نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی

2 هیات علمی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی

3 هیات علمی دانشگاه شهرکرد

چکیده

تولید نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) در ایران طی دهه 1370 افزایش چشمگیری داشت، اما به دلایلی همچون: قدیمی بودن نخلستان‌ها، استفاده از روش‌های سنتی کاشت پاچوش‌های مادری و برداشت خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد. پژوهش حاضر، در راستای بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما، به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاٌ تصادفی، بر روی ریز‌نمونه رأس ساقه‌ی خرما رقم استعمران، در محیط کشت‌ پایه موراشیگ و اسکوگ حاوی تنظیم‌کننده‌های رشد تیدیازورون (TDZ) و 2,4.دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4.D)، هر یک با دو غلظت (5 و 10 میلی گرم بر لیتر) و در 3 تکرار، انجام شد. در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، جهت جنین‌زایی مشاهده شد. حداکثر القاء جنین و تمایززایی به جنین کوتیلدونی، در محیط کشت MS و با کاهش مقدار منبع کربن به (gl-1) 20، در تیمار تنظیم‌کننده‌ی رشد (mgl-1) 10 2,4.D همراه با (mgl-1) 5 TDZ رخ داد. در پژوهش حاضر مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به دو هفته کاهش یافت و در هفته چهارم جنین‌های سوماتیکی متمایز شدند. نتایج شاهدی بر بهینه سازی دستورالعمل ریزازدیادی رقم استعمران در جهت کاهش مدت زمان جنین‌زایی و با استفاده از حداقل مصرف تنظیم‌کنندهای رشد 2,4.D و TDZ بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The optimized protocol for somatic embryogenesis in date palm (Phoenix dactylifera L.) CV. Estameran

نویسندگان [English]

  • elahe Baharan 1
  • Payam Pour Mohammadi 2
  • Ehsan Shahbazi 3

1 Plant Production and Genetics Dept., Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahwaz, I.R. of Iran

2 Plant Production and Genetics Dept., Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahwaz, I.R. of Iran

3 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Shahre-kord University, Shahre-kord, I.R. of Iran

چکیده [English]

Date palm (Phoenix dactylifera L.) production was increased impressively in Iran during 1990 decade. But for some reasons, there are possibility of withdrawing from the world market cycle, such as old groves and use of traditional methods of planting and harvest dates. This study, in order to localize commercial tissue culture propagation dates, on shoot tip explants in Murashige and Skoog (1962) culture medium, supplemented with plant growth regulators including of thidiazuron (TDZ) and 2.4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4.D), at 2 concentrations (5 and 10 mgl-1), via factorial completely randomized design in 3 replicates. In treatment with 5 (mgl-1) TDZ and 2,4-D 10 (mgl-1) were observed the highest levels of callogenesis with high-quality for embryogenesis. Maximum embryo induction and differentiation to somatic embryos was occurred in MS medium with decreased carbon source to 20 mgl-1 in 10 (mgl-1) 2,4-D with 5 (mgl-1) TDZ, treatment. In this study, the time of induction up to formation of callus, was reduced in two weeks and in the fourth week were distinct somatic embryos. Results, was evidence of optimization of the micropropagation instructions in date palm, in order to reduce the duration of embryogenesity and with minimum consumption of 2,4-D and TDZ plant growth regulators.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Date palm
  • Shoot tip
  • Somatic embryogenesis
  • Callugenesis

بهینه سازی دستورالعمل رویان­زایی رویشی در خرما (Phoenix dactylifera L.) در رقم استعمران

الهه بهاران1، پیام پورمحمدی1* و احسان شهبازی2

1 اهواز، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات 

2 شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 5/7/94                 تاریخ پذیرش: 27/12/95 

چکیده 

تولید نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) در ایران طی دهه 1370 افزایش چشمگیری داشت، اما به دلایلی همانند قدیمی بودن نخلستان­ها، استفاده از روش­های سنتی کاشت پاجوش­های مادری و برداشت خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد. این پژوهش، در راستای بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما، به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی، بر روی ریز­نمونه رأس ساقه­ خرما رقم استعمران در محیط کشت­ پایه موراشیگ و اسکوگ حاوی تنظیم­کننده­های رشد تیدیازورون (TDZ) و 2,4.دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4.D)، هر یک با دو غلظت (5 و 10 میلی گرم بر لیتر) در 3 تکرار انجام شد. در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5  TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، برای جنین­زایی مشاهده شد. حداکثر القاء جنین و تمایززایی به جنین کوتیلدونی، در محیط کشت MS و با کاهش مقدار منبع کربن به (gl-1) 20، در تیمار تنظیم­کننده­ رشد (mgl-1) 10 2,4.D  همراه با (mgl-1) 5 TDZ رخ داد. در این پژوهش مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به دو هفته کاهش یافت و در هفته چهارم جنین­های سوماتیکی متمایز شدند. نتایج شاهدی بر بهینه سازی دستورالعمل ریزازدیادی خرما در جهت کاهش مدت زمان جنین­زایی و با استفاده از حداقل مصرف تنظیم­کنندهای رشد 2,4.D و TDZ بود که منجر به کاهش تنوع سوماکلونال شد.

واژه­های کلیدی: نخل خرما، مریستم رأس ساقه، رویان­زایی رویشی، کالوس­زایی. 

* نویسنده­ مسئول، تلفن: 06136522001 پست الکترونیکی: Mohammadi@ramin.ac.ir 

مقدمه 

 

گونة نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) درختی همیشه سبز و تک­لپه، سازگار با شرایط آب و هوایی خشک و نیمه خشک است. 53% از خاک ایران استعداد کشت خرما را دارد. طی دهه 1370 تولید و صادرات خرما افزایش چشمگیری داشت و ایران از جمله تولیدکنندگان (بعد از مصر در مقام دوم) و صادرکنندگان مهم جهانی خرما بشمار می­آمد، اما به دلایلی همانند قدیمی بودن نخلستان­ها، استفاده از روش­های سنتی کاشت پاجوش­های مادری و برداشت خرما، کمبود امکانات حمل و نقل و نبود صنایع فراوری مناسب خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد (2). یک راه قابل دسترس برای حل این معضل، بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما می­باشد. استفاده از روش کشت بافت برای تکثیر و تولید انبوه نهال­های یکسان و محافظت از ژرم­پلاسم خرما مورد توجه قرار گرفته است. بدین جهت محققانی ازجمله Tisserat و Damason (1980)،  Zaid و Tisserat (1983)، Mater (1983)، Ross و همکاران (1995)، مطالعه و بررسی در این زمینه را آغاز کرده و تولید کالوس جنین­زا و تکامل جنین­ها به گیاهک را گزارش نمودند (39، 44، 24، 32). تکثیر درون شیشة خرما اغلب از طریق جنین­زایی سوماتیکی انجام شده است (30، 31، 36، 10، 34، 14، 21، 17، 8، 29). در این روش به دلیل تولید جنین از سلول­ها، بافت­ها و یا اندام­های پیکری، کلون­های نامحدودی با خصوصیات انتخابی تولید خواهد شد (9).

در ایران نیز مطالعاتی در این راستا انجام شده است. ناظری و همکاران (1371)، اولین گزارش از تولید جنین سوماتیکی را در ارقام استعمران و کبکاب منتشر کردند (6). Eshraghi و همکاران (2005) تولید جنین­های سوماتیکی را در ارقام خنیزی و مردارسنگ بررسی کردند (16). مطالعه روی ارقام کبکاب، استعمران، پیارم، برحی )1)، زاهدی، کبکاب و دیری (4) انجام شده است. در تمامی این پژوهش­ها از غلظت­های بالای تنظیم کنندة رشد 2، 4- دی­کلروفنوکسی استیک اسید (به عنوان مثال، غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر در مطالعه حبشی و همکاران (1385)) (1)، به همراه غلظت­های پایین از تنظیم کننده­های رشد سیتوکینین استفاده شده بود که این امر منجر به بروز تنوع سوماکلونال خواهد شد (25). در ضمن در اغلب آزمایشهای ریزازدیادی خرما به 16 تا 48 هفته زمان از شروع کشت تا تولید کالوس جنین­زا نیاز دارد. به‌عنوان مثال پژوهش Al-Khateeb  (2006) در 28 هفته و پژوهش Hassan و Taha (2012) در مدت 48 هفته به نتیجه رسیده است (7، 19). رقم انتخابی در این پژوهش استعمران می­باشد که بیش از 65 درصد محصول خرمای خوزستان و 40 درصد از تولید کل خرمای ایران را شامل می­شود. ازجمله مشخصات این رقم داشتن درصد قند و ریزمغذی­های بالا، همراه با فیبر کم است. این خرما نیمه خشک بوده و رطوبت کمتر از 17 درصد دارد، بنابراین می­توان آن را در انبارهای معمولی و بدون سردخانه برای بیش از یکسال نگهداری کرد (26)، به همین دلیل این رقم برای بهینه­ سازی انتخاب گردید. در این پژوهش، با توجه به گسترة پژوهش­ها و دستورالعمل­های ارائه شده در زمینه کشت بافت نخل خرما، سعی شده دستورالعملی ارائه شود که با استفاده از حداقل تنظیم کننده­های رشد که منجر به کاهش تنوع سوماکلونال خواهد شد، جنین­زایی در کمترین زمان ممکن و با کاهش هزینه­ها انجام شود.

مواد و روشها

پاجوش­های استعمران به وزن 5/2 کیلوگرم، ارتفاع 180 سانتی­متر (از محل جدا شدن پاجوش از درخت مادری تا انتهای بلندترین برگ) و دارای 6 برگ بالغ، از خزانه دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان جدا شدند. بعد از قطع شاخ و برگ اضافی، رأس ساقه­ها به مدت 1 ساعت با آب شهری به همراه چند قطره شوینده شسته شدند. برش رأس ساقه در زیر هود لامینار انجام شد و مریستم رأسی که حدود 3 سانتی‌متر ارتفاع دارد (شکل1) برای سترون سازی، به‌مدت 10 دقیقه در هیپوکلرید سدیم 25/5 درصد غوطه­ور شده و بعد 3 مرتبه با آب مقطر سترون و هر بار 10 دقیقه آب­کشی شد.

بعد از برش ریزنمونه­ها به صورت طولی، قطعات 1-2 سانتی­متری در محیط پایه (MS) Murashige و Skoog (1962) همراه با ((gl-1 40 ساکارز، (gl-1) 3/0 زغال فعال، (gl-1) 8 آگار-آگار و آنتی­اکسیدانت­های آسکوربیک اسید و سیتریک اسید به نسبت (mgl-1) 75 :75 و 4 تیمار تنظیم کنندة رشد (جدول 1) بر اساس بررسی­های Sidky و Zaid (2011)، برای القاء کالوس جنین­زا کشت شدند (27، 35). pH محیط­های کشت با استفاده از NaOH1/0 نرمال یا HCl 1/0 نرمال روی 7/5 تنظیم شده و در دمای 121 درجه سانتی­گراد در فشار15 psi برای 15 دقیقه اتوکلاو گردید.

دو واکشت اول به فاصله 3 هفته بود و کشت­ها در شرایط تاریکی2  ±25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. واکشت­های بعدی با فاصله 4 هفته انجام شد و کشت­ها به شرایط دوره روشنایی 16/8 ساعت (روشنایی/تاریکی) منتقل شدند (23). 8 هفته بعد از کشت و پس از محاسبه درصد کالوس­زایی هر تیمار، کالوس­ها به محیط القای جنین، شامل محیط کشت پایه MS همراه با ساکارز ((gl-1 40 و زغال فعال ((mgl-1 3/0 منتقل شد. 8 هفته بعد از جابه­جایی به محیط کشت پایه MS، جنین­ها بر روی کالوس­های جنین­زا کاملا قابل مشاهده و بررسی بودند. پس از این مرحله جنین ها به محیط کشت پایه MS همراه با ((gl-1 20 ساکارز انتقال پیدا کردند.

این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با 3 تکرار اجرا شد (جدول 1).

فاکتور اول تنظیم کنندة رشد 2,4-D در دو سطح و فاکتور دوم تنظیم کنندة رشد TDZ در دو سطح بود (35). تجزیة واریانس (ANOVA) داده­های بدست آمده با نرم­افزار SPSS انجام شد و مقایسة میانگین­ها به روش آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام و رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.

جدول1- سطوح مختلف تنظیم­کننده­ی رشد بر حسب میلی گرم بر لیتر

شماره تیمار تنظیم کننده رشد

2,4-D

TDZ

1

5

5

2

10

5

3

5

10

4

10

10

نتایج

اولین نشانه­های تمایززدایی به سمت تولید کالوس، به صورت تورم­هایی به رنگ زرد روی سطح ریزنمونه­ها، 10 روز بعد از کشت و نگهداری در شرایط تاریکی اولیه مشاهده شد، که به مرور زمان بعد از 2 تا 8  هفته به کالوس­های سفید مایل به زرد روشن و شفافی تمایز یافت. 

 

 

شکل 1- محدوده رأس ساقه، مریستم رأسی و برش طولی آن در نخل خرما، رقم استعمران. ­


تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از این آزمایش (جدول 2) نشان داد که بین دو سطح اکسین 2,4-D ( mgl-110 و  mgl-1 5) و نیز دو سطح سیتوکینین TDZ ( mgl-110 و mgl-1 5) تفاوت معنی‌داری وجود ندارد، اما اثر متقابل مورد بررسی معنی‌دار بود (05/0P≤).

مقایسه میانگین داده­های کالوس­زایی با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5% (جدول 2 و شکل 2) نشان داد که بالاترین میزان کالوس­زایی، اما با کیفیت کم (از لحاظ خصوصیات تعریف شده­ برای کالوس­های جنین­زا) در تیمار (mgl-1) 5 2,4-D +   (mgl-1)10 TDZ که سیتوکینین دو برابر اکسین بود به‌دست آمد (شکل 3- الف). در تیمار اکسین دو برابر سیتوکینین (mgl-1)10  2,4-D + (mgl-1) 5  TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، برای جنین­زایی (سفید رنگ با سطح صاف) مشاهده شد (شکل 3- ب).

پس از انتقال به محیط کشت القاء جنین، پاسخ­دهی ابتدا با دانه دانه شدن سطح کالوس، سپس متراکم و فشرده شدن سلول­ها و در نهایت تولید جنین کروی شکل پدیدار شد. طی 4 هفته­ بعد از انتقال به محیط القاء جنین (10 تا 12 هفته بعد از کشت اولیه)، مراحل تکامل به سمت جنین قلبی و کوتیلدونی در زیر استریومیکروسکوپ قابل شناسایی و بررسی بود.

کالوس­های حاصل از برخی تیمارها مانند (mgl-1) 5 2,4-D + (mgl-1) 10 TDZ و (mgl-1) 10  2,4-D+ (mgl-1)10 TDZ با انتقال به محیط کشت القاء جنین، قهوه­ای شدند (شکل 4- الف و ب)، اما تیمارهای دیگر، مانند کالوس­های حاصل از (mgl-1)  5 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ با تغییر رنگ کالوس به زرد روشن، کالوس­ جنین­زا تولید نمودند اما مراحل تکامل جنین را طی نکردند (شکل 4- پ).

 

جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر 2,4-D و TDZ بر روی کالوس­زایی در کشت مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران.

میانگین مربعات

درجه آزادی

منبع تغییر

 

کالوس­زایی

 

 

ns333/0

1

2,4-D(a)

 

ns 333/0

1

TDZ(b)

 

* 000/3

1

2,4-D×TDZ  ( a×b )

 

500/0

8

خطای آزمایش

 

5/38

 

ضریب تغییرات (درصد)

             

*- معنی دار در سطح احتمال 5%

 

شکل 2- مقایسه­ی میانگین تأثیر تیمارهای تنظیم­کننده­ی رشد 2,4-D و TDZ بر کالوس­زایی مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5%، میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک تفاوت معنی­داری ندارند.

 

 

شکل 3- تأثیر تنظیم کننده­های رشد2,4-D و TDZ، بر القاء کالوس در مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف، تشکیل کالوس­ جنین­زا با کیفیت کم در تیمار (mgl-1) 5 2,4-D +(mgl-1)10  TDZ. ب، تشکیل کالوس جنین­زا با کیفیت بالا در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5.TDZ

 

بر اساس این مشاهدات، کالوس­هایی که تحت تیمار
(mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ  تشکیل شده بودند، دارای بهترین جنین­زایی بودند (شکل 4- ت).

جدول 3- تیمارهای محیط القاء کالوس (mgl-1) و کیفیت تولید کالوس­ جنین­زا، از مریستم رأسی  نخل خرما، رقم استعمران.

2,4-D

5 

10

5 

10 

TDZ

5

5

10

10

کیفیت کالوس­زایی 

3

4

1

2

رتبه بندی کیفیت تولید کالوس جنین­زا: 1- ضعیف، 2- خوب، 3-

متوسط، 4- عالی (35).

به‌طورکلی دو نوع کالوس قابل تشخیص است: کالوس جنین­زا که دارای ساختاری گره دار و فشرده هستند و دارای رشد آهسته­تر بوده و توانایی ایجاد جنین تحت شرایط مناسب را دارند وکالوس غیرجنین‌زا که ساختاری کلوخه‌ای و ترد و شکننده دارند و اندازه آنها بسیار بزرگتر از کالوس های جنین­زا می‌باشد و قادر به ایجاد جنین رویشی نمی­باشند (5).

 

 

 

 

  

  

شکل 4- چگونگی جنین­زایی در محیط کشت پایه ­MS، حاصل از کالوس­های مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف و ب، قهوه­ای شدن کالوس در تیمار (mgl-1) 5 + 2,4-D(mgl-1) 10 TDZ و ((mgl-1 10 + 2,4-D (mgl-1)10 TDZ. پ، تولید کالوس جنین­زا در تیمار (mgl-1) 5  2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ. ت، القاء و تشکیل جنین در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ. ث، تکامل جنین­ها تا مرحله کتیلدونی در محیط کشت پایه ­MS دارای (mgl-1) 20 ساکارز بعد از دو ماه. ج، قهوه­ای شدن جنین­ها با ادامه واکشت در محیط کشت پایه ­MS دارای (mgl-1) 20 ساکارز بعد از 3 ماه. 


در این آزمایش از این لحاظ هر دو نوع کالوس مشاهده شد. کالوس غیر جنین­زا در تیماری با دو برابر غلظت سیتوکینین به اکسین و کالوس جنین­زا در تیمار اکسین دو برابر سیتوکینین (mgl-1) 10 2,4-D +  (mgl-1) 5  TDZکه کالوسی سفید رنگ با سطح صاف همچنین با حداکثر میزان پاسخ­دهی بود، مشاهده شد.

پس از انتقال کالوس­های تولیدی به محیط کشت القاء جنین، دو نوع جنین سوماتیکی از لحاظ مورفولوژی تمایز یافت. در برخی از تیمارها (مانند تیمار (mgl-1) 52,4-D  +(mgl-1) 5 TDZ، شکل 4- پ)، تورم­های کروی دارای مراکز قهوه­ای رنگ، روی سطح کالوس تولید کردند، این جنین­ها در مرحله­ کروی باقی ماندند و به­تدریج از بین رفتند (شکل 5- الف). در تعدادی از تیمارها (مانند تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ، شکل 4- ت)، کالوس­های حاصل با انتقال به محیط جنین­زایی تورم­های شاخی شکل تولید کردند، که پس از چندی از انتها به فرم کروی، قلبی و کوتیلدونی (اژدری) تکامل یافتند (شکل 5- ب).

 

 

 

شکل 5- کیفیت جنین­های تولید شده در محیط کشت پایه ­MS، حاصل از کالوس­های مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف، القاء تورم­های کروی با مراکز قهوه­ای رنگ، که مراحل تکامل جنین را طی نکردند. ب 1. و ب 2، القاء تورم­های شاخی شکل، که جنین سوماتیکی تولید کردند.

 

جنین­های تولید شده بعد از یک ماه، پرورش در محیط کشت پایه ­MS حاوی (gl-1) 40 ساکارز به محیط کشت پایه ­MS دارای (gl-1) 20 ساکارز منتقل شدند. کاهش مقدار ساکارز در ابتدا منجر به تکامل بیشتر جنین­های سوماتیکی تا مرحله کوتیلدونی شد و بعد از 2 ماه اندکی تغییر رنگ به سبز روشن مشاهده شد (شکل 4- ث)، اما با ادامه واکشت در محیط کشت با ساکارز  ((gl-1 20 جنین­ها قهوه­ای شده و 3 ماه بعد از جابه­جایی از بین رفتند (شکل 4- ج). 

بحث

بعد از قرار دادن ریزنمونه­ها روی محیط کشت، قهوه­ای شدن و خروج ممانعت کننده­های رشدی از آنها به محیط کشت مشاهده می­شود. قهوه­ای شدن بافت در مجاورت محیط کشت، به علت اکسیداسیون پلی­فنول­ها و تشکیل کوئینین­ها می­باشد، که برای ریزنمونه­ها کشنده است (43). مشخص شده که سیتریک اسید، آسکوربیک اسید و زغال فعال در تعامل مثبت با هم بوده و اثر مثبت بر زنده ماندن ریزنمونه­ها دارند. آسکوربیک اسید به‌عنوان ممانعت کننده از اکسیداسیون فنول­ها عمل کرده و کوئینین تشکیل شده را خارج می­کند (3) . احتمالا سیتریک اسید به‌عنوان عامل کلاته کننده عمل کرده و تخریب آسکوربیک اسید را به تأخیر می­اندازد (23). اثرات مثبت زغال فعال، در از بین بردن ترکیبات مهارکننده­ است، همچنین باعث کاهش شدید اکسیداسیون فنول­ها می­شود. استفاده از (gl-1)3/0 زغال فعال باعث افزایش قدرت زیست ریزنمونه­ها در برگ نابالغ خرما (29) و افزایش اثر اکسین در محیط و تغییر خواص محیط در جهت کاهش جذب تنظیم­کننده­های رشد و دیگر ترکیبات می­شود (22). در مطالعه دیگری کاربرد ((gl-1 3 زغال فعال در محیط کشت، فقط منجر به کاهش اکسیداسیون فنول­ها شد (34). در این مطالعه نیز استفاده از ترکیبات آنتی اکسیدانت و زغال فعال منجر به سالم ماندن مریستم ها و عدم ترشح ترکیبات فنولیک در آنها شد.

اولین نشانه­های تمایززایی به سمت تولید کالوس، به صورت نواحی تیره­تر، 10 روز بعد از کشت اولیه مشاهده شد، که به مرور زمان بعد از 2 هفته به کالوس­های سفید و شفافی تمایز یافت. پس از انتقال به محیط القاء جنین، کالوس­ها ظاهری دانه دانه پیدا کرده و سلول­های آن متراکم، فشرده و به رنگ زرد متمایل ­شدند. 4 هفته بعد مراحل اولیه جنین­زایی به­صورت تورم­های کروی با مراکز قهوه­ای نمایان ­شد. از 12 تا 16 هفته بعد از کشت اولیه، مراحل تکامل به سمت جنین قلبی و اژدری در زیر بینوکولر قابل شناسایی و بررسی بود. در مطالعه روی رأس ساقه خرما رقم Dhakki، بعد از 1 هفته بافت متورم شده و بعد از 2 هفته افزایش اندازه پیدا کرد. القاء کالوس از هفته 3 شروع و در هفته 5 تکمیل شد (23). در مطالعات دیگری روی برگ­های جوان، نتایج مشابهی به­دست آمد (رقم Ahmar در مطالعات Gueye و همکاران (2009) و رقم DegletBey در پژوهش­های Fki  و همکاران (2003) (18، 17). در این پژوهش مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به 2 هفته کاهش یافته است و در هفته چهارم از کشت جنین­های سوماتیکی متمایز شدند. دلیل این کاهش مدت زمان پاسخ­دهی، علاوه بر تفاوت­های ژنتیکی ناشی از نوع رقم، به تنظیم­کنندهای رشدی استفاده شده در این پژوهش نیز وابسته است. TDZ باعث افزایش انباشتگی و سنتز سیتوکینین­های پورینی شده و تبدیل آدنین به آدنوزین را افزایش می­دهد (13). مشخص شد که TDZ ظرفیت دوگانه­ای در القاء جنین سوماتیکی دارد، فعالیت شبه سیتوکینی آن تقسیم سلولی را افزایش می­دهد و کمی فعالیت شبه اکسینی دارد، که به‌نظر می­رسد برای القاء جنین بسیار مهم است (42).

طبق بررسی­های انجام شده، استفاده از TDZ با غلظت (mgl-1) 10 در هر دو سطح 2,4-D، کیفیت تولید کالوس جنین­زا را کاهش داد، همچنین کالوس‌های تولید شده در این تیمارها با انتقال به محیط جنین­زایی در اثر افزایش ترشحات فنولیک از بین رفتند. تولید حداکثری کالوس با استفاده از غلظت دو برابری 2,4-D نسبت به TDZ و کاهش آن همراه با افزایش غلظت بکار رفته از TDZ در مطالعات Sidky و Zaid (2011) نیز همانند این پژوهش مشاهده شده است (35). اکسین ­2,4-D (در غلظت­های (mgl-1) 5 یا بیشتر) مناسبترین تنظیم کنندة رشد برای انگیزش کالوس­زایی در نخل خرماست (15، 36).

از اکسین­ها به تنهایی یا همراه با سایر سیتوکینین­ها در القای جنین­زایی در خرما استفاده شده است (10، 11، 12، 14، 37، 41، 45). به نظر می­رسد سطوح کمتر 2,4-D استفاده شده در محیط کالوس­زایی، به القای جنین در کالوس­ها کمک کرده است (36). بر اساس مطالعات Norgaard و Krogstrup (1991)، 2,4-D فقط در مرحله انگیزش جنین­زایی لازم است و در بعضی موارد،2,4-D  و دیگر اکسین­ها مانع از جنین­زایی سوماتیکی خواهند شد (28). همچنین McClintock (1984) گزارش داد که افزایش غلظت 2,4-D در محیط کشت، باعث افزوده شدن تنوع سوماکلونال در انگور (Vice versa) می­شود (25). از آنجا که یکی از مشکلات تکثیر کشت بافتی خرما، بروز تنوع سوماکلونال در گیاهچه­های حاصل می­باشد (33)، پس در این پژوهش محیط کشت کالوس­زایی حاوی حداقل اکسین و سیتوکینین بکار رفت و محیط کشت  القای جنین فاقد تنظیم کنندة رشد بود، تا از اثرات منفی حضور اکسین فنوکسی 2,4-D که محرکی قوی در القاء کالوس می­باشد، جلوگیری شده و احتمال ایجاد تنوع سوماکلونال در نتاج کشت بافتی خرما کاهش یابد. 

نوع منابع کربوهیدرات و همچنین غلظت آنها روی توانایی سلول­ها برای القای جنین­زایی سوماتیکی و تکامل آنها مؤثر است (40، 20). مطابق نتایج بدست آمده از کاهش مقدار ساکارز مصرفی برای تکامل جنین­های تولیدی، به نظر می­رسد در محیط القای جنین، وجود فشار اسمزی ناشی از غلظت بالای ساکارز، ابتدا باعث افزایش غلظت مواد درون سلولی و بهبود جنین­زایی شده است، اما در ادامه به علت تجمع مواد قندی زیاد در سلول­ها و جذب آب بیشتر، توانایی جنین­زایی کاهش یافته است. Veramendi و Novarro (1996) در مطالعات خود روی تأثیر شرایط فیزیکی محیط کشت و غلظت ساکارز بر جنین­زایی سوماتیکی نخل خرما، با اذعان بر اینکه شرایط فیزیکی محیط کشت، غلظت و گرسنگی ساکارز از عوامل مهم در تکامل جنین است، نتیجه گرفتند که بهترین شرایط برای تکامل جنین در محیط کشت مایع (تکان در rpm 100 برای 2 هفته) و بدون ساکارز می­باشد (41). در نتیجه برای تکامل جنین­ها از کاهش مقدار ساکارز مصرفی استفاده شد، که تنها در تمایز جنین­ها تا مرحله­ کوتیلدونی مؤثر بود. لذا پیشنهاد می­شود که با استفاده از مواد اسمززا مانند سوربیتول این روند را حفظ نمود و جنین­زایی در کالوس­ها را افزایش داد، همان طور که Hassan و Taha (2012) نشان دادند در طول مرحله تکثیر و جوانه­زنی جنین سوماتیکی حاصل از مریستم رأسی نخل خرما، بالاترین تعداد جنین­های جوانه­زده با استفاده از
(gl-1) 2/19 ساکارز + (gl-1)  4/38 سوربیتول به دست می­آید (19).

نتایج این تحقیق بیانگر تأثیر غلظت تنظیم­کننده­های رشد در القاء کالوس، تشکیل کالوس جنین­زا از مریستم رأس ساقه پاجوش استعمران و تسریع تشکیل کالوس جنین­زا بود و بهترین ترکیب (mgl-1) 10 2,4.D  همراه با (mgl-1)5 TDZ برای جنین زایی در این رقم بود. همچنین مشخص شد که میزان تولید کالوس جنین­زا و مدت زمان لازم برای سپری شدن این فرایند تحت تأثیر ترکیبات محیط کشت شامل مقدار زغال فعال، حضور آسکوربیک و سیتریک اسید و همچنین نوع تنظیم­کننده­های رشدی اضافه شده می­باشد. برای القای جنین­زایی و ایجاد تمایز به جنین کوتیلدونی می­توان از محیط کشت فاقد تنظیم­کنندة رشد و نیز کاهش مقدار منبع کربن استفاده کرد.

1-      حبشی، ع. الف.، موسوی، الف.، کاویانی، م.، خوشکام، ص. و رستمی، ع.، 1385. ریزازدیادی خرما از طریق جنین­زایی رویشی. مجله­ی علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی، 12 (46): 7.

2-      حسینی، م.، هوتن، ت.، ١٣٨۶. مطالعه بازار جهانی خرما و بازارهای هدف خرمای صادراتی ایران. مجله اقتصاد کشاورزی و توسعه، ویژة بازارهای کشاورزی، 15(57).

3-      دانشمند، ف.، 1393.  تاثیر آسکوربیک اسید در کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از تنش شوری در سیب زمینی. مجله پژوهش های گیاهی، دوره 27 (3)، 426-417. 

4-      دانایی، الف.، موسوی، الف.، فراهانی، ف.، دهسرا، ب. و ضعیفی­زاده، م.، 1388. بررسی اثرات ژنوتیپ و سیتوکینین­ها بر تولید کالوس جنین­زا در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.). مجله­ی ژنتیک نوین، 4 (3): 70-63.

5-      گردکانه م. ارجی ع.، 1393 اثر NAA و ریزنمونه اندام های مختلف بر جنین زائی ثانویه توت فرنگی (Fragaria ananassa Duch.). مجله پژوهش های گیاهی، 27 (3) ، 510-501.

6-      ناظری، س.، خوشکام، ص.، افشاری، م.، مدیری، م.، شکیب، ع. و مجیدی، الف.، 1371. تولید جنین رویشی در ارقام خرمای استعمران و کبکاب در شرایط کنترل شده. مجله­ی تحقیقات کشاورزی نهال و بذر، 8 (3 و 4): 20-16.

 

7-       Al-khateeb, A. A., 2006. Role of cytokinin and auxin on the multiplication stage of date palm (Phoenix dactylifera L.) cv. Sukry. Biotechnology, 5: 349-352. 

8-       Al-Khateeb, A., 2008. Comparison effects of sucrose and date palm syrup on somatic embryogenesis of date palm (Phoenix dactylifera L.). American Journal of BiochemistryandBiotechnology,4: 19-23.

9-       Aslam, J., Khan, S. A., Cheruth, A. J., Mujib, A., Sharma, M. P., and Srivastava, P. S., 2011. Somatic embryogenesis, scanning electron microscopy, histology and biochemical analysis at different developing stages of embryogenesis in six date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivar. Saudi Journal of Biological Sciences, 18: 369–380.

10-   Beauchesne, G., 1983. Vegetative propagation of date palm (Phoenix dactylifera L.) by in vitro culture. In: Proc of first symposium on date palm, Hofuf, Saudi Arabia: 698–699.

11-   Beauchesne, G., Zaid, A., and Rhiss, A.,1986. Meristimatic potentialities of bottom of young leaves to rapidly propagate date palm. Second Symposium. Date Palm, 3-6 March, Saudi Arabia.

12-   Bhargava, S. C., Saxena, S. N., and Sharma, R., 2003. In vitro multiplication of Phoenix dactylifera L. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 12: 43-47.

13-   Cupelle, S. C., Mor, D. W. S., Kirschnet, S. C., and Mok, M. C., 1983. Effect of thidiazuron on cytokinin autonomy and the metabolism of N6-(A2-isopentenyl) [18-c14) adensine incallus tissues of Phascolus L. Plant Physiology, 73: 696-802. 

14-   Daquin, F., Letouze, R., 1988. Regeneration of date palm (Phoenix dactylifera L.) by somatic embryogenesis, improved effectiveness by dipping in a stirred liquid medium. Fruits, 43:191–194.

15-   El-Hadrami, I. and Baaziz, M., 1995. Somatic embryogenesis and analysis of peroxydases in Phoenix dactilifera L. Biology Plant, 37: 179-203.

16-   Eshraghi, P., Zarghami, R., Mirabdulbaghi, M., 2005. Somatic embryogenesis in two Iranian date palm cultivars. African Journal of Biotechnology, 4 (11): 1309-1312.

17-   Fki, L., Masmoudi, R. Drira, N., and Rival, A., 2003. An optimized protocol for plant regeneration from embryogenic suspension cultures of date palm, Phoenix dactylifera L., cv. DegletNour. Plant Cell Reports, 21: 517-524.

18-   Gueye, B., Morcillo, F., Collin, M., Gargani, D., Overvoorde, P., Bertossi, F. A., Taranbargar, T. J., Sane, D., Tregear, J. W., Borgell, A., and Verdeil, J. L., 2009. Acquisition of callogenic capacity in date palm leaf tissues in response to 2,4-D treatment. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 99: 35-45.

19-   Hassan, M. M., and Taha, R. A., 2012. Callogensis, somatic embryogenesis and regeneration of date palm, Phoenix dactylifera L., cultivars affected by carbohydrate sourees. International Journal of Agricultural Research, 7(5): 23- 242. 

20-   Iraqui, D. and Tremblay, F. M., 2001. The role of sucrose during maturation of black spruce (Piceamariana) and white spruce (Piceaglauca) somatic embryos. Physiology Plant, 111: 381-388. 

21-   Junaid, A., Khan, S. A., 2009. In vitro micropropagation of Khalasah date palm (Phoenix dactylifera L.). An important fruit plant. Journal of Fruitand Ornamental Plant Research, 17: 5–17.

22-   Khan, S., Saeed, B., and Kauser, N., 2011. Establishment of genetic fidelity of in vitro raised banana plantlets. Pakistan Journal of Botany, 43(1): 233-242. 

23-   Khan, S., and Bi Bi, T., 2012. Direct shoot regeneration system for date palm (Phoenix dactylifera L.) CV. Dhakki as a means of micropropagation. Pakistan Journal of Botany, 44: 1965-1971.

24-   Mater, A. A., 1983. Plant regeneration from callus culture of (Phoenix dactylifera  L.). Date Palm Journal, 1 (2): 57-77.

25-   McClintock, B., 1984. The significance of responses of the genome to challenge. Science, 226: 792–801.

26-   Mohseni, Y., 2012. Characteristics and types of dates in Khuzestan. Available at http://www.abadandates.com/post/8, Accessed Sep 7, 2012.

27-   Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: 473-497.

28-   Norgaard, J. V., and Krogstrup, P., 1991. Cytokinin induced somatic embryogensis from immature embryos of Abies nord maniana LK. Plant Cell Reports,9: 509-513.

29-   Othmani, A., Bayoudh, C., Drira, N., and Trifi, M., 2009. In vitro cloning of date palm Phoenix dactylifera L. cv. Deglet Bey by using embryogenic suspension and temporary immersion bioreactor (TIB). Journal of Biotechnology and Biotechnological Equipment, 23: 1181-1185.

30-   Rashid, H., and Quraishi. A., 1994. Micropropagation of date palm through tissue culture. Pakistan Journal of Agricultural Research,15: 1-7.

31-   Rhiss, A., Poulain, C., Beauchesne, G., 1979. La culture in vitro appliqué ala multiplication vegetative du palmierdattier (Phoenix dactylifera L.). Fruits, 34: 551–554.

32-   Ross, A. H., Manners, J. M., and Birch, R. G., 1995. Embryogenic callus production, plant regeneration and transient gene expression following particle bombardment in the pasture grass, Cenchrus ciliaris (Gramineae). Australian Journal of Botany, 43(2): 193 –199.

33-   Saker, M., Adawy, S., Mohamed, A., and El-Itriby, H., 2006. Monitoring of cultivar identity in tissue culture-derived date palms using RAPD and AFLP analysis. Biology Plant, 50: 198-204.

34-   Sharma, D. R., Dawra, S., and Chowdhury, J. B., 1984. Somatic embryogenesis and plant regeneration in date palm cv. Khadrawy through tissue culture. Ind. The Journal of Experimental Biology, 22: 596-598.

35-   Sidky, R.  A., and Zaid, Z. E., 2011. Direct production of somatic embryos and plant regeneration using TDZ and CPPU of date palm (Phoenix dactylifere L.). International Journal of Academic Research, 3:792.

36-   Tisserat, B., 1979. Propagation of date palm (Phoenix dactylifera L.) in vitro. Journal of Experimental Botany, 30:1275–1283.

37-   Tisserat, B., 1982. Factors involved in the production of plantlets from date palm callus cultures. Kluwer Academic Pub., Dordrecht, Euphytica, 31: 201-214.

38-   Tissert, B., 1984. Propagation of date palm by shoot tip cultures. Horticultural Science, 19: 230-231.

39-   Tisserat, B., and Demason, D. A., 1980. A histological study of development of adventive’s embryos in organ culture of Phoenix dactylifera L. Annals of Botany, 46:465-472.

40-   Tokuhara, K., and Mii, M., 2003. Effect of polyethylene glycol and sugar alcohols on soybeen somatic embryo germination and conversion. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 64: 55-62.

41-   Veramendi, J., and Navarro, L., 1996. Influence of physical conditions of nutrient medium and sucrose on somatic embryogenesis of date palm. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 45: 159-164.

42-   Victor, J. M. R., Murch, S. J., Krishna, R. S., and Saxena, P. K., 1999. Somatic embryogenesis and organogenesis in peanut: The role of thidiazuron and N.6-benzylaminopurine in the induction of plant morphogenesis. Plant Growth Regulator, 28(1): 9-15.

43-   Zaid, A., 1987. In vitro browning of tissues and media with special emphasis to date palm culture-a review. Acta Horticultural Culture, 212: 561-566.

44-   Zaid, A. and Tisserat, B., 1983. Morphogenetic responses obtained from a variety of somatic explants tissue of date palm. Botanical Magazine, 96: 67-73

45-   Zouine, J., and Hadrami, I., 2004. Somatic embryogenesis in phoenix dactylifera L. Effect of exogenous supply of sucrose on proteins, sugers, phenolics and peroxidases activities during the embryogenic cell suspension culture. Biotechnology, 3(2): 114-118.