Comparative study of growth and secondary metabolite production ability in transformed hairy roots from Cichorium intybus

Document Type : Research Paper

Abstract

Cichory (Cichorium intybus) roots contain medicinally important compounds such as phenols (mainly cichoric acid), Flavonoids and inulin. Here, we obtained and established 11 different hairy root lines of chichory  by inoculation of plant sterile leaf explants with the soil bacterium Agrobacterium rhizogenes, A4 strain. Phenolic compounds, total flavonoids and carbohydrates were determined by spectrophotometer, and chicoric acid was determined by HPLC. The highest growth rates were observed in A, H, J and I root lines. Total phenol and flavonoid contents had no significant difference between the obtained root lines but cichoric acid in J and then in F lines were more than the other lines. The highest levels of carbohydrates were observed in D, G, J and I root lines. According to the results, The J root line was the best one for growth rate, cichoric acid and carbohydrate production.  

Keywords

مقایسه رشد و توان تولید متابولیتهای ثانویه در دودمانهای ریشه مویی تراریخت حاصل از کاسنی (Cichorium intybus) 

بنت الهدی آذرمهر، فرح کریمی*، مسعود تقی­زاده و سید لطیف موسوی گرگری

تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 21/8/91               تاریخ پذیرش: 3/12/91

چکیده

در این پژوهش با هدف تولید و جداسازی دودمانهای ریشه­مویی بیش تولید کننده ترکیبات ثانویه،  قطعات جداکشت برگ کاسنی با آگروباکتریوم رایزوژنز سویه  A4تلقیح شد. دودمانهای حاصل از نظر رشد، محتوای فنل و فلاونوئید کل، شیکوریک اسید و کربوهیدراتهای محلول مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. سنجش فنل، فلاوونوئید و کربوهیدراتهای محلول به روش اسپکتروفتومتری و سنجش شیکوریک اسید توسط HPLC انجام شد. بیشترین سرعت رشد در دودمانهای A، H، I و J مشاهده شد. دودمانهای به دست آمده از نظر فنل و فلاوونوئید کل تفاوت معنی­داری با یکدیگر نشان ندادند ولی از نظر محتوای شیکوریک اسید دودمان J و پس از آن دودمان F حاوی بیشترین مقدار از این ماده بودند. بیشترین مقادیر کربوهیدرات نیز در دودمانهای D، G، I و J مشاهده شد. با توجه به نتایج حاصل، به نظر می­رسد دودمان J با بیشترین مقادیر رشد و تولید شیکوریک اسید و کربوهیدرات، برترین دودمان حاصل در این پژوهش باشد.

واژه های کلیدی: آگروباکتریوم رایزوژنز، ریشه موئی، کاسنی، متابولیت ثانویه

* نویسنده مسئول، تلفن: 51212227-021، پست الکترونیکی: f[email protected]

مقدمه

 

کاسنی از اعضای خانواده گل­ستاره­ایها (Asteraceae)، گیاهی دو ساله و یکی از گونه­های مهم گیاهان دارویی است. ریشه این گیاه حاوی ترکیبات دارویی شامل پلی­ساکاریدی به نام اینولین (inulin)، سزکوئی­ترپن­لاکتونها، کومارینها، فلاونوئیدها، شیکوریک اسید و ویتامینها است که دارای استفاد­ه­های دارویی مختلفی می­باشند. همچنین از گیاه کاسنی به دلیل ترکیبات آنتی­رادیکال و آنتی­اکسیدان موجود در ریشه برای درمان ایدز (AIDS)، سرطان و دیابت استفاده می­شود (17 و 22). در بسیاری از گیاهان، کشت ریشه موئی (Hairy root culture) روشی مؤثر برای تولید متابولیتهای ثانویه است. این ریشه­ها دارای پایداری ژنتیکی و بیوشیمیایی بوده و علاوه بر رشدی سریع، توانایی سنتز ترکیبات طبیعی در سطوح قابل مقایسه با گیاه مادر نیز از دیگر ویژگیهای این نوع کشت می­باشد (15). تشکیل ریشه­های موئی در گیاهان در واقع حاصل نوعی بیماری گیاهی است که بوسیلۀ آگروباکتریوم رایزوژنز که یک باکتری گرم منفی است ایجاد می­شود. وقتی که باکتری گیاه را آلوده می کند،  T-DNAکه بین قسمتهای TR و   TL در پلاسمید Ri باکتری است به گیاه منتقل شده و در ژنوم هسته­ای گیاه میزبان قرار می­گیرد. به دنبال آن، میزان اکسین سلولی افزایش یافته و در نتیجه ریشه­های مو مانند زیادی تولید می­شود (8).

گونه­های فعال اکسیژن (ROS) مولکولهای کنشگر شیمیایی اکسیژن­داری مانند یونهای اکسیژن و پراکسیدها هستند که نقش مهمی در ایجاد بیماریهای خطرناکی چون سرطان و بیماریهای قلبی- عروقی ایفاء می­کنند و خنثی­سازی اثر آنها توسط آنتی اکسیدانها و سیستمهای جاروب کننده رادیکالها صورت می­گیرد (4). همین طور این رادیکالها از طریق پراکسیداسیون لیپیدها و در نتیجه تخریب غشاء، تخریب پروتئینها، غیرفعال­کردن آنزیمها، از بین بردن رنگیزه­ها و اختلال در عملکرد DNA تنش ثانویه اکسیداتیو ایجاد می­کنند که منجر به خسارات جدی به ساختارهای سلولی و گیاه می­شود (2). فنلها به دلیل ساختار و گره­های هیدروکسیلی که دارند عموماً ترکیباتی با قدرت آنتی­اکسیدانی قوی هستند (5). مطالعات، ارتباطی منفی بین مصرف رژیمهای غذایی سرشار از میوه و سبزی­ و خطر بیماریهای مزمن را در انسان نشان داده­اند. قسمتی از عملکردهای فیزیولوژیکی میوه­ها و سبزیها در رژیم غذایی انسان، مربوط به فراوانی ذخائر پلی­فنلی آنهاست (4). به علاوه پاسخهای دفاعی گیاه منجر به بیوسنتز و تجمع انواع ترکیبات ثانویه گیاهی می­گردد. حمله پاتوژنها یا زخمی شدن گیاه منجر به القاء پاسخهای دفاعی و به دنبال آن بیوسنتز ترکیبات ثانویه همچون فنل و فلاونوئیدها می­گردد (1). شیکوریک اسید که به نام دی­کافئوئیل­تارتاریک­اسید نیز شناخته می­شود به دلیل توانایی در مهار آنزیم HIV integrase و همچنین تحریک ترشح انسولین و جذب گلوکز، مورد مطالعه قرار گرفته است(11). گسترش نگران­­کننده سندروم نقص ایمنی اکتسابی (AIDS)، کشف عوامل درمانی برای جلوگیری از تکثیر ویروس مسبب نقص ایمنی انسانی (HIV-1) را ضروری می­­سازد. درک پیشرفته از چگونگی چرخه سلولی ویروس این امکان را فراهم ساخته که اهداف خاصی به منظور قطع چرخه سلولی ویروس تعریف گردد. یکی از اهداف، آنزیم integrase  ویروسی است که مسئول ورود و ادغام DNA ویروسی با DNA سلول میزبان است. این ورود DNA برای ایجاد آلودگی ویروسی لازم است. بنابراین عواملی که بتوانند از این فرآیند ممانعت به عمل آورند به عنوان عوامل ضد ایدز شناخته می­شوند. شیکوریک اسید یکی از قویترین مهارکننده­های HIV-1 integrase بوده و دارای فعالیت ضدایدزی است (12). اینولین نیز (به عنوان عمده­ترین کربوهیدرات­ محلول موجود در کاسنی) دارای اثرات مفید دارویی از جمله جهت مصرف افراد دیابتی، متابولیسم لیپیدها، دخالت در جذب بیشتر کلسیم و منیزیم و تعیین میزان فیلتراسیون گلومرولی (Glomelural filtration rate) است (19).

با توجه به افزایش جمعیت کره زمین و عدم کفایت وسعت زمینهای کشاورزی برای کشت انواع گیاهان به منظور تامین مواد اولیه دارویی، کشت ریشه­های مویی می­تواند به عنوان یک روش جایگزین به کار رود. به این منظور بهتر است تلقیح قطعات جداکشت با سویه­های آگروباکتریوم رایزوژنز بارها صورت گرفته و دودمانهایی از ریشه مویی با صفات برتر غربال شوند. در این مطالعه، دودمانهای ریشه­ای حاصل از تلقیح قطعات جداکشت کاسنی با A.rhizogenese سویه A4 از نظر سرعت رشد و توان تولید فنل، فلاونوئید، شیکوریک اسید و کربوهیدرات با هم مقایسه شده­اند و بر این اساس بهترین دودمان به دست آمده معرفی شده است. قبلا پژوهشی با هدف مشابه روی کاسنی صورت نگرفته و این اولین گزارش می­باشد.

مواد و روشها

کشت ریشه موئی: قطعات جداکشت برگ از گیاهچه های چهار هفته­ای حاصل از کشت بذر کاسنی در شرایط سترون درون شیشه­ای (in vitro) تهیه شد و  باAgrobacterium rhizogenes  سویه A4 تلقیح گردید. قطعات جدا کشت تلقیح شده در محیط کشت MS فاقد هورمون کشت داده شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای 28 درجه سانتی گراد، قطعات جدا کشت به محیط کشت MS فاقد هورمون حاوی آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم mg L−1250 منتقل و در شرایط تاریکی در دمای اتاق نگهداری شدند. اولین ریشه­ها پس از 15 روز مشاهده شد. هر یک از ریشه­های حاصل که در واقع از یک سلول منشا گرفته بود به عنوان یک دودمان مستقل (root line) بطور جداگانه در محیط کشت نیمMS  مایع، حاوی سفوتاکسیم mg L−1250 کشت داده شد و در شیکر انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی گراد نگهداری شد. ریشه­های موئی هر دو هفته یک بار واکشت و توزین شدند. در نهایت یازده دودمان ریشه­ای، شامل A, B, C, D, E, F, G, H, J, I, K  از نظر سرعت رشد (افزایش وزن نسبت به زمان) و محتوای متابولیتهای ثانویه مورد مقایسه قرار گرفتند.

استخراج ژنوم و آنالیز PCR : استخراج DNA از ریشه­های حاصل از تلقیح با باکتری و ریشه­های غیر ترانسفورم کاسنی بر اساس روش Khan و همکاران (2007) صورت گرفت (14). پلاسمید A.rhizogenes سویه A4 نیز به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. آزمون PCR با استفاده از پرایمر طراحی شده برای ژن rolB بر روی DNA استخراج شده انجام شد (جدول1).

 

جدول 1- آغازگر رفت و برگشت طراحی شده برای تکثیر ژن rolB

5’-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA-3’

Forward

5’-TAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC-3’

Reverse

 

برنامه PCR جهت تکثیر ژن به صورت زیر بود: مرحله اول به مدت 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد جهت باز شدن ابتدایی دو رشته DNA، مرحله دوم  35 سیکل با برنامه؛ 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، 55 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 50 ثانیه و مرحله سوم 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه. به منظور بررسی نتایج، محصول PCR، بر روی ژل آگارز 1 درصد برده شد (23).

تهیه عصاره پلی فنلی و اندازه­گیری فنل و فلاوونوئید کل: برای استخراج پلی­فنلها 2 گرم از بافت ریشه در mL30 اتانول 70 درصد (2/3= pH با فرمیک اسید) به خوبی سائیده و در طول شب خیسانده شد. عصاره به دست آمده برای سنجش فنل و فلاونوئید کل مورد استفاده قرار گرفت. برای سنجش فنل کل، 125میکرولیترعصاره پلی­فنلی، 5/0 میلی­لیتر آب دوبار تقطیر و 125 میکرولیتر معرف فولین- سیاکولتا مخلوط وبعد از گذشت 6 دقیقه 25/1 میلی­لیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد به مخلوط حاصل افزوده شد و در نهایت حجم محلول با آب مقطر به 3 میلی لیتر رسید. محلول به مدت 90 دقیقه در تاریکی نگهداری و سپس جذب آنها در طول موج 760 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد و مقدار فنل کل در هر نمونه با کمک معادله حاصل از منحنی استاندارد گالیک اسید محاسبه شد. برای سنجش فلاونوئید کل 25/0 میلی لیتر عصاره پلی فنلی، 75 میکرولیتر سدیم نیترات 5 درصد، 75 میکرولیتر محلول تازه تهیه شده آلومینیوم کلراید 10 درصد و 5/0 میلی لیتر محلول سدیم هیدروکساید 1مولار با هم مخلوط شد و سرانجام حجم نهایی محلول با استفاده از آب دو بار تقطیر به 5/2 میلی­لیتر رسانده شد. بعد از 5 دقیقه جذب آنها در طول موج 510 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد. سنجش همه نمونه­ها با سه تکرار مستقل انجام شد و مقدار فلاونوئید کل در هر نمونه با کمک معادله حاصل از منحنی استاندارد کوئرستین محاسبه شد (6).

سنجش شیکوریک اسید توسط HPLC : سنجش شیکوریک اسید به روش Llorach و همکاران (2008) انجام شد (13). بدین منظور از دستگاه HPLC (Knauer GmbH, Germany) و ستونی با مشخصات (mm ID4× mm 125 (C18:استفاده شد. سرعت جریان حلال 8/0 میلی لیتر در دقیقه و فاز متحرک شامل آب اسیدی شده با 5/0 درصد فرمیک اسید (حلال A) و متانول (حلال B) بود که بصورت گرادیان برنامه­ریزی شد. برنامه­ گرادیان با 5 درصد حلال B شروع شد و طی 25 دقیقه به 40 درصد حلال B در دقیقه رسید و به مدت 5 دقیقه بصورت ایزوکراتیک ادامه یافت. طول موج دستگاه روی nm 336=λ تنظیم شد. برای هر تزریق از 20 میکرولیتر عصاره پلی­فنلی استفاده شد. محتوای شیکوریک اسید در دودمانهای مختلف ریشه موئی، بر اساس سطح زیر منحنی به دست آمده و با استفاده از منحنی استاندارد رسم شده به وسیله شیکوریک اسید استاندارد (Sigma) محاسبه گردید.

 

 

 

شکل1. نتیجه آزمون PCR برای ژن rolB در دودمانهای ریشه مویی. M: مارکر وزن مولکولی، PC: کنترل مثبت (ژنوم باکتری)، NC: کنترل منفی (ریشه گیاهچه حاصل از کشت بذر کاسنی)، A-K: دودمانهای مختلف ریشه­ موئی

 


سنجش کربوهیدراتها: سنجش قندهای محلول به روش فنل- سولفوریک اسید انجام شد. 1/0 گرم از بافت ریشه در یک میلی­لیتر اتانول 80 درصد به خوبی سائیده و به مدت یک دقیقه با سرعت 7000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. عمل استخراج با همین روش سه بار دیگر تکرار و هر بار مایع رویی به یکدیگر افزوده و کاملاً خشک گردید. باقیمانده حاصل از تبخیر در  آب مقطر نیمه گرم حل شد و به   یک میلی­لیتر از هر نمونه به لوله آزمایش منتقل و 5/0 میلی­لیتر محلول فنل 5 درصد به آنها اضافه و به مدت 1 دقیقه ورتکس شد. از یک میلی­لیتر آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد. سپس 5/2 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ به آرامی به سطح هر لوله اضافه شده تا حرارت لازم برای پیشرفت واکنش را فراهم سازد. بعد از 30 دقیقه جذب هر یک از نمونه­ها در طول موج 485 نانومتر به دست آمد و مقدار کربوهیدرات در هر نمونه با کمک معادله حاصل از منحنی استاندارد غلظتهای معین گلوکز محاسبه شد (21). سنجش همه نمونه­ها با سه تکرار مستقل انجام گرفت.

نتایج

الکتروفورز محصول PCR ژنوم دودمانهای ریشه مویی، تکثیر قطعه­ای به طول bp720  که مؤید حضور ژن rolB بود را نشان داد. این باند تنها در کنترل مثبت (DNA باکتری) و ریشه­های تراریخت مشاهده شد در حالی که  محصول PCR حاصل از ژنوم ریشه­های شاهد فاقد قطعه bp720 بود(شکل 1).

شکل2 مراحل ایجاد ریشه­های موئی روی قطعات جداکشت، انتقال آنها به محیط کشت مایع و رشد و استقرار آنها در محیط مایع را نشان می­دهد. بیشترین رشد در دودمان A مشاهده شد که با دودمانهای E، H، I و J  تفاوت معنی­داری نداشت و کمترین رشد مربوط به دودمانهای B، C و K بود. دودمانA  رشدی برابر 264/0 گرم در روز و دودمانهای B، C و K حدود 1/0 گرم در روز رشد داشتند (شکل 3). بیشترین و کمترین محتوای فنل کل به ترتیب در دودمانهای ریشه­ مویی B و K مشاهده شد (شکل4). دودمانهای A، B و J از نظر محتوای فلاونوئید کل بافت تفاوت معنی­داری را نسبت به هم نشان ندادند و دارای بیشترین مقدار فلاونوئید کل نسبت به سایر دودمانها بودند. دودمان K نیز کمترین مقدار را نسبت به سایرین نشان داد (شکل5).

 

ج              ب         الف

شکل2. القاء و رشد ریشه­های موئی حاصل از تلقیح قطعات جداکشت

برگ کاسنی با آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4. الف) ایجاد اولیه ریشه­ها از محل جراحتهای ایجاد شده بر سطح برگهای تلقیح شده در محیط جامد ب) انتقال ریشه­ها به محیط مایع ج) ازدیاد ریشه­ها بعد از گذشت یک ماه از انتقال به محیط مایع

شکل 3. مقایسه رشد دودمانهای ریشه مویای حاصل از تلقیح قطعات جدا کشت با آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین میانگینها می­باشد (p≤0.05) .

شکل4. محتوای فنل کل بافت در دودمانهای ریشه مویای حاصل از آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4. حروف متفاوت نشان­دهنده تفاوت معنی­دار بین میانگینها می­باشد p≤0.05)).

 

زمان بازداری ترکیب استاندارد شیکوریک اسید تهیه شده از شرکت سیگما با ­استفاده از کروماتوگرام­ HPLC، 5/0 ± 28  به دست آمد (شکل 6). محتوای شیکوریک اسید بافت ریشه در دودمان J بیشترین و در دودمان K کمترین مقدار را نسبت به سایر دودمانها داشت (شکل7).

شکل 5. محتوای فلاونوئید کل بافت در دودمانهای ریشه مویی حاصل از سویه A4. حروف متفاوت نشان­دهنده تفاوت معنی­دار بین میانگینها می­باشد p≤0.05)).

محتوای کربوهیدرات بافت ریشه در دودمانهای G، I و J نسبت به دودمانهای A، B، C، E و F به طور  معنی­داری بیشتر بود (شکل8).

 

 

شکل7. محتوای شیکوریک اسید بافت در دودمانهای ریشه مویی حاصل از آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4. حروف متفاوت نشان­دهنده تفاوت معنی­دار بین میانگینها می­باشد p≤0.05)).

بحث و نتیجه­گیری

ریشه موئی  که در اثر آلودگی گیاه با باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز ایجاد می­شود، سرعت رشد بالا و پایداری ژنتیکی زیادی دارد. همین طور به عنوان منبعی برای تولید متابولیتهای ثانویه در مقادیری قابل مقایسه با بیوسنتز این ترکیبات در ریشه گیاهان به شمار می­رود (8).

 

 

 

Minutes

 

 

شکل6. کروماتوگرام HPLC شیکوریک اسید (RT=28 ± 0.5). سمت چپ کروماتوگرام استاندارد و سمت راست کروماتوگرام عصاره فنلی یکی از نمونه­های ریشه مویی را نشان می­دهد.

 

 

 

شکل8. محتوای کربوهیدراتهای محلول بافت در دودمانهای ریشه ­مویی حاصل از آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4. حروف متفاوت نشان­دهنده تفاوت معنی­دار بین میانگینها می­باشد p≤0.05)).

باتوجه به عدم قطعیت در تعداد کپی و مکان ورود T-DNA به ژنوم گیاه میزبان و همچنین برهمکنش آنها با ژنهای اطراف، ریشه­های موئی ایجاد شده اغلب الگوهای متفاوتی از تجمع متابولیتهای ثانویه را نشان می­دهند. در سال 1989  Mano و همکاران چهل و پنج دودمان ریشه­ای به دست آمده از تلقیح گیاه Duboisia leichhardtii را بررسی و تفاوتهای قابل ملاحظه­ای را از نظر میزان رشد و مقدار آلکالوئید­ها در دودمانهای مختلف مشاهده کردند (18). در سال 1994 Hook از تلقیح آگروباکتریوم رایزوژنز سویه 9402 در گیاه   .Leontopodium alpinum Cass پنج دودمان ریشه­ای متفاوت را به دست آورد و آنها را از نظر میزان رشد و اسانسهای روغنی با هم مقایسه نمود. دودمانهای انتخاب شده از نظر فاکتورهای بررسی شده تفاوت معنی­داری را با هم نشان دادند. او علت تفاوت بین مقادیر پایین متابولیتهای اندازه­گیری شده در بعضی دودمانها نسبت به محتوای بالای این متابولیتها در سایر دودمانهای به دست آمده را ترانسفورماسیون ضعیف بیان کرد (7). در این پژوهش نیز یازده دودمان ریشه­ مویی به دست آمد که از نظر سرعت رشد و مقادیر متابولیتهای مورد بررسی تفاوتهای معنی­داری را با هم نشان دادند که ناشی از تصادفی بودن جایگیری T-DNA در ژنوم گیاه میزبان و همین طور تعداد کپی انتقال یافته و برهمکنش آنها با ژنهای اطراف آن است. انتقال ترکیب مناسبی از ژنهای rol از باکتری به گیاه برای تشکیل ریشه­های موئی لازم است و انتقال تنها یکی از این ژنها نمی­تواند همه ویژگیهای سندرم ریشه موئی را نشان دهد (20). از مهم ترین دلایل اهمیت­ فلاونوئیدها و فنلهای اسیدی، عملکرد آنها در مکانیسمهای دفاعی می­باشد. شرایط تنشی همچون اشعه UV، جراحت و آلودگی میکروبی سبب افزایش بیوسنتز ترکیبات فنلی می­شود. بنابراین فاکتورهای محیطی تاثیر به سزایی در محتوای فلاونوئیدها و فنلهای اسیدی دارند. مشاهده شده که تجمع فلاوانولهایی همچون کامپفرول و مشتقات گلیکوزیدی آن با جراحتی در روزنه افزایش می­یابد. این فلاونوئیدها کمک به سزایی در جلوگیری از عفونتهای میکروبی می­کنند. در بین ترکیبات فنلی هیدروکسی کومارینها، هیدروکسی سینامیک اسید و فلاونولها بیشترین نقش دفاعی را در جراحتها دارند. همچنین بیان آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز (PAL) نیز در اثر زخم و جراحت افزایش یافته و منجر به سنتز محصولات فنلی بیشتری می­شود. از آنجا که استفاده از آگروباکتریوم به منظور تلقیح و ایجاد ریشه موئی خود می­تواند به عنوان نوعی عامل پاتوژن برای گیاه عمل کند، به نظر می­رسد که گیاه با به کارگیری سیستم دفاعی خود اقدام به مقابله با باکتری می­کند و در پی آن مقادیر فنل و فلاونوئید تولید شده بالا می­رود (3 و 24). با توجه به دانستن اینکه شش اپرون در سمت چپ ناحیهT-DNA   وجود دارد (ژنهای Vir) که عملکرد آنها برای انتقال ژنوم باکتری به ژنوم گیاه الزامی است. نواحی VirA و Vir G با هم پروتئینی را رمزگذاری می­کنند که رونویسی از سایر ژنهای Vir را فعال نموده و به دنبال آن انتقال ژن صورت می­گیرد. عوامل فعال کننده ناحیه VirA شامل pH اسیدی، ترکیبات فنلی مانند استوسیرینگون (Asetosringon) (24) و گروههای مشخصی از منوساکاریدها می­باشند. این مونوساکاریدها با ترکیبات فنلی به صورت سینرژیک (تشدید کننده) عمل می­کنند (3). بنابراین احتمال می­رود ازدیاد تولید ترکیبات فنلی توسط گیاه که به منظور دفاع در مقابل عامل پاتوژن صورت می­گیرد خود به عنوان عاملی برای تلقیح بهتر عمل کند و از آنجا که ریشه موئی ایجاد شده دارای پایداری ژنتیکی است تولید مداوم ترکیبات فنلی را در بر خواهد داشت. در این مطالعه مشاهده شد که دودمانهای مختلف ریشه موئی مقادیر متفاوتی از فنل و فلاونوئید تولید نمودند که می­تواند ناشی از تفاوت در مکان جایگیری T-DNA در ژنوم سلول تراریخت منشاء هر یک از دودمانها باشد. در مطالعه­­ای که در سال 2009 توسط Heimler و همکاران انجام شد مقادیر تعدادی از فنلها و فلاونوئیدهای موجود در عصاره ­فنلی گیاه کاسنی بررسی شد و آنها طبق نتایج به دست آمده، شیکوریک­ اسید را به عنوان فنل شاخص کاسنی معرفی کردند (6).  بررسیهای Lee در سال 2010 نشان داد که در دو تیره Asteraceae و Lamiaceae، شیکوریک­اسید از عمده­ترین مشتقات کافئیک اسید می­باشد (9). در مطالعه انجام شده توسط Lee و همکاران مقدار فنل کل و شیکوریک اسید در برگ و ساقه­ دو واریته ریحان (Ocimum basilicum) شامل Sweet basil و Thai basil سنجیده شد. مقدار فنل کل در Sweet basil 23/5  میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ و 44/2 میلی­گرم بر گرم وزن تر ساقه و در Thai basil 05/6 میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ و 31/2 میلی­گرم بر گرم وزن تر ساقه بود. محتوای شیکوریک اسید نیز در Sweet basil و Thai basil به ترتیب 518/0 و 885/0 میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ و 003/0 میلی­گرم بر گرم وزن تر ساقه در نمونه Thai basil بود. ساقه sweet basil فاقد شیکوریک اسید بود (10). طبق نتایج حاصل از پژوهش حاضر، مقدار فنل کل در دودمانهای مختلف بین 241/1 تا 608/3 میلی­گرم بر گرم وزن تر (54/20 و 82/50 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) و محتوای شیکوریک اسید بین054/0 تا 18/3 میلی­گرم بر گرم وزن تر (705/0 و 52/41 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) متغیر بود. نسبت شیکوریک اسید به فنل کل در مطالعه­ی Lee و همکاران در برگ Sweet basil و Thai basil به ترتیب 01/0 و 15/0 و در ساقه صفر و 001/0 می­باشد و در مقایسه با مقدار به دست آمده در این پژوهش که بیشترین وکمترین مقدار آن به ترتیب 71/1 و 015/0 می­باشد، کمتر است. به عبارت دیگر دودمانهای ریشه مویی کاسنی در این پژوهش، حاوی مقادیر زیادتری از شیکوریک اسید نسبت به کل فنل تولید شده در  ریشه­های موئی این گیاه در مقایسه با همین تناسب در Ocimu basilicum می باشند (10).

شیکوریک اسید در واقع نوعی هیدروکسی سینامیک اسید و از مشتقات آن محسوب می شود، از آنجا که سنتز این نوع فنل در پاسخ به آلودگیها و جراحتها بیش از سایر فنلها صورت می­گیرد، در پاسخ به پاتوژن آگروباکتریوم رایزوژنز و جراحت ایجاد شده در روش تلقیح، وجود مقادیر قابل توجهی از شیکوریک اسید قابل انتظار است. فلاونوئیدها (به خصوص فلاونولها) نیز نقش به سزایی در پاسخ به جراحات­ میکروبی دارند. آلودگی با آگروباکتریوم به روشی که در این پژوهش انجام شد شاخص یک جراحت میکروبی است و بنابراین تمایل بیشتر مسیر بیوسنتزی به سمت تولید بیشتر فلاوونوئیدها نسبت به فنلها می­تواند ناشی از نوع پاسخ دفاعی به این نوع جراحات باشد.

اینولین از دسته کربوهیدراتهای محلولی است که به فراوانی در ریشه گیاه کاسنی دیده می­شود. از این­رو سنجش کل کربوهیدراتهای محلول در آب می­تواند به عنوان نماینده­ای از مقدار اینولین در بافت باشد. به همین منظور دودمانهای ریشه مویی به دست آمده در این پژوهش از نظر مقدار کربوهیدراتهای محلول مورد مقایسه قرار گرفتند. در تحقیقی که در سال 2007 توسط Kumari و همکاران انجام شد مقدار اینولین در بافتهای مختلف (ریشه و برگ در شرایط in vitro و in vivo و کالوس) گیاه کاسنی اندازه­گیری شد. بیشترین مقدار تقریباً برابر با 100 میلی­گرم بر گرم وزن خشک در ریشه در شرایط in vitro گزارش شد (16). دراین تحقیق دودمانهای مختلفی به­دست آمد که مقادیر بالایی از کربوهیدرات­ را نسبت به گزارشهای آمده در منابع داشتند. احتمالاً نوع ترانسفورماسیون این ریشه­ها به گونه­ای بوده که باعث بیان بالا و افزایش عملکرد آنزیمهای دخیل در متابولیسم کربوهیدراتها و در نهایت افزایش تولید آنها شده است. از آنجا که دودمانهای به دست آمده ریشه موئی دارای ثبات ژنتیکی می­باشند با کنترل و ثابت نگه داشتن عوامل محیطی دیگر و واکشت مداوم ریشه­ها در دراز مدت و یا با انتقال ریشه­ها به بیوراکتور می­توان تولید کربوهیدرات و سایر متابولیتها را در حد تولید تجاری آنها گسترش داد.


1. شبانی لیلا، احسانپور علی­اکبر (1388) القاء آنزیمهای آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولیک و فلاونوئید در کشت در شیشه شیرین بیان(L. Glycyrrhiza glabra) با استفاده از متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید، مجله زیست­شناسی ایران، جلد22، شماره4، ص: 691-703
2. نصیبی فاطمه، منوچهری کلانتری خسرو، یعقوبی محمد مهدی (1390) مقایسه اثر پیش تیمار سدیم نیترو پروساید و آرژینین بر برخی پاسخهای فیزیولوژیکی گیاه تحت تنش کم­آبی  (Lycopersicun esculentum) گوجه فرنگی، مجله زیست­ شناسی ایران، جلد24، شماره6، ص: 833-847
 
3. Ankenbauer, R. G. and  Nester, E. W. (1990) Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificityand activities of monosaccharides. Journal of bacteriology 172: 6442-6446.
4. Conforti, F., Sosa, S,  Marrelli, M., Menichini, F., Statti, G. A., Uzunov, D., Tubaro, A and Menichini, F. (2009) The protective ability of Mediterranean dietary plants against the oxidative damage: The role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol, flavonoid and sterol contents. Food Chemistry 112:587–594.
5. Degl’innoocenti, E., Pardossi, A., Tattini, M and Guidi L. (2008) Phenolic compounds and antioxidant power in minimally processed salad. Journal of Food Biochemistry 32:642–653.
6. Heimler, D., Isolani, L., Vignolini P and Romani A. (2009) Polyphenol content and antiradical activity of Cichorium intybus L. from biodynamic and conventional farming. Food Chemistry 114: 765–770.
7. Hook, I. (1994). Secondary metabolites in hairy root cultures of Leontopodium alpinum Cass.(Edelweiss). Plant cell, tissue and organ culture 38: 321-326.
8. Hu, Z. B. and Du, M. (2006) Hairy root and its application in plant genetic engineering. Journal of Integrative Plant Biology 48: 121-127.
9. Lee, J. (2010) Caffeic acid derivatives in dried Lamiaceae and Echinacea purpurea products. Journal of Functional Foods 2: 158-162.
10. Lee, J. and C. F. Scagel. (2009) Chicoric acid found in basil (Ocimum basilicum L.) leaves, Food Chemistry 115: 650-656.
11. Lee, J. and C. F. Scagel. (2010) Chicoric acid levels in commercial basil (Ocimum basilicum) and Echinacea purpurea products, Journal of functional foods 2: 77-84.
12. Lee, S. U., Shin C. G., Lee, C. K and Lee, Y. S. (2007) Caffeoylglycolic and caffeoylamino acid derivatives,       halfmers of L-chicoric acid, as new HIV-1 integrase inhibitor, European journal of medicinal chemistry 42: 1309-1315.
13. Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomas-Barberan, F., Gil, M and Ferreres F. (2008) Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole, Food Chemistry 108: 1028-1038.
14. Khan, S., Qureshi, M. I., Kamaluddin., Alam, T and Abdin, M. Z. (2007) Protocol for isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable for RAPD andrestriction digestion. Afr. J. Biotechnol 6: 175-178.
15. Kim, J. S., Lee, S.Y. and Park, S.U. (2009) An efficient protocol for Peanut (Arachis hypogaea L.) transformation mediated by Agrobacterium rhizogenes. Romanian Biotechnological Letters 14: 4641-464.
16. Kumari, B. D. R., Velayutham, P and Anitha, S. (2007) A comparitive study on inulin and esculin content of in vitro and in vivo Plants of Chicory (Cichorium intybus L. Cv. Lucknow Local). Advances in Biological Research 1: 22-25.
17. Malarz, J., Stojakowska, A. and Kisiel, W. (2002) Sesquiterpene lactones in a hairy root culture of Cichorium intybus.Verlag der Zeitschrift fur Naturforschung, Tubingen 57c, 994-997.
18. Mano, Y., Ohkawa, H. Yamada, Y. (1989) Production of tropane alkaloids by hairy root cultures of Duboisia leichhardtii transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Science 59: 191-201.
19. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S., Lee, Y. C. (2005) Carbohydrate analysis by a phenol–sulfuric acid method in microplate format. Analytical biochemistry, Volume 339(1):69-72.
20. Park, K., de Oliveira, R., and Brod, F. (2007) Drying Operational Parameters Influence on Chicory Roots Drying and Inulin Extraction. Food and Bioproducts Processing 85: 184-192.
21. Schmülling, T., Schell, J and Spena ,A. (1988) Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development. The EMBO journal 7: 2621-2629.
22. Velayutham, P., Ranjithakumari, B. D. and Baskaran, P. (2006) An efficient in vitro plant regeneration system for  Cichorium intybus L., an important medicinal plant. Journal of Agricultural Technology 2: 287-298.
23. Wang, B., Zhang, G., Zhu, L., Chen, L., Zhang, Y. (2006) Genetic transformation of Echinacea purpurea with Agrobacterium rhizogenes and bioactive ingredient analysis in transformed cultures, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 53: 101-104.
24. Winans, S. C. (1992) Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews 56: 12-31.
 
 
  • Receive Date: 11 November 2012
  • Revise Date: 22 January 2013
  • Accept Date: 21 February 2013
  • First Publish Date: 20 February 2014