بررسی تحمل به خشکی ژنوتیپ­های گندم دوروم در شرایط درون شیشه­ای

لیلا اکبری^1*، کیانوش چقامیرزا^1و2 و عزت­اله فرشادفر^1و2

¹ کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات 

² کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژِی مقاومت به خشکی

تاریخ دریافت: 16/2/93                تاریخ پذیرش: 16/5/93

چکیده

واکنش کالوس­های حاصل از کشت رویان‌های بالغ و نابالغ بیست ژنوتیپ گندم دوروم به تنش خشکی در محیط کشت MS حاوی آگار با پنج مقدار مختلف پلی‌اتیلن گلیکول 6000 (200- 0 گرم در لیتر) بررسی شد. ارزیابی ژنوتیپ­ها در قالب طرح کاملاً تصادفی به صورت آزمایش فاکتوریل 5 × 20 انجام شد. صفات سرعت رشد کالوس (میلی‌متر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس، شاخص تحمل کالوس و درصد کلروز کالوس در شرایط تنش مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اثر ژنوتیپ­، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی برای کلیه­ صفات مختلف در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود. تجزیه خوشه‌ای، ژنوتیپ­های مورد مطالعه را بر اساس صفات اندازه­گیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ تحت تنش خشکی به چهار دسته گروه­بندی کرد. ژنوتیپ­های 65-12-3-3 و 75-5-3-5 از ارقام بومی استان کرمانشاه در کشت جنین بالغ در یک گروه بودند، به‌طوری‌که این ژنوتیپ­ها در کشت جنین نابالغ در گروه­های متفاوت تحت عنوان گروه ژنوتیپ­های مقاوم قرار گرفتند. با توجه به نتایج بدست آمده در کشت جنین بالغ و نابالغ، ژنوتیپ شماره­ 75-5-3-5 به علت دارا بودن رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، درصد محتوای آب بیشتر و درصد کلروز پایین­تر در سطوح مختلف خشکی در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه به‌عنوان ژنوتیپ احتمالی متحمل نسبت به خشکی در شرایط درون شیشه­ای شناسایی شد.

واژه­های کلیدی: کشت جنین، تحمل خشکی، گندم دوروم

* نویسنده مسئول، تلفن: 8324820- 0831 ، پست الکترونیکی : Akbari.l1020@gmail.com

مقدمه

گندم دوروم از جنس تریتیکوم (Triticum) و با نام علمی تریتیکوم دوروم (Triticum durum) یک آلوتتراپلویید با تعداد کروموزوم 28 =x 4 = n2 و فرمول ژنوم AABB می­باشد (6). گندم دوروم با داشتن 21 میلیون هکتار سطح زیر کشت، هشتمین رتبه را در میان غلات جهان داراست. در ایران این گیاه با سطح زیر کشت 338 هزار هکتار در استان های خوزستان، لرستان، اصفهان و خراسان در مزارع دیم کشت شده و به صورت مخلوط با گندم نان استفاده می شود. برای تولید ماکارونی و اسپاگتی در سطح جهان کشت داده می­شود و از دیدگاه اقتصادی برای بیشتر کشورها حائز اهمیت است (20، 21). محدودیت منابع آبی و سایر عوامل باعث توجه بیشتر به مطالعه اثرات تنش خشکی و انتخاب ارقام مقاوم به خشکی شده است. روش­های اصلاح سنتی در بررسی تنش­های زنده و غیر زنده با مشکلاتی همانند نبود فضای مناسب، زمان کافی و نیز از بین رفتن زمینه­ ژنتیکی در هنگام مقایسه بین گونه­های وحشی مقاوم با  رقم های زراعی مواجه هستند (13). ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی از طریق روش­های سنتی بسیار وقت­گیر و گاهی غیر ممکن است. بنابراین تکنیک­های متعددی در جهت گزینش ژنوتیپ­های متحمل به خشکی در گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است (23). امروزه از شیوه­ های جدیدتر از جمله کشت بافت برای ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی و سایر عوامل نامساعد استفاده می­شود. در سال­های اخیر تلاش­های زیادی به منظور تولید گیاهان مقاوم در برابر تنش و به‌ویژه متحمل به شوری، با استفاده از تنوع موجود یا ایجاد شده در کشت بافت انجام شده است (10). سیستم کشت بافت برای ارزیابی تحمل به تنش­های محیطی مفید است، زیرا تنش­های محیطی در شرایط درون شیشه­ای به سادگی قابل کنترل هستند (14). انتخاب درون شیشه برای تحمل به تنش غیر زیستی به توسعه مؤثر و معتبر القای کالوس و سیستم­های باززایی گیاه بستگی دارد (11). روش های درون شیشه ای در مطالعات زیادی برای کوتاه کردن دوره­های اصلاحی به کار برده شده­اند. از طریق سلول­های گیاهی کشت شده و بررسی واکنش آنها به تنش­های محیطی مؤثر می­توان اثرات یون­ها، علف کش_­ها، آفت کش­ها و اثرات سمی را که توسط پاتوژن­ها تولید می­شوند، مطالعه کرد (17). زمانی که بافت گیاهی در محیط کشت در سطح سلولی در حال رشد است می­توان آن را تحت تأثیر عوامل تنش قرار داد، بافتی که بتواند در شرایط تنش زنده بماند، می­تواند با مقاومت به یک صفت از قبل مشخص شده (خشکی، شوری و ...) به یک گیاه کامل تبدیل شود (22). وزن تر کالوس های آفتابگردان گزینش شده در محیط تنش در مقایسه با کالوس­های گزینش شده در محیط بدون عامل تنش­زا کاهش محسوسی را از خود نشان داده­اند و با افزایش سطوح تنش رشد گیاه کاهش پیدا کرده و بین شرایط In vitro و In vivo همبستگی معنی­دار وجود دارد (24). پلی اتیلن گلیکول و مانیتول در مقایسه با غلظت­های متفاوت کلرید سدیم، موجب کاهش شدید تعداد ریشه­ها در گیاهچه های گندم دوروم شده است، همچنین میزان آسیب پلی­اتیلن گلیکول بر رشد گیاهچه­ها بیشتر از کلرید سدیم بوده است. در حالی که غلظت­های متفاوت مانیتول، تأثیری بر روی درصد جوانه­زنی و تعداد ریشه­ها نداشته است (9). نتایج بررسی بر روی کشت جنین پنج رقم گندم ایرانی نشان داد، با افزایش سطح پلی اتیلن گلیکول وزن تر کالوس­ها کاهش یافته و در غلظت­های بالای پلی­اتیلن گلیکول بیشترین مقاومت مربوط به رقمی است که با کاهش رشد نسبی همراه است (13). از آنجائی­که شناسایی و کاربرد ژنوتیپ­های متحمل به خشکی در برنامه­های به­نژادی آینده دارای اهمیت بسزایی می­باشد، از این‌رو هدف این مطالعه بررسی واکنش ژنوتیپ­های مختلف گندم دوروم و ارزیابی تحمل به خشکی ژنوتیپ­ها با استفاده از کالوس­های حاصل از کشت جنین بالغ و نابالغ در شرایط درون شیشه بود. 

مواد و روشها

مواد گیاهی: ژنوتیپ­های مورد مطالعه شامل 9 ژنوتیپ از توده­های بومی گندم دوروم، 10 لاین از ایکاردا و یک رقم بومی زرد که به عنوان شاهد بود به منظور سهولت کار به هر یک از ژنوتیپ­های مورد مطالعه کد 20-1 اختصاص داده شد (جدول1). آزمایش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام شد. به منظور بررسی اثر تنش خشکی بر روی ژنوتیپ­های دوروم، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با دو فاکتور، ژنوتیپ در 20 سطح و خشکی در پنج سطح (0، 50، 100، 150، 200 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000) با سه تکرار اجرا گردید. برای مقایسه درصد و سرعت رشد کالوس حاصل از کشت جنین و نیز واکنش آنها به محیط تحت تنش خشکی، جنین بالغ و نابالغ ژنوتیپ­های مورد مطالعه تحت شرایط استریل جدا و 10 جنین در هر محیط کشت MS حاوی آگار با 5/2 میلی­گرم در ­لیتر هورمون 2,4-D، برای تولید کالوس کشت داده شد. سپس کالوس­های تولید شده پس از واکشت برای بررسی مقاومت به خشکی به محیط­های کشت حاوی مقادیر مختلف پلی اتیلن گلیکول(PEG) به مدت 16 روز منتقل شدند.

جدول 1- ژنوتیپ­های مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی گندم دوروم

انتقال کالوس­ها به محیط کشت حاوی پلی اتیلن گلیکول: کالوس­های حاصل از جنین­های بالغ و نابالغ کشت شده پس از 28 روز نگهداری در شرایط استریل واکشت شدند. دو هفته پس از واکشت، کالوس های سالم و با قطر مناسب در محیط کشت MS جامد (حاوی پلی اتیلن گلیکول) حاوی 5/2 میلی­گرم در 2,4-D و 30 گرم در لیتر ساکارز مورد کشت دوباره قرار گرفتند. ژنوتیپ­های مورد مطالعه تحت تأثیر پنج سطح تیمار خشکی 0، 50، 100، 150 و 200 گرم در لیتر قرار داده شدند. در هر پتری­دیش حاوی پلی اتیلن گلیکول، پنج قطعه کالوس کشت شد و برای هر سطح تیمار خشکی در هر ژنوتیپ سه تکرار در نظر گرفته شد. پتری­دیش­ها پس از علامت گذاری، در اتاقک کشت در شرایط تاریکی و دمای 25 درجه^ء سانتی­گراد نگه­داری شدند. در روزهای 0، 4، 8 ،12 و 16 روز پس از کشت، قطر کالوس­ها بوسیله^ء کاغذ میلی­متری در ابتدا و پایان دوره تنش وزن تر و خشک کالوس­ها به کمک ترازوی دیجیتال اندازه گیری شد. در طی دوره کشت کالوس­ها در محیط تنش صفاتی همانند وزن کالوس، قطر کالوس، سرعت رشد کالوس، درصد کلروز، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب کالوس و شاخص تحمل خشکی کالوس نیز اندازه­گیری شدند.

صفات مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی

سرعت رشد کالوس (Callus Growth Rate)(میلی­متر قطر در روز): قطر کالوس­های حاصل در محیط کشت MS حاوی PEG بعد از 0، 4، 8 و 12 روز پس از کشت مورد اندازه­گیری قرار گرفت. نحوه­ محاسبه قطر کالوس بدین ترتیب بود که به‌کمک کاغذ میلی­متری، طول و عرض کالوس­ها اندازه­گیری شد و بعد در هم ضرب شده و از آن جذر گرفته شد تا قطر کالوس بدست آید. سپس با استفاده از میانگین کالوس­ها در هر تکرار متوسط سرعت رشد با استفاده از چهار عدد قطر کالوس محاسبه شد.  

زمان / میانگین قطر کالوس = سرعت رشد کالوس

رشد نسبی کالوس (Relative Fresh Weight Growth Callus)(بر اساس وزن تر): رشد نسبی کالوس­ها بر اساس وزن تر (RFWG)، برای هر ژنوتیپ از روش مورد استفاده کارادیموا و دژامبوا محاسبه شد: 

RFWG = [(W₂-W₁)/W₁]

که در آن  W₁و  W₂به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش می­باشد.

سرعت رشد نسبی کالوس (Relative Growth Rate Callus)(بر اساس وزن تر): برای محاسبه^ء سرعت رشد نسبی کالوس­ها بر اساس وزن تر (RGR)، برای هر ژنوتیپ از فرمول زیر استفاده شد. 

RGR= [Ln W₂- Ln W₁] دوره^ء رشد /

که در آن W₁ و  W₂به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش می­باشد.

درصد کلروز کالوس در خشکی: جهت محاسبه^ء درصد کلروز، 16 روز پس از کشت کالوس ها در محیط خشکی، به طور مشاهده­ای برای کلیه ی ژنوتیپ­ها، به هر کالوس رتبه ای عددی که نشانگر میزان کلروز در آن کالوس بود اختصاص یافت. 

درصد محتوای آب کالوس: برای محاسبه درصد محتوای آب کالوس (Water Content Callus) بر اساس وزن تر و خشک آنها در پایان دوره تنش از فرمول زیر استفاده شد (15).

RWC = [(W₂-W₁)/W₂]100* 

که در آن W₁ و  W₂به ترتیب وزن خشک و وزن تر نهایی کالوس در محیط تحت تنش می­باشد.

شاخص تحمل خشکی: برای محاسبه شاخص تحمل خشکی (Index  of  Tolerance) براساس سرعت رشد نسبی کالوس از فرمول زیر استفاده شد (8).

INTOL=RGR treatment/RGR control

محاسبات آماری: تجزیه^ء واریانس و مقایسه میانگین با آزمون حداقل دامنه­های معنی­دار دانکن در سطح احتمال یک درصد، با استفاده از نرم افزارهای آماری MSTATC و SAS انجام شد. تبدیل داده­ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و MSTATC انجام شد. همبستگی صفات با یکدیگر با استفاده از نرم افزار آماری SPSS محاسبه شد. تجزیه خوشه­ای برای گروه­بندی ژنوتیپ­ها با روش Ward و با تعیین ضریب فاصله^ء اقلیدسی با استفاده از نرم افزار SPSS.16 انجام گردید.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس بدست آمده از کالوس­ حاصل از جنین­ بالغ کشت شده در محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف پلی­اتیلن گلیکول در جدول 2 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر صفات سرعت رشد کالوس (میلی­متر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس و درصد کلروز کالوس اختلاف بسیار معنی­دار بود.

جدول 2- میانگین مربعات صفات اندازه­گیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش خشکی

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

اثر خشکی با توجه به کمی بودن، سطوح آن به درجات مختلف رگرسیونی تفکیک گردید. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد کلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم، درجه سوم و درجه چهار معنی­دار شدند.

اما برای سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجه دوم و درجه سوم با سطوح مختلف خشکی معنی­دار شدند. بین سطوح مختلف خشکی و سرعت رشد کالوس(میلی­متر قطر در روز) روابط رگرسیونی خطی و درجه دوم معنی­دار بودند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس شاخص تحمل خشکی در جدول 3 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) اختلاف بسیار معنی­دار وجود داشت. بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنی­دار شدند.

جدول 3- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح مختلف تنش خشکی

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

نتایج حاصل از مقایسه­ میانگین ژنوتیپ­های مختلف از نظر صفات مورد بررسی در جدول 4 ارائه شده است. در مقایسه­ میانگین صفت درصد کلروز کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس ژنوتیپ­های شماره 2، 3 و 4 به ترتیب کمترین مقدار کلروز و بیشترین سرعت رشد نسبی را نشان دادند. ژنوتیپ­های شماره 4، 18، 19 و 20 بیشترین سرعت رشد کالوس را در سطوح مختلف خشکی داشتند. برای صفت شاخص تحمل، ژنوتیپ­های شماره 4 و 8 تحمل بالاتری را در مقایسه با سایرین نشان دادند. ژنوتیپ شماره 4 از درصد محتوای آب بالاتری نسبت به بقیه برخوردار بود. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و درصد محتوای آب کالوس بالاتر و درصد کلروز پایین­تر بود، پس می­توان آن­ را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحمل­تر نسبت به خشکی ایجاد شده در شرایط شیشه شناسایی کرد.

در مقایسه­ میانگین اثرات متقابل ژنوتیپ و سطوح مختلف خشکی، صفات رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، محتوای آب کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد کالوس (میلی­متر قطر در روز) با افزایش سطوح خشکی تا سطح 15 درصد کاهش نشان دادند، پس از آن روند تغییرات ثابت ماند. در مقایسه­ میانگین صفت درصد کلروز کالوس، با افزایش سطح خشکی درصد کلروز کالوس تا سطح 20 درصد پلی اتیلن گلیکول افزایش یافت (شکل 1). نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج تحقیقات دیگر مطابقت داشت. در مطالعه کالوس­های حاصل از گندم دوروم در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول در محیط کشت، از مقادیر رشد نسبی کالوس و محتوای آب نسبی کالوس کاسته می­شود (19). کالوس­های حاصل از جنین­های نابالغ یک ژنوتیپ زمستانه و دوازده ژنوتیپ بهاره گندم تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول 6000 در شرایط درون شیشه­ای قرار داده شد. در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنی­داری در وزن تر و حجم نسبی کالوس­ها مشاهده نشد (18). کالوس­های حاصل از دو رقم نیشکر تحت تأثیر تنش خشکی با سطوح مختلف پلی اتیلن گلیکول، کاهش معنی داری را در سرعت رشد نسبی و محتوای آب کالوس نشان دادند (14). کالوس­های بدست آمده از قطعات فوقانی ساقه نخل خرما در محیط کشتMS حاوی ده میلی­گرم نفتالین استیک اسید و یک و نیم میلی­گرم ایزوپنتیل آدنین به همراه غلظت­های متفاوت صفر تا سی درصد پلی اتیلن گلیکول 8000 برای القای تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داده است با افزایش سطوح پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و محتوای آب کالوس در ارقام مورد مطالعه به­طور معنی­دار کاهش نشان داد (8). کالوس­های حاصل از کشت جنین بالغ سه رقم گندم دوروم به مدت یک ماه تحت تأثیر تنش های شوری و خشکی قرار داده شدند.

شکل 1- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح  مختلف خشکی

در پایان آزمایش مشخص گردید که در حضور غلظت­های متفاوت پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی کالوس­ها کاهش یافت و کالوس­هایی که تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول قرار داشتند در مقایسه با کالوس­های تحت تأثیر مانیتول قابلیت بازگشت بیشتری را داشته­اند (20). در بررسی کالوس­های نخل روغنی در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش سطوح تنش از میزان محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاسته می­شود ولی مقدار پرولین کالوس با افزایش سطح تنش افزایش نشان داده است (8). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش یافتند (14). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از جنین گندم دوروم با افزایش سطوح مختلف کلرور سدیم، سرعت رشد و رشد نسبی کالوس کاهش و درصد کلروز افزایش یافته است (1).

همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج حاصل از تجزیه همبستگی صفات اندازه­گیری شده کالوس در شرایط تنش خشکی در جدول 4 ارائه شده است. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که بین صفت درصد کلروز کالوس با سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری وجود داشت. همبستگی معنی­داری بین صفت محتوای آب کالوس با صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و درصد کلروز در شرایط تنش همبستگی معنی دار مشاهده نشد. البته بین سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی وجود داشت. بین شاخص تحمل خشکی کالوس در شرایط تنش با صفات سرعت رشد نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری مشاهده شد.

جدول 4- ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین بالغ

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

دسته­بندی ژنوتیپ­ها: از تجزیه خوشه­ای، برای دسته­بندی ارقام و ژنوتیپ­ها، به منظور پی بردن به فاصله­ ژنتیکی آنها و استفاده از تنوع موجود در آنها از نظر صفات مورد بررسی در برنامه­های اصلاح نبات استفاده می­شود. در این تحقیق، تجزیه خوشه­ای به روش Ward بر روی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب، شاخص تحمل و درصد کلروز کالوس انجام شد. بر این اساس ژنوتیپ­ها به چهار گروه تقسیم شدند (شکل2). ژنوتیپ­های زردک شماره­های 2، 4،7 و10 در گروه اول، ژنوتیپ­های 6، 8، 9، 14، 15، 16، 17، 19 و20 درگروه دوم، ژنوتیپ­های 3 و 12 در گروه سوم، ژنوتیپ های 5، 13،11 و 18 در گروه چهارم قرار گرفتند. بر اساس نتایج بدست آمده ژنوتیپ­های متحمل در گروه اول قرار داشتند. نتایج حاصل از تجزیه تابع تشخیص نیز این گروه­بندی را صد در صد تأیید کرد. در مطالعه نتایج گروه ­بندی ژنوتیپ های گندم دوروم در کشت جنین بالغ و نابالغ تحت تنش شوری نشان داد که ژنوتیپ­ها در چهار دسته قرار گرفتند و ژنوتیپ­های زردک و شماره­های 2 و 4 در گروه اول و به عنوان گروه متحمل معرفی شدند. این می تواند نشان از ارتباط تحمل به تنش شوری و خشکی در ژنوتیپ­های زردک و شماره های 2 و 4 داشته باشد (5).

شکل 2- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه صفات اندازه­گیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش به روش  Ward

نتایج تجزیه واریانس کالوس حاصل از جنین نابالغ: تجزیه واریانس صفات کالوس­های بدست آمده از جنین های نابالغ کشت شده در محیط تنش در جدول 5 ارائه شده است. تجزیه واریانس برای صفات مورد بررسی نشان داد که اثرات ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی معنی­دار بودند.

جدول 5- میانگین مربعات صفات اندازه­گیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی

** معنی­دار در سطح احتمال یک درصد ^**: Significant at 1% probability level                                                                                                                  

تنوع موجود بین ژنوتیپ­ها از نظر صفات مختلف کالوس نشان دهنده­ وابستگی این صفات به نوع ژنوتیپ است. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصدکلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه­های دوم، سوم و چهارم معنی­دار شدند. برای سرعت رشد نسبی (بر اساس وزن تر) کالوس و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجه­های دوم و سوم با سطوح مختلف خشکی معنی­دار بودند. در سرعت رشد کالوس روابط خطی و درجه دوم معنی­دار شد. نتایج به دست آمده در تجزیه واریانس صفات کالوس جنین­های نابالغ تحت تنش خشکی با نتایج حاصل از کالوس­های بالغ در همین مطالعه مطابقت داشت. تجزیه واریانس برای صفت شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی اختلاف معنی­دار بود (جدول6). بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنی­دار بودند.

جدول 6- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف تنش خشکی

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد                                                                                                  

در مقایسه میانگین صفت درصد کلروز کالوس، ژنوتیپ­های شماره 2، 3 و 4 کمترین مقدار کلروز را در کالوس نشان دادند. ژنوتیپ­های شماره 2، 3، 4، 17 و 18 بیشترین سرعت رشد را داشتند. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس بالایی بود، پس می­توان آن­ را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحمل­تر نسبت به خشکی شناسایی کرد. نتیجه بدست آمده با نتایج حاصل از کالوس­های به­دست آمده جنین بالغ همین ژنوتیپ­ها در مطالعه حاضر تا حدودی مطابقت داشت. بر اساس نتایج حاصل از مقایسه­ میانگین­ها، صفات درصد کلروز کالوس، رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، محتوای آب کالوس، شاخص تحمل و سرعت رشد کالوس با افزایش سطوح مختلف خشکی کاهش معنی داری را از خود نشان دادند و نیز با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول تا سطح 20 درصد، درصد کلروز کالوس افزایش یافت (شکل 3). واکنش ژنوتیپ­ها به سطوح مختلف تنش در طول دوره متفاوت بود. در آزمایشی که به منظور بررسی اثرات تنش خشکی بر کالوس­های گلرنگ نشان داده شده است، با افزایش سطح خشکی محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش می­یابد (4). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوس­های ایجاد شده توسط کشت هیپوکوتیل در کلزای پاییزه مشخص گردید که با افزایش سطح تنش خشکی، محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاهش می­یابد (15). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش خشکی نشان دادند که محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش می­یابند ولی محتوای پرولین کالوس با افزایش تنش افزایش می­یابد (14). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوس­های حاصل از کشت هیپوکتیل کلزا با افزایش سطوح مختلف محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش یافته است (3). در بررسی تنش خشکی بر روی کالوس­های حاصل از جنین نابالغ گندم نان مشاهده گردید که با افزایش سطوح مختلف خشکی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی و درصد محتوای آب کالوس کاهش و درصد کلروز کالوس افزایش را نشان می­دهد (2).

شکل 3- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف خشکی

همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج تجزیه همبستگی صفات مورد مطالعه در جدول 7 ارائه شده است. شاخص تحمل کالوس با درصد کلروز کالوس در شرایط تنش خشکی همبستگی معنی­دار داشت. به‌طوری‌که بین سرعت رشد کالوس و صفات رشد نسبی و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی مثبت و معنی­دار بود، همچنین بین رشد نسبی کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری مشاهده شد که این نتایج با نتایج بدست آمده از کشت جنین بالغ در مطالعه حاضر بود.

جدول 7- ضرایب همبستگی بین صفات در شرایط تنش برای ژنوتیپ­های مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین نابالغ

**: معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد

دسته­بندی ژنوتیپ­ها: بر اساس نتایج تجزیه خوشه­ای ژنوتیپ­ها در چهار دسته گروه­بندی شدند (شکل 4) که ژنوتیپ های 1، 2، 5، 8، 13، 14، 15، 16 و 17 در گروه اول، ژنوتیپ­های 3، 6، 11 و 12 در گروه دوم، ژنوتیپ­های 4، 7، 9 و 10 در گروه سوم و ژنوتیپ های 18، 19 و 20 در گروه چهارم قرارگرفتند. دسته­بندی ژنوتیپ­ها در یک گروه بیانگر شباهت بیشتر آنها از نظر صفات مورد نظر می باشد. به‌طوری‌که در گروه سوم ژنوتیپ­های متحمل و گروه چهارم ژنوتیپ­های حساس جای گرفتند. ژنوتیپ شماره 4 در خوشه­بندی بدست آمده از صفات کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ به‌عنوان ژنوتیپ متحمل به خشکی شناسایی شد. این احتمالاً نشان‌دهنده­ مقاومت به خشکی این ژنوتیپ در شرایط درون شیشه می­باشد.   

شکل 4- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه صفات اندازه­گیری شده از کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی به روش  Ward