نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه علوم و زیست فناوری گیاهی

2 دانشگاه شهید بهشتی تهران -عضو هیئت علمی

3 دانشگاه شهید بهشتی

4 گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

بر اساس مطالعات گذشته، سالیسیلیک اسید باعث کاهش پدیده شیشه‌ای شدن در گیاه آویشن دنایی (Thymus daenensis) میگردد و این پدیده ممکن است از طریق تاثیر بر روی متابولیسم پلی آمین‌ها صورت گیرد. آنزیم پلی آمین اکسیداز کاتابولیسم پلی آمین‌ها را در سلول انجام داده و یکی از محصولات جانبی آن هیدروژن پراکسید (H2O2) میباشد. هدف از این مطالعه، بررسی تاثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی آمین اکسیداز کالوس آویشن دنایی میباشد. در این پژوهش، فعالیت آنزیم پلی آمین اکسیداز، محتوای H2O2 و پاسخ آنتی اکسیدانی شامل فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. نتایج نشان داد که تیمار سالیسیلیک اسید (غلظت‌های 10 و 20 میکرومولار)، باعث افزایش وابسته به غلظت فعالیت پلی آمین اکسیداز گردید. در کالوس تحت تیمار سالیسیلیک اسید (20 میکرومولار)، کاهش فعالیت پراکسیداز محلول و افزایش H2O2 مشاهده شد. افزایش H2O2 ممکن است نتیجه تاثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی آمین اکسیداز و پراکسیداز باشد. در حالی‌که تغییرات سطوح H2O2 نتیجه تغییر در فعالیت کاتالاز نمیباشد. تنظیم سطوح H2O2 توسط سالیسیلیک اسید از طریق تاثیر بر پلی آمین اکسیداز احتمالا در هموستازی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) نقش دارد که برای فرآیندهای نمو درون شیشه ای سلول های گیاهی ضروری میباشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Stimulatory effect of salicylic acid on Polyamine oxidase activity in Thymus daenensis L. callus

نویسندگان [English]

  • Ensyeh Shahroodi 1
  • Françoise Bernard 2
  • Dariush Minaee Tehrani 3
  • Seyedeh Batool Hassani 4

1 Shahid Beheshti University G.C., Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Tehran, Iran

2 1Shahid Beheshti University G.C., Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Tehran, Iran

3 2Shahid Beheshti University G.C., Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Department of Cellular and Molecular Biology, Tehran, Iran

4 Department of Plant sciences and Biotechnology, Faculty of life sciences and biotechnology, Shahid Beheshti University G.C., Tehran, Iran

چکیده [English]

According to previous studies, salicylic acid decreases the hyperhydricity in Thymus daenesis and this event might be due to the effect on polyamines metabolism. Polyamine oxidase enzyme catabolizes the polyamines in the cell and one of its byproducts is hydrogen peroxide (H2O2). Purpose of this study is analyses of salicylic acid effect on polyamine oxidase activity in thymus daenensis callus. In this study, the activity of polyamine oxidase, content of H2O2, and responses of enzymatic antioxidant including catalase and peroxidase was measured. Results showed that salicylic acid (concentrations of 10 and 20 µM) caused an increase in polyamine oxidase activity in a dose dependent manner. In callus under salicylic acid treatment (20 µM) a decrease in soluble peroxidase activity and an elevated H2O2 content was observed. Increase of H2O2 might be due to the influence of salicylic acid on polyamine oxidase and peroxidase activities. While variations in H2O2 levels resulted in no changes of catalase activity. Regulation of H2O2 level by salicylic acid through its effect on polyamine oxidase activity might contribute to ROS homeostasis, which is necessary for in vitro developmental processes in plant cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Catalase
  • Hydrogen peroxide
  • Peroxidase
  • Polyamine oxidase
  • Thymus daenesis L

اثر تحریکی سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی­آمین اکسیداز در کالوس آویشن دنایی

انسیه شاهرودی1، فرانسواز برنارد1، داریوش مینایی تهرانی2 و سیده بتول حسنی1٭

1 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه علوم و زیست‌فناوری گیاهی

2 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه زیست سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 31/1/1397            تاریخ پذیرش: 15/8/1397

چکیده

بر اساس مطالعات گذشته، سالیسیلیک اسید باعث کاهش پدیده شیشه­ای شدن در گیاه آویشن دنایی (Thymus daenensis) می‌گردد و این پدیده ممکن است از طریق تأثیر بر روی متابولیسم پلی آمین­ها صورت گیرد. آنزیم پلی آمین اکسیداز کاتابولیسم پلی آمین­ها را در سلول انجام داده و یکی از محصولات جانبی آن هیدروژن پراکسید (H2O2) می‌باشد. هدف از این مطالعه، بررسی تأثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی­آمین اکسیداز کالوس آویشن دنایی می‌باشد. در این پژوهش، فعالیت آنزیم پلی­آمین اکسیداز، محتوای H2O2 و پاسخ آنتی‌اکسیدانی شامل فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز مورد اندازه­گیری قرارگرفت. نتایج نشان داد که تیمار سالیسیلیک اسید (غلظت­های 10 و 20 میکرومولار)، باعث افزایش وابسته به غلظت فعالیت پلی­آمین اکسیداز گردید. در کالوس تحت تیمار سالیسیلیک اسید (20 میکرومولار)، کاهش فعالیت پراکسیداز محلول و افزایش H2O2  مشاهده شد. افزایش H2O2 ممکن است نتیجه تأثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی­آمین اکسیداز و پراکسیداز باشد. در حالی­که تغییرات سطوح H2O2 نتیجه تغییر در فعالیت کاتالاز نمی­باشد. تنظیم سطوح H2O2 توسط سالیسیلیک اسید از طریق تأثیر بر پلی­آمین اکسیداز احتمالاً در هموستازی گونه­های فعال اکسیژن (ROS) نقش دارد که برای فرایندهای نمو درون شیشه‌ای سلول‌های گیاهی ضروری می‌باشد.

واژه‌های کلیدی: آویشن دنایی، پراکسیداز، پلی­آمین اکسیداز، کاتالاز، هیدروژن پراکسید

* نویسنده مسئول، تلفن: 29905935-021، پست الکترونیکی: b_hassani@sbu.ac.ir

مقدمه

 

آویشن دنایی (Thymus daenensis )، متعلق به خانواده نعناییان (Lamiaceae) می‌باشد و در مناطق نیمه­خشک ایران رویش وسیعی دارد. این گیاه به­دلیل خواص دارویی فراوان مورد برداشت بسیار قرارگرفته و در معرض خطر انقراض می‌باشد. به­همین دلیل کشت بافت درون­شیشه­ای این گیاه روشی مفید برای تکثیر آن است. یکی از مشکلات کشت بافت درون­شیشه ای، پدیده شیشه­ای شدن می‌باشد. بر اساس تحقیقات گذشته، این مشکل تا حدودی با به­کارگیری سالیسیلیک اسید در گیاه آویشن دنایی حل‌شده است (12). سالیسیلیک اسید یک هورمون گیاهی است که در تنشهای محیطی بعنوان تنظیم‌کننده و پیام‌رسان عمل می‌کند (13). شیشه­ای شدن می­تواند به­دلیل افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژن و اختلال در پاکسازی هیدروژن پراکسید (H2O2) ایجاد شود (12).

H2O2 به­عنوان یک‌گونه فعال اکسیژن (ROS)، در طی دهه­های اخیر بسیار موردتوجه قرارگرفته است. این مولکول در بسیاری از تنش­های محیطی اعم از زیستی یا غیرزیستی در گیاهان ایفای نقش می‌کند. اخیراً مشاهده‌شده است که H2O2 در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیک مانند پیری، تنفس نوری و فتوسنتز، کنترل باز و بسته شدن روزنه، فرایند چرخه سلولی و رشد و نمو شرکت دارد (14). از طرفی افزایش و تجمعH2O2 ، خود نوعی تنش اکسیداتیو به شمار می آید که باعث آغاز فرایند مرگ سلولی می‌شود. بنابراین، بقای همه ارگانیسمهای هوازی بستگی به هوموستازی H2O2دارد. این هوموستازی شامل تولید H2O2 از مسیرهای مختلف و پاکسازی آن می‌باشد. اخیراً نقش کاتابولیسم پلی­آمین‌ها در تولید H2O2 بسیار مورد توجه قرارگرفته ­است (21). سیستم پاکسازی H2O2 شامل مسیرهای آنزیمی و غیرآنزیمی می‌باشد. آنزیم‌های جاروب کننده H2O2 شامل سوپراکسید دسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) می‌باشند (4). آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل توکوفرولها، آسکوربیک اسید، گلوتاتیون(GSH) و پلی­آمین‌ها هستند (4).

بر طبق نتایج حسن نژاد و همکاران (2011)، سالیسیلیک اسید از طریق تغییر در متابولیسم پلی­آمین‌ها سلول را تحت تأثیر قرار می‌دهد (12). پلی آمین‌ها، پلی­کاتیونهای آلیفاتیک با وزن مولکولی کم، غیرپروتئینی و راست زنجیر می‌باشند که در تمام سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت یافت می‌شوند (17). پلی­آمینها شامل پوترسین، اسپرمیدین، اسپرمین و کاداوارین می‌باشند (17). پلی­آمینها در همه بخشهای سلول گیاهی شامل هسته، میتوکندری، کلروپلاست و واکوئل حضور دارند، که این موضوع اهمیت نقش آنها در فرایندهای گوناگون سلولی ازجمله پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی را نشان می‌دهد (3، 17، 19و 21). تنظیم سطح پلی­آمینهای آزاد در سلول به‌طور مؤثری توسط کاتابولیسم پلی­آمین‌ها صورت می‌گیرد. همچنین محصولات کاتابولیسم پلی­آمین‌ها می‌توانند نقش فیزیولوژیکی مهمی را تحت شرایط عادی و تنش ایفا کنند (21). در گیاهان کاتابولیسم پلی­آمین‌ها توسط آنزیم‌های دی­آمین اکسیداز و پلی­آمین اکسیدازها صورت می‌گیرد. تحقیقات گذشته نشان داده است که آنزیم پلی­آمین اکسیداز در بخشهای مختلف سلولی شامل پراکسی زوم، سیتوپلاسم و آپوپلاست فعالیت دارد (21). یکی از محصولات جانبی کاتابولیسم پلی­آمین‌ها توسط آنزیم­ پلی­آمین اکسیداز، H2O2 می‌باشد (21). H2O2 تولید شده در آپوپلاست می‌تواند در واکنش لیگنینی شدن دیواره مورد استفاده قرارگیرد و در نهایت باعث استحکام دیواره سلولی شود (21). از طرفی افزایش H2O2 از طریق کاتابولیسم پلی­آمینها، می­تواند بر روی بیان ژنهای آنتی‌اکسیدانی مرتبط با تنش تأثیر بگذارد (21). 

مطالعات پیشین نشان داده است که سالیسیلیک اسید تأثیرات مختلفی بر سیستم آنزیمی آنتی‌اکسیدانی و سطح H2O2 نشان می‌دهد (13). باتوجه به تحقیقات گذشته در زمینه تأثیر سالیسیلیک اسید بر تغییرات سطوح پلی­آمینها در گیاه آویشن دنایی (12)، در پژوهش حاضر تأثیر سالیسیلیک اسید بر روی فعالیت پلی­آمین اکسیداز در کالوس این گیاه مورد بررسی قرارگرفت.

مواد و روشها

کشت کالوس: از ریشه گیاهچه­های آویشن دنایی کشت شده در محیط MS حاوی هورمون NAA، کالوس این گیاه به­دست آمد. سپس کالوسها بمنظور ازدیاد در محیط MS (5.7=pH ) به تعداد 5 عدد در هر شیشه واکشت داده شدند.

شیشه­های حاوی کالوسها در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی، با دمای 2±23 درجه سانتی‌گراد و شدت نور 2200  لوکس نگه­داری شدند. سپس کالوس­ها به تعداد 85 عدد با غلظت­های 0، 5، 10 و20 میکرومولار سالیسیلیک اسید تیمار شدند. نمونه‌برداری پس از 14 روز بمنظور انجام آزمایشهای بعدی صورت گرفت.

سنجش مقدار هیدروژن پراکسید (H2O2): اندازه­گیری H2O2به روش ولیکوا و همکاران (2000) انجام شد (26). 1/0 گرم بافت تازه گیاهی در 1 میلی‌لیتر بافر استخراج شامل تری­کلرو­استیک اسید 1 درصد حجمی -حجمی به مدت 2 دقیقه در هاون سرد هموژن شد. عصاره­ها در rpm4000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. 200 میکرولیتراز محلول رویی با 500 میکرولیتر پتاسیم یدید (M 1) و 500 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (mM10, 7pH=) مخلوط گردید و غلظت H2O2در طول‌موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. غلظت H2O2 در هر نمونه با کمک معادله حاصل از منحنی استاندارد محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: اندازه‌گیری کاتالاز به روش کار و همکاران (1976) صورت گرفت (16) مقدار 50 میلی­گرم بافت تازه گیاهی به مدت 2 دقیقه در هاون چینی سرد با  2میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم (Mm1/0,8/6pH=) هموژن شد. عصاره­ها در 15000rpm به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و محلول رویی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی و مقدار پروتئین محلول استفاده شد. سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس روش چانس و مائلی (1955) (7) همراه با تغییراتی جزئی انجام شد. 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم (mM50 ، 8/6pH=) و 100 میکرولیتر H2O2 2/0 مولار به 200 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. فعالیت آنزیمی با اضافه کردن H2O2 به مخلوط واکنش شروع می‌گردد. میزان کاهش جذب نور در طول‌موج 240 نانومتر به مدت 8 دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری گردید. فعالیت آنزیم برحسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی‌گرم پروتئین به‌صورت OD240 min-1mg-1PrΔ محاسبه شد (7). اندازه‌گیری پروتئین محلول به روش برادفورد (1976) انجام گرفت (6) .

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: اندازه­گیری پراکسیداز به روش رولی و همکاران (2004) انجام شد (23). 1/0 گرم بافت تازه گیاهی در1 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم (mM1/0,7pH=) به مدت 2 دقیقه در هاون سرد هموژن شد. عصاره­ها در  rpm 4000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و فاز بالایی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی و مقدار پروتئین محلول استفاده شد. 100 میکرولیتر از محلول رویی با 450 میکرولیترH2O2  (mM20) و450 میکرولیتر گلایکول  2 درصد مخلوط شدند و میزان تغییرات جذب در طول 3 دقیقه و در طول‌موج 510 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری گردید. فعالیت آنزیم به‌ صورت
OD510 min-1mg-1PrΔ بیان شد (17). اندازه‌گیری پروتئین محلول به روش برادفورد (1976) انجام گرفت (6).

سنجش فعالیت آنزیم پلی­آمین اکسیداز: اندازه‌گیری فعالیت پلی­آمین اکسیداز به روش Smith (1974) همراه با تغییرات جزئی انجام شد (25). 065/0 گرم بافت تازه گیاهی در 1 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم (mM100 ، 5/6pH=) به مدت 2 دقیقه در هاون سرد هموژن شد. عصاره­ها در  rpm 12000به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. سپس فاز بالایی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی و مقدار پروتئین محلول استفاده شد. 100 میکرولیتر از محلول رویی با 500 میکرولیتر بافر استخراج و 50 میکرولیتر گلایکول (mM25) و 50 میکرولیتر پراکسیدازHRP  (mg.ml-11) مخلوط شد و پس از انکوبه­شدن بمدت 2 دقیقه در دمای اتاق (2±23 درجه سانتی گراد)، 50 میکرولیتر اسپرمین (mg.ml-15/0) به مخلوط واکنش اضافه شد. تغییرات جذب بین زمان­های
0 و 60 دقیقه و در طول موج 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV - Visble مدل
Specord210-anallytikjena اندازه‌گیری شدند. فعالیت آنزیم به‌صورت OD470 min-1mg-1PrΔ بیان شد (18). اندازه‌گیری پروتئین محلول به روش برادفورد (1976) انجام گرفت (6).

تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها: آزمایشات در قالب طرحهای کاملاً تصادفی (CRD) انجام شد. برای تعیین اختلاف معنی‌داری بین تیمارها آنالیز واریانس یک‌طرفه
(One- Way ANOVA) انجام شد. بمنظور بررسی میانگین‌های تیمارهای معنی‌دار شده (ویا دارای احتمال معنی‌دار) از آزمون LSD در سطح احتمال (0.05P≤) استفاده شد. آزمایشات با 5 تکرار صورت گرفت و آنالیز آماری آنها با استفاده از نرم‌افزار (version 18) SPSS انجام شد.  

نتایج

نتایج حاصل از بررسی H2O2 نشان داد که مقدار H2O2 در کالوس آویشن دنایی تیمار شده با سالیسیلیک اسید افزایش یافت. همزمان با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید میزانH2O2  روند صعودی نشان داد. به‌طوری که در تیمار با غلظت 20 میکرومولار سالیسیلیک اسید، میزانH2O2  در مقایسه با تیمار شاهد (فاقد سالیسیلیک اسید) به مقدار 43/1 برابر افزایش معنی‌داری را نشان داد (شکل 1).

 

شکل1- تأثیر غلظت‌های مختلف (0، 10، 20و 50 میکرومولار) سالیسیلیک اسید بر میزان H2O2در کالوس آویشن دنایی پس از 14 روز. مقادیر میانگین 5 تکرار ± خطای معیار می‌باشد. تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح احتمال 0.05P≤ نشاندار می‌باشد

سالیسیلیک اسید بر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مورد بررسی (کاتالاز و پراکسیداز کل محلول) تأثیر متفاوتی داشت. نتایج مقایسه میانگین فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای مختلف سالیسیلیک اسید نشان می‌دهد که حضور کالوسها در غلظت‌های مختلف سالیسیلیک اسید تغییر محسوسی بر فعالیت کاتالاز ایجاد نمی‌کند (شکل2). درحالیکه میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در کالوسهای تیمار شده با سالیسیلیک اسید نسبت به کالوس تیمار شاهد کاهش یافت. نتایج نشان داد که سالیسیلیک اسید بازدارنده فعالیت پراکسیداز می‌باشد که این اثر بازدارندگی در غلظت 20 میکرومولار سالیسیلیک اسید نسبت به سایر غلظت‌ها بیشتر و معنی­دار می‌باشد. بطوریکه فعالیت آنزیم پراکسیداز در این تیمار نسبت به شاهد در حدود 5/2 برابر کاهش یافت (شکل 2).

 

شکل2- تأثیر غلظت‌های مختلف (0، 10، 20و 50 میکرومولار) سالیسیلیک اسید بر میزان فعالیت کاتالاز در کالوس آویشن دنایی پس از 14 روز. مقادیر میانگین 5 تکرار ±خطای معیار می‌باشد. در سطح احتمال 0.05P≤ تفاوت معنی‌داری بین میانگین‌ها مشاهده نشد

 

شکل3- تأثیر غلظت‌های مختلف (0، 10، 20و 50 میکرومولار) سالیسیلیک اسید بر میزان فعالیت پراکسیداز در کالوس آویشن دنایی پس از 14 روز. مقادیر میانگین 5 تکرار ± خطای معیار می‌باشد. تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح احتمال 0.05P≤  نشاندار می‌باشد

نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیم پلی آمین اکسیداز در غلظت‌های متفاوت سالیسیلیک اسید نشان داد که اثر غلظت سالیسیلیک اسید بر روی فعالیت این آنزیم معنی‌دار می‌باشد. بطوریکه در غلظت‌های 10 و 20 میکرومولار سالیسیلیک اسید روند صعودی معنی‌داری در فعالیت این آنزیم مشاهده شد (شکل4). بنابراین سالیسیلیک اسید محرک فعالیت پلی امین اکسیداز است و این تأثیر وابسته به غلظت سالیسیلیک اسید می‌باشد (شکل4).

 

شکل4- تاثیر غلظتهای مختلف (0، 10، 20و 50 میکرومولار) سالیسیلیک اسید بر میزان فعالیت پلی آمین اکسیداز در کالوس آویشن دنایی پس از 14روز.  مقادیر میانگین 5 تکرار ± خطای معیار می‌باشد. تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح احتمال 0.05P≤ نشاندار می‌باشد

بحث و نتیجه‌گیری

در گیاهان H2O2بعنوان یک‌گونه فعال اکسیژن در بسیاری از تنشهای زیستی و غیر زیستی ایفای نقش می‌کند (14). اما مقادیر بالای این ماده بعنوان یک تنش اکسیداتیو بشمار می‌رود (14). سطوح تولید و پاکسازی این ماده هر دو در هموستازی این ماده نقش دارند. یکی از راههای تولید H2O2 در سلول ، آنزیم پلی آمین اکسیداز می‌باشد (21). مسیرهای پاکسازی H2O2 شامل مسیرهای آنزیمی (مثل آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز) و مسیرهای غیر آنزیمی است (4).

تیمار گیاهان با سالیسیلیک اسید باعث تغییر در متابولیسم پلی آمینها می‌شود (12). پلی آمین اکسیداز آنزیم کاتابولیسم کننده پلی آمین­ها می‌باشد که یکی از محصولات واکنش این آنزیم H2O2 است (21). بنابراین تغییر در فعالیت این آنزیم می‌تواند بر میزان H2O2 مؤثر باشد. در پژوهش حاضر تاثیر سالیسیلیک اسید بر میزان فعالیت آنزیم پلی آمین اکسیداز در کالوسهای آویشن دنایی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین فعالیت دو آنزیم آنتی‌اکسیدانی کاتالاز و پراکسیداز به‌عنوان آنزیم‌های پاکسازی کننده H2O2 نیز اندازه‌گیری شد.

همان­طور که در نتایج مشاهده شد، افزایش H2O2 می‌تواند از طریق تاثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و پلی آمین اکسیداز صورت بگیرد. آنزیم‌های متعددی ازجمله آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز در شرایط تنش باعث پاکسازی H2O2 می‌شوند. آنزیم کاتالاز در شرایط تنش شدید (نظیر غلظتهای بالای سالیسیلیک اسید) که H2O2 تجمع زیادی دارد می‌تواند فعال شود و با پاکسازی H2O2 مانع آسیب اکسیداتیو ­شود. تاثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت کاتالاز در مورد چند گیاه بررسی‌شده­ و اثر بازدارنده سالیسیلیک اسید بر روی فعالیت این آنزیم مشاهده شده است. در این مطالعات صورت گرفته غلظت سالیسیلیک اسید بسیار بالا بوده­است که باعث افزایش ناگهانی H2O2 شده است (11). افزایش H2O2 بعنوان تنش اکسیداتیو باعث مرگ برنامه­ریزی شده سلولی می‌گردد (4). در پژوهش حاضر غلظتهای خیلی کم سالیسیلیک اسید بکار گرفته‌شده است. نتایج حاصله نشان داده است که در چنین شرایطی سالیسیلیک اسید بر روی کاتالاز تاثیر نداشته ولی باعث افزایش ملایم مقدار H2O2 گردید. سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم اکسیداتیو پراکسیداز نیز تاثیر بازدارنده دارد (18). این تاثیر بازدارنده در پژوهش حاضر نیز مشاهده شد. پراکسیداز در مقایسه با کاتالاز به تیمار سالیسیلیک اسید حساسیت بیشتری را نشان داد. این موضوع بیانگر آن است که افزایش H2O2 می‌تواند در نتیجه کاهش فعالیت پراکسیداز ­باشد. اما افزایش H2O2 فقط درنتیجه کاهش فعالیت پراکسیداز نمیباشد.

پیش تیمار بذر گندم (Triticum aestivum) با غلظت 0.5 میلی مولار سالیسیلیک اسید باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز شد (1). همچنین سالیسیلیک اسید باعث کاهش فعالیت این آنزیم در گیاه ریحان (Octimum basilicum) گردید (2).از آنجایی که سالیسیلیک اسید بازدارنده فعالیت آنزیم کاتالاز می‌باشد و چون این آنزیم باعث پاکسازی هیدروژن پراکسید می‌گردد، با کاهش فعالیت این آنزیم هیدروژن پراکسید افزایش میابد (11). هیدروژن پراکسید در غلظتهای بالا سمی بوده و توسط آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی پاکسازی میگردد، اما در غلظتهای پایین نقش سیگنال را در فرآیندهای انتقال پیام بازی می‌کند و باعث فعال شدن ژنهای وابسته به مقاومت در گیاه میشود (10). همچنین گزارشاتی مبنی بر تغییر در الگوی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در شرایط تنش عناصر سنگین و دیگر تنش­های غیرزنده، تحت تیمارهای سالیسیلیک اسید و بدون آن ارائه شده­است (20). این نتایج بیان میدارد که سالیسیلیک اسید با اتصال به کاتالاز باعث کاهش فعالیت آن در توتون (8) و چندگونه دیگر گیاهی (24)  میشود. اما در پژوهش حاضر به علت پایین بودن غلظت سالیسیلیک اسید بکار رفته، این اثر بازدارنده روی کاتالاز مشاهده نشد.

سالیسیلیک اسید در غلظتهای بالاتر به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم باعث فعال شدن آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان میشود. این ماده بعنوان سوبسترای دهنده الکترون برای آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز عمل می‌نماید. در بیشتر موارد مشاهده شده­است که افزایش غلظت سالیسیلیک اسید به 1 میلی مولار فعالیت آنزیم را در مقایسه با غلظت 5/0 میلی مولار که کاهنده فعالیت آنزیمی بود، افزایش می‌دهد. این‌طور به نظر ­مارسد که این افزایش غلظت خود به‌صورت یک تنش در گیاه عمل می‌کند که باعث ارتقای سیستم آنتی‌اکسیدانی آنزیمی گیاه میشود. در ذرت نیز پیش تیمار بذر با سالیسیلیک اسید باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان میشود (15).

نتایج جدید بدست آمده، چند نوع پلی آمین­اکسیداز را در سلول گیاهی نشان می‌دهند که شامل پلی آمین­اکسیدازهای آپوپلاستی، پراکسی­زومی و سیتوپلاسمی ­می‌باشند. آنزیم پلی آمین­اکسیداز، اسپرمین و اسپرمیدین را اکسید کرده و یکی از محصولات جانبی این واکنش H2O2 می‌باشد. تولید H2O2 از طریق آنزیم پلی آمین­ اکسیداز بدو صورت انجام می‌پذیرد. به‌طورکلی در گیاهان انجام واکنش تبدیل اسپرمین و اسپرمیدین به پوترسین و از طرف دیگر اکسیداسیون اسپرمین و اسپرمیدین در آپوپلاست نقش مهمی دارد (9و 21). همچنین سطح H2O2 آپوپلاستی نقش کلیدی در تنظیم رشد سلول و توسعه و لیگنینی شدن دیواره سلولی دارد (22). پلی آمین اکسیداز اندازه‌گیری شده در این پژوهش، نوع آپوپلاستی می‌باشد.

بر اساس نتایج این پژوهش، نقش سالیسیلیک اسید در تغییرات مقدار پلی آمینها احتمالاً از طریق تنظیم فعالیت پلی آمین اکسیداز آپوپلاستی و مقدار H2O2 آپوپلاستی اعمال میشود و از این طریق ­می‌تواند یکی از دلایل کاهش شیشه­ای شدن در آویشن دنایی باشد. مطالعات صورت گرفته نقش احتمالی تغییرات در متابولیسم پلی آمینها را در فرآیند لیگنینی شدن و کاهش شیشه­ای شدن تقویت می‌کند (5و 12). به عبارتی طبق نتایج حسن نژاد و همکاران (2011) سالیسیلیک اسید بر متابولیسم پلی آمین‌ها مؤثر است (12). این فرضیه وجود دارد که این امر از طریق تاثیر بر فعالیت آنزیم پلی آمین اکسیداز صورت می‌گیرد. نتایج پژوهش حاضر این فرضیه را تقویت کرد. بنابراین سالیسیلیک اسید می‌تواند با تاثیر بر روی فعالیت پلی آمین اکسیداز، روی متابولیسم پلی آمین‌ها تاثیر داشته و باعث کاهش شیشه‌ای شدن گردد.

1- دولت‌آبادیان، آ.، ثانوی، ع.، و اعتمادی، ف.، 1378. اثر پیش تیمار سالیسیلیک اسید بر جوانه‌زنی بذر گندم
(Triticum aestivum L.)  در شرایط تنش شوری، مجله زیست‌شناسی ایران، 12 (4)، صفحات 692-702.

2- قیصری، س.، سعیدنعمت پور، ف.، و صفی­پور افشار، ا.، 1394. اثر سالیسیلیک اسید و آسکوربیک اسید بر محتوای رنگیزه های فتوسنتزی و فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در گیاه ریحان (Octimum basilicum) تحت تنش سرب، مجله زیست‌شناسی ایران 28 (4)، صفحات 814-825.

 

3- Alcazar, R., Altabella, T., Marco, F., Bortolotti, C., Reymond, M., Konez, C., Carrasco, P., and Tiburcio, A. F., 2010. Polyamines: molecules with regulatory functions in plant abiotic stress tolerance. Planta, 23(6), PP: 1237-1249.

4- Apel, K., and Hirt, H., 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu. Rev. Plant Biol, 55, PP: 373–399.

5- Bernard, F., Navvab Moghadam, N., and Mirzajani, F., 2015. The effect of colloid silver nanoparticles on the level of lignification and hyperhydricity syndrome in thymus daenensis vitro shoots: a possible involvement of bonded polyamines, Plant Physiol. Biochem, 51, PP: 40-46.

6- Bradford, M. M., 1976. A rapid and sesitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing of protein-dye binding, Anal. Biochem, 72, PP: 248-254.

7- Chance, B., and Maehly, A. C., 1955. Assay of catalases and peroxidases. Methods in Enzymol, 11, PP: 764-755.

8- Chen, Z., Ricigliano, J. R., and Klessig, D. F., 1993. Purification and characterization of a soluble salicylic acid binding protein from tobacco. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90, PP: 9533-9537.

9- Cona, A., Rea, G., Angelini, R., Federico, R., Tavladoraki, P., 2006. Functions of amine oxidases in plant development and defense. Trends Plant Sci, 11, PP: 80–88.

10- -Foyer, C. H., Lopez-Delgado, H., Dat, J. F., and Scott, I. M., 1997. Hydrogen peroxide- and glutathioneassociated mechanisms of acclamatory stress tolerance and signalling. Plant Physiol, 100, PP: 241– 254.

11- Harvath, E., Janda, T., Szalai, G., and Paldi, E., 2002. In vitro salicylic acid inhibition of catalase activity in maize: differences between the isozymes and a possible role in the induction of chilling tolerance, Plant science, 163, PP: 1129-1135.

12- Hassannejad, S., Bernard, F., Mirzajani, F., and Gholami, M., 2011. S. A., improvement of hyperhydricity reversion in Thymus daenensis shoots culture may be associated with polyamines changes. Plant Physiol. Biochem., In vitro cell Dev. Biol- Plant, 51, PP: 546-553. doi:10.1016/j.plaphy.2011.10.006.

13- Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M., and Ahmad, A., 2010. Effect of exogenous salicylic acid under changing environment. A review. Environ. Exper. Bot., 68, PP: 14–25.

14- Hung, S. H., Yu, C. W., and Lin, C. H., 2005. Hydrogen peroxide function as a stress signal in plants. Bot Bull Acad Sin, 46, PP: 1–10.

15- Janda, T., Szalai, G., Tari, I., and Paldi, E., 1999. Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, PP: 175-180.

16- Kar, M., and Mishra, D., 1976. Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiol, 57, PP: 315-319.

17- Kusano, T., and Suzuki, H., 2015. Polyamines, a universal molecular nexus for growth, survival and specialized metabolism. Edts, Springer, 336 p.

18- Maksimov, I. V., Surina, O. B., Sakhabutdinova, A. R., Troshina, N. B., and Shakirova, F. M., 2004. Changes in the phytohormone levels in wheat calli as affected by salicylic acid and infected with Tilletia caries, a bunt pathogenic agent. fiziol. rast. (Moscow), vol. 51, PP: 256–261. (Russ. J. Plant Physiol., Engl. Transl.).

19- Marco, F., Alcazar, R., Tiburcio, A. F., and Carrasco, P., 2011. Interactions between polyamines and abiotic stress pathway responses unraveled by transcriptome analysis of polyamine overproducers. OMICS 15, PP: 775-781. Doi: 10.1089/ omi.2011.0084.

20- Matewally, A., Finkemeir, I., Georgi, M., and Dietz, K. J., 2003. Salicylic acid alleviates cadmium toxicity in barley seedlings, Plant Physiol, 132, PP: 272-281.

21- Moschou, P. N., Paschalidis, K. A., and Roubelakis-Angelakis, K. A., 2008. Plant polyamine catabolism: The state of the art. Plant signal. Behav, 3, PP: 1061-1066.

22- Rodriguez, A. A., Maiale, S. J., Menendez, A. B., and Adolfo, O., 2009. Polyamine oxidase activity contributes to sustain maize leaf elongation under saline stress. Journal of Exp. Bot. 60(15), PP: 4249-4262.

23- Ruley, A. T., Sharma, N. C., and Sahi, S. V., 2004. Antioxidant defense in a lead accumulating plant, Sesbania drummondii. Plant Physiol. Biochem, 42, PP: 899–906.

24- Sanchez-Casas, P., and Klessig, D. F., 1994. A salicylic acid-binding activity and a salicylic acidinhibitable catalase activity is present in a variety of plant species. Plant Physiol, 106, PP: 1675-1679.

25- Smith, T. A., 1974. Polyamine oxidation by enzymes from Hordeum vulgare and Pisum sativum seedlings. Phytochem, 13, PP: 1075-1081.

26- Velikova, V., Yordanov, I., and Edreva, A., 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines. Plant Sci, 152, PP: 59-66.