The study isoforms and activities of antioxidant enzymes in immature flora segments of saffron (Crocus sativus L.) Iran

Document Type : Research Paper

Authors

1 assistant professor

2 professor

Abstract

Abstract:
Saffron (Crocus sativus l.), member of Iridaceae which was used as spice and also in medicine. An investigation was set up in order to select suitable samples to improve saffron production. The activities and isoforms of antioxidant enzymes which were affected on H2O2/O2 ratio, that represented the potential of organogenesis was carried out by using electrophoresis and five different segments of saffron immature flora. The number of peroxidase isoforms which were specific-tissue and developmental stages that consumer of H2O2 and Superoxide dismutase which produce H2O2 from superoxide showed high ratio in ovary and low in perianth segments. Catalase was repressed by higher but responses by lower level of H2O2, acts versus peroxidase. The other Three enzymes, Polyphenoloxidase is specific-growth and represent defense system, Malatedehydrogenase, showed relationship between organs and their growth and also produced H2O2 and Estrase was specific- organization of tissue all gave us useful information to select right segments for our propose.

Keywords

مطالعه ایزوفرم‌های زیمایه‌های پاداکساینده در قطعات گل نارس زعفران ( Crocus sativus L. ) ایران برای انتخاب  نمونه برتر اندام‌زایی به روش الکتروفورز

منیر حسین‌زاده نمین1،2*، حسن ابراهیم‌زاده2 و طیبه رجبیان3

1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست‌شناسی، گروه فیزیولوژی گیاهی

2 تهران، دانشگاه الزهرا، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

3 تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 11/7/91               تاریخ پذیرش: 17/9/91

چکیده

زعفران (Crocus sativus L.) از تیره Iridaceae به‌عنوان ادویه و در پزشکی نیز استفاده می‌شود. تحقیقی به‌منظور تعیین اندام مناسب برای کشت بافت و بهبود محصول زعفران انجام شد. شدت ظهور و ایزوفرم‌های زیمایه‌های پاداکساینده و تعیین‌کننده نسبت  H2O2 /O2  که نشانگر پتانسیل اندام‌زایی است به روش الکتروفورز و با استفاده از پنج قطعه گل نارس زعفران انجام شد. تعداد ایزوفرمهای پراکسیداز که نشانویژه بافت و مرحله نموی و مصرف‌کننده  H2O2هستند و سوپراکسید دیسموتاز که تولیدکننده H2O2 است در تخمدان بالاترین و در گلپوش و میله پائین‌ترین نسبت H2O2 /O2 را به نمایش گذاشتند. کاتالاز که در غلظت بالای H2O2 غیرفعال می‌شود و بر خلاف پراکسیداز در سطوح پائین H2O2 قادر به پاسخگویی است. سه زیمایه پاداکساینده پلی فنل اکسیداز نشانویژه سیستم دفاعی و رشد و نمو، مالات دهیدروژناز نشانویژه روابط بین اندامها و رشد و نیز تولید H2O2 و استراز نشانویژه سطح سازمان یافتگی بافتها اطلاعات مفیدی را درباره توان بالای تخمدان به‌عنوان نمونه برتر و توان پائین گلپوش و میله را در اندام‌زایی ارائه دادند تا بتوانیم مناسبترین نمونه را برای کشت بافت انتخاب کنیم.

واژه‌های کلیدی: Iridaceae، الکتروفورز، ایزوفرم،Crocus sativus L .

* نویسنده مسئول، تلفن تماس: 88044051، پست الکترونیکی:  [email protected] 

مقدمه

 

زعفران گیاهی ترپیلوئید، عقیم، تک لپه‌ای و عضوی از تیره (Iridaceae) است. کلاله‌های خشک شده زعفران به‌عنوان ادویه مصرف می‌شود. رنگ کروسین (crocin) زعفران از مشتقات کاروتنوئید و محلول در آب است. امروزه زعفران علاوه بر ادویه در پزشکی به‌عنوان ضد سرطان، ضد تومور و نیز به‌عنوان پاداکساینده بکار می‌رود که جاروب‌کننده گونه‌های واکنشگر اکسیژن (ROS) است. گونه‌های واکنشگر اکسیژن به‌ترتیب شامل سوپر اکسید (O˙-2)، هیدروژن پراکسید(H2O2)  و رادیکال هیدروکسیل (˙(OH می‌باشند که اثراتی زیان‌آور از قبیل پراکسیداسیون لیپد، موتاسیون DNA و واسرشتی پروتئین‌ها را در سلولها دارند Scandalios) (1993. زیمایه‌های پاداکساینده از قبیل SOD،POD  و  CATمی‌توانند رادیکال اکسیژن و هیدروژن پراکسید را به‌ترتیب حذف کنند. گونه‌های واکنشگر اکسیژن که در غلظت پائین اثرات خفیف دارند دخیل در علامت‌دهی سلولی بوده و در غلظت‌های قابل تحمل بوسیله زیمایه‌های پاداکساینده جاروب می‌شوند .(Gechev and Hille, 2005) در متابولیسم طبیعی سلول، H2O2 از طریق واکنش Mehler در کلروپلاستها، از طریق زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری‌ها و در تنفس نوری از پراکسی‌زوم‌ها تولید می‌شوند. تنش‌های زیستی و غیرزیستی تولید H2O2 را از این مسیرها و نیز از منابع زیمایه‌ای از قبیل NADPH اکسیدازها و یا پراکسیداز‌های دیواره سلولی افزایش می‌دهند. سطوح H2O2 سلولی، با میزان فراورده‌های H2O2 و متابولیسم از طریق کاتالاز و چرخه گلوتاتیون- اسکوربات که شامل اسکوربات پراکسیداز (APX)، دهیدرواسکوربات ردوکتاز (DHAR) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) است، تعیین می‌شود. همچنین  H2O2به گلوتاتیون واکنش نشان داده و آنرا از حالت احیاء (GSH) به حالت اکسید (GSSG) تبدیل می‌کند. هورمونهای گیاهان عالی نه تنها در پائین‌دست علامت‌دهی ROS قرار گرفته‌اند، بلکه ROS به نوبه خود پیک‌های ثانوی در اغلب مسیرهای علامت‌دهی هورمونی هستند (et al., 2006 .(Coupe, آنها اثرات زیان‌آوری را از طریق اکسایش چربیها، شکستن پلی‌ساکاریدها، جهش در DNA و واسرشتی پروتئین‌ها در سلولها می‌گذارند Scandalios 1993; ) Apel and Hirt, 2004.(. گیاهان واجد دو سازوکار دفاعی پاداکساینده‌های غیر زیمایه‌ای و زیمایه‌ای برای کاهش اثرات کشنده هستند (Allen,1995).

پاداکساینده‌های زیمایه‌ای بکار رفته در این پژوهش بشرح زیر است.

سوپر اکسید دیسموتاز :(SOD, EC 1.15.1.1) (Superoxide dismutase) سوپر اکسید دیسموتاز می‌تواند سوپر اکسید آنیونی (O˙-2) را جاروب کرده و غلظت O˙-2 و H2O2 یاخته‌ای را با کاتالیز کردن سوپر اکسید و تبدیل آنها به O2 و H2O2 تنظیم نماید.  H2O2به نوبه خود توسط کاتالاز و پراکسیداز حذف می‌شود. سوپر اکسید علاوه بر واکنشگری، به دلیل عدم انتشار از عرض دیواره و ماندگاری در محل تولید، مخرب است. در گیاهان برحسب نوع کوفاکتور فلزی که زیمایه از آن استفاده می‌کند و نیز جایگاه زیر یاخته‌ای، سه نوع SOD شناخته شده است. Mn-SOD در میتوکندری و پراکسی‌زوم، Cu/Zn-SOD در سیتوسل، کلروپلاست و پراکسی‌زوم و Fe-SOD در کلروپلاست قرار گرفتند. حداقل یک نسخه از این Mn-SOD در هر ژنوم گیاهی موجود می‌باشد. SOD-Fe در کلروپلاستها یافت می‌شود. به‌ نظر می‌رسد SOD-Fe در بعضی از گونه‌های گیاهی با  Cu/Zn-SOD جایگزین شده باشد (et al.,2006 (Katyshev.

کاتالاز (Catalase) (CAT, EC 1.11.1.6): کاتالاز باعث دیسموتاسیون H2O2 به H2O و  O2می‌شود، بدون اینکه نیاز به منابع احیاء کننده داشته باشد. کاتالاز نسبت به پراکسیدازها توان کمتری در جاروب کردن H2O2 دارد، زیرا تمایل کمتری نسبت به گهرمایه در آنها وجود دارد. بیان ژن کاتالاز در ذرت بافت ویژه است. کاتالاز گلی اکسی زوم نقش اساسی را در شکستن H2O2 تولید شده در بتا- اکسیداسیون و در تنفس نوری بازی می‌کند و بیان آنها اندام ویژه و نیز نشانویژه مرحله نمو بافتی است (Du, et 2008.(al.,.

پراکسیداز (Peroxidase) (POD, EC 1.11.1.7): گیاهان عالی واجد دسته بزرگی از پراکسیدازها می‌باشند که در طیف وسیعی از فرایندهای فیزیولوژیکی از قبیل جاروب کردن و ایجاد H2O2، طویل شدن سلول، ساختار دیواره سلولی، تمایز و پاسخ گیاه به تنش شرکت می‌کنند. الگوی بیانی پراکسیدازها بافت ویژه و تنظیمشان وابسته به تمایز است. بطور کلی پراکسیدازها براساس عملکرد و جایگاه زیر سلولی‌شان به دو گروه تقسیم شدند. آنهایی که گایاکول (o- متوکسی فنل) را به‌عنوان گهرمایه احیاءکننده اکسید می‌کنند؛ در سیتوسل، واکوئل، دیواره سلولی و آپوپلاست قرار دارند و در تعدادی از فرایندها که به رشد و تمایز گیاه مربوط می‌شوند، شرکت می‌کنند. نوع دیگر آن اسکوربیک اسید را به‌عنوان گهرمایه احیاکننده استفاده می‌کنندGhamsari) (et al., 2007 . بعضی از پراکسیدازهای گیاهی تولید H2O2 می‌کنند. پراکسیدازهای ویژه پرزها در میانکنش کلاله- دانه گرده، باعث سست شدن دیواره سلول کلاله شده و اجازه نفوذ و رشد لوله گرده را می‌دهد، و نیز کمک به شناسایی دانه گرده گونه ویژه، دفاع برابر عوامل بیماری‌زا و محافظت از شهد (نکتار) در زمان قبول دانه گرده کرده و نقش کلیدی دارند. از طرفی نشان داده شده که کلاله‌های تر و تازه از حمله بیماری‌زاها محافظت می‌شوند، زیرا خامه پروتئینهای مربوط به بیماری‌زایی (PR) را که بعضی از آنها پراکسیدازها می‌باشند، بیان می‌کند ((Mclnnis et al., 2006.

پلی فنل اکسیداز (Polyphenol oxidase) (PPO, EC 1.1.1): پلی فنل اکسیدازها باعث تبدیل مونو فنلها به O- دی فنل‌ها و سپس O- دی هیدروکسی فنل‌ها به O-quinone می‌شوند که بعداً تولیدات O-quinone حاصل می‌تواند پلیمریزه شده با گروه‌های آمینی پروتئینهای سلولی واکنش نشان دهد و منجر به رنگیزه‌های سیاه و یا قهوه‌ای شود. فنل‌ها و اغلب ترکیبات فنلی، ترکیبات حد واسط مسیرهای شیکیمیک اسید و فنیل پروپانوئید می‌باشند که در بیوسنتز چوب دیواره سلولی دخیل هستند. ژنهای این زیمایه در بعضی گونه‌ها بصورت خانواده چند ژن و در برخی بصورت تک ژنی شناسائی شدند. زیمایه‌های آنها در بافتهای فتوسنتز‌کننده و غیر فتوسنتزکننده هر دو حضور دارند. دو دسته پلی فنل اکسیداز وجوددارد: لاکازها (Laccases) و کاتکول اکسیدازها ((catechol oxidases. کاتکول اکسیداز به گرانومهای کلروپلاست و میتوکندری اتصال دارد. کاتکول اکسیداز و لاکاز هر دو با استفاده از اکسیژن مولکولی گهرمایه‌های فنلی را اکسید می‌کنند. مقدار زیمایه در شرایط رشد و نمو گیاه تغییر می‌کند (Mayer and Harel, 1979). تفاوتهای مشاهده شده در الگوی ایزوفرمی در ارتباط با اندامکهای زیر سلولی، مرحله نمو بافتی، تیمار با هورمونهای گیاهی و حمله عوامل بیماری‌زا از نظر فیزیولوژیکی دارای اهمیت است. فعالیت پلی فنل اکسیداز در ابتدای تکوین گل بیشتر از سایر دوره‌هاست. این امر احتمالآ ناشی از نیاز بیشتر به سازوکارهای دفاعی دوره گلدهی می‌باشدMustafa and) (Verpoorte, 2007.

مالات دهیدروژناز (MDH- EC.1.1.1.37): مالات دهیدروژناز در گلی اکسی زوم‌ها، میتوکندریها، پراکسی زوم‌ها، کلروپلاستها و سیتوسل حضور دارد. مالات دهیدروژناز وابسته به +NADP کلروپلاستی بطور غیرمستقیم بوسیله نور تنظیم می‌شود. مالات دهیدروژناز وابسته به +NAD در گیاهان عالی در سه فرم در سیتوپلاسم، میتوکندری و اندامکها و فرم وابسته به  NADP+در کلروپلاستها حضور دارند و بوسیله ژنهای مختلف هسته‌ای رمز سازی و در سیتوپلاسم سنتز می‌شوند و به اندام‌های مورد نظر انتقال می‌یابند (1992 Gietl,). تغییر یک آمینواسید در لاکتات دهیدروژناز (LDH) ویژگی زیمایه را به MDH تغییر می‌دهد، به‌طوری‌که آرژینین در MDH و گلوتامین در LDH و گهرمایه ترجیحی برای MDH اگزالوا ستات و برای LDH پیرووات است.LDH  و MDH هر دو در دسته اکسیدوردواکتازها قرار دارند. سیستم MDH اطلاعات مفیدی درباره روابط بین اندامها و بافتها در خصوص رشد، متابولیسم و توارث می‌دهد. این زیمایه‌ها در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانولها، ترپنوئیدها، استروئیدها و الکالوئیدهای حاصل از مسیر شیکیمیک اسید و بیوسنتز هورمونهای گیاهی و مسیرهای متابولیسمی از قبیل چرخه کربس و تنفس نوری شرکت می‌کنند (www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.37).

استیل استراز: استرازها نشانگرهای مناسبتری نسبت به پراکسیدازها در فرایندهای نموی هستند. از طرفی نشانگرهای خوبی برای ریخت‌زایی گیاهی می‌باشند. الگوهای ایزوفرمی آنها در بین بافت های سازمان یافته و غیر سازمان یافته متفاوت است.  Coppensو Dewitte در سال1990 گزارش کردند که طرحهای ایزوزیمی استراز در کالوس جو دوسر می‌توانند به‌عنوان نشانگرهای بیوشیمیایی رویان‌زایی و اندام‌زایی استفاده شوند و نیز سیستم استراز برای بررسی رویان‌زایی، قبل از اینکه رویانهای بدنی شکل بگیرند، حساس‌تر هستند. طرح ایزوفرم پیچیده بوده و به مرحله ریختی خاص ارتباط دارد. هدف از پژوهش حاضر مطالعه و مقایسه ایزوفرم های شش زیمایه پاداکساینده در پنج قطعه مختلف گل نارس زعفران (تخمدان، خامه، گلپوش، میله و کلاله) با استفاده از روش الکتروفورز با ژل پلی اکریلامید به‌منظور تعیین اندام مناسب برای کشت بافت و برای بهبود محصول زعفران است زیرا اغلب این زیمایه ها بافت ویژه بوده و اطلاعات مفیدی در مورد رشد و نمو و سازمان یافتگی نمونه ها می‌دهند.

مواد و روشها

نمونه های گیاهی: برای برقراری آزمایش ها، بنه‌ها با گلهای نارس از مزرعه مردآباد کرج وابسته به پردیس علوم دانشگاه تهران در فصل پائیز در فاصله ماه‌های آذر و دی جمع‌آوری شدند و بلافاصله به آزمایشگاه انتقال یافتند. سپس بر روی یخ قسمتهای مختلف گل که شامل تخمدان، خامه، میله، کلاله و گلپوش بودند از هم تفکیک شده و پس از توزین و بسته‌بندی ابتدا به ازت مایع انتقال و بعد در فریزر С80⁰- تا زمان آزمایش نگه‌داری شدند.

برای استخراج پروتئین از بافر سدیم فسفات ( 2/0 مولار) 8/6  pH و برای سنجش پروتئین از روش برادفورد (1976 Bradford,) با استفاده از دستگاه طیف‌سنج Shimadzu Model UV-160-Japan و در طول موج nm 595 استفاده شد و برای نمایش ایزوفرم ها از الکتروفورز با ژل پلی اکریلا مید به روش PAGE  (Hames and Rickwood, 1990)استفاده شد. ژلها بعد از اتمام الکتروفوروز در تماس با گهرمایه‌های اختصاصی زیمایه ها قرار گرفتند.

آشکار سازی زیمایه ها بر روی ژلهای پلی آکریلا مید و محاسبه Rm : برای آشکار سازی زیمایه ها بر روی ژل پلی آکریلامید، بعد از خاتمه الکتروفورز ژل حاوی زیمایه در مجاورت گهرمایه اختصاصی قرار گرفت تا ایزوفرم های (نوار های اختصاصی) آن زیمایه ظاهر شوند. سپس Rm (relative mobility) ایزوفزم ها طبق فرمول مسافت پیموده شده توسط نوار پروتئینی در ژل زیرین از شروع ژل زیرین تا نوار پروتئینی تقسیم بر مسافت پیموده شده توسط رنگ در ژل زیرین از شروع ژل زیرین تا خط پیشروی رنگ محاسبه شد.

سوپر اکسید دیسموتاز و مالات دهیدروژناز: آشکار سازی فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز و مالات دهیدروژناز در ژلهای 10 ٪ پلی آکریلامیدی در مجاورت محلول گهرمایه اختصاصی انجام شد  (Wendel and Weeden, 1990). برای شناسایی ایزوفرم های انواع مختلف SOD، یعنیFe-SOD, Mn-SOD  و Cu/Zn-SOD پیش تیماری از بازدارنده های اختصاصی  H2O2 (5mM)و KCN (3mM) انجام شد. از میان انواع مختلف ایزوفرم های Cu/Zn-SOD حساس به سیانید، ایزوفرم های Fe-SOD و Cu/Zn-SOD حساس به H2O2 و ایزوفرم های Mn-SOD مقاوم به هر دو بازدارنده بودند 2001) .(Martinez et al.,

کاتالاز: آشکار سازی ایزوفرم های کاتالاز در ژل 5/7 درصد پلی آکریلامید در مجاورت محلول گهرمایه اختصاصی انجام شد

.(Dewir et al., 2005)

پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز: آشکار سازی ایزوفرم های پراکسیدازها و پلی فنل اکسیدازها به‌ترتیب در ژلهای 5/7  و 10 درصد پلی آکریلامید در مجاورت محلول گهرمایه اختصاصی انجام شد .(Van Loon, 1971)

استیل استراز: ایزوفرم های استراز در ژلهای 10 درصد پلی آکریلامید در مجاورت محلول گهرمایه اختصاصی آن آشکار سازی شد (Balen et al., 2003).

نتایج

آشکار سازی فعالیت زیمایه های پاداکساینده: نتایج حاصل از آشکار سازی و مقایسه شدت ظهور ایزوفرم های زیمایه های پراکسیداز، کاتالاز، پلی فنل اکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، مالات دهیدروژناز و استیل استراز در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی در ژل پلی آکریلامید بشرح زیر می باشد.

سوپر اکسید دیسموتاز: نتایج مطالعه ایزوفرمهای سوپراکسید دیسموتاز در نمونه ها نشان‌دهنده دو دسته ایزوفرم (نوار) بود. پنج ایزوفرم در دسته اول با Rm های 58/0، 55/0، 52/0، 5/0 و 48/0 و چهار ایزوفرم در دسته دوم با Rm های 42/0، 36/0، 3/0 و 26/0 بر روی ژل آشکار شدند. نوارهای هر دو دسته در قطعات تخمدان، خامه و گلپوش بر حسب نمونه و با شدت های مختلف آشکار شدند. قطعه میله، نوارهای دسته اول را نسبت به دسته دوم با شدت کمتری آشکار کرد. به غیر از کلاله که فاقد دو نوار با Rm های 5/0 و 48/0 در دسته اول بود، بقیه نمونه ها تمام نوارها را با شدت های متفاوت به نمایش گذاشتند. دو نوار با Rm های 42/0 و 36/0 بشدت در همه نمونه ها ظاهر شدند (شکل 1).

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های SOD در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی: تخمدان (O)، خامه (St) ، گلپوش (P) ، میله (F)  و کلاله  (S)

در دو سمت نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های SOD در نمونه میله با پیش تیمارهای  KCN و H2O


کاتالاز: بررسی ظهور و شدت نوار های کاتالاز در نمونه های مختلف نشان داد به غیر از کلاله که واجد تک نوار با  Rm78/0 بود بقیه از الگوی ایزوفرمی مشابهی پیروی کردند و دارای دو نوار با Rm های 9/0 و 77/0 بودند (شکل 2).

پراکسیداز: بررسی ظهور و شدت نوارهای پراکسیدازی در نمونه ها نشان داد که میله و کلاله با داشتن یک نوار با Rm 81/0 مشابه هم بودند ولی شدت ظهور در آنها متفاوت بود. تخمدان واجد دو نوار با Rm 81/0 و 71/0 بود ولی شدت نوار در  Rm81/0 نسبت به بقیه بیشتر بود. گلپوش واجد نوارهایی ضعیف با Rm 53/0، 51/0 و 48/0 علاوه بر 81/0 بود. خامه واجد سه نوار با Rm 81/0- 71/ -63/0 بود که بطور کمرنگ ظاهر شدند (شکل 3).

پلی فنل اکسیداز: ظهور و شدت نوارهای پلی فنل اکسیداز نشان داد که تخمدان، خامه، گلپوش و میله دو نوار با Rm های 92/0 و 82/0 را با شدت های مختلف ظاهر کردند ولی جداکشت کلاله فقط یک نوار با Rm 72/0 را ظاهر کرد (شکل 4).

 

 

 

O

 

S

 

F

 
                                                        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های (CAT) در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی:

 تخمدان (O)، خامه (St) ، گلپوش (P) ، میله(F)  و کلاله  (S)

 



 
 

 


 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3- نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های پراکسیداز (POD) در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی:

تخمدان (O)، خامه St) )، گلپوش (P)، میله(F)  و کلاله  (S)


مالات دهیدروژناز: بررسی ظهور و شدت نوارهای مالات دهیدروژناز نشان داد که تخمدان و خامه واجد دو نوار با Rm 67/0 و 69/0 بودند که شدت ظهور در خامه چهار برابر تخمدان بود. نمونه های گلپوش و کلاله فاقد نوار بودند. نمونه میله علاوه بر دو نوار واجد نوار سوم با Rm 65/0 بود که تظاهرات هر سه نوار متوسط و مساوی بودند (شکل 5).

استیل استراز: ایزوفرم ها در سه دسته روی ژل ظاهر شدند. ایزوفرم های دسته اول با Rm های (95/0، 89/0 و 84/0) و یا (92/0، 86/0 و 81/0) علاوه بر ایزوفرم 71/0 که مشترک در هر دو دسته بودند. در هر نمونه فقط یکی از دو دسته را واجد بود. دسته دوم 5 نوار با Rm های 47/0، 44/0، 4/0، 35/0 و 32/0 و دسته سوم 4 نوار با Rm های 31/0، 28/0، 26/0 و 23/0 بر روی ژل ظاهر شدند. از میان نمونه ها کلاله و خامه واجد ایزوفرم Rm 71/ 0 بودند.

 

 

 






 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 4- نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های پلی فنل اکسیداز (PPO) در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی:

تخمدان (O)، خامه(St) ، گلپوش (P)، میله(F)  و کلاله (S)

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

شکل 5- نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های مالات دهیدروژناز(MDH)  در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی:

تخمدان (O)، خامه (St) ، گلپوش (P) ، میله (F) و کلاله  (S)

 

 قطعات گلپوش و میله فقط در دسته دوم با سه نوار با Rm های 47/0، 44/0 و 35/0 تفاوت داشتند. کلاله و خامه با داشتن دو نوار همراه با نوار 71/0 در دسته اول و تشابه در نوارهای دسته دوم و سوم شبیه هم بودند. از طرفی تخمدان و میله در داشتن تعداد نوارها در هر سه دسته مشابه هم بودند (شکل 6).

بحث

سوپر اکسید دیسموتاز: این زیمایه می‌تواند    O˙-2را که مولکول علامت دهنده است و از کاهش یک الکترون O2 حاصل از چرخه انتقال الکترون در میتوکندری یا کلروپلاست و یا از چرخه بتا- اکسیداسیون اسید های چرب در گلی اکسی زوم بدست می‌آید به H2O2 تبدیل نماید. O˙-2 و H2O2 هر دو می‌توانند ژنهای مختلفی را بطور انفرادی یا با هم القاء کنند. کاتالاز و پراکسیداز H2O2 تولید شده را به آب و اکسیژن تبدیل می‌کنند. در کشت بافت توت فرنگی سطوح بالای O˙-2 پتانسیل پائین اندام‌زایی را نشان داد. سطوح بالاتر  O˙-2و پائین‌تر H2O2 مسئول کاهش توان نو پدیدی و افزایش تشکیل مریستم مانند می‌باشد.(Tian et al.,2003)

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 6 - نیمرخ ژل با ایزوفرم‌های استراز در پنج قطعه گل نارس زعفران مزروعی:

تخمدان (O)، خامه(St) ، گلپوش (P) ، میله (F) کلاله  (S)

 

 

مقایسه نتایج فعالیت زیمایه SOD در این پژوهش نتایج Tian و همکاران (2003) را تأیید نمود. نوع Mn-SOD در میتوکندری و پراکسی زوم وجود دارد. نتایج حاصل نشان‌دهنده وجود دو دسته ایزوفرم بود. دسته اول واجد 5 ایزوفرم در بالای ژل و دسته دوم واجد 4 ایزوفرم درموقیت پائین ژل بودند. با بکارگیری بازدارنده H2O2 فقط نوع Mn-SOD با 5 ایزوفرم در بالای ژل مشاهده شد و همه قطعات بغیر از کلاله که فقط سه ایزوفرم داشتند بطور کامل نشان داده شدند. تیمار با بازدارنده دیگر KCN که در آن Cu/Zn-SOD حذف شد برای نشان دادن موقعیت دو دسته دیگر ازجمله نوع Fe-SOD در روی ژل پلی آکریلامید بکار رفت. نوع Fe-SOD در کلروپلاست است و در همه گیاهان یافت نمی‌شود و به فعالیت PSII بستگی دارد (Alsher et al., 1997). در این آزمایش سه ایزوفروم متعلق به Fe-SOD درست در موقعیت Cu/Zn-SOD در نمونه میله مشاهده شد که با بکارگیری KCN  قابل رؤیت شدند. از آنجایی‌که فعالیت PSII در نمونه‌ها کم است، بنابراین نوع SOD کلروپلاستی سهم بسیار کمی را نشان داد. ازاین‌رو بنظر می‌رسد نوع Cu/Zn-SOD بیشتر از دو نوع دیگر در زیوه فعالتر باشد.

کاتالاز: کاتالاز نقش مهمی در دفاع از تنش‌های فیزیولوژیکی ایفا می‌کند. در یاخته‌ها  H2O2بطور طبیعی تولید شده و نسبتاً پایدار و قابل نفوذ از دیواره های سلولی هستند. کاتالاز درغلظت‌های بالای H2O2 به سرعت غیرفعال می‌شود. بررسی الگوی الکتروفورزی نمونه‌ها نشان داد که تمام نمونه‌ها واجد دو ایزوفرم بودند، بجز کلاله که فقط یک ایزوفرم را به نمایش گذاشت. نتایج بررسی اثر اکسین بر سه ژن کاتالاز ذرت (cat1,2,3) نشان می‌دهد هر کدام از ژنها پاسخ های متفاوتی به اکسین در مراحل مختلف نموی می‌دهند. در ذرت سه ایزوفرم کاتالاز توسط سه ژن رمز سازی می‌شوند(Du et al., 2008) . مطالعات نشان داد که H2O2 ممکن است به‌عنوان یک مولکول علامتی در اعمال یاخته دخیل باشد. Keyhani و همکاران (2002) گزارش کردند که بنه زعفران مزروعی در حالت خواب دارای سه ایزوفرم می‌باشد. ایزوفرم منفرد کاتالاز در قطعه کلاله تصور می‌شود به میزان بالای H2O2 حساس باشد. گیاه ice plant (Mesembryanthemum crystallinum) دو ایزوفرم درکالوسهای ریشه‌زا، رویان‌زا و کالوسهای فاقد اندام‌زایی حاصل از این گیاه را نشان داد (Kanazawa et al., 2000).

پراکسیداز: تعدادی از فعالیت‌های فیزیولوژیکی از قبیل چوبی شدن، پاسخهای تنشی، دفاع در برابر بیماری‌زاها و پیری به پراکسیدازهای گیاهی نسبت داده می‌شود. همچنین اتصالات عرضی پروتئین‌های دیواره یاخته‌ای مثل پروتئین  extensinتوسط پراکسیدازها، می‌توانند بر رشد دیواره‌های اسکلتی اثر گذاشته و ساختار آنرا تغییر دهند. ازاین‌رو پراکسیدازها در چندین فرایند فیزیولوژیکی از قبیل طویل شدن و تشکیل ساختار دیواره یاخته‌ای دخیل می‌باشند. تعداد زیادی از پراکسیدازها در گیاهان حاصل بیان ژنهایی هستند که در طی تکوین گیاه و تشکیل اندام‌های نوپدید وارد عمل می‌شوند 2003) (Balen et al.,. از طرفی پراکسیدازهای گایاکولی که جایگاهشان در سیتوسل، واکوئل، آپوپلاست و خارج یاخته گیاهیست می‌توانند در رشد و نمو دخیل باشند (Shigeoka 2002). بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرم‌ها و شدت نوارهای پراکسیدازی در قطعات نشان داد که گلپوش واجد سه ایزوفرم اختصاصی با Rm 53/0، 51/0 و 48/0 علاوه بر 81/0 بود که در سایر قطعات مشاهده نشد ولی شدت ظهور آنها پائین بود. خامه واجد سه ایزوفرم با Rm 81/0- 71/ 0-63/0 بود که بطور ضعیف ظاهر شدند. تخمدان واجد دو نوار با Rm 81/0 و 71/0 بود ولی شدت نوار در 81/0 نسبت به بقیه بیشتر بود. میله و کلاله با داشتن یک نوار با Rm 81/0 مشابه هم بودند ولی شدت ظهور در آنها متفاوت بود. پاسخ نمونه‌ها احتمالاً به ساختار و میزان تمایز یافتگی و رشد آنها بستگی داشت. Lamport (1986) گزارش کرد که پراکسیدازهای کاتالیز کننده اتصالات عرضی، تمایلی به کاتالیز کردن مناطق با رشد بالا را ندارند. بنابراین توسعه یاخته‌ای متأثر از اسیدی بودن بالای محیط است، زیرا اکسین با آزاد سازی پروتون و با ایجاد شرایط اسیدی این اتصالات را مهار می‌کند و از طرفی فقط پراکسیدازهای بازی در تخریب اکسین مؤثرند و نه نوع اسیدی. بنابراین تا زمانیکه یاخته رشد می‌کند امکان ایجاد اتصالات بین تکپارهای اکستانسین وجود ندارد.

پلی فنل اکسیداز: محل زیمایه PPO در پلاستید و گهرمایه فنلی آن اکثراً در واکوئل قرار دارد. از عملکردهای این زیمایه، تشکیل رنگیزه و استفاده از اکسیژن است و واکنش قهوه‌ای شدگی توسط PPO فقط بعد از سست شدن این کده مثل زخمی شدن رخ می‌دهد (Kim et al., 2001). تفکیک قطعات غنچه گلی بناچار در همه نمونه‌های زخم بوجود آمد. از این‌رو همه نمونه‌ها افزایشی را در فعالیت این زیمایه نشان دادند. ترکیبات فنلی گیاهان بر اکسایش IAA اثر داشته و تعدیل توسط PPO بیشتر از POD بوده که می‌تواند نشانه نیاز بالا به سیستم دفاعی باشد. فنل‌های ساده و بیشتر ترکیبات فنلی، حدواسط‌های مشتقات مسیرهای شیکیمیک اسید و فنیل پروپانوئید هستند و کاهش در فعالیت پلی فنل اکسیداز در ابتدای نمو ممکن است دخیل در این فرایند باشد. بررسی الگوی الکتروفورزی این زیمایه 4 ایزوفرم را نشان داد که تعداد آن در نمونه‌ها بر حسب نمونه و مراحل تکوینی از 2 تا 4 ایزوفرم تغییر می‌کند. در حالیکه در بنه زعفران مزروعی وجود سه ایزوزیم PPO بر روی ژل پلی آکریلامید نشان داده شدSaeidian and) Keyhani 2007).  

مالات دهیدروژناژ: سیستم  MDHاطلاعات مفیدی درباره روابط بین اندامها و بافتها درخصوص رشد، متابولیسم و توارث ارائه می‌دهد. نتایج حاصل از آشکار سازی این زیمایه نشان‌دهنده سه ایزوفرم بود که بجز میله که دارای ایزوفرم 3 با Rm 65/0 بود، بقیه دارای دو ایزوفرم با Rmهای 69/0 و 67/0 بودند که با شدتهای مختلف در نمونه‌ها ظاهر شدند. گلپوش و کلاله هیچگونه ایزوفرمی را نشان نداد. از آنجایی‌که برای آشکار سازی از گهرمایه NAD+ استفاده شد، انتظار می‌رود مالات دهیدروژناز وابسته به +NAD وارد عمل شود. در گیاهان عالی مالات دهیدروژناز وابسته به +NAD در سیتوپلاسم، میتوکندری و اندامکها حضور دارند.

مالات دهیدروژناز جزء اکسیدوردوکتاز بوده که باعث ایجاد الکترون و پروتون می‌گردد و بدنبال آن H2O2 تولید می‌شود که یا توسط پاد اکساینده‌ها استفاده شده و یا برای علامت‌دهی بکار گرفته می‌شود (Wang et al., 2005). در مواردی بین ظهور نوارهای این زیمایه و فعالیت CAT در نمونه‌ها انطباقی مشاهده شد که نشان‌دهنده تولید H2O2 در حد تحریک CAT می‌باشد.

استیل استراز: استرازها نشانگرهای بیوشیمیایی مناسبی برای فرایندهای نموی هستند. فعالیت آنها با کاهش سطح سازمان یافتگی بافت افزایش می‌یابد (Balen, 2003). این زیمایه نشانگرهای زیست شیمیایی خیلی مناسبتر از پراکسیدازها برای فرایندهای نموی هستند و تعداد زیادی ایزوفرم‌های بیان شده دارند.Coppens  و Dewitie (1990) از ایزوفرمهای استراز کالوس barley) (Hordeum  vulgare به‌عنوان نشانگر زیست شیمیایی رویان‌زایی و اندام‌زایی استفاده کردند و نتیجه گرفتند که سیستم استراز برای آشکارسازی رویان‌زایی، قبل از اینکه رویانهای بدنی شکل بگیرد، خیلی حساس است و سه دسته ایزوفرم روی ژل پلی آکریلامید را به نمایش می‌گذارد. در مطلعه حاضر 13 ایزوفرم نیز در سه دسته ظاهر شدند که دسته اول دارای چهار ایزوفرم بود که اغلب نمونه‌ها واجد سه ایزوفرم از آن مجموعه بودند. کلاله در دسته اول دو ایزوفرم به‌اضافه یک ایزوفرم با Rm 71/0 را داشت. جداکشتهای گلپوش و میله چهار ایزوفرم در دسته اول داشتند ولی Rmهای دو ایزوفرم متفاوت از بقیه بود که به‌ترتیب 95/0 و 89/0 بودند. در دسته دوم پنج ایزوفرم بود، بغیر از میله و تخمدان که هر پنج ایزوفرم را نشان دادند بقیه بین یک تا سه ایزوفرم متغیر بودند ولی همگی ایزوفرم 2 با Rm 44/0 را بشدت نمایش دادند، بغیر از کلاله که در این دسته نیز متفاوت از بقیه بود. کشت بافت گیاهMammillaria gracillis Pfeiff  در پنج نمونه مختلف 13 ایزوفرم استراز را در سه دسته به نمایش گذاشتند (Balen, 2004). دسته اول 4 ایزوفرم، دسته دوم 4 ایزوفرم و دسته سوم 5 ایزوفرم را واجد بودند. این نتایج قابل مقایسه با نتایج حاضر در قطعات گل نارس در زعفران مزروعی است که 13 ایزوفرم را نشان دادند ولی در دسته دوم بجای 4 از 5 ایزوفرم و در دسته سوم به جای 5 از 4 ایزوفرم برخوردار بود. نتایج بدست‌آمده از پژوهش حاضر نشان داد که قطعه تخمدان > خامه > کلاله > گلپوش و میله به‌ترتیب از توان اندام‌زایی بیشتری برخوردار می‌باشند.

1.Allen, R. D., 1995. Dissection of oxidant stress tolerance using transgenic plants. Plant physiology., 107:1049-1054.
2. Alsher, R. G., Donahue, J. L., Cramer, C. L. 1997. Reactive oxygen species and antioxidants : Relationships in green cells. Physiologia. Plantarum. 100:224-233.
3.Apel, K., and Hirt, H. 2004. Reactive oxygen species: Metabolism, oxidative stress and signal transduction. Annual Review Plant Biology. 55:373-399.
4.Balen, B., Krsnik-Rasol, M., Simeon-Rudolf, V. 2003. Isoenxymes of peroxidase and esterase related to morphogenesis in Mammillaria gracillis Pfeiff. tissue culture. Journal of Plant Physiology. 160:1401-1406.
5.Balen, B., Krsnik-Rasol, M., Zadro, I, Simeon-Rudolf, V. 2004. Esterase activity and Isoenxymes in relation to morphogenesis in Mammillaria gracillis Pfeiff. tissue culture.Acta Botanica Croatica. 63(2), 83-91.
6.Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytica Biochemistry. 72:248-254.
7.Coppens, L., and Dewitte, D., 1990.  Esterase and peroxidase Zymograms from barley (Hordeum vulgare L.) callus as a biochemical marker system of embryogenesis and organogenesis. Plant Science. 67:97-105.
8.Coupe, S, A., Palmer, B. G., Lake, J. A. 2006 Systemic signaling of environmental cues in Arabidopsis leaves. Journal of Experimental Botany. 57(2):329-341.
9.Dewir Y. H., Chakrabarty, D., Ali, M. B., Hall, E. J., Paek, K. Y. 2005. Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities of Euphorbia millii hyperhydric shoots. Environmental and Experimental Botany. 58(1-3):93-21.
10. Du, Y.Y., Wang, P.C., Chen, J., Song, C.P.2008. Comprehensive functional analysis of the catalase gene family in Arabidopsis Thaliana. Journal of Integrative Plant Biology. 50:1318-1326.
11.Gechev, T. S., and Hille, J. 2005. Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death. Journal of Cell Biology. 168:17-20.
12.Ghamsari, L., Keyhani, E., Golkhoo2, S. 2007. Kinetics Properties of Guaiacol Peroxidase Activity in Crocus sativus L. Corm during Rooting. Iranian Biomedical Journal. 11 (3):137-146.
13. Gietl. C. 1992. Malate dehydrogenase isoenzymes: Cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles. Biochimica et Biophysica. Acta 1100:217-234.
14.Hames, B. D., and Rickwood, D. 1990. Gel Electrophoresis of Proteins. A practical Approach. Second Edition. Oxford University press.
15.Kanazawa S., Sano, S. Koshiba, T., and Ushimaru, T. 2000. Changes in antioxidative in cucumber cotyledons during natural senescence: comparison with those during dark-induced senescence. Physiologia. Plantarum. 109:211-216.
16.Katyshev A.I., Rogozin I.B., Konstantinov Yu.M. 2006. Identification of new superoxide Dismutase transcripts in plants by EST analysis: alternative polyadenylation and splicing events.BGRS-Computational structural and functional genomics and transcriptomics
17.Keyhani, J., Keyhani, E., Kamali, J. 2002. Thermal stability of catalases active in dormant saffron (Crocus sativus L.) corms. Molecular Biology. Reports. 29:125-128.
18.Kim, J. Y. Seo, Y. S., Kim. J. E., Sung, S. K., Song, K. J., An, G., Kim, W.T. 2001. Two polyphenol oxidases are differentially expressed during vegetative and reproductive development and in response to wounding in the FuJi apple, Plant Sciences. 161:1145-1152.
19.Lamport, D. T. A. 1986. Roles for peroxidases in cell wall genesis. Plant Physiology. 83:39-43. Martinez, C. A., Loureiro, M. E., Oliva, M. A., Maesrri, M. 2001. Differential responses of superoxide dismutase in freezing resistant Solanum curtilubum and freezing sensitive Solanum tuberosun subjected to oxidative and water stress. Plant Sciences. 160:505-515.
20. Mayer, A. M., Harel, E. 1979. Polyphenol oxidase in plants. Phytochemistry, 18:193-215. 18.
21. Mclnnis, S. M., Emery, D. C., Porter, R. Desikan, R., Hancock, J. T., Hiscock, S. J. 2006. The role of stigma peroxidases in flowering plants: insights from further characterization of a stigma-specific peroxidase (ssp) from Senecio squalidus (Asteraceae). 57(8):1835-1846.
22.Mustafa. N. R. Verpoorte. R. 2007. Phenolic compounds in Catharanthus roseus. Phytochemistry Reviews. 6:243-258.
23.Saeidian, S., and Keyhani, E. 2007. Polyphenol Oxidase Activity during Development of Saffron (Crocus sativus L.) Corm. Acta Horticulture. 739:435-442
24.Scandalios J. G. 1993. Oxygen stress and superoxide dismutase. Plant physiology. 101:7-12.
25. Shigeoka, S., Ishikawa, T., Tamoi, M., Miyagawa, Y., Takeda, T., Yabuta, Y., Yoshimura, K (2002). Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. Jounal of Experimental Botany 53:1305-1319.
26. Tian, L., Gu, Q., Zhu, M. 2003. The involvement of hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus. Plant Sciences. 165:701-707.
27.Van Loon, L. C. 1971. Tobacco polyphenol oxidase, a specific staining method indicating non-identity with peroxidase. Phytochemistry. 10:503-5072.
28.Wang P, Ma G, Liao L, Gao F. 2005. Construction of multienzyme bioactivesystems using a multiscale design approach. China Particuology.3(36):304
29. Wendel, J. F., and Weeden, N. F. 1990. Visualization and interpretation of plant isozymes. Isozymes in plant biology. (Eds De Solits and PS Solits) 5-45.
  • Receive Date: 02 October 2012
  • Revise Date: 20 October 2012
  • Accept Date: 07 December 2012
  • First Publish Date: 20 February 2015