بهینه سازی اندام زایی مستقیم در بنفشه آفریقایی (Saintpaulia ionantha) با استفاده از روش سطح پاسخ

ماریا میثاقی^۱ ، فتانه یاری^۲*، امیر موسوی^۳، یونس مستوفی^۴ و حمیده افقی^۵

^۱ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، گروه علوم باغبانی و زراعی

² ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده کشاورزی، گروه تولیدات گیاهی و کشاورزی پایدار

^۳ ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه زیست فناوری مولکولی گیاهی

^۴ ایران، کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی

⁵ ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده زیست فناوری، گروه زیست‌فناوری پزشکی و صنایع دارویی

تاریخ دریافت: 27/08/1400          تاریخ پذیرش: 10/01/1401

چکیده

بنفشه آفریقایی یکی از گیاهان تجاری مهم با تنوعی بی­نظیر در رنگ و شکل بوده که سبب محبوبیت این گیاه شده است. مهندسی ژنتیک می­تواند یکی از تکنیک­های پرکاربرد برای اصلاح گیاهان باشد. اگرچه این تکنیک خود مبتنی بر کشت بافت برای به ثمر نشاندن ایده­های نو در ایجاد ارقام جدید است و بهینه سازی اندام­زایی مستقیم به منظور پایه گذاری اصلاح گل بسیار حائزه اهمیت است. به همین منظور بهینه سازی اندام­زایی از بافت­های برگ و دمبرگ دو رقم مختلف بنفشه آفریقایی به نام­هایLittle Maya, Grinia بااستفاده از روش سطح پاسخ مورد بررسی قرارگرفت. هدف پژوهش حاضر اثر محیط کشت پایه حاوی مقادیر مختلف تنظیم کننده های رشد شاملTDZ،BA  وIAA  بر القاء اندام­زایی مستقیم بود. تیمارهای اعمال شده در هر دو رقم، منجر به القای اندام­زایی مستقیم در ریزنمونه­های برگ و دمبرگ شدند. ریزنمونه برگ نسبت به دمبرگ پتانسیل اندام زایی بیشتری نشان داد اما پتانسیل اندام­زایی مستقیم رقم ­ها در ریزنمونه­های مشابه باهم با یکدیگر تفاوت چشمگیری نداشت. اگرچه مدل بهینه شده توسط نرم افزار و نتیجه تکرار آزمایشگاهی این مدل، بیانگر این است که ریزنمونه برگ رقم Little Maya بیشترین پتانسیل اندام­زایی مستقیم را دارد و در این راستا محیط حاوی BA 0.05 mg/l+ TDZ 0.01 mg/l +IAA 1 mg/l در القای اندام­زایی مستقیم در هر دو رقم موفق عمل نموده است. لذا باتوجه به مدل بدست آمده، به نظر می­رسد میزان اندام­زایی مستقیم ماحصل تعامل بین نوع هورمون­های بکار رفته و نوع ریزنمونه بوده که می­تواند همبستگی مستقیم با ژنوتیپ نیز نشان­دهد.

واژه های کلیدی: بنفشه آفریقایی، القای اندام­زایی، کالوس، هورمون های گیاهی

* نویسنده مسئول، تلفن: ۰۹۱۲۰۸۲۵۲۶۰ ، پست الکترونیکی: Fataneh.yari@gmail.com

مقدمه

Saintpaulia در سراسر جهان به عنوان بنفشه آفریقایی شناخته شده و یک گیاه تجاری- زینتی با ارقام متنوعی از رنگ و شکل است. ویژگی هایی که آن را به عنوان یک گیاه آپارتمانی محبوب ساخته، میزان تحمل آن به سایه، رنگ بندی متنوع و همیشه گلدار بودن این گیاه در اغلب فصل­های سال است (۱۱). تکنیک های ریز ازدیادی برای تولید انبوه گیاهان جدید، خصوصاً انواع ابلق یا اصلاح شده در یک دوره نسبتاً کوتاه پرکاربرد بوده است (۲۹). از دیگر سو، روش­های درون شیشه­ای به طور گسترده ای برای القای تغییرات و معرفی ارقام جدید دارای ارزش تجاری مورد استفاده بوده و ترکیب این تکنیک­ها با شیوه­های مهندسی ژنتیک توانسته دریچه جدیدی دراین زمینه بر روی صنعت گلکاری باز نماید (۱۹). گزارشاتی بیان داشتند که بنفشه آفریقایی ظرفیت بالایی برای اندام­زایی از طریق باززایی یا رویان­زایی در شرایط درون شیشه­ای با استفاده از ریز نمونه های مختلفی ازجمله برگ (۲۷)، جوانه گل (۲۰)، اپیدرم (۲)، پرچم (۳۲) و پروتوپلاست (۱۳) دارد. اندام زایی در کشت بافت مستلزم تشکیل اندام­های نابجا از ناحیه تقسیم سلولی فعال است و اندام­های نابجا مستقیماً از بافت اصلی (اندام زایی مستقیم) یا به طور غیرمستقیم از طریق کالوس (اندام زایی غیرمستقیم) ایجاد می­شوند. این در حالیست که جدا بر نوع ریزنمونه، موقعیت فیزیولوژیک گیاه مادری، دهنده ریزنمونه و تعامل و مقادیر هورمون­های به کار رفته در محیط کشت در میزان اندام­زایی و موفقیت در این امر بسیار کلیدی اعلام شده است (6، ۲۷و 31). گزارش شده که دمبرگ بنفشه آفریقایی فاقد خصیصه اندام­زایی در شرایط درون شیشه ای می باشد (۱۶). این در حالی است که در گزارش دیگری ذکر شده است که دمبرگ دارای امکان اندام­زایی بیشتری نسبت به دیگر بخش­های برگ است و در نتیجه پتانسیل بالایی برای ریز ازدیادی بنفشه آفریقایی دارد (۳ ،۲۹ و۳۰). بررسی های انجام گرفته بر روی مواد مختلف تنظیم کننده رشد مصنوعی در شرایط کشت درون شیشه­ای مشخص کرده که سیتوکنین­ها جزو مهمترین تنظیم کننده­های رشد برای باززائی محسوب می شوند. در بین آنها بنزیل­آمینوپورین (BAP) مؤثرترین و پرکاربردترین سیتوکنین مورد استفاده بوده است (۲۱و ۳۱)، اگرچه TDZ، از دسته فنیل اوره­ها، در بسیاری از کشت­های گیاهان زینتی به عنوان ماده القاء کننده اندام­زایی مورد استفاده قرارگرفته است. این در حالیست که گزارش شده، کاربرد آن در القاء رویان­زایی در بیشتر ارقام سبب ایجاد جهش­های سوماکلونال زیادی گردیده است. اولین گزارش کاربرد آن در بنفشه آفریقایی متعلق به سال ۲۰۰۲ میلادی می­باشد که در مقادیر کمتر از ۵/۲ میکرومول بر لیتر منجر به اندام­زایی و در مقادیر بالاتر رویان­زایی شده است (۱۹). بیشتر گزارشات حاکی از اثر بهینه TDZ در باززایی شاخساره نسبت به BA می باشد (۲۹). روش‌شناسی سطح پاسخ (RSM) مجموعه‌ای از تکنیک‌های ریاضی و آماری مفید برای مدل‌سازی و تحلیل یک فرایند است که در آن یک پاسخ مورد نظر تحت تأثیر چندین عامل مستقل قرار می‌گیرد (۲۳). هدف طرح های سطح پاسخ ، بهینه سازی پاسخ (متغیر خروجی) متأثر از چندین متغیر مستقل (متغیرهای ورودی) برای ساخت مدل های تجربی است. در طراحی آزمایش ها، هدف، شناسایی و تحلیل متغیرهای مؤثر بر خروجی­ها با کمترین تعداد آزمایش است (۲۳و۲۵). در بسیاری از پدیده‌های فیزیولوژیک به دلیل تعداد زیاد عوامل کنترل‌کننده، ناشناخته بودن مکانیسم یا پیچیدگی محاسباتی، امکان ارایه یک مدل ریاضی ساده مقدور نبوده و در چنین مواردی استفاده از روش‌های تجربی مدلسازی کارساز است، که روش سطح پاسخ به عنوان یکی از روش‌های مدل‌سازی تجربی کارآمد مطرح است (۱۰و ۲۳). که در سال ۱۹۷۱ از این روش برای بهینه سازی محیط کشت بافت استفاده شد (۲۲) و در مورد ریزازدیادی، بینش مطلوبی از برهمکنش بسیاری از عوامل موثر بر رشد و اندام­زایی در شرایط آزمایشگاهی ایجاد کرده و تاکنون مطالعاتی در مورد بهینه‌سازی باززایی شاخساره یا گیاه در برخی از گیاهان با استفاده از RSM انجام شده است (۱، ۸، ۱۰، ۱۴و ۲۴). بررسی های انجام شده با استفاده از روش سطح پاسخ مشخص نموده است که هر دو عامل تغذیه ای (۲۵و ۲۸) و هورمون (۵، ۸، ۱۲و ۲۶) نقش مهمی در رشد و نمو گیاهان در شرایط کشت درون شیشه­ای در آزمایشگاه ایفا کرده و مدل بهینه شده توسط این روش مقادیر تأثیرگذار هریک از عوامل را روی پاسخ مورد بررسی شبیه سازی نموده و به صورت یک مدل ارائه نموده است. سطح ساکارز (۵) و همچنین ماهیت، غلظت و نسبت اکسین ها و سیتوکینین های مختلف درون زا و برون زا (۱۲، ۲۴، ۲۵، ۲۷ و ۲۹) در هر کدام از بررسی ها توانسته اند یکی ازعوامل اصلی تأثیر گذار بر فرایند رشد و اندام­زایی قلمداد شوند. باتوجه به اهمیت اندام­زایی مستقیم، لزوم کاهش تغییرات ناخواسته سوماکلونال و معرفی پروتوکلی مطلوب به عنوان زیرساخت مهندسی ژنتیک در این گونه گیاهی و از دیگر سو قیمت بسیار بالای ماده TDZ در مقایسه با بنزیل آدنین و اهمیت کاهش هزینه­های تولید در عرصه صنعت گلکاری، تعیین حداقل میزان لازم TDZ به منظور بررسی تکمیلی و بهینه سازی اندام­زایی در ارقام بنفشه آفریقایی با استفاده از ریزنمونه های مختلف از بخش­های مختلف برگ در تعامل با غلظت های مختلف TDZ  با سایر مواد مختلف تنظیم کننده رشد با لحاظ تأثیر ژنوتیپ، هدف اصلی این تحقیق بوده است، امید است که برای استفاده در پژوهش­های اصلاحی- ژنتیکی آتی، راهگشا باشد.

مواد و روشها

استقرار ریزنمونه در محیط کشت: در ابتدا برگ و دمبرگ های سالم و جوان هر دو رقم Little Maya, Grinia با آب جاری به مدت ۲۰ دقیقه شسته شدند و در ادامه با محلول سفید کننده تجاری ۳۰ درصد به مدت ۱۰ دقیقه ضدعفونی گردیده و سپس ۳ بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. در ادامه اطراف برگ بریده و حذف شد تا در نهایت برگی به اندازه ۵/۱ سانتی مترمربع به عنوان ریز نمونه در نظر گرفته شد و پهنک برگ در سطح محیط کشت استقرار داده شد. در مورد ریز نمونه های دمبرگ نیز همین مراحل انجام شد با این تفاوت که دمبرگ­ها داخل محیط کشت به صورت مورب قرار داده شدند. جهت استقرار در شرایط درون شیشه­ای از محیط کشت پایه­ی MS به همراه ۳۰ گرم در لیتر ساکارز، ۶/۵ گرم در لیتر آگار، ۲ میلی گرم در لیتر اسید ایندول استیک و ۸/۰ میلی گرم در لیتر بنزیل آدنین استفاده گردید.

پرآوری ریزنمونه های کشت بافتی: دراین مرحله، برگ و دمبرگ گیاهچه­های درون شیشه ای در مرحله استقرار به عنوان ریز نمونه در محیط کشت جدید استفاده شدند. به طوریکه محیط کشت پایه، مشابه مرحله اول در نظر گرفته شد و برای پرآوری از مقادیر بهینه شده از جمله mg/l ۳ هورمون IAA  و mg/l ۱۲/۰BA  و mg/l ۱/۰  Thiamine –Hclاستفاده شد (9).  

بهینه سازی اندام زایی مستقیم و تجزیه و تحلیل داده ها: به منظور بهینه سازی اندام زایی مستقیم، از ریزنمونه برگ یا دمبرگ گیاهچه های درون شیشه ای مرحله پرآوری، مطابق طراحی نرم افزار Design Expert نسخه ۱۱ استفاده گردید. روش سطح پاسخ (RSM) مجموعه ای از تکنیک های آماری است که در بهینه سازی فرایندهایی به کار می رود که پاسخ موردنظر توسط تعدادی از متغیرها تحت تأثیر قرار می گیرد. با کمک این طرح آماری، تعداد آزمایش ها کاهش یافته و کلیه ضرایب مدل رگرسیون درجه دوم و اثر متقابل فاکتورها، قابل برآورد هستند . مهم ترین مسأله این تحقیق بررسی آثار اصلی و متقابل فاکتور­ها بود، از این رو طرح آماری سطح پاسخ انتخاب شد جهت مدل­سازی و شبیه سازی فرایند باززایی مستقیم انتخاب شد (۷و۲۲). طرح سطح پاسخ با نقاط مرکزی در هر وجه و ۳ نقطه مرکزی دارای ماژول های مختلف ارزیابی است (۲۳). دراین تحقیق برای بررسی و رسیدن به معادله ریاضی، ماژول‌ نرم افزاری Historical Data Design انتخاب شد، که کاربرد اصلی این ماژول مدل­سازی براساس انجام آزمایش­های تجربی اجرا شده و داده‌های ثبت شده حقیقی می­باشد. تأثیر چهار متغیر مستقل (هورمون­های به کار رفته در محیط کشت) هرکدام در سه یا دو سطح (مقادیر به میلیگرم بر لیتر) شامل: (۰۲/۰ و ۰۱/۰، ۰) TDZ، (۱/۰ و۰۷۵/۰ ،۰۵/۰) BA، (۲و۱) IAA  و نوع رقم (در دو سطح)، بر متغییرهای وابسته کمی از جمله، درصد باززایی مستقیم ریزنمونه برگ و دمبرگ مورد بررسی قرارگرفت. که به واقع هردو متغییرهای کمی مذکور به عنوان پاسخ این آزمایش در نظر گرفته شدند. تعداد ۲۴ آزمایش براساس طرح روش سطح پاسخ اجرا گردید. ماژول‌ نرم­افزاری Historical Data Design فاقد نقطه مرکزی بوده و عدم برازش بوده لذا از سایر فاکتورها اعم از R²، Adjusted R²،Predicted R²  ، Adequate precision و CV برای تایید صحت مدل استفاده می­شود.

جدول ۱- متغیرهای مستقل و سطوح مورد استفاده از آنها در طرح سطح پاسخ

رابطه بین متغیرهای مستقل کد شده و مقادیر حقیقی آنها در معادله ۱ آمده است.

Xi = (Xi- X₀)/ ΔXi  معادله 1:

که دراین معادله، Xi  مقدار کد شده، Xi مقدار حقیقی،  X0مقدار حقیقی همان متغیر در نقطه مرکزی و XiΔ :تغییر گام در مقدار متغیر است، داده­های حاصل از آزمایش­ها با معادله ۲که معادله برازش چندجمله­ای درجه ۲ است، مطابقت داده­شده است.

معادله ۲:

Y= β₀ + Σ β_i X_i + Σ β_ii Xi² + Σ β_ij X_iX_j

دراین معادله Y : پاسخ پیش بینی شده،  β0: عرض از مبدأ،  βi: ضریب خطی،  βii : ضریب درجه دو،: βij  ضریب برهمکنش تعاملی و : XiXj متغیرهای غیرمستقل هستند. همچنین به منظور ارزیابی صحت برازش و دقت پیشبینی مدل ارائه شده با روش پاسخ سطح، از دو پارامتر آماری: ضریب تعیین ((R²) Determination Coefficient) و ضریب تعیین اصلاح شده (Adjusted Determination Coefficient)،Predicted R² ، Adequate precision و CV استفاده شد. مطابق الگوی تعریف شده توسط نرم­افزار کلیه تیمارها اعمال شد و pH تمامی محیط های کشت روی۷/۵ تنظیم و به مدت ۲۰ دقیقه در فشار psi۱۵ اتوکلاو شدند. ظروف پس از کشت در دمای ۲۵ ۲ درجه سلسیوس و ۱۵۰۰ لوکس نور به مدت ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. در ادامه میزان باززایی مستقیم ریزنمونه­ها هر ۳ هفته یکبار یادداشت برداری شدند و توسط نرم افزار تجزیه و تحلیل شدند. همچنین کلیه آزمونهای آماری در سطح معنی ۰۵/۰ P≤ یا همان احتمال ۹۵ درصد انجام شد. آخرین مرحله این مدل آماری، شامل ارائه گرافیکی رابطه­ی مدل و تعیین میزان هورمون­های رشد بهینه بود که به وسیله­ی نمودار رویه پاسخ و کنتور  (Contour) انجام پذیرفت و به ترتیب اهمیت میزان پاسخ های مهم در این برایند مشخص شدند و متغیر وابسته (پاسخ)، درصد باززایی مستقیم ریزنمونه ها در نظر گرفته شد. در ادامه محیط کشت بهینه برای باززایی مستقیم از ریزنمونه های بنفشه آفریقایی، با استفاده از تکنیک بهینه سازی عددی(Numerical optimization)  تعیین شد.

نتایج

باززایی مستقیم ریزنمونه برگ: به منظور تعیین میزان اثر چهار فاکتورهورمون­های TDZ، BA، IAA و رقم بنفشه آفریقایی بر پاسخ بهینه باززایی مستقیم و برهمکنش پس از وارد کردن داده­ها در نرم افزار Design Expert، پاسخ فرایند، مورد ارزیابی قرارگرفت. اعتبار کل مدل رگرسیون با استفاده از تجزیه و تحلیل واریانس داده­ها (جدول۱) مورد آزمون قرارگرفت و مشخص شد که مدل ارائه شده (پاسخ ۱) با ۹۹ درصد اطمینان، دارای اثر معنی­دار است. رابطه پاسخ ۱ مدل ارائه شده برای میزان تجزیه صورت گرفته را برحسب عامل­های کد شده نشان می­دهد.

= پاسخ 1+44.00+(3.19×TDZ)+(11.33×BA)-(0.9167×IAA)+(2.17×Cultivar(-)27.44×TDZ×BA (

پاسخ 1(باززایی مستقیم از ریزنمونه برگ)

در ادامه بر مبنای تجزیه واریانس صورت گرفته مشخص شد که کلیه عوامل مورد بررسی و اثر تعاملی هورمون­های TDZو BA، بیشترین تأثیر را در میزان پاسخ ریزنمونه برگ و ایجاد اندام زایی مستقیم داشته است (جدول ۲) و ضریب همبستگی (R²) مدل، احتمال درست بودن مدل پیشنهادی نرم افزار را نشان می­دهد که مطابق آنالیز انجام شده، میزان این ضریب ۹۹ درصد، به دست آمده است. نزدیک بودن مقدار AdjR² به R²، تأیید کننده مقدار صحیح ضریب همبستگی (R²) می باشد. از دیگر سو میزان اختلاف مورد قبول بین این دو ضریب کمتر از ۲/۰ می‍باشد که در اینجا اختلاف در حد هزارم درصد بوده و در حد کاملاً قابل قبول مشاهده می­شود. در ادامه میزان شاخص دقت کافی (Adequate Precision)  برابر با ۰۷/۶۸ بوده که مطابق تعریف خود نرم افزار چون از عدد ۴ بزرگتر می باشد، نشانگر مطلوبیت این شاخص است و میزان ضریب تغییرات نیز ۵۹/۵ بوده است. بنابراین باتوجه به هر چهار ضریب مورد بحث، مشخص می­گردد که مدل پیشنهادی توسط نرم افزار از صحت کامل برخوردار است. در همین راستا نمودار پراکنش باقیمانده­ها (شکل ۱) بیانگر نرمال بودن پراکنش داده های مورد بررسی بوده است و در نتیجه تفاوت های معنی دار بدست آمده، در طی آنالیز برگرفته از ماهیت خود داده بوده اند. نمودار پیش بینی پراکنش داده­ها در کنار خط برازش شده براساس مدل پیشنهادی نرم افزار نیز گویای صحت مدل و کارایی آن در پیش­بینی و مدلسازی داده­ها می باشد (شکل ۲). بر مبنای همین نمودارها مشخص می­گردد پراکنش داده ها پاسخ شماره ۱، بین ۰/۰ تا ۸۵ درصد بوده است. به عبارت دیگر بیشترین میزان باززایی مستقیم از ریزنمونه­های برگ در حدود ۸۵ درصد بوده است.

جدول ۲- نتایج تجزیه واریانس (ANOVA) مدل سطح پاسخ درجه دوم کاسته برای درصد باززایی مستقیم ریزنمونه برگ

R-Squared= 0.993, Adj R-Squared= 0.991, Adequate Precision= 68.07, C.V%= 5.59

براساس مدل پیشنهادی و آنالیز انجام شده بروی داده ها، می توان مشاهده نمود که تأثیر هر سه هورمون به کار رفته در محیط کشت و خود رقم کاملاً معنی دار بوده است و از دیگر سو تنها اثر متقابل، کاربرد همزمان هورمون های TDZ و BA معنی دار بوده است.

باتوجه به عدم معنی داری سایر اثرات تعاملی و معنی دار بودن اثرات ساده نوع رقم و میزان هورمون اکسین بر باززایی مستقیم ریزنمونه دمبرگ، همانطور که مشاهده می­گردد رقم Little Maya توان باززایی بالاتری نسبت به رقم Grinia نشان می­دهد (شکلهای ۳و ۴) و از سوی دیگر در بافت برگ بالارفتن میزان هورمون اکسین نه تنها اثر مثبتی بر بهبود باززایی مستقیم نداشته است بلکه از میزان آن نیز تا حد معنا داری می­کاهد. با توجه به اینکه بیشترین میزان باززایی مستقیم بافت برگ در هر دو رقم و در هر دو مقدار تیمار اکسینی به کار رفته در محیط القاء باززایی شامل TDZ mg/l ۰/۰ در ترکیب با  BA mg/l  ۱/۰ بوده است، به همین دلیل برای نشان دادن اثرات ساده، تغییرات آن­ها با این مقادیر نشان داده شد.

عدم حضور هورمون­های TDZ و BA در ترکیب با هر دو سطح هورمون IAA برابر با عدم باززایی مستقیم در ریزنمونه­های برگ در هر دو رقم می باشد و در کلیه نمودارهای اثرات تعاملی (شماره­های ۵ و ۶) به خوبی قابل مشاهده است. در تعریف پیش فرض نرم افزار Design Expert  مورد استفاده در این تحقیق، رنگ آبی برابر با مقدار صفر در نظر گرفته شده و تغییر رنگ به سمت قرمز بیانگر افزایش آن کمیت تعریف شده است. در همین راستا مشخص می­گردد که افزایش مقدار هورمونی TDZ در ترکیب با پایین ترین سطح هورمون (mg/l ۰۵/۰) BA در همراهی با اکسین (IAA) منجر به بهبود درصد باززایی مستقیم از ۲۰درصد تا حدود۶۰ درصد در ریزنمونه برگ می­گردد. این در حالیست که کاربرد هورمون BA به عنوان تنها عامل هورمون سایتوکنینی محیط کشت در ترکیب با اکسین (IAA) می تواند منجر به باززایی بالغ بر ۸۰ درصد از ریزنمونه های برگ گردد. ترکیب مقادیر کمتر از ۰۰۵/۰ هورمون TDZ با مقادیر بالاتر از ۰۹/۰ هورمون BA ، نیز نتایجی مشابه در برداشته است. از دیگر سو ترکیب های مقادیر بالاتر از هر دو نوع هورمون سایتوکنینی بکار رفته در این تحقیق نشانگر تأثیر کمرنگ تعامل آن­ها بر باززایی مستقیم در ریزنمونه برگ ( بین ۴۰ درصد الی ۶۰درصد) در هر دو رقم بوده است.

باززایی مستقیم ریزنمونه دمبرگ: در ادامه تجزیه و تحلیل آماری انجام شده بر روی داده ها (جدول۳)، مشخص گردید که ریزنمونه دمبرگ در هر دو رقم پتانسیل باززایی مستقیم داشته که این پاسخ تحت تأثیر هر ۴ عامل اصلی مورد بررسی اعم از خود رقم و تمامی ۳ تیمار هورمونی قرار گرفته است. اثر تعاملی هورمون TDZ (عامل A) درهورمون­های BA و IAA از یک­سو و ترکیب تعاملی آن با خود رقم از سوی دیگر معنی دار بوده است. سایر ترکیب­های بر روی پاسخ باززایی مستقیم ریزنمونه دمبرگ بی اثر بوده و بنابراین مطابق مدل پیشنهادی نرم افزار از معادله حذف شده اند. در ادامه مشخص شد که مدل ارائه شده برای پاسخ شماره ۲ با ۹۹ درصد اطمینان، دارای اثر معنی­دار است. رابطه پاسخ ۲ مدل ارائه شده برای میزان تجزیه صورت گرفته را، برحسب عامل­های کد شده نشان می­دهد.

= پاسخ 2

+17.46+(16.38×TDZ)+(2.54×BA)+(1.37×IAA)+(0.7083×Cultivar)+(1.87×TDZ×BA)+(1.13TDZ×IAA)+(0.5000TDZ×Cultivar)

پاسخ 2 ( باززایی مستقیم از ریزنمونه دمبرگ)

همانطور که اشاره شد، کلیه تیمارهای هورمونی اعمال شده تأثیر به سزایی در میزان پاسخ ریزنمونه دمبرگ و ایجاد اندام زایی مستقیم داشته اند (جدول ۳) و ضریب همبستگی (R²) مدل، که احتمال درست بودن مدل پیشنهادی را نشان می­دهد ۹۸ درصد، بوده و نزدیک بودن مقدار AdjR² به R²، تأیید کننده مقدار صحیح ضریب همبستگی (R²) می باشد. از دیگر سو میزان اختلاف مورد قبول بین این دو ضریب کمتر از ۲/۰ لحاظ شده که در اینجا اختلاف یک صدم درصد بوده و در حد کاملاً قابل قبول می­باشد. در ادامه میزان شاخص دقت کافی (Adequate Precision) برابر با ۳۷/۹۸ بوده که مطابق تعریف خود نرم افزار چون از عدد ۴ بزرگتر می باشد، نشانگر مطلوبیت این شاخص است و میزان ضریب تغییرات نیز ۲۴/۴ بوده است. بنابراین با توجه به هر چهار ضریب مورد بحث، مشخص می­گردد که مدل پیشنهادی توسط نرم افزار از صحت کامل برخوردار است. در همین راستا نمودار پراکنش باقیمانده ها (شکل ۷) بیانگر نرمال بودن پراکنش داده های مورد بررسی بوده است و در نتیجه تفاوت های معنی دار بدست آمده، در طی آنالیز برگرفته از ماهیت خود داده بوده اند. نمودار پیش بینی پراکنش داده­ها در کنار خط برازش شده براساس مدل پیشنهادی نرم افزار نیز گویای صحت مدل و کارایی آن در پیشبینی و مدلسازی داده­ها می باشد (شکل ۸)، همانطور که مشاهده می­شود پراکنش داده­های حقیقی کاملاً با خط برازش شده مطابقت داشته و اختلاف داده­ها از خط بسیار جزیی می­باشد.

جدول ۳- نتایج تجزیه واریانس (ANOVA) مدل سطح پاسخ درجه دوم کاسته برای درصد باززایی مستقیم ریزنمونه دمبرگ

R-Squared= 0.98, Adj R-Squared= 0.97, Adequate Precision= 98.37, C.V%= 4.24

از دیگر سو مطابق نمودارهای شماره ۵ و۶ مشخص می­گردد پراکنش داده­ها بین ۰ تا ۴۲ درصد بوده است که به بیان دیگر بیشترین میزان باززایی از نمونه­های دمبرگ تنها ۴۲ درصد بوده است. در مقام مقایسه بین دو پاسخ ۱ و ۲ مشخص می­گردد که در هر دو رقم مورد بررسی، پتانسیل ریزنمونه­های برگ در مقایسه با دمبرگ از جهت توان باززایی مستقیم، تقریباً ۲ برابر بوده است (شکلهای ۵ الی ۸).

در نمودارهای تعاملی هورمون­های سایتوکنینی به کار رفته در محیط کشت القاء باززایی مستقیم از ریزنمونه دمبرگ، مشخص می­ گردد که بافت دمبرگ در عدم حضور هورمون TDZ هر قدر هم میزان هورمون BA بالا باشد توان باززایی نداشته و به ترتیب با افزایش مقادیر هر دو هورمون در تعامل بایکدیگر بر میزان باززایی افزوده می­گردد و این افزایش با بالارفتن میزان هورمون اکسین در محیط کشت نسبت مستقیم دارد (شکلهای ۹ و ۱۰). بنابراین کاربرد و حضور هورمون TDZ برای القاء باززایی مستقیم از بافت دمبرگ ضروری است. اما برای نتیجه بهتر نیاز به ترکیب هر دو هورمون سایتوکنینی TDZ و BA ضروری به نظر می­رسد. این در حالیست که برای باززایی مستقیم از بافت برگ حضور هورمون BA کاملاً کافی بوده است. شایان ذکر است افزوده شدن هورمون TDZ در زمینه بهبود پتانسیل باززایی بافت برگ چندان ضروری نبوده است. نکته حائزه اهمیت دیگر اثر ترکیبی هورمون اکسین، در تعامل با هورمون­های سایتوکنینی در این پژوهش می­باشد. در ریزنمونه برگ اگرچه حضور این هورمون برای القاء باززایی ضروری بوده اما بالارفتن مقدار آن تأثیر به سزایی در بهبود پاسخ شماره ۱ که همان باززایی مستقیم از بافت برگ است، به همراه نداشته است (شکل­های ۵ و۶). 

این در حالیست که افزوده شدن ۱ میلی­گرم در لیتر بر میزان هورمون اکسین اعمال شده در محیط، بهبود ۱۰ درصدی پتانسیل باززایی ریزنمونه دمبرگ از ۳۰ به ۴۰ درصد مشهود است (شکلهای ۹ و ۱۰). لذا به نظر می­رسد بافت دمبرگ برای باززایی به مقادیر بالاتری از تیمارهای ترکیبی هورمون های سایتوکنین و اکسین در هر دو رقم نیاز دارد. نمودارهای ۱۱ و ۱۲ نیز تأیید کننده همین نکته می­باشند که در مقادیر یکسان هورمون TDZ با افزایش مقدار هورمون BA از mg/l ۰۵/۰ به mg/l ۱/۰ و متقابلاً افزایش دو برابری مقدار هورمون IAA از mg/l۱ به  mg/l۲ افزایش ۱۰ درصدی در پاسخ شماره ۲، به همراه داشته است. بنابراین در مقایسه این دو بافت از جهت پتانسیل باززایی به نظر می­رسد که بافت برگ نتایج موفقیت آمیزتری نشان داده و از دیگرسو در محیط القاء باززایی حاوی اندک مقادیر هورمون TDZ یا حتی محیط های فاقد این ماده، فقط با حضور هورمون بنزیل آدنین میزان گیاهچه باززا شده مستقیم مطلوب را فراهم می­نماید. این در حالیست که هم هزینه تهیه چنین محیط کشت القای باززایی مستقیمی کمتر بوده و هم درصد باززایی بالاتر بوده و از همه مهمتر خطر القاء تغییرات سوماکلونال ناخواسته ناشی از کاربرد هورمون TDZ نیز به حداقل می­رسد. نتایج نمودارهای ۱۳ الی ۱۶ بیانگر پتانسیل بالاتر رقم Little Maya  در مقایسه با رقم  Griniaدر پاسخ به تیمارهای القا باززایی مستقیم در ریزنمونه دمبرگ می­باشد و روند صعودی هر ۳ نمودار بیانگر بهبود میزان باززایی در هر دو رقم با افزایش میزان هورمون­های به کار رفته در محیط کشت می­باشد و این روند رخدادی یکسان برای هر دو رقم را نشان می­دهد. بنابراین می­توان اینطور نتیجه گرفت که باززایی مستقیم از ریزنمونه دمبرگ، در هر دو رقم وابستگی مستقیم با حضور هورمون TDZ داشته و روند صعودی باززایی نیز منوط به روند افزایشی مقادیر هورمون­های به کار رفته در محیط کشت است، که به طور قطع هزینه هر گیاهچه باززا شده از ریزنمونه دمبرگ نسبت به ریزنمونه برگ بالاتر بوده و همین طور احتمال بروز تغییرات ناخواسته سوماکلونال در گیاهچه­ها در طی فرایند رشد آتی نیز بسیار بیشتر خواهد بود. کاهش هزینه­های تولید متضمن دستیابی به عرصه تجارت پایدار می­باشد و کاهش هزینه­های القاء اندام زایی مستقیم یکی از مهمترین اهداف این تحقیق نیز بوده است، برهمین مبنا به منظور تعیین محیط کشت بهینه باززایی مستقیم مطابق جدول ۴، مقادیر برای نرم افزار تعریف شد و درجه اهمیت هرکدام از عوامل تأثیرگذار بر روی پاسخ شماره ۱، لحاظ گردید. دستیابی به اندام­زایی مستقیم هدف اصلی این بهینه سازی با عدد ۵ یعنی بیشترین درجه اهمیت تعریف شد و کمترین مقدار کاربرد هورمون TDZ در درجه بعدی اهمیت با درجه ۴ قرارگرفت. کاهش هزینه­های تولید متضمن دستیابی به عرصه تجارت پایدار می­باشد و کاهش هزینه های القاء اندام زایی مستقیم یکی از مهمترین اهداف این تحقیق نیز بوده است، برهمین مبنا به منظور تعیین محیط کشت بهینه باززایی مستقیم مطابق جدول ۴، مقادیر برای نرم افزار تعریف شد و درجه اهمیت هرکدام از عوامل تأثیرگذار بر روی پاسخ شماره ۱، لحاظ گردید. دستیابی به اندام­زایی مستقیم هدف اصلی این بهینه سازی با عدد ۵ یعنی بیشترین درجه اهمیت تعریف شد و کمترین مقدار کاربرد هورمون TDZ در درجه بعدی اهمیت با درجه ۴ قرار گرفت. زایی مستقیم یکی از مهمترین اهداف این تحقیق نیز بوده است، برهمین مبنا به منظور تعیین محیط کشت بهینه باززایی مستقیم مطابق جدول ۴، مقادیر برای نرم افزار تعریف شد و درجه اهمیت هرکدام از عوامل تأثیرگذار بر روی پاسخ شماره ۱، لحاظ گردید. دستیابی به اندام­زایی مستقیم هدف اصلی این بهینه سازی با عدد ۵ یعنی بیشترین درجه اهمیت تعریف شد و کمترین مقدار کاربرد هورمون TDZ در درجه بعدی اهمیت با درجه ۴ قرار گرفت. اندام زایی مستقیم یکی از مهمترین اهداف این تحقیق نیز بوده است، برهمین مبنا به منظور تعیین محیط کشت بهینه باززایی مستقیم مطابق جدول ۴، مقادیر برای نرم افزار تعریف شد و درجه اهمیت هرکدام از عوامل تأثیرگذار بر روی پاسخ شماره ۱، لحاظ گردید. دستیابی به اندام­زایی مستقیم هدف اصلی این بهینه سازی با عدد ۵ یعنی بیشترین درجه اهمیت تعریف شد و کمترین مقدار کاربرد هورمون TDZ در درجه بعدی اهمیت با درجه ۴ قرار گرفت.

در ادامه ۱۰۰ راه حل بهینه شده توسط نرم افزار ارایه شده، که به طور خلاصه در جدول شماره ۵ به راه حل یا پاسخ بهینه شده اصلی با بالاترین میزان احتمال مطلوبیت و پاسخ بهینه شده برای رقم دوم مورد بررسی، اشاره شده است. همانطور که در این جدول مشخص شده است رقم Little Maya با میزان احتمال مطلوبیت ۹۸۳/۰ درصد دارای قابلیت ۶۷/۸۲ درصد باززایی مستقیم در محیط کشت حاوی mg/l  ۱/۰ هورمون BA و mg/l ۱ هورمون   IAAبدون کاربرد هورمون TDZ را دارا می­باشد.

شایان ذکر است باتوجه به پتانسیل مطلوب­تر این رقم در باززایی مستقیم، ۷۲ راه حل اول داده شده در نرم افزار متعلق به همین رقم بود (داده ها ارایه نشده اند) و رقم Grinia در رتبه۷۳ ام پیشنهادی نرم افزار با احتمال مطلوبیت ۹۵/۰ درصد قرار گرفت که در این راه حل میزان باززایی مدلسازی شده برای این رقم ۳۳/۷۸ درصد در محیط کشت حاوی mg/l  ۱/۰ هورمون BA و mg/l ۱ هورمون  IAAبدون کاربرد هورمون TDZ بوده است. شایان ذکر است که در ادامه محیط کشت های پیشنهادی بهینه شده توسط نرم افزار، در سه تکرار برای ریزنمونه برگ در هر رقم مجددا اجرا شد که نتایج تجربی حاصله میانگین ۶۶/۸۱ درصدی برای رقم Little Maya و ۳۳/۷۳ درصد برای رقم Grinia را نشان داد که بسیار نزدیک به نتایج پیشنهادی نرم افزار بود. همانطور که مشاهده می­گردد در صورت حذف هورمون TDZ از محیط کشت القا باززایی مستقیم با بافت برگ، فارغ از نوع رقم، ترکیب تعاملی mg/l  ۱/۰ هورمون BA و mg/l ۱ هورمون   IAA بهترین محیط کشت با بالاترین میزان القا باززایی مستقیم، می­باشد.

جدول ۴- مقادیر تعریف شده جهت بهینه سازی محیط کشت القای باززایی مستقیم از ریزنمونه برگ

جدول ۵- پاسخ های بهینه شده نرم افزار بر مبنای مدل حاصله از تجریه و تحلیل داده­ها و مقادیر تعریف شده در جدول ۴

بحث و نتیجه گیری

تکنیک‌ بهینه‌سازی بوسیله روش سطح پاسخ معمولاً زمانی به کار می‌رود که فاکتورهای مهم و محدوده غلظت آن‌ها در طی تجزیه و تحلیل اولیه شناسایی شده است و بهینه‌سازی تکمیلی در محدوده فاکتورها و محدوده غلظت تعریف شده برای پاسخ مطلوب و مورد نظر، نیاز است. این روش زمانی که بیش از ۲ عامل برای بهینه سازی در نظر گرفته می­شود می­تواند ابزار موثری باشد (۲۳). در این تحقیق روش سطح پاسخ سعی دارد تا با استفاده از یک طرح آزمایش مناسب، راهی برای تخمین برهمکنش‌ها و اثرات درجه دوم  عوامل موثر بر باززایی بیابد تا تأثیرات چندگانه متغیرها را مدلسازی ‌نماید. سپس به ارائه‌ی یک مدل رگرسیون برای برقراری ارتباطی بین پاسخ ها و فاکتورها می‌پردازد. در این میان هدف اصلی این تحقیق بهبود فرایند باززایی مستقیم با درک عوامل اصلی تأثیرگذار از جمله تأثیر ژنوتیپ، تأثیر تنظیم کننده­های رشد محیط کشت، کاهش تغییرات سوماکلونال و کاهش نقاط ضعف از جمله کاهش هزینه های تولید و رسیدن به یک مدل پایدار در فرایند باززایی مستقیم بود. از آنجاییکه رشد و نمو و فرایند تمایزیابی در گیاهان به طور مستقیم یا غیرمستقیم با تغییرات بیان ژن­ها مرتبط است (۱۷) و در هر دو مکانیسم تولید گیاه کامل از ریزنمونه کشت بافتی، خواه به شکل اندام­زایی و خواه رویان­زایی عامل اصلی نوع و غلظت هورمون­های محیط کشتی بیان شده است (۱۸)، بر همین مبنا فاکتورهای اصلی تأثیرگذار بر این فرایند در روش سطح پاسخ نوع و غلظت هورمون های محیط کشت و نوع ریزنمونه و ژنوتیپ لحاظ شدند و مدل رگرسیونی پیش بینی شده توسط نرم افزار نیز این فرضیات تحقیق را اثبات نمود. گزارشات حاکی از اینست که عوامل بسیار کلیدی وجود دارند که می توانند در تمایز­یابی و اندام­زایی علی الخصوص رویان­زایی تأثیر مستقیم و به سزایی داشته باشند، از جمله مشاهده شده که محتوای داخلی هورمون­ها در بافت­های مختلف حتی در یک رقم با همدیگر تفاوت داشته و به طور شفاف­تری بررسی­ها نشان داده است در یک ریزنمونه مقادیر هورمون­های درونی در ابتدای کشت درون شیشه­ای و پس از گذر یک دوره کشت نیز تفاوت­های بارزی را بیان داشته اند (۴). مطابق مدل بدست آمده از روش سطح پاسخ با ماژول Historical Data Design مشخص شد که نوع ریزنمونه در یک رقم و در یک محیط کشت یکسان تأثیر بارزی بر اندام­زایی داشته است. لذا به نظر می­رسد، همانطور که گزارشات نشان می­دهد محتوی هورمون­های درونی در هر بافت نقش کلیدی در تنظیم مورفولوژی گیاه داشته (۱۵) و به احتمال بسیار زیاد، تعادل بین هورمون­های درونی و بیرونی، القاء کننده فرایند اندام­زایی در ریزنمونه می­باشند. در همین راستا مشخص شده است که محتوای درونی هورمون­های اکسین و اسید ابسیزیک در بافت­هایی که پتانسیل رویان­زایی را دارند بالاتر است (18و 33) و مقادیر همین هورمون­ها در طی اندام­زایی شاخه در بافت­هایی که پتانسیل اندام­زایی نیز دارند بالاتر است و عوامل درونی و بیرونی حتی، تنش­هایی که سبب تجمع این هورمون­ها در بافت می­شوند نیز پتانسیل اندام­زایی ریزنمونه را افزایش می­دهند (۳۳). در کل می­توان باتوجه به مدل بدست آمده، اینطور نتیجه گیری کرد که مقادیر درونی هورمون­های بافت برگ یا دمبرگ، پتانسیل اندام­زایی آن بافت را مشخص می­کنند که به طور قطع این مقادیر خود وابسته به  نوع رقم یا به عبارتی ژنوتیپ گیاه می­باشد. لذا شناخت روند تغییرات هورمون­های محیط کشت و حتی نوع تنظیم کننده به کار رفته در محیط کشت و میزان آن در طی فرایند اندام­زایی یا رویان­زایی در برخی ارقام می تواند به طور مستقیم یا غیرمستقیم تحت کنترل محتوای درونی هورمون­های آن رقم و برهمکنش آنها قرار بگیرد. در همین راستا به کارگیری یک مدل تجربی در تحقیقاتی مشابه می­تواند راهگشای هدفمند تر نمودن میزان و نوع تنظیم کننده های رشد برای دستیابی به اندام زایی خاص و مورد نظر باشد.