نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان

2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا

3 گروه باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا

چکیده

جنسCardamine L. از خانواده Brassicaceaeبا بیش از 200 گونه در جهان و 7 گونه در ایران با توجه به تنوع کاریولوژی و مورفولوژی بالا، گیاه مناسبی برای بررسی های فیلوژنتیکی و تکامل می باشد. گونه کاردامینه هیرسوتا از این جنس بتازگی بعنوان گیاهی مدل در مطالعات مقایسه ای تکاملی معرفی شده است. این گیاه از هفت منطقه مختلف ایران جمع آوری و پس از استخراج DNA ی برگی، ناحیه ITS آنها با استفاده از پرایمر های ITS4 وITS5 تکثیر و سپس تعیین توالی گردید. توالی ها با استفاده از نرم افزار مگا 7 مورد آنالیر فیلوژنتیک قرار گرفتند و از طریق مقایسه نتایج بلاست و درخت فیلوژنتیکی، گونه های C.hirsuta C.flexuosa, C.tenera,و C.uliginosa شناسایی گردیدند. همچنین با استفاده از دو اکوتیپ اروپایی مشخص از گونه هیرسوتا به عنوان شاهد (آزروس و اکسفورد تهیه شده از موسسه ماکس پلانک)، نتایج حاصل تایید گردید. یافته های این پژوهش، علاوه بر تایید حداقل چهار گونه کاردامینه در ایران، کارآمدی نشانگر ITS را در تفکیک گونه های مختلف جنس کاردامینه بخوبی نشان داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification of some Iranian Cardamine species using the ITS molecular marker

نویسندگان [English]

  • Mahmood Ghorbani Marghashi 1
  • Hedayat Bagheri 2
  • Mansour Gholami 3

1 PhD. Student, Biotechnology Department, Bu-Ali sina university, Hamedan, I.R. of Iran

2 Biotechnology department, Faculty of agriculture, Bu-Ali Sina University

3 Horticulture Department, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina university

چکیده [English]

The genus Cardamine L. in Brassicaceae comprises about 200 species in the world and 7 species in Iran. It has great morphological and karyological diversity and complex evolutionary history. This plant was collected from six different parts of Iran. The identity of these species was further explored by DNA extraction from young leaves and amplification of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) internal transcribed spacer (ITS) region by ITS4 and ITS5 primers. The amplified DNA was sequenced via Takapozist Company. Phylogeny reconstructions were performed using MEGA7 software. Blast and phylogeny analysis identified the collected plants as C.hirsuta C.flexuosa, C.tenera and C.uliginosa. Two known europian ecotypes of C. hirsuta (azureus and oxford from Max Planck Institute) were used as control which confirmed the outcome. These results not only confirmed the presence of at least four Cardamine species in Iran but also showed the effectiveness of ITS marker in identification of different species in the genus Cardamine.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cardamine
  • ITS marker
  • Phylogenetic analysis

شناسایی برخی گونه های کاردامینه در ایران با استفاده از نشانگر ملکولی ITS

محمود قربانی مرغشی1، هدایت باقری1*و منصور غلامی2

1 ایران، همدان، دانشگاه بو علی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

2 ایران، همدان، دانشگاه بو علی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی

تاریخ دریافت: 29/2/97                تاریخ پذیرش: 5/9/97

چکیده

جنسCardamine L.  از خانواده  Brassicaceaeبا بیش از 200 گونه در جهان و7 گونه در ایران با توجه به تنوع کاریولوژی و مورفولوژی بالا، گیاه مناسبی برای بررسی های فیلوژنتیکی و تکامل می باشد. گونه کاردامینه هیرسوتا از این جنس، بتازگی بعنوان گیاهی مدل در مطالعات مقایسه ای تکاملی معرفی شده است. این گیاه از شش منطقه مختلف ایران جمع آوری و پس از استخراج DNA ی برگی، ناحیه ITS با استفاده از پرایمر های ITS4 وITS5 تکثیر و سپس تعیین توالی گردید. توالی ها با استفاده از نرم افزار مگا 7 مورد آنالیر فیلوژنتیک قرار گرفتند و از طریق مقایسه نتایج بلاست و درخت فیلوژنتیکی، گونه های  C.hirsuta C.flexuosa,  C.tenera, و C.uliginosa  شناسایی گردیدند. همچنین با استفاده از دو اکوتیپ اروپایی مشخص از گونه هیرسوتا بعنوان شاهد (آزوروس و آکسفورد تهیه شده از موسسه ماکس پلانک)، نتایج حاصل تایید گردید. یافته های این پژوهش، علاوه بر تایید حداقل چهار گونه کاردامینه در ایران، کارآمدی نشانگر ITS را در تفکیک گونه های مختلف جنس کاردامینه بخوبی نشان داد.

واژه های کلیدی: کاردامینه ، نشانگر ITS، آنالیز فیلوژنتیکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09393804375 ، پست الکترونیکی:  bagheri.hedayat@gmail.com

مقدمه

 

جنس Cardamine ازخانواده Brassicaceae شامل بیش از 200 گونه در جهان می شود که در تمامی کره زمین به جز قطب جنوب پراکنده شده اند. این تعداد گونه در یک جنس بمراتب بیشتر از میانگین تعداد گونه های شناسایی شده در این خانواده است که بالغ بر 3700 گونه در 338 جنس از این خانواده می باشد(24 ،10). تنوع کاریولوژی و مورفولوژی زیادی در این جنس وجود دارد که کار شناسایی آنها را با روشهای غیرمولکولی دشوار می سازد.  بدلیل تنوع و ساختار تکاملی پیچیده این جنس، تاکنون تحقیقات متنوعی روی ارتباط تکاملی گونه های آن انجام شده است. از طرفی بدلیل اهمیت برخی از گونه های این جنس نظیرکاردامینه هیرسوتا که بتازگی به عنوان گونه مدل معرفی شده است (22) و همچنین ارتباط خویشاوندی و تنوع پلی پلوئیدی در گونه های دیگر این جنس، مانند C.flexuosa سعی شده است با استفاده از روش های مختلف مولکولی و مورفولوژیکی، درک بهتری از ارتباطات این گونه ها و رابطه تکاملی آنها فراهم گردد (24، 18). امروزه بارکدگذاری DNA با استفاده از اطلاعات مشترک یک یا چند ژن در بین گونه­های گیاهی و جانوری و توالی یابی این مناطق و اشتراک گذاری این اطلاعات در پایگاه داده های بیوانفورماتیک، راهی موثر در شناسایی گونه هاست. در این روش، گونه­ها با سرعت، دقت و هزینه پایینی، شناسایی و تفکیک می­گردند. اولین بارWoes  و Fox (28) با استفاده از توالی یابی قطعه کوچکی از زیر واحد کوچک rRNA مربوط به ارگانیسم های مختلف، موفق به بررسی فیلوژنی آنها شدند. امروزه کاربرد این روش در شناسایی گونه های سایر جانداران و گیاهان گسترده شده است. از مزایای این روش، استفاده از قطعات کوچکی از اندامهای رویشی و یا زایشی، مستقل از مرحله رشد، برای شناسایی می باشد. در گیاهان، ژن های مختلفی مانند trnH-psbA matK, rbcL, و ITS معرفی و مورد استفاده قرار گرفته اند که درصد موفقیت هر کدام از این ژنهای نشانگر در گونه های گیاهی، متفاوت گزارش شده است(16). در جنس کاردامینه نیز بدلیل تحقیقات گوناگون انجام شده، ITS بیش از 150 گونه از این جنس در NCBI ثبت شده است (26، 20، 15، 14، 12،13، 11).

در این تحقیق، شناسایی گونه های کاردامینه کشور با استفاده از نشانگر مولکولی Internal transcribed spacer (ITS) مورد بررسی قرار گرفت. از جنس کاردامینه در ایران 7 گونه گزارش شده است(5) که در سرزمین های پست تا ارتفاعات مناطق مرطوب می رویند. در سال1390توسط عباسی(5) برخی از گونه های این جنس از دیدگاه ریخت شناسی، گرده شناسی و تشریحی با استفاده از تاکسونومی عددی مورد بررسی قرار گرفت اما تاکنون بررسی ملکولی بر روی گونه های این جنس در ایران صورت نگرفته است. از طرفی برخی از گونه­های این جنس نظیرC. hirsuta  و C. Flexuosa اگرچه به لحاظ تکاملی و ژنومی، تفاوت فاحشی با هم دارند اما به لحاظ مورفولوژیکی بسیار شبیه بوده و شناسایی آنها براحتی امکان پذیر نیست. در سال 2005  قهرمان و نقی نژاد برای اولین بار وجود گونه C.flexuosa را در ایران در نواحی هیرکانی مازندران گزارش دادند. همچنین در بررسی های فلور منطقه ای که در مناطق مختلف کشور مانند مازندران، گیلان، اردبیل و خوزستان انجام گردید، وجود چندین گونه از این جنس گزارش شده است (27، 9، 8، 7، 6، 4، 3، 2، 1).

در تحقیق حاضر نمونه هایی از این گیاه با توجه به گزارشات موجود از مکانهای مختلف، جمع آوری گردیده و برای اولین بار با استفاده از نشانگر ITS مورد مقایسه مولکولی قرار گرفتند. با توجه به معرفی گونه کاردامینه هیرسوتا در تحقیقات ژنتیکی پایه و همچنین شباهت آن با گونه C.flexuosa، از دو نمونه گیاهی اروپایی گونه کاردامینه هیرسوتا نیز به عنوان شاهد استفاده گردید.

مواد و روشها

بذر و یا نمونه های گیاهی کاردامینه از مناطق طبیعی اردبیل، نور، بابل، مشهد، محلات و گلخانه های دانشگاه بوعلی سینا جمع آوری گردید(جدول 1). نمونه های گیاهی به گلدان، منتقل و بذرگیری از آنها صورت گرفت. بذور بدست آمده، دوباره کشت گردید و از برگهای جوان حاصل، استخراج  DNAبا استفاده از روش CTAB (17) انجام گرفت. در مورد نمونه های تنکابن و بابل، از برگ گیاهان جمع آوری شده، استخراج DNA صورت گرفت. از دو نمونه گیاهی گونه کاردامینه هیرسوتای اروپایی (تهیه شده از موسسه ماکس پلانک) نیز بعنوان شاهد و برای اطمینان از نتایج، استفاده گردید. کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز 8/0 درصد بررسی گردید. همچنین با استفاده از اسپکتروفتومتر و سنجش جذب در طول موج های 260 و 280 نانومتر، خلوص و غلظت DNA استخراجی مورد ارزیابی قرار گرفت. واکنش زنجیره ای پلیمراز برای توالی های nrDNA ITS با آغازگرهای ITS4 وITS5 (شکل1) در حجم 40 میکرولیتر وطبق برنامه دمایی زیر صورت گرفت: واسرشت اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه و در انتها، بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصول PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز 8/0درصد،  تفکیک و برای توالی یابی به شرکت تکاپوزیست ارسال گردید (شکل 2).

جدول1- مناطق مختلف جمع آوری نمونه های کاردامینه که برای شناسایی مولکولی در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند.

ردیف

نام علمی گیاه

محل جمع آوری

شماره هرباریومی

1

Cardamine hirsuta

طرقبه مشهد

CM 16

2

Cardamine hirsuta

محلات

CM 17

3

Cardamine flexuoca

همدان (دانشگاه بوعلی سینا)

CH 8

4

Cardamine flexuoca

بابل (امیر کلایه)

CB 9

5

Cardamine tenera

نور (جنگل نور)

CN 11

6

Cardamine uliginosa

اردبیل(دامنه شرقی سبلان)

CA 12

 

 

شکل1- محل اتصال آغازگرهای مختلف ناحیه ITS و نواحی تکثیر داخلی هر کدام از پرایمر ها بر اساس محل اتصال آنها(25). در این تحقیق از آغازگرهای ITS4 وITS5 استفاده گردید.

 

کیفیت توالی های بدست آمده با استفاده از نرم افزارSeqMan مربوط به DNASTAR بررسی گردید. برای بررسی توانایی بارکد مورد بررسی در تفکیک گونه ها، برای هرگیاه مورد مطالعه، چندین توالی دیگر از همان جنس وچندین بارکد از پایگاه اطلاعات داده NCBIنیز جمع آوری شد. این توالی ها در نرم افزار MEGA7 (23) با استفاده از الگوریتمClustalW همردیف شده و درخت خویشاوندی با استفاده از فاصلهp-distance ، روش Neighbor joining و Bootstrap 1000 ترسیم گردید.

نتایج

استخراج DNA : نتایج الکتروفورز و اسپکتروفتومتری نشان داد که تمامی DNA های استخراجی از کیفیت بالایی برخوردار می باشند. بنابراین تمامی نمونه ها برای آنالیز PCR مورد استفاده قرار گرفتند.

توالی یابی: الکتروفورز محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی ژل، باند ITSتکثیر شده را نشان داد (شکل 2). البته در مورد نمونه های تنکابن و بابل که برگها مستقیما از گیاهان جمع آوری شده، جدا و استخراج DNA صورت گرفته بود، دو باند مشاهده گردید که بررسی های بعدی نشان داد که باند دوم مربوط به آلودگی قارچی می باشد. داده­های حاصل از توالی یابی نشان داد که طول کل قطعهITS  تکثیر شده در گونه های کاردامین بین 720-680  متغیر بود.

 

شکل2- الکتروفورز محصول تکثیر قطعهITS  با استفاده از PCR در نمونه های کاردامینه. ستون اول: سایز مارکر(L)، ستون دوم: نمونه کاردامینه تنکابن(T)، ستون سوم: نمونه کاردامینه بابل(B)، ستون چهارم: نمونه کاردامینه مشهد(M).

بررسی نسبت بازها و ترکیب نوکلئوتید ها در نمونه های جمع آوری شده، تفاوت بسیار کم داخل گونه های هیرسوتا (محلات، مشهد، آزوروس و آکسفورد از ماکس پلانک) و تفاوت بارز بین این گونه با گونه های دیگر را نشان داد (جدول2).  نسبت GC در گونه های هیرسوتا به اندازه 2 درصد کمتر و نسبت AT به همین میزان بیشتر از دیگر گونه ها بود.

بررسی موقعیتSingle nucleotide polymorphisms (SNP)در گونه هیرسوتا نشان داد که بیشتر تغییرات SNP مربوط به ناحیه اول ITS بود و در منطقه 5.8S  در هیچکدام از گونه های مورد بررسی، تفاوتی دیده نشد. بنظر می رسد این ناحیه، کاملا حفاظت شده است. همچنین در ناحیه دوم ITS، اگرچه تفاوت درSNP مشاهده شد اما این تفاوت بمراتب کمتر از ناحیه اول بود (جدول 3). بجز موقعیت 172 که تفاوتSNP مربوط به بازهای پورین و پیریمیدین است در موقعیت های دیگر، تفاوت منحصرا یا مربوط به بازهای پورین و یا پیریمیدین است. همچنین در موقعیت 585، نمونه های مختلف به جز نمونه آکسفورد، فاقد یک نوکلئوتید بودند که احتمالا نشان دهنده یک حذف شدگی باشد.

بر خلاف گونه هیرسوتا در گروه flexuosa، جایگاه هایSNP به مراتب بیشتر از هیرسوتا بود ضمن آنکه در هر دو ناحیه اول و دوم ITS، تفاوتهایSNP تقریبا به یک میزان دیده شد. همچنین در ناحیه 5.8S یک SNP مشاهده گردید (جدول 4).

در گونه پراتنسیس همانند گونه هیرسوتا اکثر تفاوتهایSNP درITS1 مشاهده شد و فقط سه SNP در مقابل هشت SNP در ITS2 مشاهده گردید. ناحیه 5.8S کاملا حفاظت شده و بدونSNP بود(جدول5).

همردیفی توالی ها: نتایج همردیفی(BLASTn) توالی های ITS گیاهان جمع آوری شده، تایید نمود که تمامی گیاهان جمع آوری شده از جنس کاردامینه بودند. همچنین از نظر شناسایی گونه نیز نتایج همردیفی، درصد بالای شباهت را با گونه های دیگر این جنس نشان داد.


 

جدول2- ترکیب و درصد نوکلئوتید های تشکیل دهندهnrDNA ITS  در کاردامینه های ایرانی و خارجی (دو اکوتیپ آزوروس و آکسفورد از موسسه ماکس پلانک تحت عنوان C.hirsuta بعنوان شاهد، اضافه شدند).

آزوروس

آکسفورد

اردبیل

نور

همدان

محلات

مشهد

نوکلئوتید

39/23

35/23

15/24

83/23

26/23

23/23

55/23

A

10/22

22/22

51/23

83/23

91/23

94/21

94/21

T

45/26

25/26

28/25

44/25

85/25

61/26

29/26

G

06/28

18/28

05/27

89/26

98/26

23/28

23/28

C

52/54

43/54

33/52

33/52

83/52

84/54

52/54

G+C

48/45

57/45

67/47

67/47

17/47

16/45

48/45

A+T

620

620

621

621

619

620

620

طول توالی

 

جدول3- موقعیت SNP ها در گروه C.hirsutaدر نتایج حاصل از توالی یابیnrDNA ITS

SNPموقعیت

54

74

119

172

185

256

585

634

آکسفورد

T

A

T

C

G

C

T

A

آزوروس

T

A

C

A

G

T

-

G

محلات

C

G

C

A

G

T

-

G

مشهد

C

A

C

A

A

T

-

G

جدول4- موقعیت SNP ها در گروهC.flexuosa در نتایج حاصل از توالی یابی nrDNA ITS

SNPموقعیت

14

35

39

93

232

247

464

537

567

601

610

Hamedan (Asian flexuosa)

A

T

T

T

T

C

T

T

A

T

T

KM875628.1(Cardamine flexuosa)

-

C

G

C

C

T

C

C

T

T

C

KM875629.1 (Asian flexuosa)

A

T

T

T

T

C

T

T

A

C

T

KP998042.1 (Cardamine flexuosa)

A

C

T

T

T

C

T

T

T

T

C

جدول 5- موقعیت SNP ها در گروه C.pratensis در نتایج حاصل از توالی یابی nrDNA ITS

SNPموقعیت

50

56

80

116

130

143

210

251

461

524

548

Ardebil (Cardamine sp)

A

G

G

C

C

G

C

C

A

C

T

Nor (Cardamine tenera)

T

G

G

C

T

G

C

C

G

T

C

KF987890.1 (Cardamine schulzii)

A

G

G

C

C

G

C

T

G

C

C

KF987864.1 (Cardamine pratensis)

A

G

C

T

C

G

C

C

G

C

T

KF987847.1 (Cardamine pratensis)

A

G

G

T

C

T

T

C

G

C

T

AY245992.1 (Cardamine tenera GK)

T

-

G

C

C

G

C

C

T

-

C

AY245981.1 (Cardamine uliginosa KPU)

-

-

G

C

-

G

C

C

G

C

T

AY245980.1 (Cardamine tenera KS)

T

-

G

C

-

G

C

C

-

-

C


در گونه جمع آوری شده از منطقه جنگل نور، اگرچه نتایج یکسانی از بلاست ناحیه کامل ITS با بلاست نواحی جداگانه ITS1 و ITS2 بدست نیامد اما با توجه به ویژگی های مورفولوژیکی و بررسی های انجام شده در مورد شناسایی این گونه در منطقه جنگل نور و نتایج بدست آمده از بلاست جداگانه نواحیITS ، این گونه با دقت 99 درصد C.tenera تعیین گردید. نتایج حاصل از بلاست گونه جمع آوری شده از منطقه اردبیل، شباهت 98 درصدی با دو گونه C.flexuosa  و C.pratensis را نشان داد اما در بلاست جداگانه نواحیITS1 و ITS2این گونه جمع آوری شده با 99درصد شباهت C.uliginosa تعیین گردید. همچنین نتیجه بلاست گیاهان جمع آوری شده از منطقه امیرکلاه در بابل، شباهت 98 درصدی را با گونه C.flexuosa نشان داد در حالیکه  نتایج حاصل از بلاست گیاهان جمع آوری شده از محلات، مشهد و دو اکوتیپ ارسالی از موسسه ماکس پلانک آلمان (آزوروس و آکسفورد) نشان داد که گونه جمع آوری شده با احتمال 99 درصد C.hirsuta  است.

آنالیزمکانبینژنیITS1: درخت فیلوژنی حاصل از توالی یابی مکان بین ژنیITS1، سه گروه مختلف را نشان داد. گروه اول شامل گونه های C.tenera، C.pratensis، C.sultiziو گیاه جمع آوری شده از منطقه اردبیل، گروه دوم شامل گونه های C.flexuosa و گروه سوم شامل گونه هایC.hirsuta  بودند. جنس Lipidium sisymbrioides خارج از گروه  قرار گرفت. بیشترین طول شاخه مربوط به گروه C.hirsutaبا طول 036/0 و کمترین آن مربوط به C.flexuosaبا طول 0064/0 بدست آمد. طول شاخه بین سه اکوتیپ C.tenera، صفر بدست آمد. همچنین برای دو اکوتیپ همدان و Asian flexuosa طول شاخه صفر نشان داده شد که نشاندهنده فاصله ژنتیکی اندک بین این دو اکوتیپ می باشد. ناحیه ITS1 دارای 260 نوکلوتید بود که بیشترین SNP ها در این ناحیه دیده شد و در واقع بیشترین تنوع مربوط به این ناحیه مشاهده شد(شکل 3).

آنالیزمکانبینژنیITS2 : درخت فیلوژنی حاصل از توالی یابی مکان بین ژنیITS2 سه گروه مختلف را نشان داد. در این درخت، فاصله شاخه ها در گروهC.hirsuta  و گروه C.pratensisصفر بدست آمد در حالیکه در گروه C.flexuosa، مقادیر طول شاخه ها بین صفر و 0057/0 متغیر بود که احتمالا نشاندهنده تفاوتهای بیشتر ناحیه ITS2 نسبت به دو گروه دیگر باشد. دلیل صفر بودن طول شاخه ها در داخل تاکساهای گروه کاردامینه هیرسوتا را می توان به تعداد کم SNP (جدول 3) در این ناحیه نسبت داد بطوریکه در ناحیه ITS2در این نمونه ها، فقط دو SNP مشاهده گردید.  بیشترین فاصله مربوط به گروه C.hirsuta  به میزان 045/0 بدست آمد و جنس L. sisymbrioides خارج ازگروه قرار گرفت (شکل4).

 

 

شکل3- درخت فیلوژنتیک به روشNeighbor-joining مبتنی بر همردیفی توالی  ITS1و به کمک نرم افزار MEGA7از مقایسه توالی نمونه های کاردامینه جمع آوری شده در ایران و توالی های موجود در NCBI، ترسیم شد .اعداد روی هر گروه نشان دهنده ضریب Bootstrapping بر پایه 1000 تکرار می باشد.

 

بلاست توالی کامل ناحیه ITS، با توالی گونه های دیگر کاردامینه نظیر C.pratensis و C.flexuosa همردیف شد و همچنین نزدیکی دو گونه C.tenera وC.pratensisنشان داده شد (شکل5).

 

 

شکل4- درخت فیلوژنتیک به روشNeighbor-joining مبتنی بر همردیفی توالی ناحیه  ITS2و به کمک نرم افزار MEGA7 از مقایسه توالی نمونه های کاردامینه جمع آوری شده در ایران و توالی های موجود در NCBI ترسیم شد .اعداد روی هر گروه نشان دهنده ضریب Bootstrapping بر پایه 1000 تکرارمی باشد.

 

 

شکل5- درخت فیلوژنتیک به روش  Neighbor-joining مبتنی بر همردیفی توالی ITS1, ITS2 و ناحیه 5.8S و به کمک نرم افزار MEGA7 از مقایسه توالی نمونه های کاردامینه جمع آوری شده در ایران و توالی های موجود در NCBI ترسیم شد. اعداد روی هر گروه نشان دهنده ضریب Bootstrapping بر پایه 1000 تکرارمی باشد.


بحث و نتیجه گیری

تاکنون تحقیقات متعددی به لحاظ مولکولی بر روی گونه های مختلف جنس کاردامینه انجام شده است(26، 20، 15، 14، 12،13، 11). این جنس با بیش از 200 گونه، جزء یکی از بزرگترین خانواده های گیاهی محسوب می شود (24). علاوه بر تنوع پلوئیدی گزارش شده در این جنس، برخی از گروه های مختلف در آن براحتی با یکدیگر تلاقی می یابند.  بدلیل همین تلاقی های درون گروهی و تنوع بالای پلوئیدی، شناسایی برخی از گونه های آن بدشواری صورت می گیرد(24). از طرفی بدلیل همین تنوع و پیچیدگی، بررسی های مولکولی و یافتن روابط تکاملی گونه ها، بسیار مفید و جالب می باشد. در ایران فقط 7 گونه از این جنس گزارش شده است(5) و تاکنون هیچ بررسی مولکولی بر روی آنها انجام نشده است. نتایج این تحقیق بر روی گونه های جمع آوری شده، نشان داد که ITS می تواند به عنوان یک نشانگر قدرتمند در شناسایی گونه های مختلف کاردامینه بخوبی عمل کند. به عنوان مثال در تحقیقاتی که یوسف وند و همکاران (9) در جنگل نور برای شناسایی تنوع گیاهی منطقه انجام دادند، 4 گونه کاردامینه گزارش شد که یکی از گونه های شناسایی شده C.tenera بود که در این بررسی با استفاده از بلاست نواحیITS1 و ITS2 با 99 درصد شباهت، این گونه مورد تایید قرار گرفت. البته بلاست توالی کامل ناحیه ITS، با توالی گونه های دیگر کاردامینه نظیر C.pratensis و C.flexuosa همردیف شد که می تواند بیانگر پیچیدگیهای شناسایی مولکولی در جنس های پلی پلوئید بعلت نسخه های تکراری و متعدد ITS باشد(11،20). نتایج درخت فیلوژنی همچنین تایید کننده نزدیکی دو گونه C.tenera, C.pratensisبود (شکل5).

در تحقیقاتی که توسط قهرمانی نژاد و همکاران (21) در پنج تالاب بابل انجام شد، گونه گیاهی جمع آوری شده این جنس، گونه C.hirsuta معرفی شد در حالیکه نتیجه بدست آمده از توالی یابی گیاه جمع آوری شده از تالاب امیرکلاه در منطقه بابل در این تحقیق، C.flexuosa تعیین گردید. بالا بودن درصد شباهت در بلاست (95 درصد) و مشخصات ظاهری آن شامل داشتن ساقه موج دار، تعداد  پرچم (شش)، نداشتن کرک بر روی برگ ها، تعداد زیاد شاخه فرعی و داشتن کرک بر روی ساقه از صفات بارز این گونه است که در شناسایی آن درنظرگرفته شد (27). از لحاظ سطح پلوییدی گونهC.hirsuta  دیپلوئید است در حالیکه C.flexuosaگونه ای تتراپلوئید می باشد. از لحاظ تکاملی این گونه در نتیجه تلاقی C. hirsuta x C. caldeirar، C. hirsuta x C. impatiens و C.hirsuta x C.parvifloraبوجود آمده است (19).

درخت فیلوژنی گونه جمع آوری شده از همدان نشان داد این گونه در یک گروه مجزا از  C. hirsuta قرار گرفته و با گونه آسیایی خود، شباهت و قرابت بیشتری دارد. نتیجه همردیفی توالی آن، شباهت99 درصدی با گونه C.flexuosa را نشان داد که از لحاظ مورفولوژیکی نیز این شباهت تایید گردید. همچنین این گونه کاردامینه در کنار گونه های مشابه در درخت فیلوژنتیکی قرار گرفت. چون این گیاه از گلخانه دانشگاه بوعلی سینا جمع آوری شده بود، بررسی ها نشان داد که احتمالا از طریق خاک گلدان از ناحیه شمال به همدان انتقال یافته است.  در واقع رویشگاه طبیعی آن، نواحی مرطوب و خاکهای توربی در حاشیه مزارع برنج یا تالاب ها می باشد (27). گیاهانی که در این تحقیق از مناطق تنکابن، بابل و حاشیه جنگل نور جمع آوری شدند، کاملا مشابه این گیاه بودند. با اینکه در گزارش نقی نژاد و قهرمان(27) به حضور این گیاه در مناطق مختلف هیرکانی اشاره شده است اما در تحقیقات انجام شده در مورد فلور مناطق ناحیه شمال و شمال غرب، نامی از این گیاه ذکر نشده است (7،8،9،27، 6، 4، 3، 2، 1).

در بررسی نمونه های C.hirsuta از بذرهای دو اکوتیپ مشخص از موسسه ماکس پلانک نیز بعنوان شاهد استفاده شد. توالی گیاهان جمع آوری شده از گلخانه های مشهد و محلات با توالی این گیاهان مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج هر سه درخت فیلوژنی از نواحی مختلفITS، نتایج یکسانی را نشان داد و هر چهار نمونه با طول شاخه صفر در یک گروه قرار گرفتند. از طرفی با در نظرگرفتن تعداد SNP، دو نمونه مشهد و محلات قرابت بیشتری را در درخت فیلوژنی نشان دادند. این نمونه ها هرچند از نظر مورفولوژیکی شباهت بالایی با C.flexuosa نشان دادند ولی در هر سه درخت فیلوژنی، بصورت دو گروه کاملا مجزا قرار گرفتند که تایید کننده تفاوت بارز مولکولی بین این دو گونه می باشد. مقایسه تفاوت موقعیتSNP در این دو گونه نشان می دهد که بر خلاف C.hirsutaکه اکثر تفاوتها در ناحیه اول ITS است، در گونه C.flexuosa تقریبا در هر دو ناحیهITS1 و ITS2به یک میزان مشاهده می شود که نشان از الگوی متفاوت ژنی این دو گونه است و البته با توجه به تتراپلوئیدی بودن C.flexuosa این تفاوتها دور از انتظار نمی باشد.

در بررسی فلور دامنه های شمالی و شرقی سبلان که بوسیله شریفی و همکاران(4) صورت گرفت دو گونه C.hirsuta و C.uliginosa  شناسایی شد. در این بررسی نیز گیاه کاردامینه از همین منطقه جمع آوری و ناحیه ITS آن توالی یابی شد. نتایج حاصل از توالی یابی و بلاست ITS1 و  ITS2نشان داد که با احتمال 99 درصد این گیاه با گونه های C.uliginosa  وC.pratensis  و C.schultzi و با احتمال 97 درصد با گونه C.flexuosa vucherشباهت دارد ولی در درخت فیلوژنتیکی حاصل ازITS کامل، در کنار C.uliginosa قرار گرفت. به لحاظ ویژگی های مورفولوژیکی، این گیاه شباهتی با گونه C.flexuosa نشان نمی دهد از طرفی گونه C.pratensisدارای الگوی پیچیده ای از تنوع مورفولوژیکی و کروموزومی شامل دیپلوئیدی و سطوح مختلف پلی پلوئیدی دیگر(16 تا 96 کروموزومی) است. همچنین این گونه تاکنون در ایران گزارش نشده است ولی بطور وسیعی در اروپا، شمال افریقا، امریکای شمالی و آسیا گسترده شده است (26). در نتیجه با توجه به نتیجه توالی یابی و درخت فیلوژنی، به احتمال زیاد این گونه C.uliginosa می باشد که با گزارش فلور منطقه سبلان شرقی همخوانی دارد. با اینحال صحت این موضوع نیاز به بررسی های مورفولوژیکی و مولکولی دقیق تری دارد.

 در مجموع، این تحقیق به خوبی نشان داد که ITS می تواند بعنوان یک نشانگر مولکولی مناسب در شناسایی جنس و گونه در گیاهان کاردامینه، کارایی بالایی داشته باشد. از آنجا که ناحیه ITS گونه های زیادی از کاردامینه، تعیین توالی شده و در NCBI ثبت گردیده است، همین امر باعث افزایش کارایی این نشانگر شده است.

  1. خدادادی، ص.، سعیدی، م.س. و نقی نژاد، ع.ر. (1388) بررسی فلور و زیستگاه های تالاب حفاظت شده استیل (آستارا) و محیط اطراف آن، شمال غرب ایران. رستنیها، جلد 10 شماره 1 صفحات 1-19
  2. دیناروند،م.، اجتهادی ، ح.، جنگجو، م. و اندرزیان ، ب. (1394)  معرفی فلور، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی گیاهان منطقه حفاظت شده شیمبار )استان خوزستان .(زیست شناسی گیاهی ایران، شماره 23 صفحه 1-14
  3. روانبخش، م. و امینی، ط. (1391) بررسی فلور، پراکنش جغرافیایی و ساختار اکولوژیکی ذخیره گاه جنگلی گیسوم تالش. مجله زیست شناسی ایران جلد 25 شماره1 صفحات 21-31
  4. شریفی ، ج.، جلیلی، ع.، قاسماف، ش.، نقی نژاد، ع.ر.  و عظیمی، ف.( 1391) مطعم بررسی فلوریستیک، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی گیاهان اراضی ماندابی،(wetlands) دامنه های شمالی و شرقی سبلان. تاکسونومی و بیوسیستماتیک. سال چهارم، شماره 10صفحات 41-52
  5. عباسی، ف. (1391) بررسی بیوسیستماتیکی جنس Cardamine L. در ایران از خانواده شب بو .(Brassicaceae) پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه الزهرا.
  6. محمودی، ج. (1386) بررسی تنوع گونه ای گیاهان جنگل حفاظت شده کلار آباد در سطح گروه های اکولوژیک. مجله زیست شناسی ایران جلد 20 شماره 4 صفحات 353-362
  7. نقی نژاد، ع.ر. و حسین زاده، ف. (1393) بررسی تنوع گونه های گیاهی تالاب بین المللی فریدونکنار مازندران. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 27شماره2 صفحات 320-335
  8. نقی نژاد، ع.ر، حسینی، سرجامند، م.ع. وسعیدی، م.ش. (1389) بررسی فلوریستیک جنگلهای حفاظت شده مازیبن و سی بن رامسردر طول شیب ارتفاعی ( 300 تا 2300 متر).  فصلنامة تاکسونومی و بیوسیستماتیک، شماره 5 صفحات 9-114
  9. یوسفوند، ث.، اسماعیل زاده، ا.، جلالی ، غ.ع.  و اسدی، ح. (1396) معرفی فلور، شکل زیستی و کورولوژی پوشش گیاهی روزمینی و بانک بذر خاک پارک جنگلی نور. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 30 ، شماره 1.
    1. Al-Shehbaz, I.A., Beilstein M.A. and Kellogg, E.A. (2006) Systematics and phylogeny of the Brassicaceae (Cruciferae): An overview. Plant Systematics and Evolution , 259:89-120.
    2. Angela, R., Post R.A., Krings, A., Xiang, J., Brian, R., Sosinski. and Joseph, C. (2011) Neal on the Identity of the Weedy Bittercresses (Cardamine: Brassicaceae) in United States. Nurseries: Evidence from Molecules and Morphology Weed Science, 59(1):123-135.
    3. Anthony, D.M. and Heenan, P.B. (2000) Systematic Relationships of New Zealand Endemic Brassicaceae inferred from nrDNA ITS Sequence data.Systematic Botany, 25(1): pp. 98-105.
    4. Beilstein, M.A., Al-Shehbaz, I.A., Mathews, S. and Kellogg, E.A. (2008) Brassicaceae phylogeny inferred from phytochrome A and ndhF sequence data: tribes and trichomes revisited. American Journal of Botany, 95(10): 1307-1327.
    5. Bleekera, W., Klausmeyera, S., Peintingerb M. and Dienstc, M. (2008) DNA sequences identify invasive alien Cardamine at Lake Constance.Biologicalcon Servation, 141:692-698.
    6. Carlsen, T., Bleeker, W., Hurka, H., Elven, R. and Brochmann, C. (2009) Biogeography and Phylogeny of Cardamine (Brassicaceae. Annals of the Missouri Botanical Garden, 96(2):215-236.
    7. Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C. and Song, J. (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PloS one, 5(1):e8613.
    8. Doyle, J.J. and Doyle, J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15.
    9. Doyle, J.J. (1992) Gene trees and species trees: molecular systematics as one-character taxonomy. Systematic Botany, 17: 144–163.
    10. Ellis, R.P. and Jones, B.M.G. (1969) The origin of Cardamine flexuosa with evidence from morphology and geographical distribution. National J institute of Agricultural Botany, Cambridge.Watsonia 7:92-103.
    11. Franzke, A., Pollmann, K., Bleeker, W., Kohrt, R. and Hurka, H. (1998) Molecular systematics of Cardamine and allied genera (Brassicaceae): Its and non-coding chloroplast DNA.  Folia Geobotanica, 33: 225-240.
    12. Ghahremaninejad, F., Naqinezhad, A. and Amirgholipour K,V. (2012) Plant diversity of five important wetlands of Babol Mazandaran province, Iran.  Taxonomy and Biosystematics, 13-24.
    13. Hay, A.S., Pieper, B., Cooke, E., Mandáková, T., Cartolano, M., Tattersall, A.D., Ioio, R.D., McGowan, S.J., Barkoulas, M., Galinha, C., Rast, M.I., Hofhuis, H., Then, C., Plieske, J., Gana,l M., Mott, R., Martinez-Garcia, J.F., Carine, M.A., Scotland,.R.W., Gan, X., Filatov, D.A., Lysak, M.A. and Tsiantis, M. (2014)  Cardamine hirsuta: a versatile genetic system for comparative studies. The Plant Journal, 78:1-15.
    14. Kumar, S., Stecher, G. and Tamura, K.(2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology andEvolution, 33(7):1870-4.
    15. Lihová, J., Marhold, K., Kudoh, H. and Koch, M.A. (2006) Worldwide phylogeny and biogeography of Cardamine flexuosa (Brassicaceae) and its relatives. American Journal of Botany, 93(8): 1206-1221.
    16. Sahin, F.P., Yamashita, H., Guo, Y., Terasaka, K., Kondo, T., Yamamoto, Y., Shimada, H., Fujita, M., Kawasaki, T., Sakai, E., Tanaka, T., Goda, Y. and Mizukami, H. (2007) DNA Authentication of Plantago Herb Based on Nucleotide Sequences of 18S–28S rRNA Internal Transcribed Spacer Region. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30:1265-1270.
    17. Marhold, K., J. Lihova, M., Perny. and Bleeker, w. (2004) Comparative ITS and AFLP analysis of diploid Cardamine (Brassicaceae) taxa from closely related polyploid complexes. Annals of Botany . (Oxford),93:507-520.
    18. Naqinezhad, A.R., Ghahreman, A. and Assadi, M. (2004) Some New Record Species for the Flora of Iran as Well as Ecological and Phytogeographical Notes. Journal Botany, 11(1)89-96.
    19. Woese, C.R. and Fox, G.E. (1977) Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences  USA, 74:5088-5090.