منجر به واکنش فنتون و هابر-وایس (Fenton Haber-Weiss reaction) می­گردد که در ازای آن رادیکال خطرناک هیدروکسیل تولید می­شود که می­تواند به صورت پی­درپی انواع درشت­مولکول­های زیستی از جمله لیپیدها و پروتئین­ها را ناپایدار کند. نتیجه تنش اکسیداتیو ناشی از سمیت آهن در گیاهان کاهش میزان پروتئین­ها، قندهای محلول، کلروفیل و صدمات برگشت­ناپذیر به غشای زیستی و اسیدهای نوکلئیک است که توسط بسیاری از محققان گزارش شده است (11 و 16).

با توجه به این که عنصر آهن در ساختار کلروفیل نقش مستقیمی ندارد اما وجود آهن کافی سبب بهبود کلروفیل­سازی در گیاه می­گردد و وضعیت کلروفیل گیاه می­تواند در میزان فتوسنتز تأثیر گذار باشد (2). گزراش شده است که محلول پاشی آهن، روی و منگنز به تنهایی یا به صورت اختلاط باهم دیگر باعث افزایش محصول پنبه می­شود که این افزایش ناشی از افزایش مقدار کلروفیل و کاروتنوئید برگ و همچنین ارتفاع گیاه است (4).

در مطالعه انجام شده توسط Misra و Sharma (1991) در ارتباط با اثر آهن بر گیاه نعناع ژاپنی (Mentha arvensis)، غلظت­های متوسط آهن (6/5 میکروگرم بر میلی­لیتر) موجب افزایش میزان وزن خشک و تر، میزان اسانس و ترکیب منتول شد (29).

در تحقیق دیگری، کاربرد برگی مقادیر بالای آهن موجب افزایش تولید و عملکرد اسانس گیاه علف لیمو (Cymbopogon citratus) شد (37). در گیاه رزماری (Rosmarinus officinalis) کاربرد برگی ترکیب کلاته شده آهن به صورت Fe-DTPA هیچ اثر معنی­داری بر افزایش میزان متابولیت­های ثانویه نداشت. البته این تحقیق در شرایط کم­آبی صورت گرفته و احتمالاً عدم تأثیر ترکیب آهن اعمال شده در ارتباط با کاهش فعالیت­های متابولیسمی گیاه در شرایط تنش خشکی بوده است (30). با این حال، افزودن ترکیب Fe-EDTA به محلول غذایی گیاه نعناع در شرایط کشت هیدروپونیک موجب افزایش اسانس این گیاه شد (37).

ترکیبات موجود در عصاره گیاه سیر از جمله آلیسین، آلیل سیستئین و آلیل دی­سولفید دارای خواص آنتی­اکسیدانی می­باشند. لذا نتایج تحقیق حاضر نشان می­دهد که الیسیتور غیرزیستی سولفات آهن توانایی بهبود عملکرد و نیز کیفیت ویژگی­های آنتی­اکسیدانی (ترکیب آلیسین) گیاه دارویی سیر را دارا می­باشد و می­توان از این راهکار در تولید گیاهان سیر دارای مقادیر بالای ترکیبات دارویی و نیز کربوهیدرات­ها و سایر ترکیبات تغذیه­ای استفاده نمود.

نتیجه­ گیری

در پژوهش حاضر بیشترین میزان آلیسین و پروتئین در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی در هر دو بازه زمانی در تیمار 12/11 میلی­گرم در لیتر مشاهده شد. در تیمار 56/5 میلی­گرم در لیتر افزایش معنی­دار وزنِ تر و طول ریشه و میزان سیستئین نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد. هم چنین تفاوت معنی­دار وزنِ تر و طول بخش هوایی در غلظت 39/1 میلی­گرم در لیتر در مقایسه با سایر تیمارها اندازه­گیری شد. در مجموع می توان گفت تیمار سولفات آهن از یک سو به عنوان منبع گوگرد و از سویی دیگر آهن بعنوان محرک سنتز پروتئین و کلروفیل، به احتمال می­تواند عامل مؤثری در افزایش میزان آلیسین و در نهایت خواص دارویی گیاه سیر باشد.

1- ﺑﻜﺎﺋﻴﺎن، م.، ﻓﺮازﻣﻨﺪ، ر.، ﻛﻲﻗﺒﺎدی، س.، ﺳﻌﻴﺪی، س. 1394. ﺑﺮرﺳﻲ اﺛﺮ ﺿﺪﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ ﻋﺼﺎره اﺗﺎﻧﻮﻟﻲ ﺳﻴﺮ (Allium sativum)ﺑﺮ روی ﺳﻮﻳﻪ­ﻫﺎی اﺳﺘﺎﻓﻴﻠﻮﻛﻮﻛﻮس اورﺋﻮس ﻣﻘﺎوم ﺑﻪ آﻧﺘﻲ ﺑﻴﻮﺗﻴﻚ­ﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ. جلد 28، شماره 1، صفحه 41-34.

2- حمزه پور، ن.، ملکوتی، م.ج.، مجیدی، ع. 1389. برهم­کنش عناصر روی، آهن و منگنز در اندام­های مختلف گندم. مجله­ی پژوهش­های خاک (علوم خاک و آب). الف، جلد 24، شماره 1، صفحه 8-1.

3- فتحی رضایی، پ.، راکعی، ا. 1396. بررسی اثر ساکارز بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها و چندین پارامتر بیوشیمیایی گیاه تاتوره در شرایط کشت درون شیشه‌ای. دوره 30، شماره 4، صفحه 571-558.

4- نوری حسینی، س.م.، ذبیحی، ح.م.، رمضانی مقدم، م.ر. 1393. پاسخ عملکرد و اجزای عملکرد پنبه به مصرف خاکی و محلول پاشی عناصر غذایی آهن و روی. مجله پژوهش­های پنبه ایران. جلد 2، شماره 2، صفحه 57-43.

 

5- Ajungla, L., Patil, P., Barmukh, R. and Nikam, T. (2009). Influence of biotic and abiotic elicitors on accumulation of hyoscyamine and scopolamine in root cultures of Datura metel L. Indian journal of biotechnology 8:317-322.

6- Amagase, H. (2006). Clarifying the real bioactive constituents of garlic. The Journal of nutrition   136(3): 716S-725S.

7- Amagase, H., Petesch, B. L., Matsuura, H., Kasuga, S. and Itakura, Y. (2001). Intake of garlic and its bioactive components. The Journal of nutrition 131(3): 955S-962S.

8- Angelova, Z., S. Georgiev and Roos, W. (2006). Elicitation of plants. Biotechnology & Biotechnological Equipment 20(2): 72-83.

9- Arnault, I., Christidès, J.-P. Mandon, N., Haffner, T., Kahane, R. and Auger, J. (2003). High-performance ion-pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin, deoxyalliin, allicin and dipeptide precursors in garlic products using multiple mass spectrometry and UV detection. Journal of Chromatography A 991(1): 69-75.

10- Baghalian, K., Ziai, S. A., Naghavi, M. R., Badi, H. N., and Khalighi, A. (2005). Evaluation of allicin content and botanical traits in Iranian garlic (Allium sativum L.) ecotypes. Scientia Horticulturae 103(2): 155-166.

11- Barberon, M., Zelazny, E., Robert, S., Conéjéro, G., Curie, C., Friml, J., and Vert, G. (2011). Monoubiquitin-dependent endocytosis of the iron-regulated transporter 1 (IRT1) transporter controls iron uptake in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences 108(32): E450-E458.

12- Bhattacharjee, S. (2005). Reactive oxygen species and oxidative burst: Roles in stress, senescence and signal transducation in plants. Current Science: 1113-1121.

13- Bideshki, A. and Arvin, M. (2010). Effect of salicylic acid (SA) and drought stress on growth, bulb yield and allicin content of garlic (Allium sativum) in field. Plant Ecophysiol 2: 73-79.

14- Bideshki, A., Arvin, M. and Darini, M. (2013). Interactive effects of Indole-3-butyric acid (IBA) and salicylic acid (SA) on growth parameters, bulb yield and allicin contents of garlic (Allium sativum) under drought stress in field. International Journal of Agronomy and Plant Production 4(2): 271-279.

15- Bideshki, A. and Arvin, M. J. (2013). Interactive effects of methyl jasmonate (MJ) and indole-3 butyric acid (IBA) on growth and bio chemical parameters, bulb and allicin yield of garlic (Allium sativum L.) under drought stress in Iran. International Journal of Agriculture 3(2): 349.

16- Blokhina, O., Virolainen, E. and Fagerstedt, K. V. (2003). Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of botany 91(2): 179-194.

17- Booker, F. L. (2000). Influence of carbon dioxide enrichment, ozone and nitrogen fertilization on cotton (Gossypium hirsutum L.) leaf and root composition. Plant, Cell and Environment 23: 573-583.

18- Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry 72(1-2): 248-254.

19- Chakraborty, B., Singh, P. N., Shukla, A. and Mishra, D. S. (2012). Physiological and biochemical adjustment of iron chlorosis affected low-chill peach cultivars supplied with different iron sources. Physiology and Molecular Biology of Plants 18(2): 141-148.

20- Forieri, I., Wirtz, M., Hell, R. (2013). Toward new perspectives on the interaction of iron and sulfur metabolism in plants. Frontiers in Plant Science, 4, 357: 1-5.

21- Gaitonde, M. (1967). A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids. Biochemical Journal 104(2): 627.

22- Hacıseferoğulları, H., Özcan, M., Demir, F., and Çalışır, S. (2005). Some nutritional and technological properties of garlic (Allium sativum L.). Journal of Food engineering 68(4): 463-469.

23- Hughes, J., Tregova, A., Tomsett, A., Jones, M., Cosstick, R. and Collin, H. (2005). Synthesis of the flavour precursor, alliin, in garlic tissue cultures. Phytochemistry 66(2): 187-194.

24- Iberl, B., Winkler, G. and Knobloch, K. (1990). Products of allicin transformation: ajoenes and dithiins, characterization and their determination by HPLC. Planta Medica 56(02): 202-211.

25- Imen, A., Najjaa, H. and Neffati, M. (2013). Influence of sulfur fertilization on S-containing, phenolic, and carbohydrate metabolites in rosy garlic (Allium roseum L.): a wild edible species in North Africa. European Food Research and Technology 237(4): 521-527.

26- Jamal, A., Moon, Y.-S. and Zainul Abdin, M. (2010). Sulphur-a general overview and interaction with nitrogen. Australian Journal of Crop Science 4(7): 523.

27- Kamenetsky, R. and Rabinowitch, H. D. (2006). The genus Allium: A developmental and horticultural analysis. Horticultural Reviews 32: 329-378.

28- Malakouti, M. and Tehrani, M. (1999). Effects of micronutrients on the yield and quality of agricultural products (micro nutrients with macro effects). Tarbiat Modares University publication, Iran.

29- Misra, A. and Sharma, S. (1991). Critical concentration of iron in relation to essential oil yield and quality parameters of Japanese mint. Soil Sci. Plant Nutr. 37 (2), 185-190.

30- Moretti, M. D. L., Peana, A. T. Passino, G. S., Bazzoni, A. and Solinas, V. (1998). Effects of iron on yield and composition of Rosmarinusofficinalis L. essential oil. Journal of Essential Oil Research, 10: 43-49.

31- Naznin, M. T., Kitaya, Y., Shibuya, T., Endo, R., Hirai, H., and Lefsrud, M. G. (2015). Ground based study on culturing garlic as a source of vegetable food and medicine in space-growth and ajoene accumulation in garlic plants cultured with different CO2 regimes. Biological Sciences in Space, Vol. 29, 1-7.

32- Ohsumi, C., Hayashi, T. and Sano, K. (1993). Formation of alliin in the culture tissues of Allium sativum. Oxidation of S-allyl-L-cysteine. Phytochemistry 33(1): 107-111.

33- Ravi, S., Channal, H., Hebsur, N., and Dharmatti, P. (2010). Effect of sulphur, zinc and iron nutrition on growth, yield, nutrient uptake and quality of safflower (Carthamus tinctorius L.). Karnataka Journal of Agricultural Sciences 21(3).

34- Rout, G. R. and Sahoo, S. (2015). Role of iron in plant growth and metabolism. Reviews in Agricultural Science, 3:1-24.

35- Sukkaew, P. and Tira-umphon, A. (2012). Effects of storage conditions on Allicin content in garlic (Allium sativum). VI International Symposium on Edible Alliaceae 969.

36- Yeritsyan, N. and Economakis, C. (2001). Effect of nutrient solution's iron concentration on growth and essential oil content of oregano plants grown in solution culture. International Conference on Medicinal and Aromatic Plants. Possibilities and Limitations of Medicinal and Aromatic Plant 576.

37- Yeritsyan, N. and Economakis, C (2002). Effect of nutrient solution’s iron concentration on growth and essential oil content of oregano plants grown in solution culture. Proc. Int. Conf. on MAP, Acta Hort. 576, ISHS.

38- Zeinali, A. and Moradi, P.  (2015). The Effects of Humic Acid and Ammonium Sulfate Foliar Spraying and Their Interaction Effects on the Qualitative and Quantitative Yield of Native Garlic (Allium sativum L.) J. Appl. Environ. Biol. Sci. 4(12S): 205-211.