نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیات علمی / 1 گروه زیست شناسی˓ دانشکده علوم پایه˓ واحد علوم و تحقیقات تهران˓دانشگاه آزاد اسلامی˓ تهران˓ ایران

2 استاد / 2 گروه زیست شناسی گیاهی˓ دانشکده علوم پایه˓ دانشگاه آزاد اسلامی˓ مرو دشت˓ ایران

3 هیات علمی / 3 گروه علوم گیاهی˓ دانشکده علوم زیستی˓ دانشگاه خوارزمی˓ تهران˓ ایران

چکیده

خشکی با اثرات تنش اسمزی˓ رشد گیاهان و تولید محصولات کشاورزی را کاهش می‌دهد. نیتریک اکسید یک رادیکال گازی پایدار است که بعنوان یک مولکول پیام‌رسان در گیاهان عمل می‌کند و در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی˓ نموی و همچنین پاسخ‌های گیاهان به تنش‌‌های محیطی شرکت می‌کند. در پژوهش حاضر از نیتروپروساید سدیم (SNP) بعنوان رها کننده NO استفاده گردید. گیاهچه‌های کلزا به مدت 21 روز در معرض مقادیر رطوبتی خاک شامل 100%˓ 60% و 30% ظرفیت زراعی (FC ) در ترکیب با SNP (0˓25˓50˓ 75 و100 میکرومولار) و بدون SNP قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تنش خشکی به تنهایی سبب کاهش وزن خشک اندام‌های هوایی و ریشه می گردد. مقادیر پرولین˓ قند‌های محلول˓ آنتوسیانین˓ فلاونوئید‌ها و فنل کل در گیاهان تحت تنش خشکی افزایش معنی داری نشان دادند. در بین غلظت‌های مختلف SNP تیمار 25 میکرومولار˓ عملکرد رشد و مقادیر پرولین˓ قندهای محلول˓ آنتوسیانین˓ فلاونوئیدها و فنل کل را تحت تنش خشکی افزایش داد. غلظت‌های زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب آسیب‌های اکسیداتیو در گیاهچه-های کلزا گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of sodium nitroprusside (SNP) on some physiological parameters in oilseed rape (Brassica napus L.) seedlings under drought stress

نویسندگان [English]

  • Masoumeh Nikravesh 1
  • Bahman kholdebarin 2
  • Taher Nejadsattari 1
  • Farzaneh Najafi 3

1 Teacher / 1 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

2 Professor / 2 Department of Plant Biology, College of Basic Sciences, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran

3 Teacher / 3Department of Plant Science, Faculty of Biological Sciences Kharazmi University, Tehran, Iran

چکیده [English]

Drought with its osmotic stress effects inhibits plants growth and limits agricultural crops production. Nitric oxide (NO) is a stable free radical gas which acts as a signaling molecule in plants and participates in various plants physiological and developmental processes and also in plants responses to environmental stresses. In this study sodium nitroprusside (SNP) was used as NO donor. Oilseed rape seedlings were subjected to various soil moisture contents including, 100%, 60% and 30% field capacity (FC) with and without SNP (0, 25, 50, 75 and 100 µM) for a period of 21 days. Results showed that drought stress alone reduces both shoots and roots dry weight. The amounts of proline, soluble sugars, anthocyanin, flavonoids and total phenols were significantly higher in seedlings subjected to drought stress. Of the various concentrations of SNP used, treatments containing 25 µM, increased both growth and the amounts of proline, soluble sugars, anthocyanin, flavonoids and total phenols under drought stress. Higher concentrations (75 and 100 µM) of SNP caused oxidative damages to the seedlings.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Drought stress"
  • " Nitric Oxide"
  • " Brassica"

اثر سدیم نیتروپروساید ( (SNPبر برخی عوامل فیزیولوژیکی گیاه کلزا
(
Brassica napus L. ) تحت تنش خشکی

معصومه نیک‌روش،1 بهمن خلدبرین2*، طاهر نژادستاری1 و فرزانه نجفی3

1 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

2 شیراز، دانشگاه شیراز، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی 

3 تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 9/7/94             تاریخ پذیرش: 7/2/95

چکیده

خشکی با اثرات تنش اسمزی، رشد گیاهان و تولید محصولات کشاورزی را کاهش می­دهد. نیتریک اکسید یک رادیکال گازی پایدار است که به‌عنوان یک مولکول پیام­رسان در گیاهان عمل می­کند و در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی، نموی و همچنین پاسخ­های گیاهان به تنش­­های محیطی شرکت می­کند. در این پژوهش از نیتروپروساید سدیم (SNP) به‌عنوان رها‌کننده NO استفاده شد. گیاهچه­های کلزا به مدت 21 روز در معرض مقادیر رطوبتی خاک شامل 100%، 60% و 30% ظرفیت زراعی (FC ) در ترکیب با SNP (0، 25، 50،  75 و100 میکرومولار) و بدون SNP قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تنش خشکی به تنهایی سبب کاهش وزن خشک اندام­های هوایی و ریشه  می‌گردد. مقادیر پرولین، قند­های محلول، آنتوسیانین، فلاونوئید­ها و فنل کل در گیاهان تحت تنش خشکی افزایش معنی‌داری نشان دادند. در بین غلظت‌های مختلف SNP تیمار 25 میکرومولار، عملکرد رشد و مقادیر پرولین، قندهای محلول، آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنل کل را تحت تنش خشکی افزایش داد. غلظت­های زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب آسیب­های اکسیداتیو در گیاهچه­های کلزا شد.

واژه­های کلیدی: تنش خشکی، کلزا، نیتریک اکسید

* نویسنده مسئول، تلفن: 3228916-071، پست الکترونیکی:bkholdeb@biology.susc.ac.ir  

مقدمه

 

تنش­های محیطی ازجمله خشکی عوامل محدود کننده محصولات زراعی هستند. بیش از 45 درصد زمین­های کشاورزی بطور دائم در معرض خشکی قرار دارند و 38 درصد جمعیت دنیا در آن مناطق ساکن هستند (17). کمبود آب به‌عنوان عدم وجود رطوبت کافی برای رشد طبیعی و تکمیل چرخه زندگی گیاهان تعریف می شود (40). محدودیت آب و افزایش رو به رشد تقاضا برای مواد غذایی اثرات خشکی را تشدید می­کنند (17).

 در تنش خشکی به علت بسته شدن روزنه­ها، غلظت CO2

در بافت مزوفیل برگ کاهش می­یابد، بنابراین محصول واکنش­های نوری فتوسنتز ازجمله NADPH مصرف نمی‍شود. از آنجایی که در این شرایط  NADPH اکسید نمی‌شود، از این‌رو مقدارNADP+  برای دریافت الکترون کاهش می­یابد. در این صورت اکسیژن به‌عنوان پذیرنده الکترون از زنجیره انتقال الکترون در فتوسنتز عمل می­کند و گونه­های فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکال سوپراکسید (O2-)، پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدرروکسیل (OH.) تولید می­شوند. گونه­های فعال اکسیژن به شدت واکنش­پذیر هستند و بعکس اکسیژن اتمسفری می­توانند ترکیبات سلولی مانند پروتئین­ها، لیپید­ها، DNA و RNA را اکسید کنند. اکسید شدن نامحدود ترکیبات سلولی سرانجام منجر به مرگ سلول و گیاه می­شود (31).

مهمترین عوامل فیزیولوژیکی برای تحمل به خشکی، تنظیم اسمزی، تولید آنتی اکسیدان­ها و رباینده­های ROS هستند. هنگام تنش خشکی، تنظیم اسمزی می­تواند سبب کاهش آسیب به سلول شود. تجمع مواد آلی قابل حل در سیتوپلاسم، پتانسیل اسمزی سلول را منفی­تر کرده و با افزایش شیب جریان آب به سمت سلول به حفظ تورژسانس سلول کمک می‌کند (51). ترکیبات دارای فعالیت اسمزی شامل قندهای محلول، قندهای الکلی، پرولین و اسیدهای آلی می­باشند (48). پرولین مهمترین نوع اسمولیت است و تجمع آن در سازگاری به خشکی در بسیاری از گیاهان گزارش شده است (28). پرولین علاوه بر تنظیم اسمزی به‌عنوان محافظ در برابر تنش­های اکسیداتیو عمل می­کند و با ماکرومولکول­ها اثر متقابل داشته و سبب حفظ شکل و ساختار آنها در زمان تنش می­شود (28). تجمع قندها در زمان تنش سبب تنظیم فشار اسمزی، کاهش اتلاف آب سلولی و نگهداری تورژسانس می­شود (46).

عدم تحرک در گیاهان سبب توسعه سازوکارهایی در آنها شده است تا بتوانند در مقابل شرایط نامطلوب محیطی مقاومت نمایند. از جمله این سازوکارها سنتز متابولیت­های ثانویه مانند ترکیبات فنلی است (5). ترکیبات فنلی در میان مواد دارای ظرفیت آنتی­اکسیدانی، یکی از مهمترین گروه­ها هستند. ترکیبات فنلی در سلسله گیاهی با داشتن حداقل یک حلقه آروماتیک و وجود یک یا بیشتر از یک گروه هیدروکسیل متصل به آن  مشخص می شوند و بر پایه تعداد و ترتیب اتم‌های کربن آنها به فلاوونوئیدها (فلاوونول­ها، فلاوون­ها، آنتوسیانین­ها) و غیر فلاوونوئید­ها (اسیدهای فنولیک، هیدروکسی سینامات‌ها، استیلبن­ها) تقسیم می­شوند که معمولا به قندها و اسیدهای آلی متصل می­گردند (13). در گونه­های Brassica بیشتر پلی فنل­ها از نوع فلاوونوئیدها (فلاونول­ها و آنتوسیانین­ها) و اسیدهای هیدروکسی سینامیک هستند (10). ترکیبات فنلی می توانند سبب برداشتن گروه­های ROS شوند (2) و مانع فعالیت آنزیم­های مسئول واکنش­های اکسیژناسیون می­شوند (15). فلاونوئیدها از انتشار ROS ممانعت می­کنند و می­توانند با پاک سازی آنها از تنش­های اکسیداتیو جلوگیری کنند (5). آنتوسیانین­ها رنگیزه­های محافظتی هستند که به عنوان گیرنده­های رادیکال­های آزاد عمل می­کنند و موجب محافظت گیاهان در برابر تنش­های اکسیداتیو می­شوند (35). افزایش آنتوسیانین در شرایط تنش به علت نقش حفاظت نوری آنها در حذف مستقیم ROS در هنگام تنش اکسیداتیو می­باشد (54).

نیتریک اکسید (NO ) یکی از مولکول­هایی است که اخیرا توسط  محققان گیاهی مورد توجه بسیاری قرار گرفته است (16).NO  یک رادیکال گازی و قابل انتشار است که بصورت درون­زا در گیاهان تولید می­شود (3). NO نه تنها در مناطق آب­دوست سلول مانند سیتوپلاسم حرکت می­کند، بلکه آزادانه از داخل فاز لیپیدی غشاء­ها نیز انتشار می­یابد (3). گزارش‌های زیادی مبنی بر نقش­های متنوع نیتریک اکسید مانند القاء جوانه زنی بذر، تنظیم متابولیسم در پیری و پاسخ به تنش­های زیستی و غیر زیستی وجود دارد (29).

نیتریک اکسید در بیشتر تنش­ها در گیاهان حضور دارد. کاربرد نیتروپروساید سدیم (SNP) به‌عنوان رها کننده NO  مقاومت گیاه به تنش خشکی را از طریق بستن روزنه­ها و در نتیجه کاهش تعرق افزایش می­دهد (19 ). NO به‌عنوان پیامبر ثانویه در سلول­های گیاهی عمل می­کند و بیان  ژن را نیز القاء می­نماید (24). کاربرد SNP فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان و میزان آب نسبی (RWC ) را در برگ­های گندم که در معرض تنش خشکی قرار گرفته بودند افزایش داده است (50). همچنین کاربرد SNP به‌عنوان رها کننده NO سبب افزایش پرولین در گیاهچه­های خیار تحت تنش شوری شده است (16).

کلزا Brassica napus L.)) یکی از مهمترین محصولات زراعی اقتصادی است که به‌دلیل داشتن دانه­های روغنی سهم مهمی در تأمین روغن خوراکی در ایران دارد. خشکی یکی از عوامل محیطی است که در کشت این گیاه روغنی مشکلاتی ایجاد کرده است. این بررسی با هدف مطالعه تأثیر تیمار NO بر برخی عوامل فیزیولوژیکی گیاه کلزا در رابطه با تحمل آن به تنش خشکی انجام شده است.

مواد و روشها

گیاه مورد مطالعه در این تحقیق، کلزا L.) (Brassica napus رقم Okapy  می­باشد. بذر مورد نظر از اتحادیه دانه­های روغنی استان فارس تهیه شد. با استفاده از ترازوی دیجیتالی در هر گلدان دو کیلوگرم خاک زراعی ریخته شد. سپس بذرها به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 2% ضد عفونی شدند و چند بار با آب معمولی و یکبار با آب مقطر آبکشی گردیدند. بذر­ها در گلدان ها به فاصله 5/2 سانتیمتری از هم کاشته شدند. گلدان­ها در گلخانه با دمای2±22 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. تنش آبی و تیمار­های نیتریک اکسید 4 هفته بعد از شرایط مطلوب آبیاری در مرحله چهار برگی گیاهان شروع شد. برای اعمال تنش خشکی و تیمار SNP گیاهان به 3 گروه تقسیم شدند. گیاهان گروه اول به مدت سه هفته در شرایط آبیاری 100،60 و30 درصد ظرفیت زراعی قرار گرفتند. اعمال تنش خشکی به روش وزنی انجام شد که قبل از آن باید ظرفیت زراعی را محاسبه کرد. برای به دست آوردن ظرفیت زراعی ابتدا سه گلدان از خاک خشک پر گردید و وزن اولیه آنها یادداشت شد. سپس تا حد خروج آب، گلدان­ها آبیاری شدند. روی گلدان­ها با پلاستیک پوشانده شد تا تبخیر انجام نشود. پس از 48 ساعت و خروج کامل آب از گلدان­ها تحت نیروی ثقل، وزن ثانویه گلدان­ها تعیین شد. با محاسبه اختلاف وزن اولیه و ثانویه گلدان­­ها، ظرفیت زراعی محاسبه گردید. برگ­های گیاهان گروه دوم بصورت یک روز در میان و به مدت سه هفته با غلظت­های 0، 25، 50، 75 و 100 میکرومولار نیتروپروساید سدیم محلول­پاشی شدند و همزمان تحت رژیم­های آبیاری 100، 60 و 30 درصد ظرفیت زراعی قرار گرفتند. برگ­های گیاهان گروه سوم بصورت یک روز در میان و به مدت 3 هفته با غلظت­های 0،25، 50، 75 و 100 میکرومولار نیتروپروساید سدیم محلول­پاشی شدند. در همه تیمارها از Tween-20 01/0 درصد به عنوان روکنشگر (Surfactant ) استفاده گردید. در مورد گیاهان شاهد، برگ­های گیاهان با آب مقطر حاوی Tween-20 01/0 درصد محلول­پاشی شدند. پس از 21 روز اعمال تنش خشکی، گیاهان برداشت شدند. ریشه­ها و اندام­های هوایی از هم جدا شده، نمونه­های مورد استفاده برای تعیین وزن خشک در دمای 70 درجه سانتی­­گراد به مدت 48 ساعت در آون خشک شدند. برای مطالعه پاسخ های فیزیولوژیکی، تعدادی از نمونه ها پس برداشت در نیتروژن مایع منجمد شدند و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند.

سنجش میزان پرولین: مقدار پرولین بر اساس روش Bates و همکاران (1973) (6) با استفاده از نین هیدرین تعیین شد. در این روش نمونه­ها با اسیدسولفوسالیسیلیک 3% هموژنه گردید و بعد به مدت 10 دقیقه در 3000g سانتریفوژ شدند. بعد از اضافه کردن اسید استیک و معرف نین هیدرین، محتوای لوله­های آزمایش به مدت یک ساعت در حمام آب­گرم (78 درجه سانتی­گراد) قرار گرفتند و بعد جذب نوری نمونه­ها به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. مقدار پرولین با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید.

سنجش میزان قندهای محلول: مقدار قندهای محلول با روش نلسون(1944) اندازه گیری شد(42). 200 میلی گرم بافت مورد آزمایش به مدت 48 ساعت در ظروف محتوای 10 میلی لیتر اسیدسولفوسالیسیلیک 3% قرار گرفت. سپس به 1/0 میلی لیتر از نمونه­ها 9/0 میلی لیتر آب مقطر و یک میلی لیتر محلول مس قلیایی اضافه شد. پس از قرار گرفتن نمونه­ها به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم (C˚78)، یک میلی لیتر آرسنومولیبدات و 7 میلی لیتر آب مقطر به هر لوله اضافه و مخلوط گردید. بعد از 10 دقیقه جذب نوری مخلوط واکنش به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومترخوانده شد. مقدار قندهای محلول با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز محاسبه و بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر بیان گردید.

سنجش میزان آنتوسیانین: غلظت آنتوسیانین به روش Wagner (1979 ) تعیین شد (52). ابتدا 1/0 گرم بافت تر در هاون با 10 میلی لیتر متانول اسیدی (99 به 1 به ترتیب متانول و اسید کلریدریک) ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 24 ساعت در تاریکی در دمای اتاق نگهداری شد و بعد به مدت 10 دقیقه با دور g4000 سانتریفوژ گردید. جذب روشناور در طول موج 550 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین از رابطه A=ƐBC استفاده گردید. در این فرمول A میزان جذب در طول موج 550 نانومتر، ضریب خاموشی برابر mMCm-1 3300،B  قطر کووت (Cm1) و C غلظت کمپلکس برحسب mM  می­باشد.

سنجش میزان فلاونوئیدها: اندازه گیری فلاونوئیدها با اسپکتروفتومتر و با استفاده از روشKrizek و همکاران (1998) انجام شد (30). 1/0 بافت تازه در هاون چینی با 10 میلی لیتر اتانول اسیدی (الکل اتیلیک و اسید استیک گلاسیال به نسبت حجمی 1:99) ساییده شد. پس از سانتریفوژ، عصاره با دور g8000 به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. میزان فلاونوئیدها با استفاده از فرمول زیر بر حسب درصد محاسبه شد.

Fla= ABS (300nm) 14V700">  × 100

V: حجم عصاره ،  ABS: جذب نوری ، Fla: فلاونوئید 

سنجش فنل کل: 1/0 گرم از بافت تازه برگ در 10 میلی لیتر اتانول 80 درصد قرار داده شدند و به مدت 15 دقیقه درحمام آب گرم جوشانده شد. پس از سانتریفوژ، نمونه­ها در دور g3000 به مدت 15 دقیقه، محلول رویی با الکل 80 درصد به حجم 10 میلی لیتر رسانده شد. سپس 5 میلی لیتر از این محلول با 5 میلی لیتر فولین و 10 میلی لیتر کربنات سدیم اشباع مخلوط و نمونه­ها به مدت 15 دقیقه با دور g4000 سانتریفوژ شد. جذب محلول رویی در طول موج 640 نانومتر در مقابل شاهد خوانده شد. برای تعیین غلظت ترکیبات فنلی از منحنی استاندارد اسید گالیک با غلظت­های مختلف استفاده و مقدار این ترکیبات برحسب میلی گرم در گرم وزن تر نمونه ها محاسبه گردید (41).

تحلیل آماری: در این مطالعه، آزمایشها براساس طرح فاکتوریل در قالب بلوک­های کاملا تصادفی و سنجش­ها­ در سه تکرار انجام شد. داده­های حاصل از اندازه گیری­ها به وسیله نرم افزارآماری SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مقایسه میانگین داده­ها در سطح خطای 5 درصد (P≤0.05) با آزمون  Duncanو رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.

نتایج 

اثر غلظت­های مختلف SNP بر وزن خشک اندام­های هوایی و ریشه گیاه کلزا تحت تنش خشکی: تنش خشکی سبب کاهش وزن خشک اندام­های هوایی و ریشه گیاهان کلزا گردید (شکل های 1و2). محلول پاشی SNP با غظت 25 میکرومولار وزن خشک اندام­های هوایی و ریشه گیاهان کلزا را تحت تنش خشکی (FC60% و FC30%) افزایش داد. غلظت­های زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) و تنش خشکی (FC60% و FC30%) باعث کاهش وزن خشک ریشه و اندام­های هوایی گردید. در شرایط مطلوب آبیاری فقط غلظت 100 میکرومولارSNP ، سبب کاهش معنی دار در رشد اندام های هوایی کلزا شد (شکل های 1 و 2).

 

 

 

 

شکل 1- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر وزن خشک اندام­های هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی  داده­ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.

 

 

شکل 2- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر وزن خشک ریشه گیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن p<0/05) ( مقایسه شدند.

 


اثر غلظت­های مختلف SNP بر میزان پرولین برگ و ریشه گیاه کلزا تحت تنش خشکی: نتایج به‌دست آمده از اندازه‌گیری اسیدآمینه پرولین در برگ و ریشه گیاهان کلزا به ترتیب در شکل های 3و4 نشان داده شده است.

 

 

شکل 3- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر محتوای پرولین اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (p < 0/05) مقایسه شدند.

 

 

شکل 4- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر محتوای پرولین ریشه گیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.

 

تنش خشکی (FC60% و FC30%) سبب افزایش قابل توجهی در محتوای پرولین برگ و ریشه در مقایسه با گیاه شاهد (FC 100%) شد. تیمار گیاهان با سدیم نیتروپروساید (25 میکرومولار) باعث افزایش محتوای پرولین در شرایط تنش خشکی ( FC60% و  FC30%)  گردید. غلظت های 75 و 100 میکرو مولار سدیم نیترو پروساید سبب کاهش محتوای پرولین در برگ و ریشه گیاهان کلزا در شرایط تنش خشکی شد. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار پرولین برگ و ریشه در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشت.

اثر غلظت‌های مختلف SNP بر میزان قندهای محلول برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: داده­های حاصل از سنجش مقدار قندهای محلول در شکل 5 نشان می­دهد که با افزایش خشکی میزان قند­های محلول افزایش می­یابد و در ظرفیت زراعی 30 % به حداکثر می­رسد. به‌طوری‌که مقدار آن از 43/35 میکرو گرم بر گرم وزن تر در شاهد به 13/73 میکرو گرم بر گرم وزن تر در ظرفیت زراعی 30% افزایش می یابد. تیمار گیاهان با 25 میکرومولار SNP سبب افزایش محتوای قندهای محلول تحت تنش خشکی گردید. غلظت های بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) سبب کاهش محتوای قندهای محلول گیاهان در تنش خشکی شده است. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار قند­های محلول اندام­های هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.

اثر غلظت­های مختلف SNP بر میزان آنتوسیانین برگ گیاه کلزا تحت تنش شوری: محتوای آنتوسیانین در برگ­های گیاهان تحت تنش خشکی در شکل 6 نشان داده شده است. با افزایش تنش خشکی میزان آنتوسیانین به طور معنی داری افزایش یافته که این افزایش در 60%و 30% ظرفیت مزرعه به ترتیب27 و58 درصد نسبت به شاهد (ظرفیت زراعی100%) می­باشد. محلول­پاشی برگ ها با SNP (25µM) به طور معنی داری میزان آنتوسیانین را تحت تنش خشکی افزایش داده است. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار آنتوسیانین اندام­های هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشت.

 

 

 

شکل 5- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان قندهای محلول اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) مقایسه شدند.


اثر غلظت­های مختلف SNP بر میزان فلاونوئیدهای برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: تحت تنش خشکی افزایش معنی داری در مقدار فلاونوئیدهای گیاهان کلزا مشاهده شد (شکل 7). این افزایش در 60% و 30% ظرفیت مزرعه به‌ترتیب 35 درصد و77  درصد در مقایسه با شاهد (ظرفیت زراعی 100%) بوده است. کاربرد SNP (25 میکرومولار) سبب افرایش فلاونوئیدها تحت تنش خشکی گردید (شکل 7). تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار فلاونوئید اندام­های هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.

 

 

 

شکل 6- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان آنتوسیانین اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی  داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.

 

 

شکل 7- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان فلاونویید اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شده‌اند.


اثر غلظت‌های مختلف SNP بر میزان ترکیبات فنلی برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: افزایش ترکیبات فنلی تحت تنش خشکی (FC30% و FC60%) در مقایسه با شاهد در شکل 8 نشان داده شده است. محلول پاشی برگ­ها با SNP (25 میکرومولار) تحت تنش خشکی، محتوای فنل کل را به طور معنی داری افزایش داده است. غلظت­های بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) محتوای ترکیبات فنلی برگ­ها را کاهش داد. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار ترکیبات فنلی اندام­های هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.

 

 

 

شکل 8- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر مقدار فنل کل اندام هوایی کیاه کلزا تحت تنش کم آبی داده‌ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.

 


بحث 

با توجه به نتایج به‌دست آمده مصرف نیترو پروساید سدیم (25 میکرومولار) سبب بهبود رشد گیاهان کلزا تحت تنش خشکی شده است. رادیکال­های آزاد اکسیژن در شرایط تنش سبب شکستن رنگیزه­ها و پروتئین­های دستگاه فتوسنتزی می­شوند. احتمالا نیتریک اکسید با اثرات ربایندگی گونه­های واکنش کننده اکسیژن (ROS ) تولید شده در تنش موجب بهبود وضعیت کلروفیل سلول های گیاهی می­شود (33) و با افزایش فتوسنتز مقدار ماده خشک گیاه نیز افزایش می یابد. از طرف دیگر، غلظت­های زیاد SNP با تولید گونه­های فعال نیتروژن اثرات بازدارندگی ROS را شدیدتر کرده و احتمالا به دستگاه فتوسنتزی گیاه آسیب رسانده و منجر به کاهش رشد گیاه می شود (27).

نتایج به‌دست آمده در این پژوهش نشان داد که تنش خشکی سبب افزایش میزان پرولین در برگ و ریشه کلزا شده است. تنظیم اسمزی مهمترین سازوکاری است که جذب آب از خاک را توسط گیاه بهبود می­بخشد و سبب برقراری تورژسانس سلول در شرایط تنش خشکی می­گردد (17). یک چنین فرایند تنظیم اسمزی، از طریق ترکیبات سازگار با متابولیسم مانند پرولین، قندهای محلول، گلیسین بتایین و اسیدهای آلی در گیاهان اعمال می‌گردد (37). در بسیاری از گیاهان پرولین به‌عنوان یک اسیدآمینه چندمنظوره در پاسخ به تنش غیرزیستی تجمع می­یابد. پرولین به‌عنوان یک اسمولیت، سازگاری مناسبی با آنزیم­ها و ماکرومولکول­های سلول دارد و از ساختار پروتئین­ها و غشاء سلول­ها محافظت می­کند (49). پرولین همچنین به‌عنوان رباینده رادیکال هیدروکسیل عمل می­کند (12). تیمار گیاهان با سدیم نیتروپروساید (25 میکرومولار) باعث افزایش مقدار پرولین تحت تنش خشکی شده است که می­تواند به دلیل افزایش سنتز این اسید آمینه باشد (شکل 1و2). پیرولین 5- کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) آنزیم کلیدی در بیوسنتز پرولین است که  فعالیت آن با تیمار سدیم نیتروپروساید افزایش می­یابد. نتایج این پژوهش با مطالعات دیگران در مورد افزایش فعالیت این آنزیم توسط نیتریک اکسید تحت تنش خشکی مطابقت دارد (34). در غلظت­های زیادSNP  همانطور که اشاره شد با تولید گونه­های فعال نیتروژن (پراکسی­نیتریت) تنش نیتروزاتیو ایجاد می شود که اثرت آسیب­رسانی  ROS را تشدید می کند (27).

افزایش محتوای قندهای محلول تحت تنش خشکی احتمالا به علت افزایش فعالیت آنزیم آمیلاز، هیدرولیز نشاسته به قندهای ساده­تر و کاهش انتقال قندها از برگ به سایر قسمت­های گیاه می­باشد(54). تحت تنش خشکی قند­های محلول به‌عنوان عوامل اسمزی و محافظت کننده اسمزی عمل می کنند (7). قند های محلول با کاهش پتانسیل اسمزی سلول به تداوم جذب آب و حفظ تورژسانس کمک می­کنند. نقش محافظت اسمزی قندها در پایداری غشاء­ها و پروتئین­ها از طریق تشکیل باندهای هیدروژنی با دنباله­های قطبی پلی پپتیدها (14) و گروه­های فسفات فسفولیپیدهای غشاء گزارش شده است (47). همچنین قندهای محلول در گیاهان می توانند فعالیت آنتی­اکسیدانی داشته باشند (32). در این پژوهش محلول پاشی برگ­ها به وسیله SNP (25µM) در گیاهان کلزا تحت شرایط خشکی مقدار قند­های محلول را در مقایسه با گیاهان شاهد (خشکی تنها) افزایش داده است (شکل5). بررسی­های پژوهشگران دیگر نشان داده است که کاربرد SNP تحت تنش خشکی محتوای قندهای محلول را در گیاهان کتان (39) افزایش می دهد. در تحقیقات Liao و همکاران (2012) مشخص شد که تیمار SNP انجام فتوسنتز در برگ­ها را بهبود می­بخشد و اثرات منفی خشکی بر تجمع کربوهیدرات­ها و ترکیبات نیتروژنی را در Tagetes erecta  کاهش می­دهد (36).

آنتوسیانین­ها رنگدانه­های محلول در آب و از خانواده فلاونوئید­ها هستند که از مسیر شیکمیک اسید ساخته می­شوند (26). آنتوسیانین ها دارای خاصیت آنتی اکسیدانی هستند، و به‌عنوان گیرنده رادیکال های آزاد عمل می­کنند و گیاهان را در برابر تنش­های اکسیداتیو محافظت می­کنند (35). بررسی­های پیشین نشان داده است که در برگ­های گیاه Brachystegia spiciformis  تجمع آنتوسیانین سبب کاهش پتانسیل اسمزی برگ­ها و در نتیجه کاهش پتانسیل آب برگ و کاهش هدایت روزنه ای می­شود( 11). در سیب زمینی همانند کلزا با افزایش تنش خشکی میزان تولید فلاونوئیدها افزایش یافته است(53). همچنین انباشتگی آنتوسیانین در برگ گیاه Craterostigma  در شرایط آبگیری گزازش شده است(25). این نتایج نشان دهنده افزایش مسیر تولید فلاونوئید است که منجر به تولید آنتوسیانین می شود (53). محلول­پاشی برگ­ها با SNP (25µM)  بطور معنی­داری میزان آنتوسیانین را تحت تنش خشکی افزایش داده است. در این راستا، Ganjewala و همکاران (2008) گزارش کردند که تیمار SNP مقدار آنتوسیانین را در برگ­های نخود افزایش می­دهد که احتمالا از طریق بازدارندگی مصرف قندهای تولید شده در فتوسنتز و تبدیل آنها به آنتوسیانین‌ها می باشد (18). مولکول زیستی NO ممکن است القاء کننده بیوسنتز متابولیت­های ثانویه مانند آنتوسیانین باشد که به‌عنوان پالایندهROS  برای کاهش تنش اکسیداتیو عمل می­کنند (22).

بررسی­های پیشین در گیاه کلزا (Brassica napus) در شرایط تنش خشکی نشان داده است که محتوای فلاونوئیدها  به عنوان متابولیت­ های ثانویه افزایش می­یابد (44). با ایجاد تنش اکسیداتیو بیان ژن­های آنتی اکسیدان (50) و مسیر فنیل پروپانوئید به ویژه بیوسنتز فلاونوئیدها افزایش می­یابد (38). فلاونوئیدها آنتی اکسیدان­هایی هستند که می­توانند بطور مستقیم از طریق انتقال یک پروتون موجود در حلقه خود سبب پاک سازی رادیکال­های آزاد شوند(9). همچنین فلاونوئیدها با کلاته کردن کاتیون­های Fe2+ وFe3+ می توانند پراکسیداسیون لیپیدهای وابسته به این دو شکل عنصر آهن را متوقف کنند (4). بررسی­های پژوهشگران نشان داده است که فلاونوئیدها با کاهش سیالیت غشاءها، آنها را نسبت به عوامل اکسیداتیو مقاوم کرده و از انتشار رادیکال­های آزاد از خلال آنها جلوگیری می­کنند (23). همچنین فلاونوئیدها با بازدارندگی آنزیم­های سیکلواکسیژناز، لیپواکسیژناز، مونواکسیژناز میکروزومی و گزانتین اکسیداز از تشکیل رادیکال آزاد اکسیژن ممانعت می­کنند (8). کاربرد SNP (25 میکرومولار) سبب افزایش فلاونوئیدها تحت تنش خشکی گردید (شکل 7). تنش خشکی سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز می­شود که آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها و آنتوسیانین هاست (21). احتمالا NO نیز به همین روش بر مقدار این ترکیبات آنتی اکسیدانی می­افزاید. البته غلظت­های بالای  SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب کاهش محتوای فلاونوئید شده است ( شکل 7) که احتمالا به علت اختلال در سیستم دفاعی گیاه در این شرایط است و نیاز به بررسی بیشتر دارد.

افزایش مقدار فنل احتمالا ناشی از فعالیت مسیر هگزوز مونو فسفات و مسیر استات و رها شدن فنل­ها توسط آنزیم­های هیدرولیزکننده می باشد(45). پژوهش­هایSakihama  و همکاران (2002) نشان داده است که ترکیبات فنلی با دادن الکترون به آنزیم­های نوع پراکسیداز و سم زدایی آب اکسیژنه تولید شده می توانند در سلول به عنوان آنتی اکسیدان عمل کنند (43). محلول پاشیSNP (25 میکرومولار) تحت تنش خشکی محتوای فنل کل را به طور معنی داری افزایش داده است( شکل 8) که این نتایج با تحقیق نصیبی و همکاران (1390) مطابقت دارد (1). غلظت­های بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) محتوای ترکیبات فنلی برگ­ها را کاهش داد. پیش ماده اصلی برای سنتز فنل در بافت­های گیاهی کربوهیدرات­ها مخصوصا کربوهیدرات­های محلول هستند که منجر به تشکیل مواد ضروری مورد احتیاج برای سنتز پلی­فنل­ها می شود(20)، بنابراین کاهش ترکیبات فنلی مشاهده شده در غلطت های 75 و 100 میکرومولار SNP تحت تنش خشکی ممکن است ناشی از کاهش در محتوای قندهای محلول در این شرایط باشد.

کاهش عملکرد گیاه کلزا در غلظت های زیاد SNP و تحت تنش خشکی در کلیه  پارامتر های  بررسی شده در این پژوهش مشهود است. نیتریک اکسید عملکرد دو گانه دارد و می تواند به عنوان اکسیدانت قوی و نیز به صورت آنتی اکسیدانت مؤثر عمل کند. نقش دوگانه نیتریک اکسید به غلظت آن و وضعیت محیط به عنوان عامل تنش بستگی دارد (24).

نتیجه‌گیری کلی

بررسی­های انجام شده در این پژوهش نشان داد که نیتریک­اکسید در غلظت­های پایین می­تواند آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی را در گیاهان کلزا کاهش دهد. نیتریک اکسید از طریق مقابله با ROS  سبب بهبود عملکرد رشد، افزایش اسمولیت­ها و پارامترهای دفاعی گیاه در مقابل تنش خشکی می­شود و این امر به مقاومت گیاه در مقابل تنش خشکی کمک می­کند. کاربرد غلظت­های زیاد SNP در گیاه کلزا نقش همکاری (synergism ) با ROS داشته و آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی را تشدید می­کند. محلول پاشی گیاهان با ترکیبات تولید کننده نیتریک اکسید مانند سدیم نیتروپروساید در هنگام تنش کم آبی می توانند با بستن روزنه ها از هدر رفتن بیشتر آب در تعرق توسط گیاه جلوگیری کنند و همزمان با فعال کردن سیستم دفاعی آنتی اکسیدان گیاه، از تنش­های اکسیداتیو بر روی گیاهان ممانعت کنند.

1- نصیبی، ف.، منوچهری کلانتری، خ. و یعقوبی، م. 1390.  مقایسه اثر پیش تیمار سدیم نیتروپروساید و آرژینین بر برخی پاسخ­های فیؤیولوژیکی گیاه گوجه فرنگی(L.  Lycopersicum esculentum) تحت تنش آبی. مجله زیست شناسی ایران. 24: 833-847..

 

2- Amarowicz, R., Weidner, S., Wojtowicz, I., Karmac, M., Kosin´ska, A. and Rybarczyk, A. 2010. Influence of low-temperature stress on changes in the composition of grapevine leaf phenolic compounds and their antioxidant properties. Funct. Plant Sci. Biotechnol. 4: 90–96.

3- Arasimowicz-Jelonek M., Floryszak-Wieczorek, J. and J. Kubis, J. 2009. Interaction between polyamine and nitric oxide signaling in adaptive responses to drought in cucumber. J. Plant Growth Reg. 28: 177-186.

4- Arora, A., Nair, M.G. and Strasburg, G.M. 1998. Structure-activity relationships for antioxidant activities   of a series of flavonoids in a liposomal system. Free Radic. Biol. Med. 24: 1355–1363.

5- Arora, A., T. M., Byrem, Nair, M.G. and Strasburg, G.M. 2000. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids. Arch. Biochem. Biophys. 373: 102–109.

6- Bates, L. S., Walderen, R.P. and Thane, I.D. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil. 39: 205-208.

7- Bohnert, H. J., Nelson, D.E. and Jensen, R.G. 1995. Adaptations to environmental stresses. Plant Cell. 7: 1099-1111.

8- Brown, J. E., Khodr, H., Hider, R.C. and Rice-Evans, C. A. 1998. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: Implications for their antioxidant properties. Biochem. J. 330: 1173-1178.

9- Cao, G., Sofic, E. and Prior, R.L. 1997. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: Structure-activity relationships. Free Radic. Biol. Med. 22: 749–760.

10- Cartea, M. E., Francisco, M., Soengas, P.  and Velasco, P. 2011. Phenolic compounds in Brassica vegetables. Molecules. 16: 251-280.

11- Choinski, J. S. and Johnson, M. 1993. Changes in photosynthesis and water ststus of developing leaves of Brachystegia spiciformis Benth. Tree Physiol. 13: 17-27.

12- Claussen,W. 2005. Proline as a measure of stress in tomato plants. Plant Sci.168: 241-248.

13- Crozier, A., Jaganath, I.B. and Clifford, M.N. 2006. Phenols, polyphenols and  tannins: An overview. In Plant Secondary Metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. Eds.; Blackwell: Oxford, UK. pp. 1-24.

14- Crowe, J. H., Hoekstra, F.A. and Crowe, L.M. 1992. Anhydrobiosis. Ann. Rev. Physiol.54: 579-599.

15- Elavarthi, S. and Martin, B. 2010. Spectrophotometric assays for antioxidant enzymes in plants. Methods Mol. Biol. 639: 273–281.

16- Fan, H., Du, C. and Guo, S. 2012.  Effect of nitric oxide on proline metabolism in cucumber seedlings under salinity stress. J. American Society Horticul. Sci.137: 127-133.

17- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S.M.A. 2009. Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agron. Sustain. Develop. 29: 185-212.

18- Ganjewala, D., Boba, S. and Raghavendra, A,S. 2008. Sodium nitroprusside affects the level of anthocyanin and flavonol glycosides in pea (Pisum sativum L. cv. Arkel) leaves. Acta Biol. Szegediensis. 52: 301-305.

19- Garcia-Mata, C. and Lamattina, L. 2001. Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress. Plant Physiol. 126: 1196-1204.

20- Gebaly, S.G. 2007. Effect of foliar application of methanol under two levels of irrigation regime on cotton productivity. Egypt J. Agri. Research. 85(2): 615-628

21- Guidi, L., Deglinnocenti, E., Remorini, D., Massai, R. and Tattini, M. 2008. Interactions of water stress and solar irradiance on the physiology and biochemistry of Ligustrum vulgare. Tree Physiol. 28: 873–883.

22- Hala Ezzat, M. A. and Ghada Saber, M.I. 2014. Tomato fruit quality as influenced by salinity and nitric oxide.Turkish J. Bot. 38: 122-129.

23- Harborne, J. B. and Williams, C.A. 2000. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochem. 55: 481-504.

24- Hayat, S., Hasan, S.A., Mori, M., Fariduddin, R., Ahmad, A. 2010. Nitric oxide in plant physiology, Eds. Hayat S., Mori M., Pichtel J., Ahmad A. Wiley-VCH GmBH and Co, KGaH, Weinheim, pp.: 1-16.

25- Hoekstra, F.A, Golovina, E.A. and Buitink, J., 2001 .Mechanisms of plant desiccation tolerance. Trendsin Plant Science, 6(9): 431-438

26- Holton, T. A. and Cornish, E.C.  1995.  Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. Plant Cell. 9: 1071-1083.

27- Jasid, S., Simontacchi, M., Bartoli, C.G., Pantarulo, S. 2006. Chloroplasts as a nitric oxide cellular source. Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins. Plant Physiology. 142: 1246-1255.

28- Koc E., İslek, C. and Üstun, A.S. 2010. Effect of cold on protein, proline, phenolic compounds and chlorophyll content of two pepper (Capsicum annuum L.) varieties. Gazi University J. Sci, 23: 1-6.

29- Kopyra, M. and Gwozdz, E.A. 2004. The role of nitric oxide in plant growth regulation and responses to abiotic stress. Acta Physiol. Plant. 26: 459-472.

30- Krizek, D. T., Britz, S.J. and Mirecki, R.M. 1998. Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. new red fire lettuce. Physiol. plant. 103: 1-7.

31- Kumar Shunker, A. and Venkateswarlu, B. 2011. Abiotic stress in plants: Mechanisms and adaptations, Academia.edu. ISBN: 9533073942.

32- Lang-Mladek, C., Popova, O., Kiok, K. Berlinger, M., Rakic, B. and Aufastez, W.   2010. Transgenerational inheritance and resetting of stress-induced loss of epigenetic in Arabidopsis. Mol. Plant. 3: 594-602.

33- Laspina, N.V., Groppa, M.D., Tomaro, M.L.  and Benavides, M. P. 2005. Nitric oxide protects sunflower leaves against Cd-induced oxidative stress. Plant Sciences .169: 323-330.

34- Lei, y. B., Yin, C.Y. and C.Y. Li. 2007. Adaptive responses of Populus przewalskii to drought stress and SNP application. Acta Physiol Plant. 29: 519-526.

35- Lin-Wang, K., Bolitho, K., Grafton, K., Kortstee, A., Karunairetnam S., Mc Ghie, T., Espley, R., Hellens, R. and Allan, A. 2010. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae. Plant Biol. 10: 50.

36- Liao, W.B., Yu, J.H., Zhang, M.L., 2012. Nitric oxide and hydrogen peroxide alleviate drought stress in marigold explants and promote its adventitious root development.Plant Physiol. Biochem. 58: 6-15.

37- Liu, C., Liu, Y., Guo, K., Fan, D., Li, G., Zheng, Y., Yu, L. and Yang, R. 2011. Effect of drought on pigments, osmotic adjustment and antioxidant enzymes in six woody plant species in karst habitats of southwestern China. Environ. Exp. Bot. 71: 174-183.

38- Mackerness, S. A. H., John, C.F., Jordan, B. and Thomas, B. 2001. Early signaling components in ultraviolet-B responses: distinct role for different reactive oxygen species and nitric oxide. FEBS Lett. 489: 237-242.

39- Magdy, A. S., Hazem, M.M.H., Alia, A.M.N. and Alshaimaa, A.I. 2012. Effect of sodium nitroprusside, putrescine and glycine betaine on alleviation of drought stress in cotton plant. American-Eurasian J. Agric. Environ. Sci., 12(9): 1252-1265.  

40- Manivannan, P., Abdul Jaleel, C. Somasundaram, R., Panneersel Vam, R. 2008. Osmoregulation and antioxidant metabolism in drought- stressed Helianthus annuus under triadimefon drenching. Comptes Rendus Biologies.331: 418-425.

41- Matta, A.J. and Giai, I. 1969. Accumulation of phenol in tomato plant is affected by different forms of Fusarium oxysporum. Planta Medica, 50: 512-513.

42- Nelson, N. 1994. A photometric adaption of the Somogi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem. 153: 375-380.

43- Sakihama, Y., Coheno, M., Grace, S. and Yamasaki, H. 2002. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities phenolic-induced oxidative damage mediated by metals in plant. Toxicol. 177: 67-80.

44- Sangtarash,  M. H., Qaderi, M.M., Chinnappa, C.C. and Reid, D.M. 2009. Differential sensitivity of canola (Brassica napus) seedlings to ultraviolet-B radiation, water stress and abscisic acid. Environ. Exp. Bot. 66: 212-219.

45- Shehab, G.G., Ahmad, O.K. and EL- Beltagi, H.S. 2010. Effects of various chemical agents for alleviation of drought stress in rice plants. Not. Bot. Hort. Agrobot. 38(1): 130-148.

46- Slama, I., Ghnaya, T., Hessini, K., Messedi, D., Savoure, A. and Abdelly, C. 2007. Comparative study of the effects of manitol and PEG osmotic stress on growth and solute accumulation in Sesuvium portulacastrum. Environ. Exp. Bot. 61: 10-17.

47- Strauss, G. and Hauser, H. 1986. Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 2422-2426.

48- Subbarao, G.V., Nam, N. H. Chauhan, Y.S. and Johansen, C. 2000. Osmotic adjustment, water relations and carbohydrate remobilization in pigeonpea under water deficits. J. Plant Physiol. 157: 651-659.

49- Szabados, L. and Savoure, A.  2009. Proline: a multifunctional amino acid. Trends Plant Sci.15: 89-97.

50- Tan, J., Zhao, H., Y. Hong, Y., Li, H. and Zhao, W. 2008. Effects of exogenous nitric oxide on photosynthesis, antioxidant capacity and proline accumulation in wheat seedling subjected to osmotic stress. World J. Agri. Sci. 4: 307-313.

51- Vinyard, P. G., Moody, C. J. and  Jacob, C. 2005. Oxidative activation of antioxidant defense. Trends Biochem. Sci. 8: 453-461.

52- Wagner, G.J. 1979. Content and vacuole / extra vacuole distribution of neutral sugars, free amino acids anthocyanins in protoplasts. Plant Physiol. 64: 88-93.

53- Watkinson, J. I., Hendricks, L., Sioson, A.A., Vasquez-Robinet, C., Verlyn, S., Heath, L.S., Schuler, M., Bohnert, H. H. J., onierbale, M. and Grene, R. 2006. Accessions of Solanum toberosum spp. Andigena show differences in photosynthetic recovery after drought stress as reflected in gene expression profiles. Plant Sci. 171(6):745-758.

54- Zhang, K. M., Yu, H. J., Shi, K., Zhou, Y. H., Yu, J. Q. and Xia, X. J. 2010. Photoprotective roles of anthocyanins in Begonia semperflorens. Plant Sci. 179(3): 202-208.