Document Type : Research Paper
Author
Abstract
Effects of propyl gallate, an inhibitor of plastid terminal oxidase involved in chlororespiration, on photosystem II efficiency in Dunaliella salina were investigated, using chlorophyll a fluorescence transient measurements. Trated cultures with propyl gallate concentrations of 0.1, 0.5, 1, 2 and 4 mM showed that photosystem II efficiency increased in the presence of concentrations up to 1 mM and chlororespiration process was inhibited at propyl gallate concentrations of 1 and 2 mM. Nonetheless, no negative significant effect was observed on photosystem II electron flow. However, the fluorescence intensity drastically decreased and almost reached a plateau in 4 mM propyl gallate-treated cells. Such reduction was also found for Fv/Fo (the activity of the water splitting complex), Φpo (efficiency of quantum yield of primary photochemistry) and ΦEo (quantum yield for electron transport). The decrease of these parameters was also coordinated with appearance of fluorescence intensity increase at 300 µs step. The data showed that the decrease of photosystem II efficiency in the presence of 4 mM propyl gallate is because of its effects on water splitting complex on the donor side of photosystem II. Therefore, it may be supposed
Keywords
اثر پروپیل گالات بر کارایی فتوسیستم II در جلبک سبز تک سلولیDunaliella salina با استفاده از اندازهگیری فلورسنس کلروفیل a
علیرضا عینعلی1، منصور شریعتی2* و مرضیه پائیزی2
1 زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 3/10/91 تاریخ پذیرش: 21/7/92
چکیده
در این پژوهش اثر پروپیل گالات که از فعالیت اکسیداز انتهایی پلاستید دخیل در تنفس کلروپلاستی جلوگیری میکند، بر کارایی فتوسیستم II در جلبک سبز تک سلولی Dunaliella salina با استفاده از اندازهگیری کینتیک فلورسنس کلروفیل a مطالعه شده است. تیمار کشتهای جلبکی با غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلیمولار پروپیل گالات نشان داد که کارایی فتوسیستم II تا غلظتهای 1 میلیمولار افزایش یافته و از فرایند تنفس کلروپلاستی در غلظتهای 1 و 2 میلیمولار پروپیل گالات جلوگیری میشود. با وجود این، هیچ تأثیر منفی معنیداری در روند انتقال الکترون فتوسیستم II مشاهده نشد. شدت فلورسنس کلروفیل a در جلبک D. salina تیمار شده با 4 میلیمولار پروپیل گالات به شدت کاهش پیدا کرده و به یک سطح تقریبا صاف میرسد. چنین کاهشی در میزان Fv/Fo (پارامتر متناسب با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده آب)، Φpo (کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه) و ΦEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون) نیز مشاهده میشود. البته افزایش شدت فلورسنس در سطح K (300 میکرو ثانیه) نیز با کاهش ایجاد شده در این شاخصها هماهنگ میباشد. نتایج نشان میدهد که کاهش کارایی فتوسیستم II در حضور غلظت 4 میلیمولار پروپیل گالات از تأثیر این ممانعتکننده بر کمپلکس تجزیه کننده آب در سمت دهنده فتوسیستم II ناشی میشود. بنابراین، میتوان پروپیل گالات را بهعنوان یک ممانعتکننده اختصاصی فتوسیستم II علاوه بر نقش آن در ممانعتکنندگی تنفس کلروپلاستی در نظر گرفت.
واژههای کلیدی: پروپیل گالات، فلورسنس کلروفیل a، فتوسیستم II، کمپلکس تجزیه کننده آب،Dunaliella salina
* نویسنده مسئول، تلفن: 7932472-0311، پست الکترونیکی:mansour_shariati@yahoo.com
مقدمه
پروپیل گالات از مشتقات استری اسید گالیک است که بهعنوان جاروب کننده رادیکالهای آزاد با ویژگیهای آنتی اکسیدانی، آثار زیستی وسیعی را در گیاهان سبب میشود (7، 13، 27، 30، 43). این ترکیب از فسفریلاسیون پروتئینهای کلروفیل a و b کمپلکسهای جمعآوری کننده نور جلوگیری میکند. همچنین، از تجزیه پروتئین D1 تحت تابش نور شدید نیز ممانعت بعمل میآورد (17-13، 17). این ترکیب به طور گستردهای در مطالعات فتوسنتزی بهعنوان ممانعت کننده اختصاصی اکسیداز انتهایی پلاستید (PTOX) که در فرایند تنفس کلروپلاستی دخالت دارد، استفاده میشود (9، 16، 23). تنفس کلروپلاستی عبارت است از یک زنجیره انتقال الکترون تنفسی در غشای تیلاکوئیدی کلروپلاستها که هر دو فرایند احیای غیر فتوشیمیایی و اکسیداسیون پلاستوکینونها را همراه با مصرف اکسیژن مولکولی دربر میگیرد (5، 6). بنابراین با توجه به تأثیر پروپیل گالات در زنجیره انتقال الکترون، تغییرات ایجاد شده توسط این ممانعتکننده به راحتی از طریق اندازهگیریهای فلورسنس کلروفیل a قابل بررسی است.
بررسی فلورسنس کلروفیل a ابزاری مفید برای مطالعه فرایندهای انتقال الکترون فتوسیستم II است (15، 18، 21، 36، 37). بهطوریکه بلافاصله پس از تابش نور به یک نمونه فتوسنتزی سازگار شده با تاریکی، شدت فلورسنس در مدت 2 میلیثانیه به علت احیای پذیرنده اولیه فتوسیستم II (QA) از یک سطح پایه (سطح O یا Fo) به یک سطح بالاتر (سطح J یا FJ) افزایش مییابد. افزایش سطح J به سطح I (یا FI) در مدت تقریبی 30 میلیثانیه و به علت پر شدن مخزن پلاستوکینون رخ میدهد. در نهایت، سطح فلورسنس از FI به سطح بیشینه (سطح P یا Fm) رسیده که این حالت نشاندهنده تجمع الکترونها در سمت پذیرنده فتوسیستم I میباشد (37، 39). کارایی فتوسیستم II بر اساس آزمون JIP و توسط مجموعهای از شاخصهای ساختاری و کاربردی حاصل از افزایش چند مرحلهای سطح فلورسنس کلروفیل تعیین میگردد (34، 36، 37، 38، 40). آزمون JIP بر مبنای تئوری جریان انرژی در غشاهای زیستی، بدون کوچکترین آسیبی به موجود زنده و با استفاده از تغییرات حاصل از کینتیک فلورسنس کلروفیل a، هر گونه تغییر در دستگاه فتوسنتزی را نشان میدهد. به همین علت این روش به صورت گسترده در بررسی رفتار دستگاه فتوسنتزی بهویژه فتوسیستم II کاربرد دارد (1، 22، 25، 41).
Dunaliella، یک جلبک سبز تک سلولی فاقد دیواره بوده، قابلیت انعطافپذیری فراوانی دارد و به دلیل دارا بودن کلروپلاست مشابه با گیاهان عالی، سرعت رشد بالا، کشت مداوم و آسان و همچنین قابلیت منحصر به فرد در ارائه پاسخهای بیوشیمیایی مناسب به انواع تنشهای فیزیولوژیکی و سایر ترکیبات شیمیایی بهعنوان یک سیستم مدل برای مطالعات فتوسنتز، جذب و انتقال و فرایندهای متابولیسمی استفاده میشود (3، 10). اغلب مطالعات انجام شده در مورد اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II در زمینه ممانعت از تنفس کلروپلاستی در گیاهان عالی بوده و گزارشهای اندکی در مورد این اثر در جلبکهای سبز وجود دارد. گذشته از این، اثر مستقیم غلظتهای مختلف پروپیل گالات بر ساختار و عملکرد فتوسیستم II و همچنین روند رشد در گیاهان تاکنون بررسی نشده است. ازاینرو در این تحقیق سعی میگردد با استفاده از آنالیز چند مرحلهای افزایش فلورسنس کلروفیل a (OJIP)، این اثر بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II و رشد سوسپانسیونهای جلبکی مشخص شود. همچنین جایگاه عمل پروپیل گالات در زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی مورد بحث قرار میگیرد.
مواد و روشها
منابع تأمین و کشت جلبک: جلبک Dunaliella salina سویه UTEX 200 مورد استفاده در این تحقیق از کلکسیون کشت جلبک دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه شد. تهیه محیط کشت مایع با غلظت 1 مولار NaCl، بر اساس روشهای یاد شده در منابع قبلی انجام شد (32). عمل انتقال سلولهای جلبکی از مخزنهای جلبکی به محیط کشت مایع در داخل ارلن مایرهای 250 میلی لیتری اتوکلاو شده و در شرایط کاملاً استریل انجام شد. کشتهای جلبکی در اتاق کشت و در دمای Cº 25 و شدت نور 70 میکرو مول فوتون بر مترمربع بر ثانیه به مدت 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی بر روی دستگاه شیکر به صورت مداوم و با سرعت 100 دور در دقیقه قرار گرفتند. زمانی که کشتهای جلبکی به مرحله نمایی رشد رسیدند، توسط غلظتهای مختلف پروپیل گالات تیمار شدند.
تیمار کشتهای جلبکی با غلظتهای مختلف پروپیل گالات: زمانی که جلبکها در مرحله نمایی رشد بودند، محلول پروپیل گالات در غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی مولار تهیه و به داخل ارلنها اضافه شد. قبل از اضافه کردن ممانعت کننده، بهمنظور همسان سازی سوسپانسیونهای جلبکی و یکسان نمودن نقطه ابتدایی منحنیهای رشدی، محتوای کلیه ارلنها با یکدیگر مخلوط شد. نمونههای جلبکی با استفاده از محیط کشت در حجم نهایی 100 میلیلیتر طوری آماده شدند که تعداد اولیه سلولها در آنها بطور تقریبی 106 × 5 سلول بر میلیلیتر باشد. کشتهای جلبکی تیمار شده با پروپیل گالات برای مدت 96 ساعت در اتاق کشت با همان شرایط توصیف شده در بالا قرار گرفتند. کشتهای جلبکی فاقد ممانعت کننده بهعنوان شاهد در نظر گرفته شدند.
شمارش سلولی، استخراج و اندازهگیری رنگیزهها: تعداد سلولها بلافاصله پس از اضافه کردن ممانعت کننده و 96 ساعت پس از آن توسط لام هموسایتومر در سه تکرار شمارش شد و میزان رشد سلولی بر اساس درصد تغییرات تعداد سلول پس از 96 ساعت نسبت به زمان صفر بیان شد. بهمنظور استخراج کلروفیل کل و بتاکاروتن، یک میلی لیتر از سوسپانسیونهای جلبکی به میکروتیوب منتقل و در g 10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از حذف محلول رویی، به رسوب باقی مانده یک میلی لیتر استون 80% اضافه و پس از ورتکس شدید، عمل سانتریفیوژ به مدت 2 دقیقه تکرار شد. محلول رویی از میکروتیوبها استخراج و برای اندازهگیری میزان رنگیزهها بکار رفت. میزان کلروفیل کل از طریق روش اسپکتروفوتومتری اندازهگیری شد (2). میزان بتاکاروتن با استفاده از ضریب جذب برابر ) 2273 = (E1%1cm در طول موج 480 نانومتر محاسبه شد (4).
اندازهگیری فلورسنس کلروفیل a : بهمنظور اندازهگیری فلورسنس کلروفیل a در زمانهای صفر و 96 ساعت پس از اضافه کردن پروپیل گالات، یک میلیلیتر از محلول جلبکی به شیشه مخصوص اندازهگیری فلورسنس منتقل شد و بعد شیشهها به مدت 10 دقیقه در تاریکی نگهداری شدند. نشر سریع فلورسنس کلروفیل a از 10 میکروثانیه تا 1000 میلیثانیه با استفاده از دستگاه Handy PEA (Plant Efficiency Analyser, Hansatech, UK)، با تابش یک پالس نور شدید (3500 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه) در یک اتاقک کاملا تاریک اندازهگیری شد. شدت فلورسنس در 50 میکروثانیه بهعنوان سطح O (Fo) و شدت فلورسنس حداکثر بهعنوان سطح P (Fm) در نظر گرفته شد (36، 37). تغییرات شدت فلورسنس القا شده توسط پروپیل گالات در 300 میکروثانیه (سطح K) از طریق نرمال سازی مقادیر سیگنال فلورسنس بین سطوح O و Jبر اساس فرمول زیر و با استفاده از اختلاف سیگنال بین نمونههای شاهد و تیمار شده با مقادیر مختلف ممانعتکننده تعیین شد (28).
WOJ = (Ft-Fo)/(FJ-Fo)
که در این فرمول، WOJبرابر مقادیر سیگنال فلورسنس نرمال شده بین سطوح O و J، Fo شدت فلورسنس در 50 میکروثانیه، FJ شدت فلورسنس در 2 میلیثانیه و Ft شدت فلورسنس در فاصله زمانی بین 50 میکروثانیه و 2 میلیثانیه پس از تابش پالس نور شدید میباشد. در نهایت اطلاعات بهدست آمده از نشر فلورسنس توسط آزمون JIP و با استفاده از نرمافزار BiolyzerHP3 (Labrotory of Bioenergetics, University of Geneva, Switzerland) آنالیز شدند (36). شاخصهای حاصل از آزمون JIP مورد استفاده در این پژوهش و توصیف آنها در جدول 1 آمده است.
اندازهگیری میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II : میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II با استفاده از دستگاه پلاروگراف و از طریق یک الکترود سنجش اکسیژن نوع Clark (Hansatech Ltd, UK) که در محفظهای حاوی سلولهای جلبکی قرار دارد، اندازهگیری شد (11). سوسپانسیونهای جلبکی در مرحله نمایی رشد از طریق سانتریفیوژ در g 2000 به مدت 5 دقیقه رسوب داده شده و در بافر واکنش با نسبت 1:6 حل شدند. ترکیب بافر واکنش شامل 25/0 میلی مولار پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 25/0 میلی مولار دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 2/0 میلی مولار منیزیم کلراید، 25 میلی مولار سدیم بیکربنات و 1 مولار نمک NaCl و اسیدیته برابر 5/7 است. غلظت کلروفیل بافر واکنش طوری تنظیم شد که نمونه مورد آزمایش حاوی 40 میکروگرم کلروفیل بر میلیلیتر باشد. شدت نوری برابر با 400 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه برای انجام آزمایش بکار رفت. مقادیر اکسیژن آزاد شده به صورت نانومول بر میکروگرم کلروفیل در دقیقه بیان گردید.
جدول 1- شاخصهای بیوفیزیکی حاصل از اندازهگیری فلورسنس کلروفیل و آزمون JIP
شاخص |
توصیف شاخص |
ABS/RC |
میزان کل جذب نور توسط کلروفیلهای آنتن نسبت به مراکز واکنش فعال |
Fo |
شدت فلورسنس در µs50 (مرحله O) |
FK |
شدت فلورسنس در µs300 (مرحله K) |
FJ |
شدت فلورسنس در ms2 (مرحله J) |
FI |
شدت فلورسنس در ms30 (مرحله I ) |
Fm |
بیشینه شدت فلورسنس (مرحله P) |
FV |
فلورسنس متغیر بیشینه (FV=Fm–Fo) |
Fv/Fo |
کارایی کمپلکس تجزیه کننده آب در سمت دهنده فتوسیستم II |
ΦDo |
میزان اتلاف انرژی به صورت انرژی گرمایی |
ΦEo |
میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II |
ΦPo |
میزان عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه |
تجزیه و تحلیل آماری: همه آزمایشها در سه تکرار مستقل برای هر تیمار انجام شد. میانگین و انحراف معیار (Standard deviation ±SD) برای هر تیمار اندازهگیری و اختلاف آماری معنیدار بین نمونههای شاهد و تیمار شده با پروپیل گالات با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون Holm-Sidak در سطح 05/0 (P < 0.05) تعیین شد.
نتایج
اثر پروپیل گالات بر رشد سلولی و میزان رنگیزهها: اثر پروپیل گالات بر میزان رشد سلول در شکل 1- الف نشان داده شده است. همان طور که در شکل مشاهده میگردد، پس از گذشت 96 ساعت از اضافه کردن ممانعت کننده به سوسپانسیونهای جلبکی، در بیشتر موارد تعداد سلولها افزایش مییابد. در غلظت 1/0 میلیمولار ممانعت کننده، تفاوت معنیداری نسبت به غلظت صفر ممانعت کننده (شاهد) ملاحظه نمیشود. با این حال در غلظت 5/0 میلیمولار افزایش معنیدار و در غلظتهای 1 و 2 میلیمولار کاهش معنیداری ملاحظه میگردد. در حالی که در غلظت 4 میلیمولار ممانعت کننده تقسیم سلولی به طور کامل متوقف میگردد.
اضافه کردن ممانعت کننده تا حد 5/0 میلیمولار باعث افزایش میزان کلروفیل کل و بتاکاروتن میشود، در حالی که غلظتهای بالاتر از 5/0 میلیمولار ممانعت کننده باعث کاهش تدریجی آن میگردند، بهطوری که در غلظت 4 میلیمولار، این رنگیزهها به طور کامل از بین میروند (شکل 1- ب و پ).
اثر پروپیل گالات بر شدت فلورسنس کلروفیل a : اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II در زمانهای صفر و 96 ساعت پس از تیمار سلولهای جلبک با غلظتهای مختلف این ممانعت کننده با استفاده از اندازهگیری نشر سریع فلورسنس کلروفیل (O-J-I-P) در شکل 2 نشان داده شده است. همان طور که ملاحظه میشود شدت فلورسنس پس از 96 ساعت در حضور غلظتهای 1/0، 5/0 و 1 میلیمولار ممانعت کننده دارای بالاترین سطوح I و P در مقایسه با شاهد هستند. کشتهای تیمار شده با غلظت 2 میلیمولار ممانعت کننده شیب صعودی فلورسنس پایینتری نسبت به شاهد نشان میدهند. کینتیک فلورسنس در تیمار با غلظت 4 میلیمولار به شدت کاهش یافته و به سطح تقریبا یکنواختی میرسد.
شکل 1- اثر غلظتهای مختلف پروپیل گالات بر درصد تغییرات: (الف) تعداد سلول، (ب) غلظت کلروفیل کل و (پ) میزان بتاکاروتن 96 ساعت پس از تیمار با ممانعت کننده مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار میباشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنیدار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) میباشد.
شکل 2- اثر غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلیمولار پروپیل گالات بر کینتیک OJIP فلورسنس کلروفیل a. (الف) زمان صفر، (ب) 96 ساعت پس از تیمار با ممانعت کننده
آنالیز شدت فلورسنس بین سطوح O و (WOJ) J که بیانگر شدت فلورسنس کلروفیل a در سطح K (F300µs) میباشد (شکل 3) نشاندهنده افزایش شدید شدت فلورسنس در 300 میکرو ثانیه در تیمار با غلظت 4 میلیمولار ممانعت کننده است.
اثر پروپیل گالات بر میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II : بررسی میزان اکسیژن آزاد شده در حضور غلظتهای مختلف پروپیل گالات نشاندهنده اثر ممانعتکنندگی این ترکیب بر میزان تولید اکسیژن فتوسنتزی میباشد (شکل 4). همان طور که در شکل ملاحظه میشود، غلظتهای 1/0 و 5/0 میلیمولار پروپیل گالات تأثیر معنیداری بر کاهش میزان اکسیژن فتوسنتزی ندارند؛ در حالی که غلظتهای بیشتر از 5/0 میلیمولار سبب کاهش معنیدار آن شده، به طوری که در حضور غلظت 4 میلیمولار، تولید اکسیژن فتوسنتزی متوقف میشود.
بررسی تغییرات جریان الکترون فتوسیستم II در حضور پروپیل گالات: افزایش میزان پروپیل گالات تا غلظت 1 میلی مولار باعث افزایش تدریجی میزان Fv/Fo که شاخص مرتبط با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده آب در سمتدهنده فتوسیستم II است (20، 29)، میشود. این افزایش در ΦEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II) نیز مشاهده میشود. در حالی که این غلظتها تأثیر معنیداری بر میزان شاخص ΦPo (کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه) نداشته است. با وجود این، تمامی این شاخصها در حضور غلظت 4 میلیمولار ممانعت کننده به شدت کاهش پیدا میکنند (شکل5). همچنین غلظتهای 1/0 تا 2 میلیمولار پروپیل گالات تأثیری بر ΦDo (میزان اتلاف انرژی) و نسبت ABS/RC (میزان کل جذب نور توسط کلروفیلهای آنتن نسبت به مراکز واکنش فعال) ندارد. بهطوریکه تنها غلظت 4 میلیمولار ممانعت کننده باعث افزایش شدید این شاخصها در مقایسه با شاهد میشود (شکل 6).
شکل 3- اثر غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلیمولار پروپیل گالات بر شدت فلورسنس کلروفیل a در سطح K. مقادیر نسبت به شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) نرمال شدهاند.
شکل 4- میزان آزاد شدن اکسیژن فتوسنتزی در سلولهای D. salina در معرض غلظتهای مختلف پروپیل گالات مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار میباشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنیدار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) میباشد.
شکل 5- تغییرات Fv/Fo، PoΦ و EoΦ در کشتهای جلبکی تیمار شده با غلظتهای مختلف پروپیل گالات مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار میباشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنیدار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) میباشد.
شکل 6- تغییرات ABS/RC و DoΦ در کشتهای جلبکی تیمار شده با غلظتهای مختلف پروپیل گالات مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار میباشد. علامت ستاره بیانگر وجود تفاوت معنیدار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) میباشد.
بحث
همانند گزارشهای پیشین در مورد گیاهان عالی، جلبکهای سبز و سیانوباکتریها مبنی بر افزایش چند مرحلهای فلورسنس سلولهای سازگار شده با تاریکی (1، 25، 39)، سلولهای جلبک Dunaliella نیز یک افزایش چند مرحلهای فلورسنس را پس از قرار گرفتن در تاریکی از خود نشان میدهند (شکل2). شدت فلورسنس کلروفیل a در مراحل مختلف صعود (O-J-I-P) بیانگر میزان احیای QA، QB و مخزن پلاستوکینون است (18، 24). بررسی شدت فلورسنس نشان داد که سلولهای جلبکی تیمار شده با غلظتهای 1/0 تا 1 میلیمولار پروپیل گالات سطوح I و P بالاتری در مقایسه با شاهد دارند. بالاتر بودن سطح I نشاندهنده مخزن پلاستوکینون احیاتر و تجمع بیشتر اولین پذیرندة الکترون (QA-) در حضور پروپیل گالات است (37). این رویداد میتواند بیانگر توقف فرایند تنفس کلروپلاستی در نتیجه ممانعت از اکسیداز انتهایی پلاستید (PTOX) توسط پروپیل گالات باشد. از طرفی، زمانی که تولید اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II با استفاده از روش پلاروگراف تعیین میگردد، یک همبستگی منفی بین کاهش تدریجی در میزان آزاد شدن اکسیژن با افزایش غلظت ممانعت کننده مشاهده میشود. به هر حال غلظت ممانعت کننده تا حد 2 میلیمولار تأثیر منفی بر فعالیت کمپلکس تجزیه کننده آب و روند جریان انتقال الکترون فتوسیستم II ندارد (شکل 5). بنابراین چنین به نظر میرسد که کاهش معنیدار میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II در حضور غلظتهای 1 و 2 میلیمولار پروپیل گالات به علت ممانعت از جریان الکترونی بین فتوسیستم II و اکسیژن یا در حقیقت ممانعت از عملکرد PTOX دخیل در فرایند تنفس کلروپلاستی باشد. مطالعات پیشین نشان دادند که میزان آزاد شدن اکسیژن فتوسنتزی به محض اضافه کردن پروپیل گالات به سلولهای کلامیدوموناس کاهش مییابد (8، 9، 14). این کاهش سریع در میزان اکسیژن آزاد شده به دلیل خاصیت آنتی اکسیدانی پروپیل گالات نیست، زیرا هیچ یک از سایر آنتی اکسیدانها مانند سوپر اکسید دسموتاز، کاتالاز، آلفا توکوفرول و آسکوربات میزان اکسیژن آزاد شده را تغییر نمیدهند (9). این نتایج پیشنهاد میکنند که کاهش در میزان آزاد شدن اکسیژن در حضور غلظتهای تا حد 2 میلیمولار ممانعت کننده، بدون تأثیر بر جریان الکترونی، ناشی از ممانعت از تنفس کلروپلاستی است.
کاهش شدید شدت فلورسنس و رسیدن آن به یک سطح تقریبا صاف در حضور غلظتهای 4 میلیمولار ممانعت کننده میتواند به علت کاهش ظرفیت فتوسیستم II برای انتقال الکترون از سیستم تجزیه کننده آب به سمت فتوسیستم I باشد. مشابه با کاهش شدید شدت فلورسنس در حضور این غلظت، کاهش شدیدی نیز برای Fv/Fo، شاخصی متناسب با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده آب در سمت دهنده فتوسیستم II (20، 29)، کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه (Φpo) و میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II (ΦEo) مشاهده میشود (شکل 5). همگام با چنین کاهشی، افزایش مشاهده شده در نسبت ABS/RC که ناشی از کاهش در تعداد مراکز واکنش فعال و یا افزایش در تعداد مولکولهای آنتنی میباشد (38)، میتواند بیانگر آسیب برگشتناپذیر به فتوسیستم II باشد (20). به هر حال نتایج ما بیانگر کاهش شدید در تعداد مراکز واکنش فعال است (نتایج نشان داده نشده است). تجمع مراکز واکنش غیرفعال، با افزایش اتلاف انرژی جذب شده به صورت گرما (شکل 6) همراه است. از سوی دیگر کارایی کمپلکس تجزیه کننده آب بهعنوان حساسترین بخش در زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی محسوب میشود (20). کاهش در فعالیت این بخش از آسیب به سیستم انتقال الکترون فتوسنتزی ناشی میشود (29). همچنین، نتایج نشان داد که تغییرات در هر دو شاخص Fv/Fo و Φpo با افزایش شدت فلورسنس در 300 میکروثانیه (سطح K) هماهنگ است (شکل3). افزایش در شدت فلورسنس در محدوده 300 میکرو ثانیه نشاندهنده اثر ممانعت کنندگی در سیستم تجزیه کننده آب در سمت دهنده فتوسیستم II میباشد (12، 35). بنابراین میتوان چنین تصور کرد که کاهش کارایی فتوسیستم II از ممانعت ایجاد شده توسط غلظت 4 میلیمولار پروپیل گالات بر کمپلکس تجزیه کننده آب ناشی میشود.
تیمار سلولهای جلبکی با غلظتهای تا 5/0 میلیمولار پروپیل گالات اثر مثبتی هم بر فتوسنتز و هم بر شاخصهای فیزیولوژیک مانند رشد سلول و میزان رنگیزهها دارد. مطالعات روی گیاه آرابیدوپسیس نشان داد که پروپیل گالات در غلظتهای پایین میتواند سبب افزایش عملکرد کوانتومی فتوسیستم II شود (26). همچنین سایر مطالعات روی اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسنتزی بیان کننده نقش این ممانعت کننده در غلظتهای پایین در ممانعت از تجزیه پروتئین D1 است (12، 33). این امر نشان میدهد که ممانعت کنندة تنفس کلروپلاستی در این محدوده غلظت میتواند بهعنوان یک محافظت کننده از سیستم فتوسنتزی عمل کند. با توجه به توقف رشد سلول در کشتهای تیمار شده با غلظت 4 میلیمولار پروپیل گالات (شکل 1)، میتوان چنین نتیجه گرفت که ممانعت از فعالیت فتوسیستم II در این شرایط میتواند ناشی از اثر ممانعت نوری ایجاد شده در حضور غلظت بالای پروپیل گالات باشد. مطالعات گذشته نیز نشان دادهاند که ممانعت از کمپلکس تجزیه کننده آب، حساسیت فتوسیستم II را به ممانعت نوری افزایش میدهد (42) و این امر میتواند سبب تسریع تجزیه پروتئین D1 شود (19).
با توجه به نتایج بهدست آمده از این پژوهش میتوان چنین جمعبندی نمود که غلظت 4 میلیمولار پروپیل گالات به طور مستقیم بر اجزای فتوسیستم II اثر گذاشته و احتمالا باعث القای پدیده ممانعت نوری در جلبک Dunaliella شده است. همچنین، با در نظر گرفتن نحوة اثر این غلظت از ممانعت کننده بر فتوسنتز و رشد سلولهای جلبکی، سمت دهنده فتوسیستم II بهعنوان جایگاه عمل ممانعت کننده در غلظت بالاتر از 2 میلیمولار شناخته شد. بنابراین میتوان پروپیل گالات را بهعنوان یک ممانعت کننده اختصاصی فتوسیستم II علاوه بر نقش آن در ممانعت کنندگی تنفس کلروپلاستی در نظر گرفت.
سپاسگزاری
بدینوسیله از مسئولان محترم تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان به دلیل حمایت مالی در انجام این تحقیق قدردانی میگردد. نویسندگان مقاله از دستاندرکاران قطب تنشهای گیاهی در دانشگاه اصفهان نیز تشکر و قدردانی مینمایند.