نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیات علمی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

2 کارشناس ارشد خبره موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

3 هیئت علمی موسسۀ تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

4 دانشیار موسسۀ تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

5 استاد موسسۀ تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

چکیده

گونۀ Centaurea lachnopus Rech. f. گیاهی است علفی دو یا چند ساله که در مراتع بیابانی استان سمنان رویش دارد. به دلیل دامنۀ محدود اکولوژیک، پراکنش جغرافیائی محدود و تخریب بعضی از عرصه‌های رویشگاهی، در معرض خطر می‌باشد. به منظور بررسی امکان نگهداری بلند مدت بذر این گونه در شرایط فراسرد (Cryopreservation) و بررسی رشد بذور فراسردی در شرایط آزمایشگاه و گلخانه، بذر این گونه از رویشگاه طبیعی آن جمع‌آوری گردید. به منظور تعیین بهترین پیش تیمار جهت ذخیره‌سازی بذر در برودت 196- درجه سانتیگراد، سه پیش تیمار شاملDesiccation, PVS2 و30% Glycerol همراه با شاهد مورد آزمایش قرار گرفت. بذور تیمار شده به مدت یکهفته، یکماه و یکسال در شرایط فراسردی درون ازت مایع نگهداری شدند. بذور پس از خروج از شرایط فراسرد، در شرایط آزمایشگاه و گلخانه مورد آزمایش قرار گرفتند و تعدادی از صفات مرتبط با جوانه‌زنی و استقرار در گلخانه بررسی گردید. نتایج بررسی‌ها نشان داد که بذر Centaurea lachnopus قابل نگهداری در شرایط فراسرد یا 196- درجۀ سانتیگراد می‌باشد. در بررسی اثر پیش تیمار‌ها در حفاظت از بذر در شرایط فراسرد، مشخص گردید تفاوت معنی داری بین پیش تیمار‌های 30%Glycerol، Desiccation وPVS2 برای اغلب صفات مشاهده می‌شود و بهترین پیش تیمار Desiccation است. اثر متقابل مدت زمان نگهداری بذور در شرایط فراسرد و پیش تیمارهای مختلف بر میانگین صفات نشان داد که در تعدادی از صفات تفاوت بین زمان‌ها وجود دارد ولی درتعداد دیگری از صفات این تفاوت معنی‌دار نیست. در شرایط گلخانه بذور فراسردی بهتر و یکنواخت‌تر از شرایط آزمایشگاه جوانه زده و مستقر گردیدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Cryopreservation of Centaurea lachnopus Rech. f. Seeds and Establishment of the Cryopreserved Seeds under Laboratory and Greenhouse Conditions

نویسندگان [English]

  • mohabatali naderi 1
  • maryam jebbeli 2
  • amrali shahmoradi 3
  • abbas ghamari zare 4
  • ali ashraf jafari 5

چکیده [English]

Centaurea lachnopus Rech. f. is a biennial or perennial range specie which grows in Semnan province located in center of Iran. Narrow geographic range and ecological zone, small population size, and habitat degradation in one of its growing sites put this species under threat. To evaluate the possibility of long-term preservation of Centaurea lachnopus seeds, three pre-cryopreservation methods including PVS2, Desiccation, and 30% Glycerol were applied before incubation of the seeds under cryopreservation conditions (-196°C). The treated seeds were incubated in LN for period of 1 week, 1 month, and 1 year. The cryopreserved seeds were removed from liquid nitrogen and evaluated under laboratory and greenhouse conditions. The results showed that seeds of Centaurea lachnopus are able to tolerate cryogenic conditions. Effects of the cryopreservation pre-treatments including 30%Glycerol, Desiccation and PVS2 were significantly different from seed attributes and Desiccation showed the best effects on survival rate and other attributes of the cryopreserved seeds. The interaction effects between LN incubation periods and pretreatments were significant for some of the attributes. However some of the attributes did not show different means in different incubation periods. In greenhouse conditions, the cryopreserved seeds were germinated better and established more consistently than that of the laboratory conditions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Centaurea lachnopus
  • Seed cryopreservation
  • Range species
  • Endangered species

بررسی امکان نگهداری بذر Centaurea lachnopus Rech. f. در شرایط فراسرد و بررسی رشد بذرهای فرا‌سردی در شرایط آزمایشگاه و گلخانه

محبّت علی نادری شهاب، مریم جبلّی*، امر علی شاهمرادی، عباس قمری زارع و علی اشرف جعفری 

تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور 

تاریخ دریافت: 15/4/93                تاریخ پذیرش: 28/11/93

چکیده

گونۀ Centaurea lachnopus Rech. f. گیاهیست علفی، دو یا چند ساله که در مراتع بیابانی استان سمنان رویش دارد. به دلیل دامنۀ محدود اکولوژیک، پراکنش جغرافیایی محدود و تخریب بعضی از عرصه‌های رویشگاهی، در معرض خطر می‌باشد. به‌منظور بررسی امکان نگهداری بلند مدت بذر این گونه در شرایط فراسرد (Cryopreservation) و بررسی رشد بذرهای فراسردی در شرایط آزمایشگاه و گلخانه، بذر این گونه از رویشگاه طبیعی آن جمع‌آوری شد. به منظور تعیین بهترین پیش‌تیمار برای ذخیره‌سازی بذر در فراسرد یا برودتC °196- سه پیش تیمار) PVS2  ویتریفیکاسیون)، Desiccation (آبگیری) و گلیسرول 30 درصد همراه با شاهد مورد آزمایش قرار گرفت. بذرهای تیمار شده به مدت یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال در شرایط فراسرد یا برودتC°196- (درون ازت مایع) نگهداری شدند. بذرها پس از خروج از شرایط فراسرد، در شرایط آزمایشگاه و گلخانه  مورد آزمایش قرار گرفتند و تعدادی از صفات مرتبط با جوانه‌زنی و استقرار بررسی گردید. نتایج بررسی‌ها نشان داد که بذر Centaurea lachnopus قابل نگهداری در شرایط فراسرد یا C°196- می‌باشد. در بررسی اثر پیش تیمار‌ها در حفاظت از بذر در شرایط فراسرد، تیمارهای آبگیری، گلیسرول 30% و PVS2 به ترتیب با 67/37 درصد، 67/37 درصد و 67/22 درصد جوانه‌زنی در تیمار یک هفته ماندگاری در فراسرد، تفاوت معنی‌داری داشتند و پیش تیمار آبگیری بهترین پیش تیمار بود. اثر متقابل مدت زمان نگهداری بذرها در شرایط فراسرد و پیش‌تیمارهای مختلف بر میانگین صفات نشان داد که در تعدادی از صفات تفاوت بین زمان‌های ذخیره سازی وجود دارد ولی در تعداد دیگری از صفات این تفاوت معنی‌دار نیست. در شرایط گلخانه بذرهای فراسردی بهتر و یکنواخت‌تر از شرایط آزمایشگاه جوانه زده و مستقر شدند. پیش تیمار آبگیری با 30 درصد، 67/31 درصد و 33/28 درصد استقرار به ترتیب در یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ماندگاری در ازت مایع بهترین پیش تیمار برای ذخیره سازی بلند مدت بذر این گونه در شرایط فراسرد بود.

واژه‌های کلیدی: Centaurea lachnopus، نگهداری بذر در فراسرد، گونه مرتعی، گونه در معرض خطر.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02636770810 ، پست الکترونیکی: jebelly@rifr-ac.ir

مقدمه

 

گونۀ  Centaurea lachnopus Rech. fگیاهی بیابانی، دو یا چندساله از خانواده Asteraceae است. بر اساس گزارشهای موجود (14) رویشگاه‌های این گونه در بین سمنان- دامغان و سرخه (سمنان) در ارتفاع 1400 متر از سطح دریا می‌باشد (شکل 1). همچنین رویشگاه‌های این گونه را بیابان گچی حوالی سرخه ارتفاع 1600 متر، 7-2 کیلومتری سرخه ارتفاع 1400-1300 متر، سمنان به طرف فیروزکوه ارتفاع 1350 متر نیز گزارش کرده‏اند (15). در بررسی فلور ناحیۀ گرمسار و شکل‌های زیستی و کوروتیپ‌های گیاهان این منطقه، به حضور این گونه در منطقه گرمسار (1) و دامغان (3) اشاره شده ولی مکان دقیق رویشگاه (های) این گونه مشخص نشده است. با توجه به اینکه گونه‌C. lachnopus  و رویشگاه آن به شدت در معرض تهدید و تخریب است، حفظ و حراست از آن از اولویت بالایی برخوردار می‌باشد.


 

شکل 1- گیاه چند ساله (راست) و جوان (چپ) Centaurea lachnopus در عرصه رویشگاهی سمنان

 

ذخیره‌سازی بذر یا اندام گیاه در ازت مایع (Cryopreservation) امکان نگهداری طولانی مدت بذرها و اندام‌های گیاهی را امکان پذیر می‌کند. ذخیره‌سازی ژرم‏پلاسم گیاهی در دمای فراسرد یا برودت C°196- در اواخر قرن گذشته وارد مرحله عملی شد. اجرایی شدن روش‌های آزمایشی و نگهداری گستردۀ اندام‌های گیاهی در شرایط فراسرد و دستیابی به روش مناسب، نیاز به تحقیقات و بررسی‌های وسیعی دارد (16). استفاده از پیش تیمار‌های مناسب، استفاده از مواد محافظت‏کننده با غلظت‌های بهینه، دمای مناسب، سرما‏دهی تدریجی و ... در گونه‌های گیاهی مختلف باید مورد بررسی قرار گیرد تا روش بهینه بدست آید. به همین دلیل بهینه‌سازی روش‌ها از ضروریات کار بوده و موفقیت ذخیره‌سازی بذر یا اندام گیاهی در فراسرد بستگی به تحقیقات گسترده در زمینه‌های فوق دارد. زنده‌مانی نمونه‏های گیاهی در فراسرد و میزان رشد مجدد نمونه‌ها پس از خروج از شرایط فراسرد، تولید گیاه کامل و سایر عوامل می‌تواند مورد تجزیه و تحلیل علمی قرار گرفته و کارآیی هر روش مورد ارزیابی قرار گیرد و بعد بر اساس نتایج، روش ذخیره‌سازی بهینه تعیین گردد )8(. ازاین‌رو با بهینه‌سازی روش و استفاده از مواد و تیمار‌های مناسب می‌توان به نتایج مطلوبی در ذخیره‌سازی نمونه‌‌های گیاهی در شرایط فراسرد دست یافت (18).

در بررسی روش‌های فراسردی (20) اثر پیش تیمارهای ویتریفیکاسیون و دهیدراتاسیون- کپسوله‌کردن در زنده‌مانی نمونه‌های گیاهی در شرایط فراسرد مورد مطالعه قرار گرفت. درصد زنده‌مانی نمونه‌ها پس از خروج از ازت مایع و اعمال شوک حرارتی، برای پیش تیمارهای مختلف به شدت متفاوت بود. به‌طوری‌که در پیش‌تیمار ویتریفیکاسیون، درصد زنده‌مانی%33 و در آبگیری %60 بود. این اختلاف چشمگیر حاکی از تأثیر پیش‏تیمار در میزان زنده‌مانی نمونه در شرایط فراسرد می‌باشد.

بهینه‌سازی رطوبت بذر قبل از ورود به شرایط فراسرد یا برودت C°196- نیز تأثیر مهمی در زنده‌مانی نمونۀ گیاهی در شرایط فراسرد دارد. در همین رابطه بذر سه گونه پسته شامل P. vera، P. terebinthus وP. lenticus که جزء بذرهای روغنی و درشت‌اند مورد بررسی قرار گرفتند. مقدار رطوبت بذر هر یک از گونه‌ها برای نگهداری در شرایط فراسرد متفاوت بود. به‌طوری‌که در P. vera درصد رطوبت مناسب 7/11% و در دو گونه دیگر، رطوبت 20% مناسب‌ترین رطوبت برای حداکثر جوانه‌زنی پس از طی مراحل فراسرد بود (13). بذر گونه Najas flexilis که ازگونه‌های آبزی آبهای شیرین است، برای نگهداری در شرایط فراسرد باید رطوبت بذر تا 15% کاهش و بعد وارد ازت مایع گردد (10). ازاین‌رو کیفیت و سلامت بذر، رطوبت نسبی محیط رشد گیاهچه و شرایط افزایش دمای بذر پس از خروج از ازت مایع یا برودت C°196- نقش اساسی در زنده‌مانی و رشد بذرها دارند (7). استفاده از اندام‌های رویشی مانند محور جنینی و نمونه‌های کشت بافتی گونه‌هایی مانند مرکبات در شرایط فراسرد با هدف ایجاد ژرم‏پلاسم، دستاوردی است که با استفاده از آن می‌توان نسبت به نگهداری اندامهای رویشی مرکبات و سایر ارقام برای بلندمدت استفاده کرد (6). همچنین نگهداری اندام‌های رویشی مانند محورهای جنینی و سایر اندام‏های رویشی گونه‌هایی که نگهداری بذر آنها در شرایط متعارف امکان‌پذیر نیست، مانند گونه‌های جنس بلوطQuercus) ) که بذرهای ریکالسیترنت (Recalcitrant) دارند، افقی روشن و پایدار در حراست از این گونه‌های مهم و ارزشمند است (9). بر اساس بررسی منابع علمی، عمده مطالب منابع خارجی، محدود می‌شود به اینکه این گونه از ایران گزارش شده (14) و گزارشهای داخلی نیز اغلب در مورد پراکنش این گونه در زیر حوزه ایران مرکزی (2)، یا در قالب معرفی فلور، شکل‌های زیستی و پراکنش جغرافیائی گیاهان مرتعی (3) می‏باشد. در این گزارشها به وضعیت در خطر بودن آن در عرصه‏های طبیعی نیز اشاره‌ای گذرا شده است (3). اما در مورد نحوه حفظ و حراست از این گونه، روش رویاندن بذر، تولید نهال و نگهداری بلندمدت بذر این گونۀ در معرض خطر به‌ویژه نگهداری بلندمدت آن در فراسرد تا جایی که بررسی شده هیچگونه گزارشی وجود ندارد. یافته‌های این تحقیق، به اغلب خلأهای مربوط به جمع‌آوری، جوانه‌زنی بذر، رویاندن گیاه و استقرار آن در گلخانه پاسخ خواهد داد. مضافاً اینکه امکان نگهداری بلندمدت بذر در فراسرد با هدف جلوگیری از انقراض و محو شدن آن از عرصه‏های رویشگاهی گیاه و ارائۀ راهکاری روشن و کاربردی در این زمینه به عنوان هدف اصلی پرداخته شده است.

مواد و روشها

بررسی‌های آزمایشگاهی: محل جمع آوری بذر: بذر این گونه از استان سمنان، شهرستان سمنان، جاده سمنان- فیروزکوه، سه راهی سرخه جمع‏آوری شد. مختصات و مشخصات مکانی عرصۀ مورد بررسی این گیاه بین عرض جغرافیایی35° 32' 04ʺ  و 35° 30' 31ʺ شمالی و طول جغرافیایی  53° 11' 32ʺو53° 14' 03ʺ  شرقی به وسعت تقریبی 15 کیلومترمربع و ارتفاع حدود 1450 متر (در قسمت شمالی) و 1200 متر (قسمت جنوبی) رویشگاه می‌باشد (شکل 2) (قسمت هاشورزده).

 

شکل 2- عرصۀ رویشگاهی عمده Centaurea lachnopus در حدود 20 کیلومتری مسیر سمنان- فیروزکوه، در اطراف سه راهی سرخه (قسمت هاشورزده)

وزن هزار دانه بذر این گونه 23/42 گرم و اشکال مختلف بذر در شکل 3 ارائه شده است.

بررسی جوانه‌زنی بذرها: قبل از انجام آزمایشهای فراسرد، بررسی‌های مقدماتی متعددی از قبیل خراش بذر با سمباده، شستشوی بذر با آب جاری، تیمار تاریکی و نور، تیمار‌های دمایی مختلف و روش‌های ضد‌عفونی بذر انجام شد. با توجه به اینکه استفاده از هیپوکلریت سدیم در ضدعفونی بذر باعث کاهش شدید جوانه‌زنی بذر گردید، این ماده از ضد‌عفونی بذر حذف شد. بر اساس نتایج آزمایشهای مقدماتی، بهترین روش جوانه‌زنی بذر C. lachnopus به‌شرح زیر است: ابتدا باید استحصال بذر و حذف کرکهای انتهایی بذر انجام شود (شکل3).

 

شکل 3- گل رسیدۀ خشک شده  C. lachnopus(راست)، بذر کرکدار (وسط) و بذر کرک‌زدایی شده (چپ)  

 

سپس بذرها با سمباده شماره 100 خراش ملایم داده شده و به شیشه‌های در‌دار منتقل و با تکان شدید شستشو شوند. بعد از این مرحله آب را تخلیه کرده و به شیشه‌ها آب استریل اضافه کرده و این مرحله را تا 6 بار در شرایط استریل تکرار می‌نماییم. سپس بذرها را بین کاغذ استریل مرطوب در درون پتری‌دیش قرار داده و به ژرمیناتور با دمای C°24+ در شرایط تاریکی منتقل می‌کنیم (شکل 4).

 

شکل 4- جوانه‌زنی بذرهای شاهد Centaurea lachnopus در شرایط آزمایشگاه

آزمایش نگهداری بذر در فراسرد (Cryopreservation): پیش‌تیمارهای فراسرد‌ یا تیمارهای قبل از ورود بذرها به ازت مایع به شرح زیر می‌باشد:

(Plant Vitrification Solution 2) PVS2: به لوله‌های آزمایش در‌‌ب‌‌دار 15 میلی‌لیتری حاوی بذر محلول لودینگ شامل: 4/0 مول ساکارز و 2 مول گلیسرول (11) اضافه و بمدت 20 دقیقه در دمایC°22+ قرار داده شدند. محلول را کاملاً تخلیه و به لوله‌های آزمایش حاوی بذر محلول PVS2 (C°4+) شامل: 15 درصد اتیلن‌گلیکول (w/v)، 15 درصد (w/v) DMSO، 30 درصد گلیسرول (w/v) و 4/0 مول ساکارز (17) اضافه کرده و 20 دقیقه در آب C°‌4 + قرار داده شدند. سپس لوله‌های آزمایش در‌دار حاوی بذر بلا‌فاصله وارد ازت مایع گردیدند.

Desiccation یا آبگیری: آزمایشهای مقدماتی به منظور یافتن حداقل رطوب بذر، بدون وارد آمدن صدمه به جوانه‌زنی آن انجام شد. به منظور تعیین رطوبت کل بذر، حدود 10 گرم بذر با ترازوی حساس توزین و به‌عنوان وزن اولیه بذر( FW) یادداشت شد. سپس بذرها بمدت 72 ساعت در آون با دمای C°75 قرار داده شدند. بذرها از آون خارج و بلافاصله با ترازوی حساس توزین و وزن خشک بذر (DW) بدست آمد. درصد رطوبت کل بذر با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

Total Seed Moisture Content (%) = (FW - DW)/DW*100

به منظور تهیه بذر مورد نیاز این تیمار، مقدار 5 گرم بذر تازه توزین و به دسیکاتور حاوی 100 گرم سیلیکاژل منتقل و بمدت 9 روز در سردخانه با دمای C°4+ نگهداری گردید. بذرها از دسیکاتور خارج و با ترازوی حساس توزین و درصد رطوبت بذر پس از خشک شدن در دسیکاتور با استفاده از فرمول فوق محاسبه شد. با در دست داشتن رطوبت کل بذر (87/3 در صد) و مقدار رطوبت بذر پس از خروج از دسیکاتور(55/2 درصد)، درصد کاهش رطوبت بذر در دسیکاتور نسبت به کل رطوبت بذر محاسبه گردید که این کاهش برابر 12/34 درصد رطوبت کل بذر بود. بذرها به لوله‌های آزمایش دردار 15 میلی‌لیتری منفذدار منتقل و بلافاصله وارد ازت مایع شدند.

گلیسرول 30 درصد (Glycerol): لوله‌های آزمایش در‌‌دار 15 میلی‌لیتری حاوی بذر، با گلیسرول 30 درصد پر، درب آنها را بسته و به مدت 20 دقیقه در دمای C°22+ قرار داده شدند. پس از آن لوله‌های آزمایش حاوی بذر وارد ازت مایع گردیدند.

بذرهای شاهد: سه نمونه بذر به‌عنوان بذرهای شاهد برای استفاده در آزمایشهای یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال به عنوان کوتاه مدت، میان مدت و نسبتاً بلند مدت در C°1±23+ نگهداری و به‌عنوان شاهد آزمایشها از آنها استفاده شد.

مدت زمان نگهداری بذرها در ازت مایع: بذرها به مدت یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال در داخل ازت مایع یا C°196- نگهداری شدند.

تیمارهای پس از خروج بذر از ازت مایع: بر اساس آزمایشهای مقدماتی بهترین تیمار پس از خروج بذرها از ازت مایع به شرح زیر به دست آمد. ابتدا بذرها پس از خروج از ازت مایع به مدت 2 دقیقه در آب C°42+ قرار داده شدند. آنگاه بذرها از آب گرم خارج و بمدت 30 دقیقه در محلول ساکارز استریل 5/1 مول قرار گرفتند. در شرایط استریل بذرها 6 بار با آب مقطر استریل شستشو و بعد بین کاغذ مرطوب استریل در داخل پتری دیش قرار داده شدند. پتریهای حاوی بذر به ژرمیناتور با دمای C°24+ با شرایط تاریکی منتقل گردیدند.

طرح آزمایشی: طرح آزمایشی فاکتوریل با دو فاکتور شامل پیش تیمارهای فراسرد و زمان ذخیره‌سازی در ازت مایع با بکارگیری طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار مورد استفاده قرار گرفت. پیش تیمارهای فراسرد شامل PVS2، Desiccation، گلیسرول 30 درصد و شاهد تشکیل دهنده سطح فاکتور A و سه دوره زمانی یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ذخیره‌سازی بذرها در ازت مایع تشکیل دهنده 3 سطح فاکتور B در این آزمایش بودند. پتری‌دیش‌ها هر یک با 25 بذر واحدهای آزمایشی محسوب شدند. صفات مورد بررسی و اندازه‌گیری در این آزمایش عبارت بودند از: درصد جوانه‌زنی، طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه، طول گیاهچه، شاخص بنیه بذر (VI)، سرعت جوانه‌زنی و نسبت طول ریشه‌چه به ساقه‌چه (R/S). شاخص بنیه بذر با استفاده از روش زیر (4) محاسبه شد:

100/ درصد جوانه‌زنی × میانگین طول گیاهچه به میلی‌متر (مجموع طول ساقه‌چه و ریشه‌چه)= شاخص بنیه بذر

تجزیه واریانس داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم افزار SAS انجام شد.

بررسی‌های گلخانه‌ای:بذرها پس از خروج از ازت مایع و اعمال تیمارهای پس از خروج از ازت مایع همراه با نمونه شاهد در گلخانه در گلدان‌های با قطر 15 سانتیمتر و طشت‌های بزرگ با ارتفاع 15 سانتی‌متر و قطر 60 سانتی‌متر حاوی ماسه‌بادی کشت شدند. عمق کشت 5/2 سانتی‌متر در نظر گرفته شد. بذرها هر هفته یکبار آبیاری گردیدند. درصد استقرار و سبز شدن بذرها اندازه‌گیری گردید. طرح آزمایشی مورد استفاده فاکتوریل و پیش تیمارها، تکرارها و تیمارهای زمان ذخیره سازی در ازت مایع بکار رفت. داده‌های حاصل از آزمایش و مقایسه میانگین‌ها با نرم افزار SAS انجام شد.

نتایج

بررسی‌های آزمایشگاهی: بذرها پس از گذراندن یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال از ازت مایع خارج و پس از اندازه‌گیری صفات، داده‌های آزمایشی به همراه بذر شاهد مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. تأثیر پیش تیمارهای مختلف فراسردی بر میانگین کل صفات مورد بررسی در جدول 1 ارائه شده است.

 

جدول1- اثر پیش‌تیمار‌های فراسردی بر میانگین درصد جوانه‌زنی، طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه، طول گیاه‌چه، سرعت جوانه‌زنی، بنیه بذر و نسبت طول ریشه‌چه به ساقه‌چه (R/S) بذرهای  Centaurea lachnopusذخیره‌شده در ازت مایع

پیش‌تیمار

جوانه‌زنی

(درصد)

طول ریشه‌چه

(میلی‌متر)

طول ساقه‌چه

(میلی‌متر)

طول گیاه‌چه

(میلی‌متر)

سرعت جوانه‌زنی

 

شاخص بنیه

(VI)

طول ریشه‌چه‌ و طول ساقه‌چه

شاهد

11/35 *a±5/0

58/26 a±5/0

08/37 a±7/0

67/63 a±1

64/7 a±1/0

72/22 a±5/0

72/0 ab±07/0

گلیسرول %30

 28b±1

20 c±8/0

83/25 c±8/0

83/45 c±5/1

43/4 c±2/0

86/12 c±5/0

 78/0a±07/0

Desiccation

67/32 a±8/0

47/23 b±5/0

78/32 b±1

25/56 b±1

26/5 b±1/0

47/18 b±7/0

72/0 ab±07/0

PVS2

67/20 c±1/0

53/16 d±4/0

61/23 c±6/0

14/40 d±1

99/2 d±1/0

29/8 d±4/0

7/0 b±07/0±

*: در هر ستون، میانگین‌هایی که دارای حرف یا حروف مشترک هستند در سطح 1% معنی‌دار نمی‌باشند.

 

میانگین درصد جوانه‌زنی بذرهای شاهد از نظر آماری تفاوتی با بذرهای فراسردی در تیمار Desiccation نشان نمی‌دهند (به ترتیب 11/35 درصد و 67/32 درصد)، اما پیش تیمارهای PVS2 و گلیسرول %30 به ترتیب کمترین میانگین‌ها را در بین پیش تیمارهای فراسردی دارند. این نتایج حاکی از تأثیر کم پیش تیمارهای اخیر در جوانه‌زنی و سایر صفات اندازه‌گیری شده مربوط به بذرهای ذخیره شده در ازت مایع است.

اثر متقابل پیش تیمارهای مختلف فراسردی شامل گلیسرول 30 درصد، Desiccation و PVS2 همراه با بذرهای شاهد و زمانهای نگهداری بذرها در ازت مایع بر میانگین صفات مختلف، در جدول 2 به تفصیل ارائه شده است.

 

جدول 2- اثر پیش‌تیمارهای مختلف و زمان‌های نگهداری بذر Centaurea lachnopus در ازت مایع بر میانگین درصد جوانه‌زنی، طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه، طول گیاه‌چه، سرعت جوانه‌زنی، بنیه بذر و نسبت طول ریشه‌چه به طول ساقچه (R/S)

زمان نگهداری

پیش‌تیمار

درصد جوانه‌زنی

 

طول

ریشه‌چه

)میلی‌متر(

طول

ساقه‌چه

)میلی‌متر (

طول

گیاهچه

)میلی‌متر)

سرعت

جوانه‌زنی

)میلی‌متر(

شاخص

بنیه

(VI)

طول ریشه‌چه به ساقه‌چه

یک‌هفته

شاهد

33/44* a±5/0

67/26 ab±7/0

33/38 ab±9/0

65 ab±1

53/10a±1

83/28 a±7/0

70/0 b±07/0

 

گلیسرول %30

67/32 cd±2

42/20 de±1

25 e±1

42/45 ef±2

05/5 bc±1

70/14 c±4/0

82/0 a±08/0

 

Desiccation

67/37 bc±1

75/23 bcd±1

17/34 bc±2

92/57 bc±2

98/5 b

87/21 b±5/1

7/0 b±07/0

 

PVS2

67/22 ef±2

67/16 f±7/0

75/23 e±1

42/40 ef±1

42/3 de

05/9 de±4/0

7/0 b±07/0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

یک‌ماه

شاهد

41 ab±1

67/27 a±5/0

58/39 a±2

25/67 a±2

46/9 a±5/0

59/27 a±6/1

71/0 b±07/0

 

گلیسرول %30

31 d±1

42/20 de±1

08/27 de±1

50/47 de±2

36/5 b±5/0

85/14 c±7/1

75/0 ab±07/0

 

Desiccation

33/34 cd±5/0

75/23 bcd±6/0

33/33 c±1

08/57 c±1

78/5 b±1

61/19 b±8/0

71/0 b±07/0

 

PVS2

21 ef±8/0

08/17 ef7/0

17/24 e±1

25/41 ef±2

16/3 de±1

71/8 de±8/0

71/0 b±07/0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

یکسال

شاهد

20 f±0

42/25 abc±1

33/33 c±3/0

75/58 bc±1

92/2 de±1

75/11 cd±3/0

76/0 ab±07/0

 

گلیسرول %30

33/20 f±1

17/19 ef±7/0

42/25 e±9/0

58/44 ef±1

88/2 de±1

01/9 de±2/0

76/0 ab±07/0

 

Desiccation

26 e±1

92/22 cd±9/0

83/30 cd±1

75/53 cd±2

02/4 dc±1

92/13 c±8/0

74/0 ab±07/0

 

PVS2

33/18 f±1

83/15 f±3/0

92/22 e±3/0

75/38 f±6/0

40/2 e±1

10/7 e±5/0

69/0 b±07/0

*در هر ستون، میانگین‌هایی که دارای حرف یا حروف مشترک هستند در سطح 1% معنی‌دار نمی‌باشند.

 

درصد جوانه‌زنی بذر شاهد در شرایط ایده‌آل (یک‌هفته ذخیره‌سازی در شرایط عادی) 33/44 درصد بوده و بیش از 55 درصد از بذرها قادر به جوانه‌زنی نبودند. از طرفی جوانه‌زنی بذرهای شاهد با گذشت زمان به سرعت کاهش یافته و پس از یک‌ماه و یکسال به ترتیب به 41 و 20 درصد کاهش یافت. شاخص بنیه بذر نیز با همین روند کاهش پیدا کرده و پس از یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ماندگاری (در شرایط عادی) به ترتیب به 83/28، 59/27 و 75/11 درصد رسید. اما طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه و طول گیاه‌چه تغییر ناچیزی را نشان دادند که این تغییرات نامحسوس نشان می‌دهد بذرهای شاهد در صورت جوانه‌زنی به طور عادی شروع به رشد و نمو می‌کنند.

بذرهای فراسردی که پس از پیش‌تیمار با گلیسرول 30 درصد،Desiccation  وPVS2 وارد ازت مایع شده‌اند، نشان دادند که بذر این گونه به خوبی شرایط فراسرد را تحمل کرده و قابل نگهداری در شرایط فراسرد هستند. در عین‌حال تفاوت معنی‌داری بین پیش تیمار‌های مختلف برای اغلب صفات مشاهده شد.

اثر متقابل مدت زمان نگهداری بذرها در شرایط فراسرد و پیش تیمارهای مختلف بر میانگین صفات نشان می‌دهند که درصد جوانه‌زنی بذر در تیمار یکسال ذخیره سازی در ازت مایع در کلیه پیش تیمارها کاهش نشان می‌دهند.

در بین پیش تیمارها، Desiccation بیشترین درصد جوانه‌زنی را به ترتیب 67/37، 33/34 و 26 درصد، برای یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ذخیره سازی در فراسرد نشان می‌دهد. پس از آن تیمار گلیسرول 30 درصد و متعاقب آن PVS2 قرار دارد. داده‌های جوانه‌زنی و سایر صفات مورد بررسی نشان می‌دهد که تیمار‌های گلیسرول 30 درصد و PVS2 در مقایسه با Desiccation تأثیر کمتری در حفاظت از بذرها در شرایط فراسرد دارند. در بین صفات مورد بررسی، سرعت جوانه‌زنی و شاخص بنیۀ بذر در تیمار‌های فراسردی روندی همانند درصد جوانه‌زنی نشان می‌دهند. اما صفات طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه و طول گیاهچه و نسبت طول ریشه‌چه بر طول ساقه‌چه (R/S) روند تغییرات کمی را در مدت زمان‌های ذخیره‌سازی در بین پیش تیمار‌های مختلف نشان می‌دهند. نتایج بررسی‌ها نشان می‌دهد که پیش تیمار Desiccation بهترین پیش‌تیمار برای نگهداری بذر این گونه در شرایط فراسرد می‌باشد.

بررسی‌های گلخانه‌ای: شرایط گلخانه بدلیل حضور عوامل طبیعی مانند خاک، نور، عوامل بیولوژیک، میکرو‌ارگانیسم‌ها و سایر عوامل، به عرصه طبیعی نزدیک‌تر می‌باشد. در آزمایشهای گلخانه‌ای، استقرار گیاه در گلدان مورد بررسی قرار گرفت. اثر پیش تیمارهای مختلف و مدت زمان ذخیره‌سازی بذر در ازت مایع بر استقرار و رشد گیاهان در شرایط گلخانه در جدول 3 و شکل 5 ارائه شده است.

 

جدول 3- اثر پیش‌تیمارهای مختلف و زمانهای نگهداری بذر Centaurea lachnopus در فراسرد بر استقرار و رشد نهال در شرایط گلخانه

زمان ذخیره سازی

پیش‌تیمار

درصد استقرار گیاه‌چه

یک‌هفته

شاهد

45* a±5/2

 

گلیسرول 30 درصد

67/17 d±2/1

 

Desiccation

30 b±3/4

 

PVS2

20 d±5/2

 

 

 

یک‌ماه

شاهد

33/43 a±4/1

 

گلیسرول 30 درصد

67/21 cd±4/1

 

Desiccation

67/31 b±4/1

 

PVS2

33/18 d±4/1

 

 

 

یکسال

شاهد

20 d±5/2

 

گلیسرول 30 درصد

67/14 d±2/0

 

Desiccation

33/28 bc±8/3

 

PVS2

33/19 d±5/0

*: در هر ستون، میانگین‌هایی که دارای حرف یا حروف مشترک هستند در سطح 1% معنی‌دار نمی‌باشند.

 

a                                                                      b 

شکل 5- استقرار بذر گیاهان فراسردی Centaurea lachnopus پس از یک‌ماه ماندگاری در ازت مایع (a) در گلدان و طشت (b) در شرایط گلخانه

 

براساس داده‌های جدول 3 حداکثر استقرار بذرهای شاهد در یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ماندگاری در شرایط عادی، به ترتیب 45 درصد، 33/43 درصد و 20 درصد می‌باشد که تقریباً مشابه شرایط آزمایشگاهی است. از بین پیش‌تیمارهای فراسردی، Desiccation با میانگین 30 درصد (67/31 درصد و 33/28 درصد) بیشترین میانگین استقرار را داشته و بعد PVS2 با میانگین 20 درصد (33/18 درصد و 33/19 درصد) روند ثابت بدون اختلاف معنی‌دار را در یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ذخیره‌سازی در فراسرد داشته و پس از آن گلیسرول 30 درصد با میانگین استقرار 67/17 درصد ( 67/21 درصد و 67/14 درصد) به ترتیب برای یک‌هفته، یک‌ماه و یکسال ذخیره‌سازی در فراسرد، کمترین مقدار را با روند غیریکنواخت داشته است (شکل 6).


درصد استقرار

a

a

d

d

cd

d

b

b

bc

d

d

d

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

یک‌هفته

یک‌ماه

 

شاهد

گلیسرول 30% 

Desiccation

PVS2

 

یک‌سال

شکل 6- اثر پیش‌تیمارهای مختلف و زمانهای نگهداری بذرCentaurea lachnopus در ازت مایع بر استقرار و رشد نهال در شرایط گلخانه


بحث

نتایج بررسی‌های آزمایشگاهی نشان می‌دهد که بذر C lachnopus  قابل نگهداری در شرایط فراسرد یا C°196- بوده و بخوبی شرایط فراسرد را تحمل می‌کند و قابل ذخیره‌سازی طولانی مدت است. میزان رطوبت بذر C lachnopus بسیار کم و در حد 87/3 درصد و بذر این گونه جزء بذرهای اُرتدوکس محسوب می‌شود. بذر این گونه پس از رسیدن به سرعت توسط آفات بذر‌خوار در روی بوته پارازیته می‌شود. بر اساس آزمایشهای این پژوهش، درصد جوانه‌زنی بذر این گونه در بهترین حالت 33/44 درصد بود که این درصد برای گونه بیابانی طبیعی می‌باشد. درعین‌حال شرایط فراسرد باعث کاهش درصد جوانه‌زنی، بنیۀ بذر و سرعت جوانه‌زنی می‌گردد. در این رابطه باید گفت که بذرها پس از قرار گرفتن در شرایط فراسرد تا حدی بنیۀ خود را از دست داده و درصدی از بذرها نیز که تحمل شرایط فرا‌سرد را ندارند، پس از خروج از فراسرد توان جوانه‌زنی خود را از دست می‌دهند (12)، این کاهش بنیه و جوانه‌زنی در یک مقطع و در زمان ورود بذر یا اندام گیاهی به فرا سرد رخ می‌دهد و پس از آن در طی زمان تقریباً ثابت مانده و تغییر نمی‌کند. در این تحقیق بعضی از صفات مانند درصد جوانه‌زنی، بنیۀ بذر و سرعت جوانه‌زنی در یکسال ذخیره‌سازی در فراسرد در مقایسه با یک‌هفته ذخیره‌سازی، کاهش معنی‌داری را نشان داد. به لحاظ تئوریک و محاسبات انجام شده، این کاهش منطقی به نظر نمی‌رسد. زیرا در محیط فراسرد فعالیت‌های متابولیکی و زیستی سلول به شدت و تا نزدیک به صفر کاهش یافته و به همین نسبت مدت زمان زنده‌مانی افزایش می‌یابد. در رابطه با مدت زمان ماندگاری بذر یا اندام گیاهی در شرایط فراسرد، به طور کلی بذر یا اندام‌های رویشی مانند بذر گونه‌های جنس بلوط (Quercus)، و بذر شاه بلوط (Castanea.sativa) که توان زنده‌مانی در فراسرد را نداشته باشند به محض ورود به ازت مایع و یکنواخت شدن با دمای پیرامونی خود (C°196-) بلافاصله از بین می‌روند. در صورتیکه بذر یا اندام گیاهی فضای فراسرد را تحمل کند، براساس اصول تئوریک و محاسبات ترمودینامیک (5) که بر روی بذر کاهو انجام شده نیمه عمر جوانه‌زنی بذر تا سه هزار و چهار صد سال حفظ می‌‌گردد (19).

با توجه به مباحث فوق، دلیل کاهش درصد جوانه‌زنی، بنیۀ بذر و سرعت جوانه‌زنی در تیمار یکسال ذخیره‌سازی در ازت مایع در مقایسه با یک‌هفته، به احتمال زیاد به دلیل وجود عوامل اثر‌گذار و غیرقابل پیشگیری مانند زمان اجرای آزمایشها و غیره بوده است. به عنوان نمونه، آزمایش یکسال ماندگاری در ازت مایع حدود یکسال بعد از تیمار یک‌هفته انجام شده است. ولی مشاهده شد که سایر صفات مانند طول ریشه‌چه، طول ساقه‌چه، طول گیاهچه و نسبت طول ریشه‌چه به ساقه‌چه یا از نظر آماری تفاوت معنی‌دار برای زمان‌های ذخیره‌سازی نشان نمی‌دهند و یا میزان تفاوت بسیار نا‌چیز می‌باشد. عدم وجود تغییرات نشان می‌دهد که بذرها زنده مانده بخوبی رشد کرده و تفاوتی بین زمان‌های ذخیره‌سازی وجود ندارد. تأثیر پیش تیمارهای فراسردی (گلیسرول 30%PVS2 , و Desiccation) بر صفات مورد بررسی در بذرهای فراسردی نشان داد که بیشترین میانگین صفات مربوط به پیش تیمار Desiccation بود. بنابراین در مقایسه با پیش تیمار های گلیسرول 30% و PVS2 این پیش‌تیمار بهترین تأثیر را در حفاظت از بذر در شرایط فراسرد داشته است. تأثیر مثبت Desiccation احتمالا به دلیل کاهش محتوای آب درون سلولی و کاهش شکل‌گیری کریستال‌های یخ درون سلولی در شرایط فراسرد می‌باشد. از طرفی محافظت کم پیش تیمار گلیسرول 30% و به‌ویژه PVS2 از بذر در شرایط فراسرد می‌تواند به دلیل محتوای بیشتر آب درون سلولی (در مقایسه با Desiccation) ویا تأثیر منفی گلیسرول در پیش‌تیمار گلیسرول 30% و یا گلیسرول و سایر مواد شیمیایی موجود در  PVS2 باشد. از این‌رو بهترین پیش تیمار برای نگهداری بذر گونۀ C lachnopus در شرایط فراسرد پیش تیمار Desiccation است.

بررسی‌های گلخانه‌ای نشان می‌دهد که بذرهای فراسردی به‌ویژه در تیمار Desiccation یا آبگیری زنده‌مانی خود را به طور ثابت حفظ کرده و زمان ذخیره‌سازی تغییری در درصد استقرار نداشته است. نتایج نشان داد که بذر این گونه در شرایط خاک بهتر از شرایط آزمایشگاه جوانه زده و مستقر می‌شود. میزان بالای بذرهای مستقر شده در شرایط گلخانه در مقایسه با شرایط آزمایشگاه می‌تواند به دلیل شرایط ناشناختۀ اثر‌گذار بوده باشد ویا شرایط گلخانه برای جوانه‌زنی و استقرار گیاه مناسب‌تر از شرایط آزمایشگاه است. نکته حائز اهمیت اینکه بذرهای فراسردی و شاهد C.lachnopus به خوبی توان رشد و استقرار در محیط گلخانه را دارند.

مباحث کلی در رابطه با اهمیت حفظ و حراست از این گونه اندمیک، کمیاب و در حال خطر بصورت زیر قابل ارائه است. گسترۀ پراکنش و دامنه اکولوژیک این گونه بسیار محدود می‌باشد. این گونه منحصراً در خاکهای عمدتاً کم عمقی که بر روی سازندهای گچی قرار دارند رشد می‌کند. استقرار آن در بستر یا مسیر رودهای خشک فصلی یا نقاطی که در آنها تا حدودی آب باران جمع می‌شود و یا در دامنه‌های رو به شمال تپه‌های کوچک این عرصه است. از منظر پراکنش جغرافیایی، در شعاع محدود در بعضی از نقاط استان سمنان رویش دارد. به لحاظ حفاظتی، بر اساس گزارش کریمی (3) این گونه در طبقۀ با خطر کمتر (Low Risk= LR) دسته بندی شده است. با توجه به اهمیت گیاه به دلیل در معرض خطر بودن، بررسی‌های مستمر و چند ساله‌ای از روند رویشگاه و حضور این گونه در رویشگاه اصلی آن در شهرستان سمنان، جاده فیروزکوه، سه راه سرخه (حدود 20 کیلومتری سمنان) طی سال های 1390-1386 بعمل آمده که شعاع انتشار گیاه در این رویشگاه حدود 15 کیلومتر مربع می‌باشد (شکل 2). با پیمایش عرصه و بررسی دقیق رویشگاه، ارتفاع رویشگاه از 1300 متر (کمی پائین‌تر از سه راه سرخه) تا ارتفاع 1450 متر( حدود 3 کیلومتر بالاتر از سه راه سرخه به طرف فیروزکوه) و 2 کیلومتری شمال شرقی سه راه سرخه (در دامنۀ رو به شمال تپه ارتفاع حدود 1378 متر) مشخص شد. با بررسی‌های کامل این عرصه، تعداد پایه‌های این گونه در این رویشگاه حدوداً صد پایه تخمین زده شد. با اینکه کریمی (3) این گونه را با خطر کمتر معرفی کرده است، اما بر اساس بررسی‌های میدانی و پیمایش منطقه، به دلیل گسترش فعالیت های معدنی- صنعتی، باید گفت رویشگاه این گونه در معرض نابودی، و موجودیت این گونه به شدت در معرض انقراض می‌باشد. طی بررسی‌های سالانه از عرصه رویشگاهی تا سال 1389 علاوه بر گسترش کارخانه‌های گچ، تپۀ واقع در شمال شرق سه راهی سرخه به دلیل استخراج سنگ گچ تقریباً این رویشگاه تخریب و از بین رفته بود.

با توجه به مباحث فوق، این گونه یکی از گونه‌های نادر با دامنه اکولوژیک بسیار محدود و رویشگاه آن به دلیل گسترش فعالیت‌های صنعتی- معدنی در حال نابودی می‌باشد. از طرفی به دلیل چرای مفرط عرصۀ رویشگاهی، بقای گیاه به شدت در معرض خطر انقراض است. با در نظر گرفتن اینکه بذر این گونه قابل نگهداری بلند مدت در شرایط فراسرد می‌باشد، پیشنهاد می‌گردد در اولین اقدام، بذر این گونه از عرصۀ رویشگاهی جمع‌آوری و با اعمال پیش‌تیمار مناسب در شرایط فراسرد نگهداری تا در صورت بروز خطر و حذف گونه از طبیعت، بذری برای کشت و استقرار مجدد در گلخانه و عرصه وجود داشته باشد. همچنین توصیه می‌شود در اولین فرصت طرحی در زمینه کشت این گونه در عرصه رویشگاهی و خارج از رویشگاه با هدف تکثیر گیاه و تولید بذر ارائه گردد. از طرفی از هر گونه بهره‌برداری و تصویب طرح‌هایی که منجر به بهره برداری از گیاه یا بذر آن از طبیعت باشد باید جداً جلوگیری شود. بعلاوه توصیه می‌شود بخش اجرا به هر نوع ممکن از تخریب عرصه جلوگیری و نسبت به حفاظت این گونه و عرصه‌های رویشگاهی آن اقدام کند.

سپاسگزاری

از مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور که اعتبارات مورد نیاز این تحقیق را در قالب طرح مصوب "بررسی امکان نگهداری بذر تعدادی از گونه‌های مرتعی و بیابانی در شرایط فراسرد" تأمین کرد، تشکر می‌گردد. از جناب آقای مهندس طاهری (هرباریوم مرکز تحقیقات منابع طبیعی و امور دام سمنان) که نسبت به عزیمت و شناسایی رویشگاه گیاه مساعدت کردند و از راهنمایی جناب آقای دکتر مصطفی اسدی به‌دلیل پیشنهاد گیاه برای بررسی تشکر می‌گردد. از آقای حسین نیکچهره به‌علت راهنمایی در تنظیم متن قدردانی می‌شود.

1- ایرانبخش، ع.، حمدی، م.، اسدی، م، 1387، معرفی فلور، شکل‌های زیستی و کوروتیپ‌های گیاهان منطقه گرمسار در استان سمنان، پژوهش و سازندگی در منابع طبیعی، شماره 79. ص: 199-179.

2- بخشی‌‌خانیکی،غ،1386، درختان و درختچه‌های ایران رشته علوم کشاورزی، انتشارات دانشگاه پیام نور.

3- کریمی، ز، 1388،  معرفی فلور شکل‌های زیستی و پراکنش جغرافیائی گیاهان مرتع شهرستان دامغان، مجلۀعلوم کشاورزی و منابع طبیعی، جلد شانزدهم، شمارۀ1 پیاپی 71. ویژه‌نامۀ 1-الف، ص: 186-200.

 

4- Abdul-Baki, A.A., and Anderson, J.D. 1973. Vigour determination in soybean seed by multiple criteria. Crop Science, 13: 630-633.

5- Avrami, M. 1941. Granulation phase change and microstructure, III. Kinetics of phase change. Journal of Chemical Physics, 9: 177-184.

6- Bachiri, Y., Song, G.Q., Plessis, P., Shoar-Ghaffari, A., Rekab, T., and Morisset, C. 2001. Routine cryopreservation of kiwifruit (Actinidia spp.) germplasm by encapsulation-dehydration: importance of plant growth regulators. CryoLetters, 22(1): 61-74.

7- Dussert, S., and Engelmann, F. 2006. New determinants for tolerance of coffee (Coffea arabica L.) seeds to liquid nitrogen exposure. CryoLetters, 27(3): 169-178.

8- Dussert, S., Englemann, F., and Noirot, M. 2003. Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. CryoLetters, 24: 149-160.

9- Gonzãlez-Benito, M.E., Prieto, R.M., Heradón, E., and Martin, C. 2002. Cryopreservation of Quercus suber and Quercus ilex embryonic axes: in vitro culture, desiccation and cooling factors. CryoLetters, 23(5): 283-290.

10- Hay, F.R., and Muir, J.S.K. 2000. Low temperature survival of Slender Naiad (Najas flexillis) seeds. CryoLetters, 21: 271-278.

11- Matsumoto, T., Sakai, A., and Yamada, K. 1994. Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of wasabi (Wasabia japonica) by vitrification and subsequent high plant. Plant Cell Report, 13:442-446.

12- Naderi Shahab, M., Hatami, F., Tabari, M., and Jafari, A.A. 2009. Cryopreservation and evaluation of chinese arbor-vitae (Biota orientalis) Seeds. Journal of New Seeds, 10(4): 264-276.

13- Ozden-Tokatli, Y., Ozudogru, E.A., Gumusel, F., and Lambardi, M. 2007. Cryopreservation of Pistacia spp. seeds by dehydration and one-step freezing. CryoLetters, 28(2): 83-94.

14- Parsa, A. 1943. Flore I′Iran.  vol. III, Carpifoliaceae-vacciniaceae. Publication du Ministere de l’Education: Museum d'Histoire Naturelle de Tehran. Impremerele Mazaheri, Tehran.

15- Rechinger, K. H. 1977. Flora Iranica. Akademiche Druck-und Verlagsanstalt, Graz, Austria.

16- Reed, B.M. 2001. Implementing cryogenic storage of clonally propagated plants. CryoLetters, 22(1): 97-104.

17- Sakai, A., Kobayashi, S., and Oiyama, I. 1991. Survival by vitrification of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) cooled to -196°C. Journal of Plant Physiology, 137: 465-470.

18- Valladares, S., Toribio, M., Celestino, C., and Vieitez, A.M. 2004. Cryopreservation of embryogenic cultures from mature Quercus suber trees using vitrification. CryoLetters, 25: 177-186.

19- Walters, C., Wheeler, L.J., and Stanwood,  P.C., 2004. Longevity of cryogenically-stored seeds. Cryobiology, 48: 229-244.

20- Wu, Y., Zhao, Y., Engelman, F., Zhou, M., Zhang, D., and Chen, S. 2001. Cryopreservation of apple dormant buds and shoot tips. CryoLetters, 22(6): 375-380.