نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور

2 مدرس گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور

چکیده

در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 18 اکوتیپ پنیرک (Malva neglecta) تهیه شده از بانک ژن سازمان جنگل‌ها و مراتع مورد ارزیابی قرار گرفت. با استفاده از روش CTAB استخراج DNA صورت گرفت و با 15 نشانگر ISSR تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. آغازگر‌های ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد، 2 باند یک شکل مشاهده شد. آغازگرهای IS5 و IS6 به‌ترتیب با 12 و 11 باند بیشترین تعداد و آغازگرهای UBC807 و UBC867با 4 باند کمترین تعداد باند را نشان دادند. شاخص-های محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، نسبت چندگانه موثر (EMR) و شاخص قدرت تفکیک (RP) برای کلیه نشانگرها محاسبه گردید که با توجه به شاخص‌های محاسبه شده آغازگرهای IS5 و IS6 به عنوان بهترین آغازگرها جهت بررسی تنوع ژنتیکی پنیرک معرفی گردید. میزان شباهت ژنتیکی مشاهده شده براساس اطلاعات این نشانگرها برابر 69/0 بود. بیشترین تشابه را اکوتیپ‌ 4G با اکوتیپ ‌9G با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپ‌های 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشه‌ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد اکوتیپ‌ها را در 3 گروه قرار داد که بر اساس تجزیه به مختصات اصلی (PCo) و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) گروه‌های حاصل از تجزیه کلاستر تایید گردید بر طبق این گروهبندی واریانس بین گروه‌ها در سطح 5% معنی‌دار بود، اما براساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروه‌ها تنها 29 درصد از تنوع کل بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Genetic variabiliy of Malva neglecta ecotype using ISSR molecular markers

نویسندگان [English]

  • MEHDI NOORIAN 1
  • hooman shirvani 2

1 Department of Biology, Payame Noor University, I.R. Iran

2 Department of Agriculture, Payame Noor University, Iran

چکیده [English]

In this research, the genetic diversity of 18 malva (Malva neglecta) from the gene bank of forests and rangelands was evaluated. DNA extraction was performed using CTAB method, and genetic variation was investigated with 15 ISSR markers. All of the ISSR primers showed 99 visible bands in which four bands were similar patterns. The IS5 and IS6 primers had the most number of bands with 12 and 11 bands respectively, while UBC807 and UBC867 with two bands showed the least band numbers. The Polymorphic information content (PIC), marker index (MI), EMR and RP indices were calculated for all primers. With this point of view, IS5 and IS6 were the best primers to identify variability among these Malva. Total genetic similarity based on these primers was 69 percent. The greatest genetic similarity was between G4 with ‌G9 ecotype. The lowest genetic distance was between G1 and G9 ecotype. Cluster analysis based Jakard coefficient by UPGMA was classified all genotype to tree groups and this clustering was confirmed by principal coordinate (PCo) and analysis of molecular variance (AMOVA). Portion of between group variance was just 29 percent of total variance.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Key words: Genetic variability
  • molecular marker
  • ISSR
  • Malva

بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ­های پنیرک (Malva neglecta) با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR

عبدالمهدی نوریان1* و هومن شیروانی2

ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

تاریخ دریافت: 4/11/1396            تاریخ پذیرش: 14/7/1397

چکیده

در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 18 اکوتیپ پنیرک (Malva neglecta) تهیه شده از بانک ژن سازمان جنگل­ها و مراتع مورد ارزیابی قرار گرفت. با استفاده از روش CTAB استخراج  DNA صورت گرفت و با  15 نشانگر ISSR تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد، 2 باند یک شکل مشاهده شد. آغازگرهای IS5 و IS6 به­ترتیب با 12 و 11 باند بیشترین تعداد و آغازگرهای UBC807 و  UBC867با 4 باند کمترین تعداد باند را نشان دادند. شاخص­های محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، نسبت چندگانه موثر (EMR) و شاخص قدرت تفکیک (RP) برای کلیه نشانگرها محاسبه گردید که با توجه به شاخص­های محاسبه شده آغازگرهای IS5 و IS6 به عنوان بهترین آغازگرها جهت بررسی تنوع ژنتیکی پنیرک معرفی گردید. میزان شباهت ژنتیکی مشاهده شده براساس اطلاعات این نشانگرها برابر 69/0 بود. بیشترین تشابه را اکوتیپ 4G با اکوتیپ 9G با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپ­های 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد اکوتیپ­ها را در 3 گروه قرار داد که بر اساس تجزیه به مختصات اصلی (PCo) و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) گروه­های حاصل از تجزیه کلاستر تایید گردید بر طبق این گروهبندی واریانس بین گروه­ها در سطح 5% معنی­دار بود، اما براساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروه­ها تنها 29 درصد از تنوع کل بود.

واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، مارکر مولکولی، پنیرک، ISSR

* نویسنده مسئول، تلفن: 09184630902، پست الکترونیکی: Mehdi_Noorian@yahoo.com

مقدمه

 

کشت گیاهان دارویی و معطر، از دیرباز از جایگاه ویژه­ای در نظام­های سنتی کشاورزی ایران برخوردار بوده است و این نظام­ها از نظر ایجاد تنوع و پایداری، نقش مهمی ایفا می­کرده­اند. متاسفانه در سال­های اخیر، به دلیل جایگزین شدن گونه­های زراعی اصلاح  شده دارای عملکرد و  ارزش اقتصادی  بالا، بسیاری از این گونه­ها و ارقام بومی و محلی به فراموشی سپرده شده و از سیستم­های زراعی ایران حذف شده­اند. بنابراین بررسی وضعیت تولید گیاهان دارویی و معطر و نقش این گیاهان در ایجاد تنوع در بوم نظام­های زراعی ایران، بسیار مورد اهمیت می­باشد (15). پنیرک (Malva) از تیره Malvaceae گیاهی علفی یک ساله، دوساله یا پایا با خواص شناخته شده دارویی است. گونه Malva neglecta گیاهی علفی یکساله و دارای ساقه نیمه خوابیده به طول 40-10 سانتی­متر می­باشد (1). گونـه­هـای مختلـف پنیـرک هماننـد  Malva neglecta Wallrدر کشـــورهای مختلف دنیا کشت می­گردد یا به طور خودرو رشد می­کند (6). خـواص آنتـی اکسیدانی گونه­های مختلف پنیرک در نقاط دیگر دنیا توسـط برخـی محققین گزارش شده است (18). پنیرک منبع غنی از ویتامین­های A، B و C بوده و به عنوان یکی از گیاهان داوریی موثر در کاهش عوارض سرماخوردگی به ویژه سرفه، همچنین در التهاب­های تنفسی، مجاری ادراری و گوارشی و نیز جوش­های پوستی می­باشد. نتایج مطالعات انجام دشه بر روی خواص ضد میکروبی پنیرک حاکی از آن است که این گیاه دارای خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی علیه بسیاری از پاتوژن­های انسانی می­باشد (19).

به دلیل عوارض فراوان ناشی از استفاده از داروهای شیمیائی مصنوعی، استقبال چشمگیری از داروهای طبیعی با منشاء گیاهی شده است (12). آگاهی دقیق از تنوع ژنتیکی موجود در ژرم‌پلاسم گیاهی ضمن حفظ ذخائر ژنتیکی گیاهی، قابلیت استفاده از آن‌ها را در برنامه‌های اصلاحی تعیین می‌کند. همچنین کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی نسبی بین افراد و جمعیت‌ها و روابط خویشاوندی بین آن‌ها، امکان سازماندهی ژرم‌پلاسم و تهیه جمعیت‌های مناسب برای ترسیم نقشه‌ی ژنتیکی و مکان­یابی ژن‌ها را فراهم می‌سازد (25). بیشتر به‌نژادگران معتقدند که کمبود تنوع ژنتیکی پیشرفت‌های اصلاحی را در آینده مختل می‌کند (17). ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان برای برنامه‌های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به دو رگ مناسب از اهمیت زیادی بر خوردار است (20). تنوع ژنتیکی می‌تواند به وسیله تخمین فاصله ژنتیکی با استفاده از اطلاعات شجره یا با استفاده از نشانگرهای مولکولی شناسایی شود (22). به ‌منظور تخمین این تنوع انواع مختلفی از سیستم‌های نشانگری توسط به‌نژادگران گیاهی استفاده می‌شود که از جمله آن‌ها می‌توان به نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی شامل بیوشیمیائی و DNA اشاره کرد. نشانگرهای DNA امکان شناسایی مستقیم تنوع توالی ژنومی را در بین گیاهان فراهم می‌کنند که می‌تواند در تکمیل اطلاعات شجره‌نامه مورد استفاده قرار گیرند (21). نشانگر  ISSR یک نشانگر مبتنی بر PCR است که می­تواند تفاوت­های افراد با خویشاوند را به‌سرعت از یکدیگر جدا کند و ثابت شده است که نشانگرهای مولکولی مفیدی در مطالعات انگشت نگاری ژنومی بررسی­های فیلوژنتیکی و نشان­گذاری ژن است این تکنیک از یک آغازگر منفرد طراحی شده براساس توالی زیر ماهواره که در  '5 یا '3 با 2 تا 4  نوکلئوتید انتخابی قلاب شده است استفاده می­کند و برای طراحی آغازگر به اطلاع قبلی از ژنوم نیاز ندارد نشانگر ISSR به علت طول نسبتاً بلندتر آغازگرها و دمای اتصال بالاتر قابل اطمینان­تر از RAPD است و می­تواند بطور گسترده خصوصا برای ارزیابی ژرم پلاسم گیاهی و تنوع ژنتیکی استفاده شود (26). نشانگرهای ISSR برای آشکارسازی چندشکلی ژنتیکی بین نژادها از طریق تولید تعداد زیادی نشانگر میکروساتلایتی توزیع شده در سراسر ژنوم مفید هستند (5). تحقیقات زیادی در ارتباط با وجود تنوع ژنتیکی در بین گیاهان دارویی با استفاده از نشانگرهای مولکولی خصوصا نشانگر ISSR صورت گرفته است و نتایج حاصل این بررسی­ها بیانگر کارایی این نشانگر در مطالعه تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی می­باشد (8، 9، 14، 26). در کشور ایران تحقیقات انجام شده در زمینه اصلاح گیاهان دارویی به نسبت اهمیتی که این گیاهان در صنایع مختلف دارد، محدود می‌باشد. بنابراین انجام تحقیقات بیشتر به منظور دستیابی به ارقام اصلاح شده ضروری به نظر می‌رسد، لذا تحقیق حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی در سطح مولکولی در اکوتیپ­‌های مختلف پنیرک در جهت تلاقی نمونه­های با فواصل زیاد ژنتیکی برای دستیابی به هتروزیس و افزایش ترکیبات می­تواند مفید باشد، در نهایت می­توان از این اطلاعات نیز جهت حفاظت در محل رویشگاه نمونه­ها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم استفاده نمود.

مواد و روشها

در تحقیق انجام شده بذرهای 18 اکوتیپ از گیاه دارویی پنیرک به‎منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR از بانک ژن موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد اکوتیپ و محل دریافت یا جمع­آوری در جدول 1 نشان داده شده است.

جدول 1- مشخصات اکوتیپ­های مورد استفاده در این تحقیق

کد بانک ژن

شهرستان

استان

اکوتیپ

10534

یزد

یزد

G1

12926

گنبد

گستان

G2

14342

نهاوند

همدان

G3

15504

شاهدیه

یزد

G4

15843

تفت

یزد

G5

15922

صدوق

یزد

G6

20011

هریس

آذربایجان شرقی

G7

21113

صدوق

یزد

G8

21122

بافق

یزد

G9

21601

سمنان

سمنان

G10

22521

بندر عباس

هرمزگان

G11

22900

قشم

هرمزگان

G12

22903

میناب

هرمزگان

G13

26408

کرمان

کرمان

G14

30789

دامغان

سمنان

G15

33487

طبس

یزد

G16

34327

دهلران

ایلام

G17

34338

دهلران

ایلام

G18

 

استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (24) برای هر اکوتیپ در آزمایشگاه انجام گرفت. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل ۸/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتروفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی­مولار MgCl2، 05/0 میلی­مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد و به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت­سازی به ترتیب ۳۰  ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود (52 تا 60 درجه). همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد.  بعد از اتمام واکنش زنجیره­ای پلیمراز محصولات واکنش بر روی از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد الکتروفورز شدند. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به  DNA­های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهک­های ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ­آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایش باندها استفاده شد.

محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق فرمول  محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع باندهای هر لوکوس برای کلیه اکوتیپ­ها است (16). همچنین شاخص نشانگری (MI= Marker Index) از رابطه MI= PIC × N×B بدست آمد که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود (11). شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR= Effective multiplex ratio) از رابطه EMR= NPB × β که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد باندهای چند­شکل (NPB) بدست آمد (12) و قدرت تفکیک (RP= Resolving power) از رابطه RP=∑IB محاسبه گردید. RP=∑IB در رابطه [(IB=1-[2×(0.5-Pi و Pi نسبت افراد دارای باند است (4). در پایان نیز داده­های حاصل، با استفاده از نرم افزارهای NTSYSpc 2.02e برای محاسبه ماتریس تشابه و آزمون مانتل، DARwin 6 جهت تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفه­های اصلی و GenAlEx 6.2 برای تجزیه واریانس مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

بررسی پلی­مورفیسم: با استفاده از 15 آغازگر ISSR  تنوع ژنتیکی اکوتیپ­ها مورد بررسی قرار گرفت که آغازگر­های ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد 2 باند یک شکل مشاهده شد و 97 باند چندشکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 18 اکوتیپ برابر 5/5 بود. آغازگر IS6 بیشترین تعداد باند (تعداد 12 باند) و آغازگرهای UBC807 و  UBC867کمترین تعداد باند (تعداد 4 باند) را نشان دادند. اکوتیپ 2G بیشترین باند (65 باند) و اکوتیپ 1G کمترین باند (25 باند) را در بین اکوتیپ­های مورد بررسی داشتند. شکل 1 الگوی باندی 18 اکوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر­ IS7 را نشان می­دهد.

نتایج بدست آمده برای آغازگر­های استفاده شده در جدول 2 ارائه شده است که با توجه به این جدول، میانگین درصد چند شکلی در بین اکوتیپ­های مورد بررسی برابر 12/98 بود، کمترین درصد چند شکلی را آغازگرهای IS11 (5/87%) و IS5 (91/91%) داشتند و دیگر آغازگرها با داشتن 100% چند شکلی دارای بیشترین میزان بودند. میانگین محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) در آغازگر­های مورد بررسی برابر 336/0 بود که بیشترین میزان محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) مربوط به آغازگرهای IS3، UBC807، UBC847 و UBC848 به ترتیب با 453/0، 420/،0 405/0 و 40/0 اختصاص داشت، بنابراین این آغازگرها بهتر از سایر آغازگر­ها بر اساس شاخص PIC توانستند فاصله ژنتیکی اکوتیپ­ها را مشخص کنند. آغازگر IS10، IS11 و IS5­  با کمترین میزان PIC (به ترتیب 318/0، 330/0 و 338/0) توانایی خوبی در جداسازی اکوتیپ­ها نداشتند. در مورد شاخص نشانگر (MI) آغازگرهای IS6 و IS5 به ترتیب بیشترین میزان و آغازگرهایUBC807  و UBC869 دارای کمترین میزان شاخص نشانگر بودند. برای شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR) آغازگرهای IS6 و IS5 دارای بیشترین و آغازگرUBC807  کمترین میزان را به خود اختصاص داد. در شاخص تفکیک (RP) نیز ملاحظه شد که آغازگرهای IS5 و IS6 دارای بیشترین میزان و آغازگرهای IS9 و IS14­ دارای کمترین میزان بودند. آغازگر­های IS9، IS10، IS11 و IS14 با کمترین میزان توانایی خوبی در جداسازی اکوتیپ­ها نداشتند و دیگر آغازگر­ها در حد متوسطی بودند.

ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی اکوتیپ­های مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 57/0 تا 84/0 متغیر بود (جدول 3)، میانگین تشابه بین اکوتیپ­ها برابر 69/0 بود که بالا بودن تشابه ژنتیکی نشان­دهنده تنوع­ژنتیکی کم در بین اکوتیپ­های پنیرک بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. بیشترین تشابه را اکوتیپ­ 4G با اکوتیپ ­9G  با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه و بیشترین فاصله مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپ­های 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود.

تجزیه خوشه­ای: تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای اکوتیپ­ها در شکل 2 ارائه شده است. همچنانکه ملاحظه می­گردد اکوتیپ­ها در سه گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل اکوتیپ­های 1G، 2G، 3G، 4G، 7G، 6G و10G بود، که متوسط ضریب تشابه برای این سه اکوتیپ 65/0 بدست آمد. گروه دوم شامل چهار اکوتیپ 5G، 8G، 98G و 18G بود. برای این گروه متوسط ضریب تشابه این گروه 48/0 بود. گروه سوم شامل اکوتیپ­های 11G، 12G، 13G، 14G، 15G، 16G و 17G بود که میانگین تشابه برای این گروه 58/0 بود. بنابراین اکوتیپ­های گروه اول دارای بیشترین تشابه و اکوتیپ­های گروه دوم دارای کمترین تشابه بودند.

 

L   1    2    3     4    5    6    7   8    9   10   11   12   13  14  15   16  17 18 

 

bp1500

 

bp1000

 

bp500

 

شکل 1- الگوی باندی 18 اکوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر IS7، اولین چاهک از سمت چپ   DNA Leader با سایز 100 تا bp 1500 می­باشد.

جدول 2- آغازگر­های ISSR مورد استفاده و شاخص­های محاسبه شده

قدرت تفکیک

نسبت چندگانه موثر

شاخص نشانگری

محتوی اطلاعات چند شکلی

درصد چند شکلی

تعداد مکان­های چند شکل

تعداد مکان­های تکثیر شده

توالی آغازگر

نام آغازگر

823/4

4

813/1

453/0

100

4

4

5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3'

UBC807

705/8

091/9

384/3

338/0

91/90

10

11

5'- AGAGAGAGAGAGAGAGC-3'

IS5

294/9

12

551/4

379/0

100

12

12

5'-ACACACACACACACACC-3'

IS6

529/3

5

103/2

421/0

100

5

5

5' GTGTGTGTGTGTGTGTC 3'

IS7

941/2

6

076/2

346/0

100

6

6

5'- CTCTCTCTCTCTCTCTG-3'

IS9

647/5

7

228/2

318/0

100

7

7

5'- GAGAGAGAGAGAGAGARc-3'

IS10

411/7

125/6

313/2

330/0

5/87

7

8

5'-ACACACACACACACACC-3'

IS11

529/3

6

435/2

406/0

100

6

6

5'-AGAGAGAGAGAGAGAGCC-3'

UBC847

529/5

5

937/1

388/0

100

5

5

5'-CCGCCGCCGCCGCCGCCG-3'

UBC856

588/2

5

840/1

368/0

100

5

5

5'- GACAGACAGACAGACA-3'

IS14

4

6

048/2

341/0

100

6

6

5'- GGATGGATGGATGGAT-3'

IS15

882/3

7

726/2

390/0

100

7

7

5'-DBDACACACACACACACA-3'

IS16

35/5

8

62/2

33/0

100

8

8

5'-ACACACACACACACACYG-3'

UBC857

36/3

5

2

40/0

100

5

5

5'-CACACACACACACAARG-3'

UBC848

78/4

4

42/1

36/0

100

4

4

5'-GTTGTTGTTGTTGTTGTT-3'

UBC869

55/5

34/6

44/1

36/0

12/98

46/6

6/6

میانگین

 

Y=(C,T), V=(A,C,G), D=(A,G,T), B=(C,G,T)

جدول 3- ماتریس تشابه ژنوتیپ­ها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب دایس

اکوتیپ

G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

G13

G14

G15

G16

G17

G18

G1

1

                                 

G2

73/0

1

                               

G3

75/0

79/0

1

                             

G4

78/0

86/0

68/0

1

                           

G5

70/0

75/0

60/0

79/0

1

                         

G6

68/0

67/0

78/0

68/0

63/0

1

                       

G7

70/0

68/0

73/0

67/0

59/0

73/0

1

                     

G8

65/0

70/0

71/0

65/0

73/0

71/0

67/0

1

                   

G9

57/0

68/0

67/0

63/0

68/0

67/0

71/0

70/0

1

                 

G10

78/0

79/0

71/0

84/0

70/0

75/0

70/0

65/0

60/0

1

               

G11

68/0

79/0

65/0

75/0

67/0

65/0

63/0

68/0

60/0

75/0

1

             

G12

70/0

78/0

73/0

76/0

75/0

73/0

68/0

70/0

65/0

76/0

76/0

1

           

G13

65/0

70/0

62/0

75/0

67/0

65/0

60/0

68/0

67/0

68/0

71/0

76/0

1

         

G14

62/0

73/0

62/0

71/0

70/0

62/0

67/0

62/0

63/0

75/0

68/0

70/0

75/0

1

       

G15

63/0

71/0

70/0

67/0

59/0

57/0

68/0

57/0

59/0

70/0

70/0

68/0

67/0

70/0

1

     

G16

65/0

70/0

71/0

71/0

67/0

71/0

63/0

62/0

67/0

75/0

78/0

79/0

75/0

71/0

79/0

1

   

G17

67/0

73/0

68/0

78/0

63/0

68/0

60/0

59/0

63/0

75/0

78/0

70/0

75/0

71/0

70/0

81/0

1

 

G18

67/0

75/0

63/0

79/0

75/0

67/0

68/0

76/0

68/0

76/0

76/0

68/0

70/0

67/0

71/0

70/0

70/0

1

 

 

شکل 2- نمودار حاصل تجزیه از خوشه­ای داده­های نشانگر ISSR برای اکوتیپ­­های مورد مطالعه با استفاده از ضریب دایس و روش UPGMA، اعداد روی نمودار (Node) بیانگر شباهت و نزدیکی اکوتیپ­ها می­باشد


تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس داده­های حاصل از آغازگر­های مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای اکوتیپ­ها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 51/24 و 27/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 78/43 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی اکوتیپ­ها رسم گردید (شکل 3)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای تا حدودی مطابقت داشت و اکوتیپ­ها به سه گروه تقسیم شدند.

تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروه­بندی تجزیه خوشه­ای انجام شد (جدول 5)، که اکوتیپ­ها در داخل 3 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین گروه­ها در سطح 5% اختلاف معنی­دار وجود داشت به عبارت دیگر گروه­بندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج بدست آمده نشان داد که در میان گروه­ها تنوع بیشتر از بین گروه­ها می­باشد. بر این اساس تنوع در درون گروه­ها برابر 71% و در بین گروه­ها تنوع برابر 29% مشاهده گردید.

 

 

 

شکل 3- بای پلات اکوتیپ­ها برای نشانگر ISSR بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم

 

 

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر ISSR

PhiPT

درصد از واریانس

واریانس برآورد شده

میانگین مربعات

مجموع مربعات

درجه آزادی

منابع تغییر

S.O.V

Var%

Est. Var.

MS

SS

Df

29/0*

29%

002/5

90/32

70/98

2

بین گروه

 

71%

109/12

10/12

42/157

15

درون گروه

 

100%

111/17

 

12/266

17

کل

**  اختلاف در سطح 1% معنی­دار

               


بحث و نتیجه گیری

در مطالعات بسیاری گزارش شده که نشانگر ISSR به دلیل خصوصیاتی نظیر تکرار پذیری بالا، عدم نیاز به دانستن توالی برای یافتن آغازگر و عدم نیاز به دانستن اطلاعات اولیه در مورد توالی ژنوم یکی از گزینه­های مناسب به منظور بررسی تنوع ژنتیکی می­باشد (13 و 27). در این تحقیق نیز مشخص شد که با استفاده از  این نشانگر می­توان در زمان کم، الگوی ژنتیکی را مشخص ساخت. بر اساس نتایج همانطور که مشاهده گردید تنوع قابل ملاحظه­ای در بین اکوتیپ­های پنیرک وجود داشت و چند شکلی مطلوبی بر اساس نشانگر ISSR مشاهده شد. در بررسی Celka و همکاران (7) با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR  و ISJ که بر روی 24 گونه مختلف پنیرک صورت گرفت، کارایی نشانگر مولکولی ISSR بالا گزارش گردید به نحوی که در این بررسی گونه­ها کاملا از یکدیگر تفکیک شدند. همچنین Domblides و همکاران (8) تنوع ژنتیکی 32 نمونه گیاه جعفری (متعلق به خانواده چتریان) را با استفاده از 6 آغازگر ISSR  بررسی کردند و به طور متوسط 2/10 باند پلی­مورف مشاهده کردند. آنها نشان دادند این نشانگر از کارایی بالایی برای بررسی تنوع ژنتیکی این گیاه برخوردار است.

 محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC)، یکی از شاخص­های مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف، از نظر قدرت تمایز آنها به شمار می­رود. مقادیر بالای این معیار، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. بنابراین، نشانگرهایی با محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) بالا برای تمایز ژنوتیپ­های خویشاوندی نزدیک مفید هستند (19) همچنین بهترین شاخص برای انتخاب آغازگر مناسب، شاخص قدرت تفکیک (RP) می­باشد، زیرا هم از تعداد افراد دارای باند و هم تعداد آلل تاثیرپذیری دارد (4). در حالت کلی و بر اساس شاخص­های محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) و شاخص قدرت تفکیک (RP) مناسب­ترین آغازگر­ها برای بررسی­های گونه پنیرک، آغازگرهای UBC807، IS5، IS6، IS7 و IS12 تعیین شد، و پیشنهاد می­گردد برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر اکوتیپ­­های پنیرک در تحقیقات بعدی استفاده گردند. Ma yanming و همکاران (14) در مطالعه‌ای جهت بررسی تنوع ژنتیکی 24 توده‌ی زیره سبز از 38  آغازگر ISSR استفاده کردند که در این میان 12 آغازگر تولید قطعات چندشکل نمودند. میزان چندشکلی در این تحقیق برابر با 33/0 بود و بر اساس شاخص PIC بهترین آغازگرها را معرفی نمودند. در این مطالعه میانگین تشابه بین اکوتیپ­­ها برابر 69/0 بود که بالا  بودن تشابه ژنتیکی نشان­دهنده تنوع­ژنتیکی کم در بین اکوتیپ­­های پنیرک بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. داروین (DARwin) نرم افزاری برای آنالیز تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی است. این نرم افزار بیشتر روی توصیف ساختار تنوع بر مبنای روش­های مبتنی بر فاصله تأکید دارد. در این برنامه تعدادی Node وجود دارد که به ترتیب شباهت و نزدیکی اکوتیپ­ها را نشان می­دهد. Hammad (10) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی جمعیت های پنیرک بااستفاده از نشانگر مولکولی ISSR و آیزوزایم ها بر اساس اطلاعات حاصل از این نشانگرها اقدام به گروه بندی جمعیت های مورد مطالعه با استفاده از ضریب دایس و روش UPGMA نمودند. بر اساس تجزیه خوشه­ای اکوتیپ­­ها در سه گروه قرار گرفتند، که پراکنش اکوتیپ­ها بر اساس تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. که ممکن است علت این موضوع جدایی منشاء جغرافیایی ژنوتیپ­ها یا ایجاد و تجمع جهش­های ژنتیکی مجزا در سطح ژنوم باشد که باعث ایجاد تنوع در آنها  نسبت به یکدیگر شده است. در حالی که در تعداد دیگری از ژنوتیپ­ها چنین تطابقی دیده نشده که این امر می­تواند به دلیل منشاء مشترک، مهاجرت و انتقال باشد. نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای با دیاگرام حاصل از پراکنش اکوتیپ­­ها بر اساس مقدار مختصات اول و دوم حاصل از تجزیه به مختصات اصلی مطابقت نشان داد. در نهایت بر اساس تجزیه واریانس مولکولی گروه­های حاصل از تجزیه خوشه­ای مشاهده شد. Celka و همکاران (7) در بررسی روابط ژنتیکی میان 24 گونه مختلف پنیرک با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR  و ISJ ، از تجزیه واریانس مولکولی به منظور بررسی سهم تنوع در درون و بین گونه ها استفاده نمودند. همچنین Gajera  و همکاران (9) تنوع ژنتیکی 20 ژنوتیپ گونه گیاهی در معرض خطر Mangifera indica را با استفاده از 21 آغازگر ISSR بررسی کردند و با استفاده از داده های مولکولی اقدام به گروهبندی ژنوتیپ­ها نمودند. طبق بررسی های انجام شده ، تنوع ژنتیکی بین اکوتیپ­های پنیرک مورد مطالعه وجود داشت و از آنجا که این اکوتیپ­های نماینده توده های پنیرک موجود در بانک ژن می باشند لذا در بین کل اکوتیپ­های موجود در بانک ژن نیز تنوع قابل ملاحظه ای وجود دارد. بنابراین این مطلب را که در اکثر مطالعات مربوط به ارزشیابی تنوع درون گونه ای، تنوعی اندک بین اکوتیپ­های یافته­اند و یا گاهی هیچگونه تنوعی وجود نداشته است، نمی توان به عنوان یک پیش فرض برای هرگونه در نظر گرفت. در مجموع در این مطالعه و بر اساس آغازگر­های مورد استفاده و همچنین با توجه به ماتریس تشابه، تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی کمترین تشابه و بیشترین فاصله مربوط به اکوتیپ 1G (مربوط به یزد) با اکوتیپ­های 12G (مربوط به هرمزگان) بود که پیشنهاد می­گردد از این اکوتیپ­ها که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگر­های مورد استفاده را داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامه­های اصلاحی استفاده شود. همچنین با توجه به تنوع ژنتیکی پایین درون ژنوتیپ­های پنیرک کشور که از بانک ژن جنگلها و مراتع کشور تهیه شده بود، حفاظت در محل رویشگاه نمونه­ها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روش­های تکثیر مناسب این گیاه توصیه می­شود. فرشادفر و همکاران (2، 3) در بررسی­های خود بر روی گیاهان دارویی رازیانه و مریم نخودی نتایج مشابهی را گزارش نمودند.

سپاسگزاری

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه پیام نور انجام شده است. که از این بابت از مسئولان مربوطه تشکر و قدردانی می­شـود. در ضمن کلیه حقوق مادی و معنوی آن متعلق به دانشگاه پیـام نـور می­باشد.

1- زرگری، ع.، (1387). گیاهان دارویی جلد سوم،انتشارات دانشگاه تهران، شماره 1810، صفحه 350-352

2- محسن فرشادفر، ف.، شیروانی، ه.، امجدیان، م.، قلی پور،م. 1397. مطالعه تنوع ژنتیکی اکوتیپ‌های رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، (زودآیند).

3- محسن فرشادفر، ف.، شیروانی، ه.، امجدیان، م.، نوریان، ع.م. 1397. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های گونه مریم نخودی (Teucrium polium) در غرب ایران با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، (زودآیند).

 

4- Altıntas, S., F. Toklu, S. Kafkas, B. Kilian, A. Brandolini and H. O, Zkan. (2008). Estimating Genetic Diversity in Durum and Bread Wheat Cultivars from Turkey Using AFLP and SAMPL Markers. Plant Breeding 127: 9-14.

5- Awasti, A K., Nagaraja, GM., Naik, Gv., Kanginakludru, S., Tangavelu, K. and Nagaraja, J. (2004) Genetic diversity and relationships in mulbert (genus Mours) as revealed by RAPD and ISSR marker assays Bio Medical Gentral. Genetics 5: 1471- 2156.

6- Azimova, S.S. & Glushenkova A.I. (Eds.), (2012), Lipids, Lipophilic Components and Essential Oils from Plant Sources. Springer, Tashkent, Republic of Uzbekistan, 609-633.

7- Celka, Z.,  Szczecińska, M. and Sawicki, J. (2010). Genetic relationships between some of Malva species as determined with ISSR and ISJ markers. Biodiversity Research and Conservation. 19(1): 23–32.  

8- Domblides, A. S., E. A.Domblides., V. A. Kharchenko. and G. A. Potekhin. (2010). Study of Genetic Variation Among Parsley (Petroselinum Crispum (Mill.) Nym.) Samples Using RAPD and ISSR Markers.  Moscow University Biological Sciences Bulletin., 65(4): 142-154.

9- Gajera, H. P.,  R. S. Tomar., S. V. Patel., R. R. Viradia. and B. A. Golakiya. (2011). Comparison of RAPD and ISSR markers for genetic diversity analysis among different endangered Mangifera indica genotypes of Indian Gir forest region. J. Plant Biochem. Biotechnol., 10: 1000-1007.

10- Hammad, I. (2009). Genetic Variation among Hibiscus Rosa-sinensis (Malvaceae) of Different Flower Colors Using Issr and Isozymes, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(1): 113-125,

11- Hou, Y., Z. Yan and Y. Wei. (2005). Genetic diversity in barely from west China based on RAPD and ISSR analysis Barely. Genetics Newsletter 35:9-22.

12- Kumar J, Kumar Gupta P (2008). Molecular approaches for improvement of medicinal and aromatic plants. Plant Biotechnology Reporats Journal 2: 93-112.

13- Kumar, M., G. P. Mishra, R. Singh, J. Kumar, P. K. Naik and Sh. B. Singh.( 2009). Correspondence of ISSR and RAPD Markers for Comparative Analysis of Genetic Diversity among Different Apricot Genotypes from Cold Arid Deserts of Trans-Himalayas. Physiology and Molecular Biology of Plants 15(3): 225-236.

14- Ma yanming, L., H. Wang. and F. Han. (2008). Evaleuation of cumin germplasm by ISSR markers. Xinjiang Agriculture Science., No 45.

15- Mardi, M., A. Taleei, and M. Omidi. (2003). Study on genetic variation and yield Components Indies type chickpea. Iranian Journal of Agricultural Science 34: 345-351.

16- Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey and A. Rafalski. (1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.

17- Rajaram, S. (2010). International wheat breeding. The Proceeding of 11th Iranian Crop Science Congress: Crop Production, Pp: 225-238.

18- Samavati, V. & Manoochehrizade, A., (2013), Polysaccharide extraction from Malva sylvestris and its anti -oxidant activity.International Journal of Biological Macromolecules 60, 427–436.

19- Shale, TL., Stirk, W.A., and Staden, J.V. (2005). Variation in antibacterial and anti-inflammatory activity of different growth forms of Malva parviflora and evidence for synergism of the anti-inflammatory compounds, Journal of Ethnopharmacology., 96: 325–330.

20- Singh, S.K. (2003). Cluster analysis for heterosis in wheat (Triticum aestivum L.). Indian Journal of Genetics. 63(3):249-250.

21- Solimani, V.D., Baum, B. R., and Jahason, D.A. (2002). AFLP and pedigree based genetic diversity estimates cultivars of durum wheat (Triticum turgidum L.). Theoretical and Applied Genetics, 104:350-357.

22- Stachel, M., Lelley, T., Grausgruber, H., and Vollmann, J. (2000). Application of microsatellites in wheat (Triticum aestivum L.) for studying genetic differentiation caused by selection for adaptation and use. Theoretical and Applied Genetics, 100:242–248.

23- Thimmappaiah W, Santhosh G, Shobha D, and Melwyn, GS. (2008). Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Sciatica Horticulture 118: 1-7.

24- Torres, A.M., NF. Weeden and A. Martin. (1993). Linkage among isozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba. Theoretical and Applied Genetics 85: 935–945.

25- Virk, P. S., Ford-Lloyd, B. V., Jackson, M.T., and Newbury, H. J. (1995). Use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections. Heredity, 74: 170-179.

26- Zahid, N. Y., Abbasi, N. A., Hafiz, I. A. and Ahmad, Z. (2009) Genetic diversity of indigenous fennel, (Foeniculum vulgare. Germplasm in Pakistan assessed By RAPD markers. Pakistan Journal of Botany 41(4): 1759-1767.

27- Zietkiewicz, E., Rafalski, A, and Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase reaction amplification. Genomics 20: 176-183.