نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری دانشگاه رازی کرمانشاه

2 عضو هیات علمی دانشگاه رازی کرمانشاه

چکیده

به منظور بررسی واکنش بیست ژنوتیپ گندم دوروم کالوس‌های حاصل از کشت جنین‌های بالغ و نابالغ به تنش خشکی در محیط کشت MS حاوی پنج مقدار مختلف پلی اتیلن گلیکول6000 (200- 0 گرم در لیتر) بررسی شد. ارزیابی ژنوتیپ ها در قالب طرح کاملاً تصادفی به صورت آزمایش فاکتوریل 5 × 20 انجام شد. صفات سرعت رشد کالوس (میلی متر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس، شاخص تحمل کالوس و درصد کلروز کالوس در شرایط تنش مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اثر ژنوتیپ، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی برای کلیه ی صفات مختلف معنی‌دار بود. تجزیه کلاستر، ژنوتیپ های مورد مطالعه را بر اساس صفات اندازه‌گیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ تحت تنش خشکی به چهاردسته گروه بندی نمود. ژنوتیپ‌های 65-12-3-3 و 75-5-3-5 از ارقام بومی استان کرمانشاه در کشت جنین بالغ در یک گروه بودند بطوریکه این ژنوتیپ‌ها در کشت جنین نابالغ در گروه های متفاوت تحت عنوان گروه ژنوتیپهای مقاوم قرار گرفتند. با توجه به نتایج بدست آمده در کشت جنین بالغ و نابالغ، ژنوتیپ شماره ی 75-5-3-5 به علت دارا بودن رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، درصد محتوای آب بیشتر و درصد کلروز پایین تر در سطوح مختلف خشکی در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه به عنوان ژنوتیپ احتمالی متحمل نسبت به خشکی در شرایط این ویترو شناسائی گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

In vitro Evaluation of Drought Tolerance in Durum Wheat Genotypes (Triticum durum L.)

نویسندگان [English]

  • leila akbari 1
  • Kianoosh Cheghamirza 2
  • Ezzatolah Farshadfar 2

1 razi university

چکیده [English]

The response of twenty genotypes of durum wheat (Triticum turgidum var. durum) against drought stress was assessed via in vitro mature and immature embryo culture. The reaction of derived calli to drought stress was evaluated in Murashige and Skoog (MS) medium containing different concentration of PEG 6000 (0, 50, 100, 150 and 200 g/l), using a 20×5 factorial experiment based on completely randomized design with three replications. The traits including, callus growth rate, relative fresh weight growth, relative growth rate, water content, tolerance index and chlorosis percentage under stress condition were studied. There were significant differences amongst genotypes concerning all the traits and response of genotypes to drought different levels. Cluster analysis of the mature or immature embryo cultures classified the genotypes into four groups, but the result of classification for each group of mature and immature embryo cultures were in different manner. It can be concluded that the genotype No. 75-5-3-5 showed relative fresh weight growth, relative growth rate and water content and lowest chlorosis percentage. Furthermore, this genotype showed superiority concerning in vitro drought tolerance. Therefore, it may be used as a drought tolerant genotype in plant breeding programs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • embryo culture
  • drought tolerance
  • durum wheat

بررسی تحمل به خشکی ژنوتیپ­های گندم دوروم در شرایط درون شیشه­ای

لیلا اکبری1*، کیانوش چقامیرزا1و2 و عزت­اله فرشادفر1و2

1 کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات 

2 کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژِی مقاومت به خشکی

تاریخ دریافت: 16/2/93                تاریخ پذیرش: 16/5/93

چکیده

واکنش کالوس­های حاصل از کشت رویان‌های بالغ و نابالغ بیست ژنوتیپ گندم دوروم به تنش خشکی در محیط کشت MS حاوی آگار با پنج مقدار مختلف پلی‌اتیلن گلیکول 6000 (200- 0 گرم در لیتر) بررسی شد. ارزیابی ژنوتیپ­ها در قالب طرح کاملاً تصادفی به صورت آزمایش فاکتوریل 5 × 20 انجام شد. صفات سرعت رشد کالوس (میلی‌متر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس، شاخص تحمل کالوس و درصد کلروز کالوس در شرایط تنش مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اثر ژنوتیپ­، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی برای کلیه­ صفات مختلف در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود. تجزیه خوشه‌ای، ژنوتیپ­های مورد مطالعه را بر اساس صفات اندازه­گیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ تحت تنش خشکی به چهار دسته گروه­بندی کرد. ژنوتیپ­های 65-12-3-3 و 75-5-3-5 از ارقام بومی استان کرمانشاه در کشت جنین بالغ در یک گروه بودند، به‌طوری‌که این ژنوتیپ­ها در کشت جنین نابالغ در گروه­های متفاوت تحت عنوان گروه ژنوتیپ­های مقاوم قرار گرفتند. با توجه به نتایج بدست آمده در کشت جنین بالغ و نابالغ، ژنوتیپ شماره­ 75-5-3-5 به علت دارا بودن رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، درصد محتوای آب بیشتر و درصد کلروز پایین­تر در سطوح مختلف خشکی در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه به‌عنوان ژنوتیپ احتمالی متحمل نسبت به خشکی در شرایط درون شیشه­ای شناسایی شد.

واژه­های کلیدی: کشت جنین، تحمل خشکی، گندم دوروم

* نویسنده مسئول، تلفن: 8324820- 0831 ، پست الکترونیکی : Akbari.l1020@gmail.com

مقدمه

 

گندم دوروم از جنس تریتیکوم (Triticum) و با نام علمی تریتیکوم دوروم (Triticum durum) یک آلوتتراپلویید با تعداد کروموزوم 28 =x 4 = n2 و فرمول ژنوم AABB می­باشد (6). گندم دوروم با داشتن 21 میلیون هکتار سطح زیر کشت، هشتمین رتبه را در میان غلات جهان داراست. در ایران این گیاه با سطح زیر کشت 338 هزار هکتار در استان های خوزستان، لرستان، اصفهان و خراسان در مزارع دیم کشت شده و به صورت مخلوط با گندم نان استفاده می شود. برای تولید ماکارونی و اسپاگتی در سطح جهان کشت داده می­شود و از دیدگاه اقتصادی برای بیشتر کشورها حائز اهمیت است (20، 21). محدودیت منابع آبی و سایر عوامل باعث توجه بیشتر به مطالعه اثرات تنش خشکی و انتخاب ارقام مقاوم به خشکی شده است. روش­های اصلاح سنتی در بررسی تنش­های زنده و غیر زنده با مشکلاتی همانند نبود فضای مناسب، زمان کافی و نیز از بین رفتن زمینه­ ژنتیکی در هنگام مقایسه بین گونه­های وحشی مقاوم با  رقم های زراعی مواجه هستند (13). ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی از طریق روش­های سنتی بسیار وقت­گیر و گاهی غیر ممکن است. بنابراین تکنیک­های متعددی در جهت گزینش ژنوتیپ­های متحمل به خشکی در گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است (23). امروزه از شیوه­ های جدیدتر از جمله کشت بافت برای ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی و سایر عوامل نامساعد استفاده می­شود. در سال­های اخیر تلاش­های زیادی به منظور تولید گیاهان مقاوم در برابر تنش و به‌ویژه متحمل به شوری، با استفاده از تنوع موجود یا ایجاد شده در کشت بافت انجام شده است (10). سیستم کشت بافت برای ارزیابی تحمل به تنش­های محیطی مفید است، زیرا تنش­های محیطی در شرایط درون شیشه­ای به سادگی قابل کنترل هستند (14). انتخاب درون شیشه برای تحمل به تنش غیر زیستی به توسعه مؤثر و معتبر القای کالوس و سیستم­های باززایی گیاه بستگی دارد (11). روش های درون شیشه ای در مطالعات زیادی برای کوتاه کردن دوره­های اصلاحی به کار برده شده­اند. از طریق سلول­های گیاهی کشت شده و بررسی واکنش آنها به تنش­های محیطی مؤثر می­توان اثرات یون­ها، علف کش­ها، آفت کش­ها و اثرات سمی را که توسط پاتوژن­ها تولید می­شوند، مطالعه کرد (17). زمانی که بافت گیاهی در محیط کشت در سطح سلولی در حال رشد است می­توان آن را تحت تأثیر عوامل تنش قرار داد، بافتی که بتواند در شرایط تنش زنده بماند، می­تواند با مقاومت به یک صفت از قبل مشخص شده (خشکی، شوری و ...) به یک گیاه کامل تبدیل شود (22). وزن تر کالوس های آفتابگردان گزینش شده در محیط تنش در مقایسه با کالوس­های گزینش شده در محیط بدون عامل تنش­زا کاهش محسوسی را از خود نشان داده­اند و با افزایش سطوح تنش رشد گیاه کاهش پیدا کرده و بین شرایط In vitro و In vivo همبستگی معنی­دار وجود دارد (24). پلی اتیلن گلیکول و مانیتول در مقایسه با غلظت­های متفاوت کلرید سدیم، موجب کاهش شدید تعداد ریشه­ها در گیاهچه های گندم دوروم شده است، همچنین میزان آسیب پلی­اتیلن گلیکول بر رشد گیاهچه­ها بیشتر از کلرید سدیم بوده است. در حالی که غلظت­های متفاوت مانیتول، تأثیری بر روی درصد جوانه­زنی و تعداد ریشه­ها نداشته است (9). نتایج بررسی بر روی کشت جنین پنج رقم گندم ایرانی نشان داد، با افزایش سطح پلی اتیلن گلیکول وزن تر کالوس­ها کاهش یافته و در غلظت­های بالای پلی­اتیلن گلیکول بیشترین مقاومت مربوط به رقمی است که با کاهش رشد نسبی همراه است (13). از آنجائی­که شناسایی و کاربرد ژنوتیپ­های متحمل به خشکی در برنامه­های به­نژادی آینده دارای اهمیت بسزایی می­باشد، از این‌رو هدف این مطالعه بررسی واکنش ژنوتیپ­های مختلف گندم دوروم و ارزیابی تحمل به خشکی ژنوتیپ­ها با استفاده از کالوس­های حاصل از کشت جنین بالغ و نابالغ در شرایط درون شیشه بود. 

مواد و روشها

مواد گیاهی: ژنوتیپ­های مورد مطالعه شامل 9 ژنوتیپ از توده­های بومی گندم دوروم، 10 لاین از ایکاردا و یک رقم بومی زرد که به عنوان شاهد بود به منظور سهولت کار به هر یک از ژنوتیپ­های مورد مطالعه کد 20-1 اختصاص داده شد (جدول1). آزمایش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام شد. به منظور بررسی اثر تنش خشکی بر روی ژنوتیپ­های دوروم، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با دو فاکتور، ژنوتیپ در 20 سطح و خشکی در پنج سطح (0، 50، 100، 150، 200 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000) با سه تکرار اجرا گردید. برای مقایسه درصد و سرعت رشد کالوس حاصل از کشت جنین و نیز واکنش آنها به محیط تحت تنش خشکی، جنین بالغ و نابالغ ژنوتیپ­های مورد مطالعه تحت شرایط استریل جدا و 10 جنین در هر محیط کشت MS حاوی آگار با 5/2 میلی­گرم در ­لیتر هورمون 2,4-D، برای تولید کالوس کشت داده شد. سپس کالوس­های تولید شده پس از واکشت برای بررسی مقاومت به خشکی به محیط­های کشت حاوی مقادیر مختلف پلی اتیلن گلیکول(PEG) به مدت 16 روز منتقل شدند.

 

جدول 1- ژنوتیپ­های مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی گندم دوروم

نام ژنوتیپ

کد ژنوتیپ

نام ژنوتیپ

کد ژنوتیپ

Heider/Mt/Ho

11

Zardak

1

Syrian – 4

12

65-12-3-3

2

Waha- B53

13

25-25-1-5

3

Arthar 71/Bcr//ch5

14

75-5-3-5

4

Stj3/4/stn//Hvi/Somo/ 3/yav/ fg//Roh

15

409

5

Grdara-2

16

259

6

Lgt3/4/Bcr/3/ch1//Gta/ stk

17

15-15-1-3

7

Aghrass-2

18

240

8

Quadalete//Erp/mol/3/unk/4/Mrb3/Mnal

19

37-24-2-3

9

Stj3//Bcr/lks4

20

249

10

 


انتقال کالوس­ها به محیط کشت حاوی پلی اتیلن گلیکول: کالوس­های حاصل از جنین­های بالغ و نابالغ کشت شده پس از 28 روز نگهداری در شرایط استریل واکشت شدند. دو هفته پس از واکشت، کالوس های سالم و با قطر مناسب در محیط کشت MS جامد (حاوی پلی اتیلن گلیکول) حاوی 5/2 میلی­گرم در 2,4-D و 30 گرم در لیتر ساکارز مورد کشت دوباره قرار گرفتند. ژنوتیپ­های مورد مطالعه تحت تأثیر پنج سطح تیمار خشکی 0، 50، 100، 150 و 200 گرم در لیتر قرار داده شدند. در هر پتری­دیش حاوی پلی اتیلن گلیکول، پنج قطعه کالوس کشت شد و برای هر سطح تیمار خشکی در هر ژنوتیپ سه تکرار در نظر گرفته شد. پتری­دیش­ها پس از علامت گذاری، در اتاقک کشت در شرایط تاریکی و دمای 25 درجهء سانتی­گراد نگه­داری شدند. در روزهای 0، 4، 8 ،12 و 16 روز پس از کشت، قطر کالوس­ها بوسیلهء کاغذ میلی­متری در ابتدا و پایان دوره تنش وزن تر و خشک کالوس­ها به کمک ترازوی دیجیتال اندازه گیری شد. در طی دوره کشت کالوس­ها در محیط تنش صفاتی همانند وزن کالوس، قطر کالوس، سرعت رشد کالوس، درصد کلروز، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب کالوس و شاخص تحمل خشکی کالوس نیز اندازه­گیری شدند.

صفات مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی

سرعت رشد کالوس (Callus Growth Rate)(میلی­متر قطر در روز): قطر کالوس­های حاصل در محیط کشت MS حاوی PEG بعد از 0، 4، 8 و 12 روز پس از کشت مورد اندازه­گیری قرار گرفت. نحوه­ محاسبه قطر کالوس بدین ترتیب بود که به‌کمک کاغذ میلی­متری، طول و عرض کالوس­ها اندازه­گیری شد و بعد در هم ضرب شده و از آن جذر گرفته شد تا قطر کالوس بدست آید. سپس با استفاده از میانگین کالوس­ها در هر تکرار متوسط سرعت رشد با استفاده از چهار عدد قطر کالوس محاسبه شد.  

زمان / میانگین قطر کالوس = سرعت رشد کالوس

رشد نسبی کالوس (Relative Fresh Weight Growth Callus)(بر اساس وزن تر): رشد نسبی کالوس­ها بر اساس وزن تر (RFWG)، برای هر ژنوتیپ از روش مورد استفاده کارادیموا و دژامبوا محاسبه شد: 

RFWG = [(W2-W1)/W1]

که در آن  W1و  W2به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش می­باشد.

سرعت رشد نسبی کالوس (Relative Growth Rate Callus)(بر اساس وزن تر): برای محاسبهء سرعت رشد نسبی کالوس­ها بر اساس وزن تر (RGR)، برای هر ژنوتیپ از فرمول زیر استفاده شد. 

RGR= [Ln W2- Ln W1] دورهء رشد /

که در آن W1 و  W2به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش می­باشد.

درصد کلروز کالوس در خشکی: جهت محاسبهء درصد کلروز، 16 روز پس از کشت کالوس ها در محیط خشکی، به طور مشاهده­ای برای کلیه ی ژنوتیپ­ها، به هر کالوس رتبه ای عددی که نشانگر میزان کلروز در آن کالوس بود اختصاص یافت. 

درصد محتوای آب کالوس: برای محاسبه درصد محتوای آب کالوس (Water Content Callus) بر اساس وزن تر و خشک آنها در پایان دوره تنش از فرمول زیر استفاده شد (15).

RWC = [(W2-W1)/W2]100* 

که در آن W1 و  W2به ترتیب وزن خشک و وزن تر نهایی کالوس در محیط تحت تنش می­باشد.

شاخص تحمل خشکی: برای محاسبه شاخص تحمل خشکی (Index  of  Tolerance) براساس سرعت رشد نسبی کالوس از فرمول زیر استفاده شد (8).

INTOL=RGR treatment/RGR control

محاسبات آماری: تجزیهء واریانس و مقایسه میانگین با آزمون حداقل دامنه­های معنی­دار دانکن در سطح احتمال یک درصد، با استفاده از نرم افزارهای آماری MSTATC و SAS انجام شد. تبدیل داده­ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و MSTATC انجام شد. همبستگی صفات با یکدیگر با استفاده از نرم افزار آماری SPSS محاسبه شد. تجزیه خوشه­ای برای گروه­بندی ژنوتیپ­ها با روش Ward و با تعیین ضریب فاصلهء اقلیدسی با استفاده از نرم افزار SPSS.16 انجام گردید.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس بدست آمده از کالوس­ حاصل از جنین­ بالغ کشت شده در محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف پلی­اتیلن گلیکول در جدول 2 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر صفات سرعت رشد کالوس (میلی­متر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس و درصد کلروز کالوس اختلاف بسیار معنی­دار بود.

 

 

جدول 2- میانگین مربعات صفات اندازه­گیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش خشکی

منابع تغییرات

 

درجات

آزادی

Df

میانگین مربعات Mean of squares

درصد کلروز         کالوس (CH)

سرعت رشد نسبی کالوس  (RGR)

رشد نسبی کالوس

(RFWG)

سرعت رشد کالوس

(CGR)

 

محتوای آب کالوس

( RWC)

ژنوتیپ

19

**0.264

**0.023

**0.059

**0.041

**4.465

خشکی

4

**3.049

**0.025

**4.581

**0.030

*0.125

خطی(درجه 1)

1

**10.815

**0.082

**15.351

**0.113

**17.324

درجه 2

1

**0.828

**0.018

**0.823

*0.012

*0.255

درجه 3

1

*0.285

**0.010

**0.358

ns 0.003

*0.275

درجه 4

1

*0.272

ns 0.003

** 0.796

ns 0.003

0.005 ns

ژنوتیپ × خشکی

76

**0.059

**0.031

**0.043

**0.023

**0.119

خطای آزمایشی

200

0.047

0.009

0.029

0.006

0.006

کل

299

 

 

 

 

 

درصد­ضریب تغییرات%CV

 

12.98

16.88

15.02

5.67

10.22

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

 

اثر خشکی با توجه به کمی بودن، سطوح آن به درجات مختلف رگرسیونی تفکیک گردید. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد کلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم، درجه سوم و درجه چهار معنی­دار شدند.

اما برای سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجه دوم و درجه سوم با سطوح مختلف خشکی معنی­دار شدند. بین سطوح مختلف خشکی و سرعت رشد کالوس(میلی­متر قطر در روز) روابط رگرسیونی خطی و درجه دوم معنی­دار بودند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس شاخص تحمل خشکی در جدول 3 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) اختلاف بسیار معنی­دار وجود داشت. بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنی­دار شدند.

جدول 3- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح مختلف تنش خشکی

منابع تغییرات

درجات آزادی df

میانگین مربعات  

ژنوتیپ

19

*0.321

خشکی

3

**31.760

     خطی (درجه 1)    

1

**17.430

     درجه 2

1

**82.730

     درجه 3

1

 **6.366

ژنوتیپ× خشکی

57

*0.256

خطای آزمایشی  

160

0.168

کل   

239

 

درصد ضریب تغییرات %CV

 

17.47

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

نتایج حاصل از مقایسه­ میانگین ژنوتیپ­های مختلف از نظر صفات مورد بررسی در جدول 4 ارائه شده است. در مقایسه­ میانگین صفت درصد کلروز کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس ژنوتیپ­های شماره 2، 3 و 4 به ترتیب کمترین مقدار کلروز و بیشترین سرعت رشد نسبی را نشان دادند. ژنوتیپ­های شماره 4، 18، 19 و 20 بیشترین سرعت رشد کالوس را در سطوح مختلف خشکی داشتند. برای صفت شاخص تحمل، ژنوتیپ­های شماره 4 و 8 تحمل بالاتری را در مقایسه با سایرین نشان دادند. ژنوتیپ شماره 4 از درصد محتوای آب بالاتری نسبت به بقیه برخوردار بود. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و درصد محتوای آب کالوس بالاتر و درصد کلروز پایین­تر بود، پس می­توان آن­ را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحمل­تر نسبت به خشکی ایجاد شده در شرایط شیشه شناسایی کرد.

در مقایسه­ میانگین اثرات متقابل ژنوتیپ و سطوح مختلف خشکی، صفات رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، محتوای آب کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد کالوس (میلی­متر قطر در روز) با افزایش سطوح خشکی تا سطح 15 درصد کاهش نشان دادند، پس از آن روند تغییرات ثابت ماند. در مقایسه­ میانگین صفت درصد کلروز کالوس، با افزایش سطح خشکی درصد کلروز کالوس تا سطح 20 درصد پلی اتیلن گلیکول افزایش یافت (شکل 1). نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج تحقیقات دیگر مطابقت داشت. در مطالعه کالوس­های حاصل از گندم دوروم در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول در محیط کشت، از مقادیر رشد نسبی کالوس و محتوای آب نسبی کالوس کاسته می­شود (19). کالوس­های حاصل از جنین­های نابالغ یک ژنوتیپ زمستانه و دوازده ژنوتیپ بهاره گندم تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول 6000 در شرایط درون شیشه­ای قرار داده شد. در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنی­داری در وزن تر و حجم نسبی کالوس­ها مشاهده نشد (18). کالوس­های حاصل از دو رقم نیشکر تحت تأثیر تنش خشکی با سطوح مختلف پلی اتیلن گلیکول، کاهش معنی داری را در سرعت رشد نسبی و محتوای آب کالوس نشان دادند (14). کالوس­های بدست آمده از قطعات فوقانی ساقه نخل خرما در محیط کشتMS حاوی ده میلی­گرم نفتالین استیک اسید و یک و نیم میلی­گرم ایزوپنتیل آدنین به همراه غلظت­های متفاوت صفر تا سی درصد پلی اتیلن گلیکول 8000 برای القای تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داده است با افزایش سطوح پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و محتوای آب کالوس در ارقام مورد مطالعه به­طور معنی­دار کاهش نشان داد (8). کالوس­های حاصل از کشت جنین بالغ سه رقم گندم دوروم به مدت یک ماه تحت تأثیر تنش های شوری و خشکی قرار داده شدند.

 

 

 

 

 

شکل 1- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح  مختلف خشکی


 

 

در پایان آزمایش مشخص گردید که در حضور غلظت­های متفاوت پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی کالوس­ها کاهش یافت و کالوس­هایی که تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول قرار داشتند در مقایسه با کالوس­های تحت تأثیر مانیتول قابلیت بازگشت بیشتری را داشته­اند (20). در بررسی کالوس­های نخل روغنی در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش سطوح تنش از میزان محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاسته می­شود ولی مقدار پرولین کالوس با افزایش سطح تنش افزایش نشان داده است (8). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش یافتند (14). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از جنین گندم دوروم با افزایش سطوح مختلف کلرور سدیم، سرعت رشد و رشد نسبی کالوس کاهش و درصد کلروز افزایش یافته است (1).

همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج حاصل از تجزیه همبستگی صفات اندازه­گیری شده کالوس در شرایط تنش خشکی در جدول 4 ارائه شده است. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که بین صفت درصد کلروز کالوس با سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری وجود داشت. همبستگی معنی­داری بین صفت محتوای آب کالوس با صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و درصد کلروز در شرایط تنش همبستگی معنی دار مشاهده نشد. البته بین سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی وجود داشت. بین شاخص تحمل خشکی کالوس در شرایط تنش با صفات سرعت رشد نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری مشاهده شد.

 

 

جدول 4- ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین بالغ

صفت

1

2

3

4

5

6

1-کلروز Chlorosis

1

 

 

 

 

 

2-محتوای آبRWC

0.151

1

 

 

 

 

3- رشد نسبیRFWG

-0.325

0.303

1

 

 

 

4- سرعت رشد نسبی RGR

-0.170

0.373

**0.820

1

 

 

5- شاخص تحمل    INTOL

-0.068

0.232

**0.802

**0.838

1

 

6- سرعت رشد CGR

**0.825  

0.007

-0.602

-0.013

0.040

1

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد


 


دسته­بندی ژنوتیپ­ها: از تجزیه خوشه­ای، برای دسته­بندی ارقام و ژنوتیپ­ها، به منظور پی بردن به فاصله­ ژنتیکی آنها و استفاده از تنوع موجود در آنها از نظر صفات مورد بررسی در برنامه­های اصلاح نبات استفاده می­شود. در این تحقیق، تجزیه خوشه­ای به روش Ward بر روی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب، شاخص تحمل و درصد کلروز کالوس انجام شد. بر این اساس ژنوتیپ­ها به چهار گروه تقسیم شدند (شکل2). ژنوتیپ­های زردک شماره­های 2، 4،7 و10 در گروه اول، ژنوتیپ­های 6، 8، 9، 14، 15، 16، 17، 19 و20 درگروه دوم، ژنوتیپ­های 3 و 12 در گروه سوم، ژنوتیپ های 5، 13،11 و 18 در گروه چهارم قرار گرفتند. بر اساس نتایج بدست آمده ژنوتیپ­های متحمل در گروه اول قرار داشتند. نتایج حاصل از تجزیه تابع تشخیص نیز این گروه­بندی را صد در صد تأیید کرد. در مطالعه نتایج گروه ­بندی ژنوتیپ های گندم دوروم در کشت جنین بالغ و نابالغ تحت تنش شوری نشان داد که ژنوتیپ­ها در چهار دسته قرار گرفتند و ژنوتیپ­های زردک و شماره­های 2 و 4 در گروه اول و به عنوان گروه متحمل معرفی شدند. این می تواند نشان از ارتباط تحمل به تنش شوری و خشکی در ژنوتیپ­های زردک و شماره های 2 و 4 داشته باشد (5).



 

شکل 2- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه صفات اندازه­گیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش به روش  Ward


 


نتایج تجزیه واریانس کالوس حاصل از جنین نابالغ: تجزیه واریانس صفات کالوس­های بدست آمده از جنین های نابالغ کشت شده در محیط تنش در جدول 5 ارائه شده است. تجزیه واریانس برای صفات مورد بررسی نشان داد که اثرات ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی معنی­دار بودند.

 

 

جدول 5- میانگین مربعات صفات اندازه­گیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی

منابع تغییرات

درجات آزادیdf

میانگین مربعاتmean of squares

درصد کلروز         کالوس  (CH)

سرعت رشد نسبی کالوس (RGR)

رشد نسبی کالوس

(RFWG)

سرعت رشد کالوس

(CGR)

درصد محتوای آب کالوس |( RWC)

ژنوتیپ

19

**0.685

**0.002

*0.226

**0.029

**0.014

خشکی

4

**9.564

**0.175

**6.229

*0.021

**0.426

خطی(درجه 1)

1

**37.341

**0.631

**18.768

* 0.041

**1.003

درجه 2

1

**0.267

**0.047

**0.867

**0.057

**0.094

درجه 3

1

**0.349

**0.025

**2.213

ns 0.013

**0.612

درجه 4

1

**0.291

0.005 ns

** 3.071

ns 0.003

0.011 ns

ژنوتیپ× خشکی

Genotype*Drought

76

*0.051

*0.008

*0.156

**0.015

**0.017

خطای آزمایشی Error

200

0.037

0.017

0.124

0.013

0.009

کل Total

299

 

 

 

 

 

درصد ضریب تغییرات CV%

 

11.45

16.88

8.49

1.12

10.67

** معنی­دار در سطح احتمال یک درصد **: Significant at 1% probability level                                                                                                                  

 

 

 

تنوع موجود بین ژنوتیپ­ها از نظر صفات مختلف کالوس نشان دهنده­ وابستگی این صفات به نوع ژنوتیپ است. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصدکلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه­های دوم، سوم و چهارم معنی­دار شدند. برای سرعت رشد نسبی (بر اساس وزن تر) کالوس و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجه­های دوم و سوم با سطوح مختلف خشکی معنی­دار بودند. در سرعت رشد کالوس روابط خطی و درجه دوم معنی­دار شد. نتایج به دست آمده در تجزیه واریانس صفات کالوس جنین­های نابالغ تحت تنش خشکی با نتایج حاصل از کالوس­های بالغ در همین مطالعه مطابقت داشت. تجزیه واریانس برای صفت شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) نشان داد که بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی اختلاف معنی­دار بود (جدول6). بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنی­دار بودند.

 

 

جدول 6- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف تنش خشکی

منابع تغییرات

درجات آزادیdf

میانگین مربعات

ژنوتیپ

19

**0.504

خشکی

3

**5.602

            خطی (درجه 1)

    1

**17.43

            درجه 2

    1

**2.73

           درجه 3

    1

**6.366

ژنوتیپ× خشکی   

57

**0.098

خطای آزمایشی

160

0.153

کل

239

 

درصد ضریب تغییرات  CV%

 

16.03

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد                                                                                                  

 

 

در مقایسه میانگین صفت درصد کلروز کالوس، ژنوتیپ­های شماره 2، 3 و 4 کمترین مقدار کلروز را در کالوس نشان دادند. ژنوتیپ­های شماره 2، 3، 4، 17 و 18 بیشترین سرعت رشد را داشتند. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس بالایی بود، پس می­توان آن­ را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحمل­تر نسبت به خشکی شناسایی کرد. نتیجه بدست آمده با نتایج حاصل از کالوس­های به­دست آمده جنین بالغ همین ژنوتیپ­ها در مطالعه حاضر تا حدودی مطابقت داشت. بر اساس نتایج حاصل از مقایسه­ میانگین­ها، صفات درصد کلروز کالوس، رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، محتوای آب کالوس، شاخص تحمل و سرعت رشد کالوس با افزایش سطوح مختلف خشکی کاهش معنی داری را از خود نشان دادند و نیز با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول تا سطح 20 درصد، درصد کلروز کالوس افزایش یافت (شکل 3). واکنش ژنوتیپ­ها به سطوح مختلف تنش در طول دوره متفاوت بود. در آزمایشی که به منظور بررسی اثرات تنش خشکی بر کالوس­های گلرنگ نشان داده شده است، با افزایش سطح خشکی محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش می­یابد (4). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوس­های ایجاد شده توسط کشت هیپوکوتیل در کلزای پاییزه مشخص گردید که با افزایش سطح تنش خشکی، محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاهش می­یابد (15). در مطالعه بر روی کالوس­های به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش خشکی نشان دادند که محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش می­یابند ولی محتوای پرولین کالوس با افزایش تنش افزایش می­یابد (14). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوس­های حاصل از کشت هیپوکتیل کلزا با افزایش سطوح مختلف محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش یافته است (3). در بررسی تنش خشکی بر روی کالوس­های حاصل از جنین نابالغ گندم نان مشاهده گردید که با افزایش سطوح مختلف خشکی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی و درصد محتوای آب کالوس کاهش و درصد کلروز کالوس افزایش را نشان می­دهد (2).

 

 

 

 

 

 

شکل 3- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف خشکی


 


همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج تجزیه همبستگی صفات مورد مطالعه در جدول 7 ارائه شده است. شاخص تحمل کالوس با درصد کلروز کالوس در شرایط تنش خشکی همبستگی معنی­دار داشت. به‌طوری‌که بین سرعت رشد کالوس و صفات رشد نسبی و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی مثبت و معنی­دار بود، همچنین بین رشد نسبی کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنی­داری مشاهده شد که این نتایج با نتایج بدست آمده از کشت جنین بالغ در مطالعه حاضر بود.

 

 

جدول 7- ضرایب همبستگی بین صفات در شرایط تنش برای ژنوتیپ­های مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین نابالغ

صفت

1

2

3

4

5

6

1- درصدکلروز Chlorosis

1

 

 

 

 

 

2- محتوای آبRWC

0.131

1

 

 

 

 

3- رشد نسبیRFWG

-0.380

0.280

1

 

 

 

4- سرعت رشد نسبیRGR

-0.229

0.202

**0.767

1

 

 

5- شاخص تحملINTOL

**0.850

0.014

-0.107

-0.450

1

  •  

6- سرعت رشدCGR

-0.095

0.100

**0.770

**0.794

0.111

1

**: معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد


 


دسته­بندی ژنوتیپ­ها: بر اساس نتایج تجزیه خوشه­ای ژنوتیپ­ها در چهار دسته گروه­بندی شدند (شکل 4) که ژنوتیپ های 1، 2، 5، 8، 13، 14، 15، 16 و 17 در گروه اول، ژنوتیپ­های 3، 6، 11 و 12 در گروه دوم، ژنوتیپ­های 4، 7، 9 و 10 در گروه سوم و ژنوتیپ های 18، 19 و 20 در گروه چهارم قرارگرفتند. دسته­بندی ژنوتیپ­ها در یک گروه بیانگر شباهت بیشتر آنها از نظر صفات مورد نظر می باشد. به‌طوری‌که در گروه سوم ژنوتیپ­های متحمل و گروه چهارم ژنوتیپ­های حساس جای گرفتند. ژنوتیپ شماره 4 در خوشه­بندی بدست آمده از صفات کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ به‌عنوان ژنوتیپ متحمل به خشکی شناسایی شد. این احتمالاً نشان‌دهنده­ مقاومت به خشکی این ژنوتیپ در شرایط درون شیشه می­باشد.   

 

 

شکل 4- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه صفات اندازه­گیری شده از کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی به روش  Ward

 


سپاسگزاری 

بدین‌وسیله از جناب  آقای  مهندس  رضا  محمدی (محقق

معاونت مؤسسه تحقیقات دیم سرارود) به‌دلیل در اختیار گذاشتن بذرهای این مطالعه تشکر و قدردانی می­شود.

1-      ابراهیمی، ف .1381. بررسی کالوس­زایی و باززایی چندین رقم گندم ایرانی برای تحمل تنش شوری و خشکی از طریق کشت بافت. پایان­نامه کارشناسی ارشد.دانشگاه مازندران.

2-      جمشیدی، ب .1388. بررسی تحمل به خشکی ژنوتیپ­های مختلف گندم نان. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه رازی.

3-      چقاکبودی، ز. 1387. بررسی تحمل خشکی ژنوتیپ­های کلزای پاییزه (Brassica napus L.). پایان­نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه رازی.

4-      سهیلی، ژ. 1387. بررسی تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی در طی تنش خشکی اعمال شده در گیاه گلرنگ به منظور تعیین ژنوتیپ­های مقاوم. پایان­نامه کارشناسی ارشد.  دانشگاه رازی.

5-      عباسی تکیه، م. 1386. بررسی واکنش ژنوتیپ­های گندم دوروم به القاء کالوس و تنش شوری در کشت جنین.  پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه رازی.

6-      کریمی، ح،. 1371. گندم. انتشارات دانشگاه. 588 صفحه

 

7-Aghajanlu, A.1386. Evalution seedling traits in different levels of drought stress and seedling traits and path analysis of some agronomic traits in winter wheat. Journal of Sustainable Agriculture. 2:16-27

8-AL-Khayri, J, M., AL–Bahrany, A.M. 2002. Growth, water content, and proline accumulation in drought stressed callus of date palm. Biological Plantrum. 48(1): 105- 108.

9-Almansouri, M., kinet. J. M., Lutts. S. 2001. Effect of salt and osmotic stresses on germination in durum wheat (Triticum durum Desf.). Plant and Soil. 231: 243-254.

10-Barakat, M, N., Abdel-latif, T. H.  1996. In vitro selection of wheat callus tolerance to high levels of salt and plant regeneration. Euphytica. 91: 127-140.

11-Benderradgi, H. Bouzerzou, A. Djekoun, Yekhlef, N. and Benmahammed, A.  2007. Effects of Nacl stress on callus oroliferation and plant regeneration from mature embryos of bread wheat (Triticum aestivum L.) cultivars Mahon Demias and Hidhab. Plant Tissue Cult & Biotech. 17: 19-27.

12-Biswas, J, B, Chowdhury., Bhattacharya, A. and Mandal, A. B, . 2002. In vitro screening for increased drought tolerance in rice. Biol.  plant. 38: 525- 530.

13-Dragiiska, R., Djilianov. D. and Denchev, P. 1996. In vitro selection for osmotic tolerance in alfalfa (Medicago sativa L.). BULG. J. pant physiol.22 (3):30- 39.

14-Errabii, T., C.B. Gandonou., M, Essalmani., J, Abrini., M, Idaomar and N., Skali-Senhagi,  .2006.  Growth, proline and ion accumulation in sugarcane callus cultures under drought–induced osmotic stress and its subsequent relief. African Journal of Biotechnology.5(16 ):1488- 1493

15-Ghasempour, H. R., Zebarjadi, A.R.  and Borjian, L.  2008. Mulecular aspects of drought tolerance in five genotype of Brassica napus evaluated with callus cultures under stress. XVI Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB). 17-22. Agust. Tampere. Fanland.

16-Golkar, P. A., Arzani, S. A. and Mirmohammadi meibodi, M, 1386. Callus induction and plant regeneration from immature embryo of wheat varieties. Journal of Agricultural Sciences. 9: 39-50

17-Kumar, De. K. 1997. Plant tissue culture. Department of Botany Barasat Covt. College. West Bengal.

18-Lazar, M. D., Chen, T.H.H.,  Scoles. G.Y., Kartha, K.K. 1987. Immature embryo and anther culture of chromosome addition lines of rye in Chinese spring wheat. Plant Sciences. 51:77-81.

19-Lutts, S.,  Almansouri, M. and Kinet, J.M. 2004. Salinity and water stress have contrasting effects on the relationship between growth and cell viability during and after stress exposure in durum wheat callus. Plant Science. 167: 9-18.

20-Naqavi, M, R., Pvrshhbazy, A.Sh. and Talei, A. 1381. Diversity of durum wheat reserves for some agronomic and morphological characteristics. Journal of Agricultural Science. 4:81-90

21-Saleem, M. 2003. Response of durum and bread wheat Genotypes to drought stress: Biomass and yield components. Asian Journal of Plant Sciences. 2: 290-293.

22-Swati, Z.A., Muhammad, I.  and Haya taj, F. 2003. In situ & In vitro studies in wheat (Triticum aestivum L.) genotypes for drought tolerance. Treatment of Pant Breeding and Genetic Faculty of Crop Production Science. pp 197.

23-Tabatabai Oghdaie, S.R. 1383. The use of biotechnology in breeding for resistance to osmotic stress in plants. 14

24-Turhan, H. and Baser, I. 2004. In vitro and In vivo water stress in sunflower (Helianthus annus L.). Helia. 27:227- 236.