نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، لرستان

چکیده

به تازگی نقش ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی ‌تریپتامین) به عنوان یک فیتوهورمون در افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش‌های محیطی مورد توجه قرار گرفته است. پژوهش حاضر با هدف ارزیابی اثر تیمار ملاتونین در تحمل گیاه لوبیا رقم صدری به شوری، در قالب طرح بلوک‌های کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. در این پژوهش تنش شوری در سه سطح 0، 100 و 200 میلی‌مولار NaCl به صورت افزوده شده به محلول غذایی نیم‌هوگلند بر روی گیاهان لوبیا تیمار شده با غلظت‌های 0، 100، 200 و 400 میکرومولار ملاتونین اعمال شد. تنش شوری سبب کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه، کاهش غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی، افزایش میزان پرولین، قندهای محلول، مالون‌دی‌آلدهید و H2O2 و نیز افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز شد. با استعمال ملاتونین رشد گیاه بهبود یافت. غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی، پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان افزایش یافت و از غلظت H2O2 و مالون‌دی‌آلدهید کاسته شد. نتایج نشان داد که ملاتونین در افزایش مقاومت گیاه لوبیا به شوری اثر معناداری داشته است و غلظت‌های پایین‌تر ملاتونین، مؤثرتر عمل کرده‌اند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of Melatonin on Some Morphophysiological Characteristics of Phaseolus vulgaris cv. Sadri under Salinity Stress

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Azizi 1
  • Hamzeh Amiri 1
  • Ahmad Ismaili 2

1 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Iran

2 Agronomy and plant breeding Department, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran

چکیده [English]

Melatonin (N-acetyle-5-methoxy tryptamine) has recently been considered as a phytohormone in raising the resistance of plants against environmental stresses. The present study aims to assess the effect of melatonin treatment on the tolerance of salt by Phaseolus vulgaris cv. Sadri which was conducted in completely randomized design, repeated three times. In this study, salinity stress was introduced in three levels of 0, 100 and 200 mM of NaCl to bean plants treated by melatonin with respective concentrations of 0, 100 and 200 µM. It was found that salinity stress decreased the dry weight of shoot, the root and the photosynthetic pigments while it increased proline, soluble sugars, malondialdehyde and H2O2 as it increased the activity of antioxidant enzymes of catalase, peroxidase and ascorbate peroxidase. Applying melatonin improved plant growth, the concentration of photosynthetic pigments, proline, soluble sugars and the activity of antioxidant enzymes while it reduced H2O2 and malondialdehyde concentration. Results showed that melatonin had a significant effect on raising the resistance of phaseolus vulgaris cv. Sadri against salt and that lower concentrations of melatonin worked better.

کلیدواژه‌ها [English]

  • antioxidant
  • Salinity
  • Catalase
  • Phaseolus vulgaris
  • Melatonin

اثر ملاتونین بر برخی ویژگی­های مورفوفیزیولوژیکی گیاه لوبیا رقم صدری

 (Phaseolus vulgaris cv. Sadri) تحت تنش شوری

فاطمه عزیزی1، حمزه امیری1* و احمد اسماعیلی2

1 ایران،خرم­آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

2 ایران، خرم­آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت:27/4/98                 تاریخ پذیرش: 13/7/98

چکیده

به تازگی نقش ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی ­تریپتامین) به عنوان یک فیتوهورمون در افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش­های محیطی مورد توجه قرار گرفته است. پژوهش حاضر با هدف ارزیابی اثر تیمار ملاتونین در تحمل گیاه لوبیا رقم صدری به شوری، در قالب طرح بلوک­های کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. در این پژوهش تنش شوری در سه سطح 0، 100 و 200 میلی­مولار NaCl به صورت افزوده شده به محلول غذایی نیم­هوگلند بر روی گیاهان لوبیا تیمار شده با غلظت­های 0، 100، 200 و 400 میکرومولار ملاتونین اعمال شد. تنش شوری سبب کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه، کاهش غلظت رنگیزه­های فتوسنتزی، افزایش میزان پرولین، قندهای محلول، مالون­دی­آلدهید و H2O2 و نیز افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز شد. با استعمال ملاتونین رشد گیاه بهبود یافت. غلظت رنگیزه­های فتوسنتزی، پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان افزایش یافت و از غلظت H2O2 و مالون­دی­آلدهید کاسته شد. نتایج نشان داد که ملاتونین در افزایش مقاومت گیاه لوبیا به شوری اثر معنی­داری داشته است و غلظت­های پایین­تر ملاتونین، مؤثرتر عمل کرده­اند.

واژه­های کلیدی: آنتی­اکسیدان، شوری، کاتالاز، لوبیا، ملاتونین

* نویسنده مسئول، تلفن: 33312010-066 ، پست الکترونیکی: amiri_h_lu@yahoo.com

مقدمه

 

ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی ­تریپتامین) هورمونی از تیپ ایندول­آمین و مشتق از تریپتوفان است که در مهره­داران نقش­های فیزیولوژیک متعددی چون تنظیم ریتم­های سیرکادین، نوردورگی و اثر بر خواب، تولیدمثل، سیستم ایمنی و آنتی­اکسیدانی را برعهده دارد. در گیاهان عالی ملاتونین از نظر مسیر بیوسنتز و اعمال فیزیولوژیک دارای اشتراکاتی با هورمون شناخته شده IAA است (20). در گیاهان محل بیوسنتز ملاتونین کلروپلاست­ها هستند و مقدار ملاتونین سلول­های گیاهی در مقایسه با سلول­های جانوری بسیار بیشتر است (3، 53). آنچه مطالعه ملاتونین را در گیاهان جالب می­سازد نقش­های متعددی است که در رشد گیاه و دفاع در برابر عوامل محیطی ایفا می­کند. گزارش­هایی در زمینه نقش ملاتونین در بهبود پاسخ­های گیاه به تنش­هایی چون خشکی (12، 16، 19، 40، 45، 48)، شوری (17، 47، 50)، سرما (8، 13، 43، 51)، حمله پاتوژن­ها و محافظت در برابر علف­کش (27)، سمیت یونی (29،42) و تنش اکسیداتیو (21) ارائه شده است. گزارشی از افزایش میزان ملاتونین داخلی در گیاه Glycyrrhiza uralensis تحت تیمار با پرتو UV-B نشان از نقش مؤثر آن در محافظت از آسیب اکسیداتیو ایجاد شده با UV دارد (3). بنظر می­رسد یکی از نقش­های کلیدی ملاتونین در گیاهان در رابطه با فتوسنتز و محافظت نوری باشد. علاوه بر آن که در شرایط تنشی مقدار ملاتونین گیاه افزایش می­­یابد، استفاده از ملاتونین خارجی نیز می­تواند در ایجاد مقاومت در برابر تنش تأثیرگذار باشد زیرا گیاهان می­توانند ملاتونین خارجی را جذب و ذخیره کنند (49).

شوری یک تنش غیرزیستی است که در کل دنیا بویژه نواحی خشک و نیمه­خشک بر تولید محصولات کشاورزی اثر نامطلوب می­گذارد (20، 28، 38، 47). تنش شوری سبب ایجاد تنش اکسیداتیو از طریق افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) می­گردد. ROSها کربوهیدرات­ها را اکسید کرده و رنگدانه­ها را تخریب می­کنند و به لیپیدهای غشا، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک آسیب می­زنند. پراکسیداسیون لیپیدها باعث بهم خوردن یکپارچگی غشا و تعادل متابولیسم می­شود (28، 31، 49). منبع اصلی تولید ROS در سلول­های آسیب­دیده از تنش شوری، اندامک­هایی چون کلروپلاست، میتوکندری و پروکسیزوم­ها هستند (32، 38). گیاهان برای اجتناب از اثرات ROSهایی چون H2O2 باید بتوانند بین تجزیه و تولید آنها تعادل ایجاد کنند. بهره بردن از سیستم­های آنتی­اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی برای خنثی کردن ROSها یکی از راهکارهایی است که گیاهان در شرایط تنشی پیش می­گیرند (31، 38، 39). ملاتونین به عنوان جاروب کننده عوامل اکسیداتیو و متعادل­کننده فرآیندهایی که تعادل ردوکس سلول را تغییر می­دهند، می­تواند در متحمل کردن گیاهان به نمک گزینه مناسبی باشد (3، 4، 26). برای بهبود بخشیدن تحمل گیاهان زراعی به نمک می­توان از روش­هایی چون مقاوم­سازی به تنش، تنظیم شیمیایی و اصلاح نژاد استفاده کرد که در این میان تنظیم شیمیایی به دلیل چرخه زمانی کوتاه­تر و هزینه­های پایین­تر و اثرات سریع­تر بر روش­های مهندسی ژنتیک و اصلاح نژاد مقدم است (20). بدلایلی که شرح داده شد، در سال­های اخیر استفاده از ملاتونین بعنوان یک فیتوهورمون که اثرات جالب توجهی بر روی رشد و نمو و مقاومت به تنش در گیاهان دارد، با اقبال مواجه شده است. از آن­جایی که تاکنون هیچ گزارشی از اثر تیمار ملاتونین بر روی گیاه لوبیا در شرایط تنش شوری گزارش نشده است، در پژوهش حاضر به بررسی این مقوله پرداخته شده است.

مواد و روشها

تهیه و پرایم کردن بذرها و کشت هیدروپونیک: این آزمایش در قالب طرح بلوک­های کاملا تصادفی با سه تکرار در گلخانه گروه زیست­شناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه لرستان انجام شد. بذرهای لوبیا رقم صدری از ایستگاه ملی تحقیقات لوبیای خمین تهیه شدند. بذرهای هم­اندازه و سالم انتخاب شده و پس از استریل سطحی با هیپوکلریت سدیم 7% به مدت 5 دقیقه و 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، بمدت 12 ساعت در محلول­های ملاتونین با غلظت صفر و 100 و 200 و 400 میکرومولار خیسانده شدند. سپس مجدداً با آب مقطر استریل شستشو داده شده، بر روی کاغذ صافی واتمن خشک شدند و برای جوانه­زنی به پتری دیش­های­ دارای آب مقطر استریل انتقال یافتند. جوانه­زنی در شرایط تاریکی و با میانگین دمای روز و شب به ترتیب 25 و 16 درجه سانتی­گراد انجام شد. پس از جوانه زدن بذرها و انتقال به گلدان­های 10 سانتی­متری حاوی پرلیت، گلدان­ها به گلخانه با دوره نوری 16 ساعت و شدت نور 1200 لوکس و دمای متوسط شب و روز 16 و 25 درجه منتقل شدند. هر گلدان شامل سه گیاه به عنوان یک تکرار در نظر گرفته شد. آبیاری با محلول هوگلند نیم­قدرت (7-8/6= pH) انجام شد. گیاهان در مرحله چهار برگی با غلظت­هایی از ملاتونین که با غلظت­هایی که پرایم کردن بذرها انجام شده بود، یکسان بودند، سه بار و با فاصله دو روز از همدیگر، محلول­پاشی شدند. برای محلول­پاشی هر گیاه از 50-30 سی­سی محلول ملاتونین استفاده شد تا حدی که محلول بر روی گیاه جاری شد. پس از آخرین مرحله محلول­پاشی، برای ایجاد شرایط تنش شوری، NaCl به محلول هوگلند اضافه شد. گلدان­ها به سه گروه تقسیم شدند و هر گروه در معرض یکی از غلظت­های صفر و 100 و200 میلی­مولار NaCl قرار گرفتند. برداشت، 48 ساعت بعد از اعمال تنش صورت گرفت. از هر گلدان یک گیاه برای تعیین وزن تر و خشک برداشت شد و دو گیاه باقی­مانده به منظور انجام سنجش­های بعدی، پس از برداشت بلافاصله به نیتروژن مایع و سپس به فریزر 80- منتقل شدند. 

وزن خشک بخش­های هوایی و ریشه­ها پس از 48 ساعت نگهداری در آون با دمای 70 درجه سانتی­گراد به دست آمد.

اندازه­گیری رنگیزه­های فتوسنتزی: برای اندازه­گیری مقدار کلروفیل و کارتنوئید از روش Arnon (1967) استفاده شد. 5./. گرم از بافت تازه برگ گیاه با 1 میلی­لیتر استن ۸۰٪ ساییده شد. مخلوط به دست ­آمده، به مدت 10 دقیقه با سرعت rpm ۶۰۰۰ با استفاده از سانتریفیوژ مدل SIGMA 2-16KL سانتریفیوژ گردید و در نهایت عصاره استنی شفاف جدا شده و پس از ۳۰ دقیقه تاریکی، جذب آن با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدل Epoh، شرکت BioTek انگلستان) در طول موج­های 663 و645 نانومتر برای کلروفیل­ها و طول موج 470 نانومتر برای کارتنوئیدها سنجیده شد و از فرمول­های مربوطه مقادیر رنگیزه­ها محاسبه شد (7). مقدار کلروفیل کل نمونه از مجموع کلروفیل a  و کلروفیل b بدست آمد.

سنجش قندهای احیا و پرولین: محتوای قندهای احیای نمونه برگ به روش Somogyi  (1952) استخراج و جذب نمونه­ها در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. مقدار قندها با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز و بر اساس میلی­گرم در گرم وزن تر ماده محاسبه شد (37). برای تعیین غلظت پرولین برگ‌ها از روش Bates و همکاران (1973) استفاده شد. برای این منظور پرولین با سولفوسالیسیلیک ­اسید ۳٪ استخراج شد و جذب آن در مجاورت نین­هیدرین در طول موج 520 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد و با استفاده از منحنی استاندارد، مقدار پرولین نمونه محاسبه شد (9).

سنجش پراکسید هیدروژن و بررسی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: استخراج H2O2 نمونه­های برگ به­روش Sergiev و همکاران (1997) با تری­کلرواستیک اسید صورت گرفت و جذب نمونه در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. محتوای H2O2 با استفاده از ضریب خاموشی µM-1cm-1 28/0 و بر حسب میکرومول در گرم وزن تر گیاه بیان شد (34). بررسی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به روش هیث و پارکر (1968) و با اندازه‌گیری مالون­دی­­آلدهید به عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدی غشا انجام گرفت. میزان جذب مالون­­دی­­­آلدهید تیوباربیتوریک اسید تولید شده و نیز جذب سایر رنگیزه‌های اختصاصی بترتیب در طول موج­های 532 و 600 نانومتر قرائت شد. میزان جذب در طول موج 600 از مقدار جذب در طول موجnm  532 کسر شد. سپس غلظت مالون­دی­­آلدهید با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM-1 cm-1 155 و بر حسب واحد میکرومول در گرم وزن تر گیاه محاسبه شد (15).

سنجش پروتئین و تعیین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی تهیه عصاره آنزیمی: 1/0 گرم از نمونه برگ در مجاورت ازت مایع ساییده شد و با 10 میلی­لیتر بافر فسفات­ پتاسیم mM 50 (7pH=) بهمراه EDTAی mM 1، گلیسرول 60% و پلی وینیل پیرولیدون 1%، به صورت همگن درآمد. سپس در دور g 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی برای سنجش پروتئین و آنزیم مورد استفاده قرار گرفت.

محتوای پروتئین بر اساس روش Bradford (1976) با استفاده از سرم آلبومین به عنوان استاندارد تعیین شد. در این روش 100 میکرولیتر عصاره پروتئینی و 5 میلی­لیتر معرف برادفورد به مدت 20 دقیقه ورتکس گردید. پس از قرارگیری به مدت 25 دقیقه در تاریکی و 30 دقیقه سانتریفیوژ در 5000 دور، جذب آن در طول موج 595 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. مقدار پروتئین بر اساس میلی­گرم در گرم وزن تر ماده گیاهی گزارش شد (10).

فعالیت کاتالاز (CAT) به روشKato  و Shimizu (1987) اندازه­گیری شد. در این روش فعالیت این آنزیم بوسیله ارزیابی تجزیه H2O2 به صورت کاهش جذب مخلوط واکنشی شامل عصاره آنزیمی، پراکسید هیدروژن mM10 و بافر فسفاتmM  25، هر 30 ثانیه در طول مدت یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر سنجش شد (18). فعالیت پراکسیداز (POX) با استفاده از روش Mac-Adam و همکاران (1992) در یک مخلوط واکنش شامل عصاره آنزیمی، بافر فسفات پتاسیم 1/0 ­مولار، محلول پراکسید هیدروژن 3% و گایاکول خالص پس از گذشت 20 ثانیه مورد سنجش قرار گرفت. واکنش با اضافه کردن محلول­های پراکسید هیدروژن و گایاکول آغاز ­گردید و فعالیت به­ وسیله افزایش جذب در 436 نانومتر در فواصل زمانی 30 ثانیه، به ­عنوان نتیجه­ای از اکسیداسیون گایاکول ارزیابی شد (22). فعالیت آسکوربات ­پراکسیداز (APX) بر اساس روشNakano  و Asada (1981) در یک مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار، آسکوربات 5/0 میلی­مولار و پراکسید­ هیدروژن 25/0 میلی­مولار و عصاره آنزیم استخراج شده بر اساس ارزیابی نرخ کاهش غلظت آسکوربات با اندازه­گیری جذب آن در طول موج 290 نانومتر اندازه­گیری شد (23). فعالیت هر سه آنزیم بر اساس واحد آنزیم در میلی­گرم پروتئین در گرم وزن تر گیاه گزارش شد.

آنالیز­های آماری: برای داده­ها تجزیه واریانس صورت گرفت و مقایسه میانگین ترکیب­های تیماری با استفاده از روش دانکن به وسیله نرم افزار SPSS 20 انجام شد.

نتایج

رشد گیاه: نتایج تجزیه واریانس صفات وزن خشک اندام هوایی (SDW) و ریشه­های (RDW) گیاه لوبیا در جدول1 آمده است. شوری سبب کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه شد.

در بالاترین سطح شوری استفاده شده کمترین SDW مشاهده شد. اثر مثبت ملاتونین بر روی رشد ریشه بیشتر از اندام هوایی بود. مقایسه میانگین­ها در برهم­کنش ملاتونین و شوری نشان داد در سطوح شوری استعمال ملاتونین در همه غلظت­ها اثرات کاهشی نمک را بهبود بخشید و بیشترین مقدار SDW با 25% افزایش نسبت به شاهد در نمک صفر و ملاتونین µM 100 بود.

 

 

جدول1- نتایج تجزیه واریانس اثر ملاتونین بر ویژگی­های فیزیولوژیکی و رشد گیاه لوبیا تحت تنش شوری

منابع تغییرات

درجه آزادی

کلروفیلa

کلروفیلb

کلروفیل کل

کارتنوئید

وزن بخش هوایی

وزن ریشه

میانگین مربعات

شوری

2

**761/8

**229/1

**514/16

**425/7

*165/0

**009/0

ملاتونین

3

**499/0

**262/0

**411/1

**107/6

*093/0

**012/0

شوری×ملاتونین

6

**318/0

**044/0

**445/0

**035/1

ns011/0

*002/0

خطا

24

071/0

003/0

076/0

190/0

030/0

001/0

ns و * و ** به ترتیب غیرمعنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال 01/0 و 001/0

ادامه جدول1

منابع تغییرات

درجه آزادی

قند احیا

پرولین

MDA

H2O2

POX

CAT

APX

میانگین مربعات

شوری

2

**707/3

**814/0

**062/0

**450/2391

**412/34

**388/227

*483/113

ملاتونین

3

*028/1

**049/1

**029/0

**234/533

**308/19

**175/1265

**777/18354

شوری×ملاتونین

6

ns102/0

**075/0

**010/0

**060/69

*556/7

**015/339

**195/730

خطا

24

224/0

003/0

002/0

346/4

00/2

352/7

708/30

ns و * و ** به ترتیب غیرمعنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال 01/0 و 001/0

 

 

بیشترین مقدار RDW با 46% افزایش نسبت به شاهد به سطح نمک صفر و ملاتونین µM 400 تعلق داشت (شکل1). رنگیزه­های فتوسنتزی: شوری و ملاتونین بر روی محتوای کلروفیل a و کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئیدهای برگ­های لوبیا اثر معنی­داری داشتند. نتایج تجزیه واریانس داده­های این صفات نشان داد که برهم­کنش شوری و ملاتونین نیز بر محتوای رنگیزه­ها اثر معنی­داری گذاشت (جدول1). افزایش نمک سبب کاهش رنگیزه­ها شد. استفاده از ملاتونین مقدار کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئیدها را در مقایسه با شاهد به ترتیب 9%، 30%، 15% و 25% افزایش داد. در مورد کلروفیل­ها بیشترین تأثیر مربوط به غلظتµM 100 ملاتونین و در مورد کارتنوئیدها مربوط به غلظت µM 400 ملاتونین بود. نتایج حاکی از آن است که اثر بهبود­دهنده ملاتونین در شرایط بدون نمک بر روی میزان این رنگیزه­ها بیشتر بوده است (شکل2). در مورد کارتنوئیدها، بیشترین مقدار کارتنوئید در شرایط نمک صفر و سطح ملاتونین µM 400 مشاهده شد. ممکن است افزایش میزان کارتنوئید در این غلظت از ملاتونین نسبت به سایر غلظت­های ملاتونین به نقش آنتی­اکسیدانی این رنگیزه و تنش­زا بودن غلظت­های بالای ملاتونین مربوط باشد.

محتوای قند و پرولین: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که شوری به طور معنی­داری سبب افزایش میزان قند و پرولین شد. با افزایش غلظت NaCl مقدار آنها نیز افزایش یافت (جدول1).

 

 

شکل 1- مقایسه میانگین صفات وزن خشک اندام هوایی (SDW) و وزن خشک ریشه (RDW) در غلظت­های مختلف NaCl و تیمار با غلظت­های مختلف ملاتونین. ­هر ستون معرف میانگین ± انحراف معیار 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنی­دار از لحاظ آزمون دانکن را نشان می­دهد.

   
   

شکل2- مقایسه میانگین محتوای رنگیزه­های گیاه لوبیا در غلظت­های مختلف NaCl و تیمار با غلظت­های مختلف ملاتونین. ­هر ستون معرف میانگین ± انحراف معیار 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنی­دار از لحاظ آزمون دانکن را نشان می­دهد.


ملاتونین به طور معنی­داری اثر افزایشی نمک را در مورد محتوای پرولین تشدید کرد. در بین اثرات متقابل شوری و ملاتونین با مقایسه میانگین­ها بیشترین میزان محتوای قند و پرولین در سطح µM 100 ملاتونین و شرایط mM NaCl 200 مشاهده شد که به ترتیب نسبت به شاهد بدون ملاتونین در این سطح شوری 61% و 280% افزایش میانگین نشان دادند.

مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون غشاها: نتایج واریانس داده­های مربوط به مقادیر H2O2 و MDA برگ در جدول1 آمده است. مقایسه میانگین­ها نشان داد که افزایش سطح نمک به طور معنی­داری سبب افزایش H2O2 و MDA شد. استفاده از ملاتونین سبب کاهش این دو فاکتور در شاهد و سایر سطوح نمک شد که غلظت­های 100 و 200 میکرومولار ملاتونین مؤثرتر عمل کردند. مقایسه میانگین­ها در اثر متقابل شوری و ملاتونین نشان داد که کمترین مقدار H2O2 و MDA مربوط به غلظت صفر میلی­مولار NaCl و µM 100 ملاتونین است که در مورد H2O2، 9% و در مورد MDA، 26% کاهش نسبت به شاهد نشان داد. بیشترین مقدار H2O2 در شرایط mM NaCl 200 و µM 400 ملاتونین مشاهده شد که اختلاف معنی­داری با سایر تیمارها داشت (جدول2) و بیشترین مقدار MDA مربوط به شرایط شوری mM NaCl 200 و صفر میکرومولار ملاتونین بود که معنی­داری اختلاف میانگین­ها در جدول2 آمده است.

فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان: نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در جدول1 آمده است. بجز در مورد CAT، افزایش سطح شوری سبب افزایش فعالیت آنزیم شد.

 

جدول2- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه لوبیا تحت تأثیر سطوح مختلف شوری و ملاتونین. ­هر عدد معرف میانگین 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنی­دار از لحاظ آزمون دانکن را نشان می­دهد.

NaCl

(mM)

ملاتونین

(µM)

قند احیا

(mg g-1FW)

پرولین

(µg g-1FW)

MDA

(µmol g-1FW)

H2O2

(µg g-1 FW)

POX

(U mg-1Protein)

CAT

(U mg-1Protein)

APX

(U mg-1Protein)

 

0

410/1e

g1577/0

cd195/0

fg231/36

d82/4

d61/32

e183/125

0

100

926/1e

e4540/0

d144/0

g672/32

d77/5

a91/58

bc680/145

 

200

270/1e

e5430/0

bc268/0

f125/38

d48/5

fg40/25

f243/106

 

400

320/1e

g1547/0

b334/0

f226/39

cd72/6

ef72/26

h980/61

 

0

160/2cd

g2057/0

cd213/0

d268/53

cd48/6

de04/31

d277/135

100

100

576/2b

bc9737/0

d174/0

f572/37

a04/11

cd98/33

b737/151

 

200

320/2bc

c9313/0

b311/0

e933/46

cd25/7

gh79/20

g547/92

 

400

806/1d

fg2590/0

ab350/0

c436/63

d30/5

fg46/23

h420/64

 

0

886/1d

f3460/0

a438/0

b373/68

bc45/8

b69/53

cd01/140

200

100

043/3a

a3263/1

b325/0

d030/51

a53/11

c87/37

a170/188

 

200

543/2b

b0550/1

ab361/0

bc541/65

ab91/9

h26/18

g416/85

 

400

946/1d

d6650/0

ab358/0

a231/74

cd43/6

i77/11

i820/48

 


استفاده از ملاتونین سبب افزایش فعالیت این آنزیم­ها نسبت به شاهد بدون ملاتونین شد. غلظت مؤثر ملاتونین غلظت 100 میکرومولار بود. در اثر متقابل شوری و ملاتونین بیشترین فعالیت POX و APX در غلظت mM NaCl 200 و µM 100 ملاتونین دیده شد. در مورد کاتالاز، حداکثر فعالیت در سطح نمک صفر و ملاتونین µM 100، با 80% افزایش نسبت به شاهد مشاهده شد که اختلاف معنی­داری با سایر تیمارها داشت. POX و APX در بیشترین مقدار خود بترتیب نسبت به شاهد 130% و 50% افزایش فعالیت نشان دادند (جدول2).

بحث و نتیجه­گیری

تنش شوری با ایجاد محدودیت در جذب آب و نیز سمیت یونی بر وضعیت آب بافتی گیاه، فرآیندهای متابولیکی و رشد گیاه تأثیر می­گذارد، کاهش مقدار کلروفیل و نرخ فتوسنتز سبب کاهش قابل توجهی در رشد می­شود (31، 50) و متابولیسم کربوهیدرات و اسمولیت­هایی چون اسیدهای آمینه (بیشتر از همه پرولین) تغییر می­کند (30، 36) سیستم­های غشایی و آنزیمی با بالا رفتن سطح ROS و بهم خوردن هومئوستازی ROS آسیب می­بینند. تلاش­های گیاه برای مقابله با آسیب­های ناشی از تنش با به­کار گرفتن یک سیستم آنتی­اکسیدانی قوی پروتئینی و غیرپروتئینی، معمولا در ساعات اولیه رویایی با تنش آغاز می­شود. تولید ROSها بعنوان پیامبرهای ثانویه (50)، مسیرهای علامت­رسانی را روشن می­کند و در نهایت سیستم آنتی­اکسیدانی با کاهش ROS آسیب­های ناشی از تنش را آرام می­کند. در پژوهشی در مورد گیاه لوبیا که در معرض شوری mM120 قرار داشت، مقدار پروتئین کاهش زیادی پیدا کرد در حالی ­که محتوای نسبی رنگیزه­های فتوسنتزی افزایش یافت. فتوسنتز کاهش یافت، رشد دانه­رست­ها و وزن خشک آنها با افزایش غلظت نمک در محیط، کاهش یافت (46). در پژوهشی دیگر تنش شوری (mM NaCl 100) در دو رقم لوبیای حساس و غیرحساس به شوری، سبب افزایش فعالیت APX و CAT شد که در رقم متحمل به نمک افزایش فعالیت بیشتر بود. میزان MDA نیز تحت تنش نمک افزایش یافت. مقدار کلروفیل در رقم حساس کاهش یافت و در رقم متحمل تغییری نداشت (44). تنش خشکی سبب تغییر کارکرد فتوسیستم II (کاهش Fv/Fm و Fv و افزایش میزان فلورسانس حداقل)، کاهش محتوای کلروفیل­ها و کارتنوئیدها در دو رقم لوبیا شد (1).

ترکیبات شیمیایی متعدد برای بهبود مقاومت گیاهان به شرایط تنشی توسط پژوهشگران زیادی استفاده شده است. در مورد گیاه لوبیا، استعمال آسکوربیک اسید (ASA) و جیبرلین خارجی (GA3) بر روی دانه­رست­های لوبیای تیمار شده با mM NaCl 200، آسیب اکسیداتیو حاصل از شوری را کاهش داد (33). خیساندن بذرهای لوبیا یا افشانه برگی آنها با SA و MLE (عصاره برگ Moringa oleifera) توانست فاکتورهای فیزیولوژیکی و رشدی و تعادل یونی گیاه را در برابر تنش شوری بهبود بخشد و غلظت کل قندهای محلول و پرولین آزاد را افزایش دهد (31). اسپری برگی گیاه لوبیا با غلظت­هایی از اتانول، با بهبود فاکتورهای فتوسنتزی، تحمل گیاه را به تنش خشکی افزایش داد (5). استفاده از کمپوست و ورمی­کمپوست در تعدیل اثرات سمی فلزات سنگینی چون کادمیوم و سرب در گیاه لوبیا رقم صدری نقش مثبتی ایفا کرد و با کاهش اثرات سمی این فلزات، اثر مثبتی بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی چون پراکسیداز و پلی­فنل اکسیداز داشت (2). اخیراً چندین پژوهش نشان داده­اند که ملاتونین با بهبود بخشیدن به فتوسنتز و هومئوستازی یونی، مقاومت به شوری را در هندوانه، سیب و خیار بهبود بخشیده است (14). پیش­­تیمار با ملاتونین سبب افزایش ظرفیت فتوسنتزی و توسعه سیستم ریشه­ای می­شود. تیمارهای ملاتونین با افزایش سطح رونوشت­برداری و نیز افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان توانایی گیاه را برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از تنش شوری بهبود می­بخشد. ملاتونین به طور معنی­داری تولید H2O2 و رادیکال­های هیدروکسیل را سرکوب می­کند (50). در پژوهش حاضر کاهش بیوماس ایجاد شده تحت تأثیر تنش شوری در اندام هوایی و ریشه، با تیمار ملاتونین جبران شد. همچنین ملاتونین سبب افزایش میزان رنگیزه­های فتوسنتزی در شاهد و در شرایط شوری شد. نتایج مشابهی از اثر ملاتونین بر روی این فاکتورها در گیاهان دیگری گزارش شده است. از جمله استفاده از ملاتونین در گیاه جوی دوسر که در معرض تنش شوری بود سبب افزایش محتوای کلروفیل و سطح برگ شد و وزن تر و وزن خشک گیاه را افزایش داد (14). همچنین در تحقیقی که Zhang و همکاران (2016) بر روی Cucumis melo L. انجام دادند، استفاده از ملاتونین خارجی با غلظت µM 200 به صورت افشانه برگی به طور معنی­داری از سرکوب رشد القا شده بوسیله سرما جلوگیری کرد و گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به غیر تیمار شده­ها رشد و محتوای کلروفیل  بیشتری داشتند (51). Wang و همکاران (2014) نشان دادند که ملاتونین با تغییر بیان ژن یک پروتئین که طی دوره پیری برگ در تجزیه کلروفیل نقش دارد، از کلروفیل محافظت می­کند. علاوه بر این تأثیر ملاتونین به عنوان جاروب کننده ROS و فعال کننده آنتی­اکسیدان­ها بر پایداری غشاها، سبب پایداری کلروپلاست و جلوگیری از تجزیه کلروفیل می­شود. اثر ملاتونین بر روی فتوسنتز و فعالیت آنزیم­هایی چون روبیسکو می­تواند بر تولید خالص اولیه تأثیر مثبت داشته باشد که در نهایت افزایش رشد گیاه را به دنبال دارد (41، 51). در پژوهش حاضر شوری در گیاه لوبیا مشابه با پژوهش­های دیگر به طور معنی­داری سبب افزایش غلظت قندهای محلول و پرولین شد (25). اثر افزایشی ملاتونین به طور وابسته به غلظت بر این فاکتورها در شرایط تنش و بدون تنش مشهود بود. پرولین بر روی آنزیم­ها و تمامیت غشای سلولی اثرات مثبتی دارد و بین میزان انباشته شدن اسمولیت پرولین و مقاومت گیاه به تنش ارتباط مثبت وجود دارد. پرولین علاوه بر نقشی که به عنوان تنظیم­کننده اسمزی دارد، در تنش­ شوری که با تنش اکسیداتیو دنبال می­شود، در تنظیم پتانسیل ردوکس سلولی نیز مؤثر است  و از آسیب رساندن ROS­ها به غشاهای سلولی در شرایط تنش جلوگیری می­کند (32، 24)، با استناد به نتایج حاضر می­توان بر نقش مؤثر ملاتونین در مقاوم کردن گیاه به شرایط شوری، تأکید کرد. Qian و همکاران (2015) نشان دادند که تیمار ملاتونین در گیاه گوجه فرنگی که در معرض حمله باکتریایی قرار داده شد، سبب افزایش سطح قندهایی چون فروکتوز، گلوکز و گلیسرول شد. در میان 16 اسیدآمینه­ای که اندازه­گیری کردند، سطح پرولین به طور معنی­داری پس از تیمار افزایش یافت (30). آسیب به غشاهای زیستی در نتیجه تنش­های محیطی از جمله تنش شوری با افزایش مقدار مالون­دی­­آلدهید همراه است که می­تواند با افزایش میزان H2O2 ارتباط مستقیم داشته باشد (29). در پژوهش حاضر تنش شوری در گیاه لوبیا سبب افزایش معنی­دار غلظت H2O2 و MDA شد و فعالیت آنزیم­های POX، CAT و APX را افزایش داد. استفاده از ملاتونین به طور معنی­داری سبب کاهش H2O2 و MDA در شرایط تنش شد که با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان همراه بود. غلظت µm 100 ملاتونین مؤثر بود و غلظت 400 میکرومولار آن اثرات شوری را تشدید کرد که تأیید کننده نتایج پژوهش­های پیشین می­باشد. در دانه­رست­های ذرت، استعمال µM 100 ملاتونین خارجی سبب کاهش میزان H2O2 و MDA القا شده به وسیله خشکی شد (45). علاوه بر این که ملاتونین به عنوان یک آنتی­اکسیدان در جاروب کردن مستقیم H2O2 تولید شده در تنش اکسیداتیو، شوری و سرما به روش وابسته به مقدار مؤثر است، با افزایش فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانی از جمله آنزیم­های SOD، POX، CAT و APX در کاهش آسیب­های اکسیداتیو ایفای نقش می­کند (4، 20، 11، 27، 15). Li و همکاران (2017) نشان دادند که ملاتونین خارجی می­تواند آسیب­های ناشی از تنش شوری را در برنج کاهش دهد، میزان H2O2 را کاسته و فعالیت آنزیم­های SOD و CAT را افزایش دهد (20). اثرات افزایش­دهنده ملاتونین بر روی تغییر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در گیاهانی که تحت تنش­های شوری (19، 35، 50)، خشکی (40، 45)، اکسیداتیو (3) و سرما (51) بوده­اند، گزارش شده است. Jiang و همکاران (2016) گزارشی از افزایش فعالیت آنزیم­های POX و APX با به کار بردن ملاتونین در برگ­های ذرت تحت تنش شوری ارائه دادند (17). همچنین Zhang و همکاران (2016) افزایش فعالیت آنزیم­های SOD، POX و کاتالاز را در دانه­رست­های خربزه قرار گرفته تحت تنش سرما گزارش کردند (51).

تأثیر مقادیر مختلف ملاتونین در محدوده غلظت­های بالا و پایین در گونه­های مختلف و حتی نزدیک به هم متفاوت بوده است (6، 49، 51). به عنوان مثال در Brassica oleracea L. غلظت 1 و µM 10 ملاتونین اثرات بازدارندگی فلز مس را کاهش داد و غلظت µM 100 ملاتونین، این اثرات را تشدید کرد (29). در حالی­که غلظت µM200 ملاتونین بر روی دانه­رست­های خیار که در معرض تنش سرمازدگی قرار داشتند، اثر بهبود دهنده داشت (52). غلظت µM 1/0 ملاتونین در گیاه ذرت تحت تنش شوری سبب بهبود رشد، افزایش فتوسنتز خالص و فعالیت آنتی­اکسیدانی آنزیم­ها و نیز بهبود هومئوستازی یونی شد (17). در پژوهش حاضر غلظت بهینه ملاتونین که سبب بهبود مقاومت گیاه لوبیا در برابر شرایط تنش شوری شد، میزان µM 100 بود که در تعداد محدودی از موارد با غلظت­های بالاتر ملاتونین اختلاف معنی­داری نداشت. گزارشات کمی از تأثیر بهبود­ دهنده غلظت­های بالای ملاتونین بر روی تحمل گیاه به شرایط تنشی گزارش شده است که نتایج پژوهش ما در غلظت µM 400 تأییدکننده اثرات بازدارنده غلظت ملاتونین می­باشد.

در مجموع استعمال ملاتونین به طور وابسته به غلظت با افزایش پایداری رنگیزه­ها و تقویت سیستم آنتی­اکسیدانی از آسیب­های تنش شوری به غشاها کاست و با افزایش تجمع قندهای محلول و کاهش H2O2 سبب بهبود رشد گیاه لوبیا در شرایط تنش و شاهد شد.

1- افشار محمدیان م.، امیدی پور م. و جمال امیدی ف.، 2018، اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر شاخص‌های فلورسانس کلروفیل دو رقم لوبیا. مجله پژوهشهای گیاهی، جلد 31، شماره 3. 709-694.

2- امینی ف. و بلوچی ح., تأثیر فلزات سنگین و ترکیبات مختلف بستر کاشت بر آنزیم‌های پاداکساینده و عملکرد لوبیا چیتی (Phaseolus vulgaris L. cv. Sadri). مجله پژوهشهای گیاهی, 2017. جلد 30، شماره 3. 511-498.

 

3- Afreen F., Zobayed S. M. A. and Kozai T., 2006, Melatonin in Glycyrrhiza uralensis: response of plant roots to spectral quality of light and UV-B radiation, Journal of pineal research; 41:108–115.

4- Allegra M., Reiter R.J., Tan D.X., Gentile C., Tesoriere L.  and Livrea M.A., 2003, The chemistry of melatonin’s interaction with reactive species, Journal of pineal research; 34:1–10.

5- Armand N., Amiri H. and Ismaili A.,2016, Interaction of Methanol Spray and Water-Deficit Stress on Photosynthesis and Biochemical Characteristics of Phaseolus vulgaris L. cv. Sadri, Photochemistry and Photobiology; 92:102–110.

6- Arnao M. B. and Hernandez-Ruiz J., 2009, Protective effect of melatonin against chlorophyll degradation during the senescence of barley leaves, Journal of pineal research; 46:58–63.

7- Arnon A. N., 1967, Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal; 23:112-121.

8- Bajwa V. S., Shukla M. R., Sherif S. M., Murch S. J. and Saxena P. K., 2014, Role of melatonin in alleviating cold stress in Arabidopsis thaliana, Journal of pineal research; 56(3):238-245

9- Bates L., Waldren R., Teare I., 1973. Rapid determination of free proline for water- stress studies, Plant and soil; 39:205-207.

10- Bradford M. M., 1976, A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Analytical Biochemistry; 72:248-254.

11- Cao S., Shao J., Shi L., Xu L., Shen Z., Chen W. and Yang Z., 2018, Melatonin increases chilling tolerance in postharvest peach fruit by alleviating oxidative damage, Scientific Reports; 8(1):806.

12- Cui G., Zhao X., Liu S., Sun F., Zhang C., Xi Y., 2017, Beneficial effects of melatonin in overcoming drought stress in wheat seedlings, Plant Physiology and Biochemistry; 118:138-149.

13- Fu J., Wu Y., Miao Y., Xu Y., Zhao E., Wang J., Sun H., Liu Q., Xue Y., Xu Y. and Hu T., 2017, Improved cold tolerance in Elymus nutans by exogenous application of melatonin may involve ABA-dependent and ABA-independent pathways, Scientific Reports; 7:39865.

14- Gao W., Feng Z., Bai Q., He J. and Wang Y., 2019, Melatonin-Mediated Regulation of Growth and Antioxidant Capacity in Salt-Tolerant Naked Oat under Salt Stress, International journal of molecular sciences; 20(5):1176.

15- Heath R. L. and Packer L.,1968, Photoperoxidation in isolated Chloroplasts I. Kinetics and Stoichiometry of Fatty Acid Peroxidation, Archives of biochemistry and Biophysics; 126:189-198.

16- Huang Y. H., Liu S. J., Yuan S., Guan C., Tian D. Y., Cui X., Zhang Y.W. and Yang F. Y., 2017, Overexpression of ovine AANAT and HIOMT genes in switchgrass leads to improved growth performance and salt-tolerance, Scientific Reports; 7(1):12212

17- Jiang X., Li H. and Song X., 2016, Seed priming with melatonin effects on seed germination and seedling growth in maize under salinity stress, Pak. J. Bot.; 48(4):1345-1352.

18- Kato, M. and Shimizu S., 1987, Chlorophyll metabolism in higher plants. VII. Chlorophyll degradation in senescing tobacco leaves; phenolic-dependent peroxidative degradation, Can. J. Bot.; 65:729–735.

19- Li J., Zeng L., Cheng Y., Lu G., Fu G., Ma H., Liu Q., Zhang X., Zou X. and Li C., 2018, Exogenous melatonin alleviates damage from drought stress in Brassica napus L. (rapeseed) seedlings, Acta Physiologiae Plantarum; 40:43.

20- Li X., Yu B., Cui Y., Yin Y., 2017, Melatonin application confers enhanced salt tolerance by regulating Na+ and Cl accumulation in rice, Plant Growth Regul; 83(3):441–454.

21- Li H., He J., Yang X., Li X., Luo D., Wei C., Ma J., Zhang Y., Yang J. and Zhang X., 2016, Glutathione-dependent induction of local and systemic defense against oxidative stress by exogenous melatonin in cucumber (Cucumis sativus L.), Journal of pineal research; 60:206–216.

22- MacAdam J. W., Nelson C.J. and Sharp R. E., 1992, Peroxidase Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue, Plant Physiol.; 99:872-878.

23- Nakano Y. and Asada K. 1981, Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts, Plant Cell Physiol.; 22:867–880.

24- Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi-Shinozaki K. and Shinozaki K., 1999, Antisense suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thaliana, Federation of European Biochemical Societies; 461(3):205-10.

25- Palma F., Lluch C., Iribarne C., Garcı´a-Garrido J. M. and Tejera Garcı´a N. A., 2009, Combined effect of salicylic acid and salinity on some antioxidant activities, oxidative stress and metabolite accumulation in Phaseolus vulgaris, Plant Growth Regul; 58:307–316.

26- Park S. and Back K., 2012, Melatonin promotes seminal root elongation and root growth in transgenic rice after germination, Journal of pineal research; 53(4):385-9. 

27- Park S., Lee D. E., Jang H., Byeon Y., Kim Y. S. and Back K., 2012, Melatonin-rich transgenic rice plants exhibit resistance to herbicide-induced oxidative stress, Journal of pineal research; 54(3):258-63.

28- Pasandi Pour A., Farahbakhsh H., Saffari M., 2014, Response of fenugreek to short-term salinity stress in relation to lipid peroxidation, antioxidant activity and protein content, Ethno-Pharmaceutical products; 1(1):45 -52.

29- Posmyk M. M., Kuran H., Marciniak K. and Janas K. M., 2008, Presowing seed treatment with melatonin protects red cabbage seedlings against toxic copper ion concentrations, Journal of pineal research; 45:24–31.

30- Qian Y., Tan D. X., Reiter R. J. and Shi H., 2015, Comparative metabolomic analysis highlights the involvement of sugars and glycerol in melatonin mediated innate immunity against bacterial pathogen in Arabidopsis, Scientific Reports; 28(5):15815.

31- Rady M. M. and Mohamed G. F., 2015, Modulation of salt stress effects on the growth, physio-chemical attributes and yields of Phaseolus vulgaris L. plants by the combined application of salicylic acid and Moringa oleifera leaf extract, Scientia Horticulturae; 193:105–113.

32- Razavizadeh R. and Ehsanpour A. A., 2009, Effects of salt stress on proline content, expression of delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, and activities of catalase and ascorbate peroxidase in transgenic tobacco plants, BIOLOGICAL LETT., 46(2):63–75.

33- Saeidi-sar S., Abbaspour H., Afshari H. and Yaghoobi S. R., 2013, Effects of ascorbic acid and gibberellin A3 on alleviation of salt stress in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings, Acta Physiol Plant; 35:667–677.

34- Sergiev, I., Alexieva V. and Karanov E., 1997, Effect of spermine, atrazine and combination between them on some endogenous protective systems and stress markers in plants, Compt. Rend. Acad. Bulg. Sci.; 51:121-124.

35- Shi H., Jiang C., Ye T., Tan D. X., Reiter R. J., Zhang H., Liu R. and Chan Z., 2015, Comparative physiological, metabolomic and transcriptomic analyses reveal mechanisms of improved abiotic stress resistance in bermudagrass [Cynodon dactylon (L). Pers.] By exogenous melatonin, Journal of Experimental Botany; 66 (3):681–694.

36- Siddiqui M. H., Alamri S., Al-Khaishany M. Y., Nasir Khan M., Al-Amri A., Ali M., Alaraidh I. A. and Alsahli A. A., 2019, Exogenous Melatonin Counteracts NaCl-Induced Damage by Regulating the Antioxidant System, Proline and Carbohydrates Metabolism in Tomato Seedlings, Int. J. Mol. Sci.; 20(2):353.

37- Somogyi M., 1952, Notes on sugar determination, J. Biol. Chem.; 195:19-23.

38- Stepien P. and Klobus G., 2005, Antioxidant defense in the leaves of C3 and C4 plants under salinity stress, Physiologia Plantarum; 125:31–40.

39- Sytar O., Brestic M., Zivcak M., Olsovska K., Kovar M. and Shao H., He X., 2017, Applying hyperspectral imaging to explore natural plant diversity towards improving salt stress tolerance, Science of the Total Environment; 578:90–99.

40- Wang P., Sun X., Li C., Wei Z., Liang D. and Ma F., 2013, Long-term exogenous application of melatonin delays drought-induced leaf senescence in apple, Journal of pineal research; 54:292–302.

41-Wang P., Sun X., Xie Y., Li M., Chen W., Zhang S., Liang D. and Ma F., 2014, Melatonin regulates proteomic changes during leaf senescence in Malus hupehensis, Journal of pineal research; 57:291–307

42- Yadu B., Chandrakar V., Meena R. K., Poddar A. and Keshavkant S., 2018, Spermidine and Melatonin Attenuate Fluoride Toxicity by Regulating Gene Expression of Antioxidants in Cajanus cajan L., Journal of Plant Growth Regulation; 37(4):1113–1126.

43- Yang X.L., Xu H., Li D., Gao X., Li T.L. and Wang R., 2018, Effect of melatonin priming on photosynthetic capacity of tomato leaves under low-temperature stress, Photosynthetica; 56(3):884–892.

44- Yasar F., Ellialtioglu S. and Yildiz K., 2008, Effect of Salt Stress on Antioxidant Defense Systems, Lipid Peroxidation, and Chlorophyll Content in Green Bean, Russian Journal of Plant Physiology; 55(6):782–786.

45- Ye J., Wang S., Deng X., Yin L., Xiong B. and Wang X., 2016, Melatonin increased maize (Zea mays L.) seedling drought tolerance by alleviating drought-induced photosynthetic inhibition and oxidative damage, Acta Physiol Plant; 38:48.

46- Younis M.E., Abbas M.A. and Shukry W.M., 1993, Effects of salinity on growth and metabolism of Phaseolus vulgaris, Biologia Plantarum; 35(3):417-424.

47- Zeng L., Cai J., Li J., Lu G., Li C., Fu G., Zhang X., Ma H., Liu Q., Zou X. and Cheng Y., 2018, Exogenous application of a low concentration of melatonin enhances salt tolerance in rapeseed (Brassica napus L.) seedlings, Journal of Integrative Agriculture; 17(2):328–335.

48- Zhang N., Zhao B., Zhang H. J., Weeda S., Yang C., Yang Z. C., Ren S. and Guo Y. D., 2013, Melatonin promotes water-stress tolerance, lateral root formation and seed germination in cucumber (Cucumis sativus L.), Journal of pineal research; 54:15–23.

49- Zhang N., Sun Q., Zhang H., Cao Y., Weeda S., Ren S. and Guo Y. D., 2014, Roles of melatonin in abiotic stress resistance in plants, Journal of Experimental Botany; 66(3):647-56.

50- Zhang H., Zhang N., Yang R., Wang L., Sun Q., Li D., Cao Y., Weeda S., Zhao B., Ren S. and Guo Y., 2014, Melatonin promotes seed germination under high salinity by regulating antioxidant systems, ABA and GA4 interaction in cucumber (Cucumis sativus L.), Journal of pineal research; 57:269–279.

51- Zhang Y.P., Yang S. J. and Cheny Y., 2016, Effects of melatonin on photosynthetic performance and antioxidants in melon during cold and recovery, Biologia Plantarum; 61(3):571–578.

52- Zhao H., Zhang K., Zhou X., Xi L., Wang Y., Xu H., Pan T. and Zou Z., 2017, Melatonin alleviates chilling stress in cucumber seedlings by up-regulation of CsZat12 and modulation of polyamine and abscisic acid metabolism, Scientific Reports; 7:4998.

53- Zheng X., Tan D. X., Allan A. C., Zuo B., Zhao Y., Reiter R. J., Wang L., Wang Z., Guo Y., Zhou J., Shan D., Li Q., Han Z. and Kong J., 2017, Chloroplastic biosynthesis of melatonin and its involvement in protection of plants from salt stress, Scientific Reports; 1(7):41236.