Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Regenerate shoot responses of aromatic Myrtus communis L. to salinity under in vitro condition

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Biology, Faculty of Science, Payame Noor Universtiy

2 Biotechnology division, Department of cell and molecular biology, Faculty of chemistry, University of Kashan, Kashan, Iran

3 Department of Biology, Faculty of Science, Shahed university, Tehran, Iran

Abstract

Abstract
Salinity is one of the most important limiting factors for growth and distribution of terrestrial plants. Salt stress, by affecting the osmotic potential of the soil around the root, cause toxicity to plants, which lead to reduced growth, declined productivity, and impaired nutrient uptake. The Myrtus communis L. is an ornamental-medicinal shrub that is of particular importance due to its useful aromatic compounds, its uses in traditional medicine, and applications in natural ecosystem restoration and soil erosion projects. Few studies have been conducted on the physiological responses and resistance of myrtle to abiotic stresses and the limited available results make it difficult to generalize to all populations. In the present study, we attempted to investigate the regeneration and growth rate of myrtle shoots over different salinity levels (0, 100, 150, and 250 mM NaCl) under in-vitro culture condition. Additionally, some other physiological responses such as pigment content, relative water content (RWC), cell membrane stability, leaf proline content, amount of reactive oxygen species, biochemical parameters, and activity of some antioxidant enzymes, were also evaluated. The results showed that the salinities at moderate and severe levels (150 and 250 mM NaCl, respectively) significantly effected in-vitro growth and regeneration, membrane stability, carbohydrate and protein contents as well as leaf chlorosis and necrosis. The results also showed that RWC chlorophyll content, and resistance index were only affected at high salinity level, while lipid and proline content, the activity of antioxidant enzymes, and ROS levels were relatively affected at all salinity levels.

Keywords

Main Subjects

پاسخ شاخساره‌های باززایی شده مورد معطر (Myrtus communis L.) به شوری در شرایط کشت در شیشه

پیمان آقائی1*، سید علی حسینی تفرشی2 و محمد امین طغیانی3

1 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

2 ایران، کاشان، دانشگاه کاشان، دانشکده شیمی، گروه سلولی و مولکولی

3 ایران، تهران، دانشگاه شاهد، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 27/04/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

شوری یکی از مهمترین محدودیت‌های پیش روی رشد و پراکنش گیاهان خشکی است. این تنش با تحت تأثیر قرار دادن پتانسیل اسمزی محیط اطراف ریشه ضمن ایجاد سمیت برای گیاه، به کاهش رشد، تولید محصول و اختلال در جذب عناصر غذایی می‌انجامد. مورد معطر (Myrtus communis L.) درختچه‌ای زینتی- دارویی است که به سبب دارا بودن ترکیبات آروماتیک مفید، استفاده در طب سنتی و استفاده در پروژه‌های مرمت اکوسیستم‌های طبیعی و فرسایش خاک از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. مطالعات محدودی در خصوص پاسخ‌های فیزیولوژی و مقاومتی این گیاه به تنش انجام پذیرفته که نتایج محدود موجود، تعمیم آن را روی تمامی جمعیت‌ها دشوار می‌سازد. دراین تحقیق تلاش شد تا ضمن بررسی میزان باززایی و کمیت رشد گیاهچه‌های مورد معطر در شرایط کشت درون‌شیشه تحت 4 سطح شوری (0، 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl)، برخی پاسخ‌های فیزیولوژی گیاه نظیر تغییرات محتوای رنگیزه‌ای و RWC، پایداری غشاهای سلولی، محتوای پرولین برگ، مقدار رادیکال‌های فعال اکسیژن، پارامترهای بیوشیمیایی و فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مورد سنجش و ارزیابی قرارگیرد. نتایج مؤید آن بود که سطوح متوسط و شدید شوری (بترتیب 150 و 250 میلی مولار NaCl) تأثیرات قابل ملاحظه‌ای بر پارامترهای رشد و نموی، پایداری غشاء، میزان کربوهیدرات و آمیدها و نیز میزان کلروز و نکروز برگ داشته است. نتایج همچنین نشان داد که محتوای نسبی آب برگ، میزان کلروفیل و درصد شاخص مقاومت تنها در شوری شدید و میزان لیپید و پرولین، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و میزان ROS، در همه سطوح شوری تحت تأثیر قرارگرفتند.

واژه های کلیدی: مورد معطر (Myrtus communis L.)، تنش شوری، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، کشت درون‌شیشه، FTIR، ROS، پرولین

* نویسنده مسئول، تلفن: 03133391803 ، پست الکترونیکی: peyman.aghaie@pnu.ac.ir

مقدمه

 

مورد معطر (Myrtus communis L.) گیاهی دارویی و معطر از خانواده میرتاسه به ارتفاع 1 تا 3 متر با برگ‌های متقابل، تخم مرغی و سرنیزه‌ای و میوه سته است که در صنایع بهداشتی و دارویی، کاربرد فراوانی دارد. محل رویش آن اروپای جنوبی، جنوب غربی آسیا و همچنین ایران است. ارزش اقتصادی این درختچه همیشه سبز، علاوه بر استفاده‌های زینتی، به واسطه وجود ترکیبات فنولی و آروماتیک ارزشمند آن نظیر آلفاپینن، لیمونن، سینوئل و ترپینول است که در تهیه ترکیبات فعال زیستی حائز اهمیت‌ است (17). این گیاه در طب سنتی و مدرن به واسطه خواصی همچون قابض بودن، ضدعفونی کنندگی، ضد انگلی، مقوی معده، نیرو دهنده، بهبود زخم‌ و رفع اختلالات مجاری ادراری مورد توجه است (50). باتوجه به توان تولید تاج پوشش انبوه و مناسب مورد و قدرت بازیابی بالای این گیاه در مواجهه با آسیب‌های ناشی از آتش‌سوزی و چرای دام، از آن بعنوان یک کاندیدای مناسب برای برنامه‌های مرمت اکوسیستم‌های طبیعی یاد می‌شود (13). این درختچه در زمین‌های شیبدار و نامساعد به راحتی قابل کشت بوده و از فرسایش خاک جلوگیری می‌کند. در کل گیاه مورد، تحمل قابل قبولی را در مواجهه با تنش‌های محیطی غیرزنده از جمله خشکی، شوری و نور شدید از خود نشان می‌دهد. لیکن تداوم این تنش‌ها، شدت و دفعات آن‌ها در مناطق مختلف می‌تواند اثرات منفی جبران ناپذیری به گیاه وارد نماید (27و 41). شوری اما یکی از جدی‌ترین مسائل زیست محیطی در اکوسیستم‌های خشکی است. حدود 800 میلیون هکتار از زمین‌های دنیا متأثر از شوری است که خود حدود 7 درصد از کل خشکی‌های دنیا را شامل می‌شود (23).

تنش ناشی از شوری، جوانه زنی، رشد و تولید مثل گیاهان را به شدت تحت تأثیر قرار می‌دهد (52). این موضوع آنجا اهمیت بیشتری می‌یابد که بدانیم تقریباً سه چهارم سطح زمین توسط آب‌های شور پوشیده شده و نمک ناشی از آن بخش قابل توجهی از جهان اطراف ما را تحت تأثیر قرار داده است. زهکشی ضعیف و نامناسب، فرسایش خاک، استفاده از آب‌های شور و بی‌کیفیت در کشاورزی، جنگل‌زدایی و استفاده بی رویه از کودهای شیمیایی، باعث گسترش اثرات مخرب شوری در جهان گردیده است (21). در غالب موارد، پاسخ گیاهان به تنش شوری به میزان سمیت یونی، تغییرات پتانسیل اسمزی، مدت زمان تنش و نوع گونه گیاهی بستگی دارد (17). متداول‌ترین شیوه ایراد خسارت تنش نمک در گیاهان از طریق ایجاد اختلال‌های اسمزی است که خود ناشی از افت پتانسیل اسمزی آب در حضور نمک و متعاقب آن کاهش امکان دسترسی سلول‌های ریشه به آب است. دراین شرایط، اغلب پاسخ‌های فیزیولوژیک گیاه به خشکی بروز یافته و تأثیر آن به صورت کاهش میزان آب سلول، سمیت یونی و اختلال در جذب عناصر غذایی آشکار می‌شود (14و 52). اختلال در فرایندهای متابولیکی همچون کاهش فعالیت نیترات ردوکتاز، تجزیه کلروفیل، بروز کلروز در بافت‌های گیاه و تخریب فعالیت‌های فتوسنتزی از جمله آسیب‌های ناشی از فزونی سدیم و کلر در گیاهان است (22و 60). در کل تعداد اندکی از تحقیقات به موضوع اثر شوری روی درختچه‌های زینتی و مکانیزم‌های دخیل در پاسخ آن‌ها به این تنش پرداخته‌اند (3، 15 و 59). بررسی اعمال تنش غلظت بالای نمک NaCl (250 mM) به صورت درون شیشه‌ای در مورد توسط Di Cori و همکاران (21) نشان داد این شرایط به کاهش طول ساقه و ریشه و محتوای کلروفیل گیاه منجر می‌شود. نتایج آن‌ها نشان داد، در حالیکه محتوای کاروتنوئید گیاه دراین شدت شوری بدون تغییر مانده، فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نظیر آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز افزایش معنی‌داری یافته است. کاهش کارآیی فتوسیستمII و افزایش پلی‌فنل‌ها به خصوص فلاونوئیدها در مطالعه اثر شوری روی گیاه مورد توسط Tattini و همکاران (2006)، گزارش شد (59). Acosta-Moto و همکارانش در 2015 با بررسی مکانیزم‌های مقاومت گیاه مورد به تنش شوری بلند مدت، وقوع تغییرات آناتومی در برگ‌ها از جمله کاهش پارانشیم اسفنجی و افزایش فضاهای بین سلولی در برگ، افزایش فعالیت کاتالاز، تغییر در پارامترهای رشد و نموی، فتوسنتز و پایداری غشاء را در ایجاد مقاومت به شوری، مؤثر دانسته‌اند (3). در مطالعه حاضر، اثر سطوح متوسط و شدید شوری، روی گیاهچه‌های باززایی شده به روش درون شیشه‌ای گیاه مورد، تحت بررسی قرارگرفت. هدف، شناسایی و تجزیه و تحلیل برخی پاسخ‌ها و سازوکارهای دخیل در مقاومت به شوری در این گیاه بود. بدین منظور برخی ویژگی‌های ریختی در حالت درون‌شیشه‌ای شامل، میزان باززایی، کمیت رشد بخش‌های هوایی، طول گیاهچه و وزن تر آن و نیز برخی شاخص‌های فیزیولوژی نظیر تغییرات محتوای نسبی آب برگ، محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی، کاروتنوئیدها، پراکسیداسیون چربی‌های غشایی، نشت الکترولیت‌ها از خلال سلول‌ها، محتوای پرولین برگ، مقدار رادیکال‌های فعال اکسیژن و فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی اکسیدانی مورد سنجش و ارزیابی قرارگرفت.

مواد و روشها

تهیه ماده گیاهی و شرایط کشت درون­شیشه­ای: جدا کشت‌ها از تک گره­های حاصل از درختچه‌های گیاه Myrtus communis L. کاشته شده در مجموعه فضای سبز شهرداری کاشان- ایران تهیه گردید. نمونه‌ها پس از انتقال فوری به آزمایشگاه، ابتدا به مدت 30 دقیقه با آب جاری شستشو داده شدند. پس از آن یک‌بار و به مدت یک دقیقه در الکل 70 درصد و سپس به مدت پانزده دقیقه در محلول حاوی هیپوکلریت سدیم دو درصد گندزدایی شدند. در نهایت نیز نمونه‌ها پس از سه بار آبشویی با استفاده از آب دوبار تقطیر استریل، برای کشت در شیشه مورد استفاده قرارگرفتند. محیط کشت پایه MS (موراشیگ و اسکوگ-1962) حاوی سوکروز ( g/l30) و آگار ( g/l7) با غلظت‌های مختلف (mg/l 3، 2، 5/1، 1، 5/0، 2/0) BAP (6-benzylaminopurine) و NAA (1-Naphthaleneacetic acid) (  mg/l2/0،0) برای بهینه‌سازی پروتکل باززایی مورد استفاده قرارگرفت (جدول1) (42). pH کلیه محیط‌های کشت روی 05/0± 7/5 تنظیم و سپس اتوکلاو گردیدند. نمونه‌ها در دمای °C 1±25 و تحت دوره‌های نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت µmol m-2s-1 100 نگهداری شدند. شاخساره‌‌های 4 هفته‌ای جهت ارزیابی پارامترهای کشت بافتی شامل درصد بازیابی، تعداد شاخساره در هر جدا کشت و طول آن‌ها مورد ارزیابی قرارگرفتند. پس از این مرحله، نمونه‌ها به صورت منظم و هر سه هفته یکبار و طی 5 هفته متوالی، واکشت داده شدند تا ثبات نتایج در واکشت‌های متوالی احراز گردد. محیط بهینه شده حاصل و همچنین جداکشت‌های تولید شده، برای انجام آزمایش‌های مرحله تنش شوری در شرایط درون شیشه، مورد استفاده قرارگرفتند.

اعمال تیمار شوری: جدا کشت‌های یکسان واجد گره حاصل از کشت درون شیشه، با اندازة تقریبی cm 5 /0، به محیط کشت بهینه شده M8 حاوی mgl-1 5/1 از هورمون BAP وmgl-1  2/0 از هورمون NAA منتقل شدند. برای اعمال تنش شوری، سه غلظت 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl به محیط‌های کشت اضافه و همراه با نمونة شاهد (غلظت صفر میلی مولار NaCl)، در اتاقک کشت کنترل شده (مشابه شرایط ذکر شده در بخش 2-1) قرارگرفتند. درون هر شیشه، چهار نمونه جدا کشت در فواصل یکسان از یکدیگر واکشت شدند. پس از سی روز، نمونه‌های حاصل جهت بررسی میزان باززایی، کمیت رشد و شاخص‌های فیزیولوژیکی برداشت شدند.

مطالعه صفات ریختی، شاخص‌های رشدی و باززایی شاخساره: پارامترهای باززایی شاخساره‌های کشت یافته در شیشه، شامل درصد بازیابی و تعداد شاخساره در هر گره اندازه گیری شد. علاوه بر آن طول و عرض شاخساره‌ها‌ و نیز میانگین طول برگ‌ها، به کمک یک کولیس دیجیتال اندازه گیری شد. در ادامه نمونه‌ها پس از قرارگیری در آون با دمای 65 درجه‌سانتی‌گراد تا رسیدن به وزن خشک ثابت، خشک شدند. وزن تر اولیه بافت و وزن خشک به کمک یک ترازوی دیجیتال با درجه حساسیت 0001/0 گرم، اندازه گیری شد. میزان کلروز و نکروزشد‌گی بافت‌های گیاه بر مبنای شاخص مک کینی (McKinney Index  یا MKI) و از روی علائم بصری ناشی از شوری، مورد ارزیابی قرارگرفت (39). 

محتوای نسبی آب برگ: محتوای نسبی آب برگ به روش Ings و همکاران (2013) اندازه گیری شد (30). برگ‌های توسعه یافته شاخساره، بلافاصله پس از برداشت توزین شدند و بعنوان وزن تر برگ (Fresh weight به اختصار  FW) منظور گردید. پس از آن نمونه‌های برگ در آب دوبار تقطیر استریل غوطه‌ور و برای 24 ساعت در تاریکی و دمای ºC4 نگهداری شدند. مجدداً وزن تر برگ‌ها اندازه‌گیری گردید که معرف وزن تورژسانس ( Turgid weightبه اختصار TW) است. نمونه‌های وزن شده (برگ‌های اشباع شده از آب) برای مدت 72 ساعت یا بیشتر (تا رسیدن به وزن ثابت) در آون تحت دمایºC 70 خشک شده و سپس بعنوان وزن خشک توزین گردیدند (Dry weight یا DW). با قرار دادن مقادیر حاصل در معادله زیر درصد محتوای نسبی آب برگ‌ها محاسبه شد (30).

نشت الکترولیت: بررسی پایداری غشا‌های سلولی از طریق سنجش هدایت الکتریکی ناشی از نشت الکترولیت‌ها از خلال سلول‌های برگ و به روش  Liuو همکاران (2011) با اندکی اصلاح، انجام شد (37). نمونه‌های برگی شاخساره‌های هم وزن، پس از جداسازی، در فالکون‌های قابل اتوکلاو حاوی20 میلی‌لیتر آب دوبار تقطیر، غرق گردیدند. نمونه‌ها برای مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای  ºC25 آنکوبه شدند. پس از این مدت هدایت الکتریکی ( Electrical conductivityبه اختصار EC) آن‌ها با استفاده از دستگاه هدایت‌سنج الکتریکی (Jenway, Model 4510 - انگلیس) اندازه‌گیری شد (EC اولیه). در ادامه نمونه‌ها برای20 دقیقه در اتوکلاو تحت دمای ºC 121 قرارگرفتند. پس از سرد شدن نمونه‌ها تا دمای ºC25، هدایت الکتریکی محلول مجدداً قرائت گردید (EC نهایی). با قرار دادن مقادیر EC اولیه و نهایی در معادله مربوط، میزان نشت الکترولیت از خلال سلول‌های برگ به درصد تعیین گردید.  

 

پراکسیداسیون چربی‌های غشایی: سنجش پراکسیداسیون چربی‌های غشایی به واسطه اندازه‌گیری میزان مالون‌دی آلدهید(MDA)  و به روش Heath و Packer  (28) با اندکی اصلاح، انجام شد. بدین منظور، 1/0 گرم از برگ تر شاخساره مورد با 5 میلی‌لیتر محلول 1/0 درصد (m/v)  تری‌کلرو‌استیک ‌اسید سائیده شد. عصاره همگن حاصل برای 25 دقیقه و با دور 12000 g سانتریفیوژ شد. به 1 میلی‌لیتر از محلول رویی، 4 میلی‌لیتر محلول تری‌کلرو‌استیک ‌اسید 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک اسید  (m/v) 5/0% افزوده شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه تحت حرارت 95 ºC حمام آب گرم قرارگرفت و پس از آن به سرعت بر روی یخ منتقل شد. پس از انجام مجدد سانتریفیوژ، جذب محلول رویی در طول ‌موج‌های 532 (جذب کمپلکسMDA-TBA) و 600 نانومتر (جذب سایر رنگیزه‌های غیراختصاصی) قرائت گردید. میزان MDA با در نظر گرفتن ضریب خاموشی mM-1cm-1 155 با استفاده از معادله زیر و بر حسب nmol g-1F.W. محاسبه گردید.

رنگیزه‌های فتوسنتزی و کاروتنوئید: رنگیزه‌های برگ شامل کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید کل شامل کاروتن و گزانتوفیل پس از استخراج از نمونه‌های شاخساره به روشLichtenthaler  و Welburn (1994) مورد سنجش قرار گرفت (36). بدین منظور 2/0 گرم از بافت تازه برگ گیاه مورد کشت در شیشه از هر تیمار در 5 میلی لیتر استون80 درصد سرد، سائیده و به صورت عصاره همگنی تهیه شد. نمونه به مدت 20 دقیقه و با سرعت 13000 دور در دقیقه (rpm) و در دمای ºC4 سانتریفوژ گردید. فاز رویی هر لوله اپندورف به کمک استون80 درصد به حجم 5 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس جذب نمونه‌ها در طول‌موج‌های2/663، 8/646 و470 نانومتر قرائت شد. با قرار دادن مقادیر جذب در معادله‌های مربوطه، مقادیر کلروفیل‌ و کاروتنوئید هر نمونه بر حسب میکرومول محاسبه گردید. در ادامه نیز ضریب سازگاری (Tolerance Index به اختصار TI) به تنش برای هریک از شاخساره‌های تحت تنش و شاهد با بهره‌گیری از معادله Köhl  و  Lösch (2004) محاسبه شد (21)  

استخراج آنزیم و سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسید دسموتاز: مقدار 2/0 گرم از برگ شاخساره کشت شده در شیشه برای هر تیمار‌ برداشت شد و با 1 میلی‌ لیتر بافر فسفات سدیم 50 میلی‌مولار با pH برابر 8/7 سائیده‌ شد. بافر همچنین حاوی آلفا‌‌دی‌تیوتریتول (α-Dithiothreitol) و اتیلن‌دی‌آمونیوم‌تترا (EDTA) 2 میلی‌مولار، پی وی پی (Polyvinylpyrrolidone) 1درصد، سوکروز 4 میلی‌مولار و گلیسرول10 درصد بود. عصاره حاصل بلافاصله به مدت20 دقیقه در دورrpm  13000 و دمای°C 4 سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مورد استفاده قرارگرفت. سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز به روشAebi  (1984) انجام شد (4). مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات50 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 10 میلی‌مولار و 100 میکرو‌لیتر عصاره آنزیمی بود. تجزیه هیدروژن پراکسید و کاهش جذب در طول‌موج 240 نانومتر در مدت 60 ثانیه، میزان فعالیت آنزیم را نشان داد. یک واحد از فعالیت آنزیم CAT براساس سرعت مصرف یک μmol H2O2 mL-1 min-1 در دمایºC 25 ( یا بر حسب تغییرات جذب 01/0 واحد در دقیقه) بیان شد.

سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) به روش Nakano و Asada (1981)، انجام شد. در این روش مخلوط واکنش شامل آب اکسیژنه (H2O2) 30 درصد با غلظت 2/0 میلی‌مولار، اسید آسکوربیک 5/0 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی بود. بمنظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم، منحنی کاهش جذب ناشی از اکسیداسیون آسکوربات در طول‌ موج 290 نانومتر طی مدت 2 دقیقه دنبال گردید. میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی (ε 290) معادل mM−1 cm−1 8/2 محاسبه شد. یک واحد آنزیمی معادل تجزیه یک مول آسکوربات در مدت زمان یک دقیقه و در دمای  ºC25 در نظر گرفته شد (43). فعالیت آنزیم سوپراکسیددسموتاز (SOD) بر پایه روش Beauchampو Fridovich در 1971 اندازه‌گیری شد (11). مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات 50 میلی‌مولار با pH برابر 8/7، L- متیونین 13 میلی‌مولار، نیترو بلو تترازولیوم 75 میکرومولار، ریبوفلاوین 2 میکرو‌مولار، EDTA 1/0 میلی‌مولار و 50 میکرومولار از عصاره آنزیمی استخراج شده بود. مخلوط به مدت 15 دقیقه تحت نور فلورسنت با 5000 لوکس نوری، برای 15 دقیقه قرار گرفت و سپس جذب آن در طول‌موج 560 نانومتر خوانده شد. همچنین از یک لوله‌آزمایش حاوی مخلوط واکنش بدون عصاره آنزیمی بعنوان شاهد استفاده شد. یک واحد از فعالیت آنزیم SOD مقدار آنزیمی است که موجب50 درصد ممانعت از احیای نوری NBT می‌گردد.

پرولین: اندازه‌گیری محتوای پرولین به روش Bates و همکاران (1973) و با استفاده از -Lپرولین، بعنوان استاندارد، صورت گرفت (9). بدین منظور 5/0 گرم بافت تازه برگی مربوط به هر تیمار در10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد ساییده و به مدت 20 دقیقه در دور12000 rpm سانتریفیوژ گردید. 2 میلی‌لیتر از محلول رویی با 2 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین و 2 میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال برای مدت60 دقیقه در دمای°C100 در بن ماری قرار داده شد و پس از این زمان، بلافاصله در حمام یخ قرارگرفت و بدین ترتیب واکنش متوقف شد. به هر نمونه 4 میلی‌لیتر تولوئن اضافه و با استفاده از ورتکس به مدت 20 ثانیه بخوبی یکنواخت شد. لوله‌ها به مدت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه ثابت نگه داشته شدند تا در هر لوله آزمایش دو فاز تشکیل گردد. جذب فاز رویی که حاوی کمپلکس صورتی تا قرمز رنگ واجد پرولین است، جهت اندازه‌گیری پرولین استفاده شد. شدت جذب محلول‌ها در طول موج‌ 520 نانومتر قرائت و در ادامه با استفاده از منحنی استاندارد حاصل از پرولین خالص، غلظت پرولین در هر نمونه تعیین گردید. در نهایت میزان پرولین بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر
(µmol g-1 F.W.) به دست آمد.

اندازه‌گیری مقدار رادیکال‌های فعال اکسیژن (ROS): برای اندازه‌گیری مقدار رادیکال‌های فعال اکسیژن (ROS) از روش زایلنول اورنج اسیدی استفاده شد (12). بر اساس این روش ROS در شرایط اسیدی، منجر به تغییر یون فرو به فریک شده و یون فریک حاصل با زایلنول اورنج کمپلکس نارنجی رنگ ایجاد می‌کند. برای این منظور ابتدا بافت برگ درون هاون چینی ریخته و بر روی یخ کاملاً ساییده شد. سپس بافر فسفات سدیم mM 50 با 8/6 pH استفاده گردید و محلول همگن حاصل ‌مدت 15 دقیقه با سرعت rpm 16000 درC ᵒ4 در سانتریفیوژ (Micro Centrifuge Eppendorf 1540- آلمان) گردید. جذب نوری محلول حاصل حاوی عصاره و زایلنون اورنج اسیدی در طول موج560 نانومتر خوانده شد. از غلظت‌های مختلف H2O2 برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج حاصل بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر (µM g-1 FW) محاسبه و ارائه گردید.

طیف سنجی FT-IR : 1/0 گرم پودر خشک حاصل از شاخساره‌های نمونه‌های شاهد و تیمار برای انجام آنالیزهای FT-IR استفاده شد. نمک KBr به نسبت 1 به 1 به پودر خشک گیاهی افزوده شد و نمونه‌ها به صورت قرص تهیه شد. طیف مادون قرمز نمونه­ها با استفاده از  دستگاه اسپکترومتر  FT-IRمدل Nicolet Magna-550 در محدوده طول موج cm-1 400-4000 قرائت گردید. آنالیز نمونه‌ها طی سه تکرار انجام و نتایج حاصل از بخشی از طیف خروجی در محدوده900 تا 1800 بر سانتی‌متر، با استفاده از نرم افزاز Essential FTIR Spectroscopy (نسخه 50/3) مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفت. آنالیز بیشتر داده‌های خروجی این نرم افزار و رسم منحنی‌ها با استفاده از نرم افزارهای اکسل (نسخه 2013) و GraphPad Prism (نسخه 6) انجام شد. در این صورت با محاسبه مقادیر حداکثر پیک‌های حاصل از منحنی‌های هر تیمار نسبت‌های کربوهیدرات به آمید2، آمید 1 به آمید 2، لیپید به آمید 2 و نوکلئیک اسید به آمید 2، محاسبه و به صورت نمودار ارائه گردید. 

تجزیه تحلیل آماری: تمامی آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی و حداقل در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل‌های آماری، انجام تحلیل واریانس (Analysis of variance یا به اختصار ANOVA) و آزمون مقایسه‌ای دانکن در سطح 05/0>P ، با استفاده از نرم‌افزار SPSS  (version 19.0, SPSS Inc, Chicago, IL) انجام شد. برای رسم کلیه نمودارها از نرم‌افزار گراف پد (version 6, GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA) استفاده شد.

نتایج

بهینه سازی محیط کشت باززایی شاخساره: اثر ترکیبات متفاوت تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی روی باززایی شاخساره‌های حاصل از جداکشت‌های گرهی مورد، در جدول 1 آورده شده است. بیشترین میزان استقرار جداکشت‌ها به میزان 100 درصد، در محیط‌های کشت M6 (mgl-1 NAA 2/0+ mg-1 BAP1)، M8 (mgl-1 NAA 2/0+ mg-1 BAP5/1) و M9 (mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP2) مشاهده شد. در پنجمین واکشت، بیشترین تعداد شاخساره‌های جدید، در جداکشت‌های گرهی رشد یافته روی محیط M8 (جدول1)، ایجاد شد. در هر جداکشت روی این محیط، به طور متوسط 11 نوشاخه حاصل شد که به طور قابل ملاحظه‌ای بیش از سایر محیط‌ها بود. پس از سه هفته از کشت، بلندترین شاخساره به ارتفاع 1/30 میلی متر در محیط بدون هورمون (شاهد) و پس از آن در محیط‌های M1، M2 و M8 با بترتیب 23، 2/22 و 3/20 میلی‌متر ایجاد شد. براساس نتایج حاصل، در نهایت محیط کشت M8 بعنوان محیط کشت بهینه برای انجام آزمایش‌های تنش شوری انتخاب شد.  

 

جدول 1- اثر ترکیب‌های مختلف تنظیم کننده‌های رشد گیاهی بر باززایی جداکشت‌های گرهی گیاه مورد. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P < است.

ارتفاع شاخساره

تعداد نوشاخه

استقرار (%)

ترکیب تنظیم کننده های رشد

محیط کشت

a 4/5 ± 1/30

d 3/0 ± 9/0

f* 4/6 ± 6/26

-

شاهد

bc 7/4 ± 2/22

cd 5/0 ± 7/2

e 7/4 ± 9/51

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP2/0

M1

ab 9/4 ± 0/23

cd 9/0 ± 4/2

ab 7/5 ± 7/85

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP2/0

M2

efg 1/3 ± 2/11

cd 0/1± 7/2

e 7/9 ± 4/54

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP5/0

M3

fg 0/4 ± 8/7

cd 7/0 ± 6/2

cd 7/9 ± 5/75

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP5/0

M4

def 3/4 ± 3/14

cd 7/0 ± 5/2

e 5/7 ± 0/68

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP1

M5

g 4/3 ± 8/4

cd 0/1 ± 8/2

a0/0 ± 0/100

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP1

M6

bcde 3/4 ± 6/16

cd 1/1 ± 9/2

b1/7 ± 1/85

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP5/1

M7

bcd 1/3 ± 3/20

a 4/2 ± 0/11

a0/0 ± 0/100

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP5/1

M8

fg 6/2 ± 0/7

cd 4/1 ± 6/2

a0/0 ± 0/100

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP2

M9

cdef 0/2 ± 0/15

b 1/1 ± 4/7

 ab5/2 ± 3/97

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP2

M10

efg 1/3 ± 4/10

e 1/1 ± 3/3

 a7/6± 5/67

mgl-1 NAA0+ mg-1 BAP3

M11

fg 1/4 ± 1/7

e 9/0 ± 2/3

d0/7 ± 6/66

mgl-1 NAA2/0+ mg-1 BAP3

M12

 

اثر شوری بر باززایی و پارامترهای رشد: بخش دیگری از نتایج این تحقیق بیانگر تأثیر کمی و کیفی متفاوت غلظت‌های مختلف شوری بر پارامترهای رشدی و قدرت باززایی نوشاخه‌های مورد، بود (جدول2). در حالی‌که در جداکشت‌های تحت غلظت‌های پائین‌تر نمک (100 و150میلی مولار) تفاوت معنی‌داری میان درصد باززایی نوشاخه‌ها با نمونه‌های کنترل مشاهده نشد، در شوری بالا (250 میلی مولار) میزان باززایی شاخساره‌ها بنحو معنی‌داری کاهش یافت. بررسی میزان پرآوری (Proliferation rate) نمونه‌ها، مؤید اثر منفی غلظت بالای شوری بر تعداد نوساقه در هر گره بود. بیشترین و کمترین میزان پرآوری بترتیب در نمونه‌های کنترل و غلظت250 میلی مولار NaCl به دست آمد. در عین حال شوری اثر منفی معنی‌داری روی طول، وزن تر و وزن خشک شاخساره در جداکشت‌های تحت تأثیر نمک داشت. در هر سه سطح، تنش باعث کاهش پارامترهای رشدی و افت شاخص مک‌کینی شد. البته تفاوت شاخصی میان نمونه‌های تحت شوری 100 و 150 میلی مولار NaCl نسبت به هم در این پارامترها، مشاهده نشد. در عوض تفاوت میان شاخساره‌های رشد یافته در این دو غلظت (100و 150) با نمونه‌های شاهد و شوری 250 میلی مولار نمک، کاملاً برجسته و مشخص می‌باشد. بیشترین ارتفاع و طول برگ شاخساره‌ها با بترتیب 1/28 و 2/10 میلی متر در نمونه‌های شاهد و کمترین آن با 5/5 و 4/2 در نمونه‌های تحت تنش 250 میلی مولار نمک ثبت شد. همین روند کم و بیش در صفات رشدی وزن تر و خشک شاخساره‌ها تکرار شد. چنانکه نمونه شاهد با 196 و 24 میلی‌گرم بترتیب واجد بیشترین و نمونه تحت تنش 250 میلی مولار با بترتیب 39 و 6 میلی‌گرم کمترین وزن تر و خشک شاخساره در شرایط کشت درون شیشه شدند. محاسبه شاخص مک‌کینی نشان داد که نمونه‌های کنترل واجد کمترین میزان کلروز و نکروز شدگی و سطح بالایی از سبزی و سلامت بودند. در غلظت بالای نمک در محیط‌های کشت (250 میلی مولار)، عدد شاخص مک‌کینی بنحو معنی‌داری افزایش یافت و از 24/0 در کنترل به 74/2 در غلظت 250 میلی مولارنمک رسیدکه مؤید افزایش قابل توجه در میزان کلروزه و نکروزه شدن بافت‌ها است. در این خصوص تفاوت معنی‌داری میان نمونه‌های تحت تنش 100 میلی مولار نمک با کنترل مشاهده نمی شود. در غلظت 150 نیز هر چند شاخص مک‌کینی افزایش یافته، لیکن همچنان میزان آن کمتر از یک سوم مقادیر ثبت شده در غلظت 250 میلی مولار شوری بود. 

 

 

جدول 2- اثر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) بر میزان باززایی، صفات رشدی و شاخص مک‌کینی (MKI) گیاه Myrtus communis کشت شده در شرایط درون شیشه­ای. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P < است.

تیمار

درصد باززایی

تعداد نوساقه در هر گره

طول شاخساره

(میلی متر)

وزن تر شاخساره

(میلی گرم)

وزن خشک شاخساره (میلی گرم)

طول برگ

(میلی متر)

شاخص مک‌کینی (MKI)

شاهد

a0/0± 0/100

a3/0± 0/11

a9/0± 1/28

a17± 196

24±2 a

a3/1± 2/10

a24/0

100 میلی مولار NaCl

a9/0± 1/99

b3/1± 2/8

ab2/1± 7/24

b19± 147

b 3 ±16

ab8/0± 3/8

ab58/0

150 میلی مولار NaCl

a1/1± 9/95

c6/0± 5/5

bc8/0± 4/21

b13± 121

b 4 ±13

bc1± 1/7

bc86/0

250 میلی مولار NaCl

b4/1± 3/87

d2/0± 1/2

d6/0± 5/5

d7± 39

c 2 ±6

d5/0± 4/2

d84/2

 

 

محتوای نسبی آب برگ: افزایش غلظت نمک تا سطح 150 میلی‌مولار در محیط‌های کشت، اثر شاخصی بر محتوای نسبی آب برگ، نداشت (شکل 1- الف). بالاترین سطح RWC در جداکشت‌های تحت شرایط کنترل به میزان 5/77 درصد ثبت گردید. در مقابل در غلظت‌ 250 میلی‌مولار نمک، محتوای نسبی آب به شدت و تا سطح 52 درصد کاهش یافت. غلظت‌های 100 و 150 میلی مولار نمک با ثبت بترتیب 2/72 و 2/70 درصد، فاقد اختلاف متمایزکننده با نمونه‌های کنترل بودند. RWC یک شاخص بسیار مهم است که وضعیت آبی گیاه را نشان می‌دهد و در شرایط تنش بعنوان یک شاخص نشانگر پساییدگی بافت‌ها مورد سنجش قرار می‌گیرد.

اثر تنش شوری روی پایداری غشاهای زیستی: مقایسه محتوای MDA برگ مورد تحت تنش با نمونه‌های شاهد در شرایط کشت در شیشه جهت تعیین میزان پراکسیداسیون چربی‌های غشایی نشان داد که در سطوح بالای شوری (250 میلی مولار)، میزان MDA به شدت افزایش می‌یابد (شکل 1- ب). هم‌زمان شدت نشت الکترولیت‌ها از خلال غشاء (EL) نیز بنحو چشمگیری زیاد می‌شود (شکل 1- ج). در شوری 150 میلی‌مولار نمک، گرچه میزان نشت الکترولیت تا حدی بالا است، لیکن این میزان به طور برجسته‌ای نسبت به نمونه‌‌های تحت شوری250 میلی‌مولار کمتر است (کمتر از نصف). در غلظت150میلی‌مولار محتوای MDA در سطحی نسبتاً پائین‌تر و فاقد تفاوت معنی‌دار با نمونه‌های تحت شوری 100 و کنترل بود.

 

شکل 1- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) بر محتوای نسبی آب برگ (الف)، میزان مالون‌ دی‌ آلدئید(ب) و نشت الکترولیت از خلال غشاء (ج) و در شاخساره‌های کشت بافتی مورد معطر. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0P < است.

 

اثر تنش شوری روی محتوای رنگیزه‌ای و شاخص مقاومت: اثر تنش شوری بر محتوای کلروفیل و کاروتنوئید برگ نوشاخه‌های مورد بیانگر اثر منفی شوری بالا (250 میلی مولار نمک) بر محتوای کلروفیل (a و b) و کاروتنوئید برگ ها است (جدول3). در این شرایط محتوای هر سه نوع رنگیزه به شدت کاهش می‌یابد. در حالی‌که تیمار جداکشت‌ها با غلظت 100 میلی مولار NaCl فاقد هرگونه اثر مشخص در محتوای کلروفیل برگ‌ها در مقایسه با کنترل است، محتوای کاروتنوئید آن‌ها در این شرایط حدود 24 درصد افزایش یافته است. در غلظت 150 میلی مولار نمک در محیط‌های کشت، محتوای رنگیزه‌ای فاقد اختلاف معنی‌دار با نمونه‌های کنترل است. همچنین بیشترین درصد کاهش شاخص مقاومت در شوری 250 میلی مولار NaCl رخ داد. از این نظر تفاوت معنی‌دار میان غلظت‌های 100 و 150 میلی مولار نمک مشاهده نشد.

 

جدول 3- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) بر محتوای کلروفیل، کاروتنوئید و شاخص مقاومت در شاخساره‌های کشت بافتی  .Myrtus communisمقادیر کلروفیل و کاروتنوئید بر اساس میلی‌گرم بر گرم وزن تر نمونه (mg.g-1F.W) محاسبه شده است. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P <است.

شاخص مقاومت

% (TI)

کاروتنوئیدها

 

کلروفیل  b

 

کلرفیل  a

تیمار

-

b16/0 ±65/1

a07/0 ±554/0

a34/0 ±71/2

شاهد

a   65

a12/0 ±23/2

a08/0 ±499/0

a61/0 ±31/2

100 میلی مولار NaCl

a   53

ab17/0 ±91/1

ab05/0 ±462/0

ab19/±71/1 ±31/2±01/2

150 میلی مولار NaCl

b   41

c04/0 ±85/0

c03/0 ±261/0

c09/0 ±88/0

250 میلی مولار NaCl

 

اثر تنش شوری بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان: تنش شوری فعالیت آنزیم کاتالاز را در همه غلظت‌های نمک نسبت به کنترل افزایش داد (شکل 2- الف). بیشترین افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به شاهد در نمونه‌های تحت شوری 100 و پس از آن بترتیب در نمونه‌های تحت شوری150 و 250 میلی‌مولار نمک اتفاق افتاد. در حالی که اعمال شوری100 میلی‌مولار نمک باعث افزایش حدود 4/3 برابری در فعالیت آنزیم CAT شد، این افزایش در شوری‌های150 و250 میلی‌مولار NaCl بترتیب در حد 6/2 و 5/1 برابر نسبت به شاهد ثبت گردید. بررسی تغییرات فعالیت آنزیم APX در سطوح مختلف شوری بیانگر تغییرات کم و بیش مشابه آن با CAT در سطوح مختلف شوری است با این تفاوت که اولاً سطح و شدت نوسانات کمتر بوده و ثانیاً شوری 250 میلی مولار نمک، سطح فعالیت APX را به پائین‌تر از سطح کنترل رسانده است (شکل 2- ب). نتیجه‌ای که در فعالیت آنزیم CAT، به گونه‌ای معکوس رخ داده است. در این میان بالاترین فعالیت  آنزیم APX در نمونه‌های تحت تنش 100 میلی‌مولار نمک و کمترین میزان فعالیت آن در غلظت 250 میلی‌مولار NaCl قابل مشاهده است. برخلاف CAT و APX، بیشترین فعالیت آنزیم SOD در نمونه‌های کشت شده در غلظت150 میلی‌مولار نمک مشاهده شد (شکل 2- ج). نوعی روند افزایشی در فعالیت آنزیم SOD در مقایسه با کنترل تا غلظت 150 میلی‌مولار NaCl مشاهده می‌شوند که در غلظت‌ بالاتر نمک (250 میلی‌مولار NaCl) جریان آن معکوس می‌گردد. فعالیت SOD در شوری150 میلی‌مولار NaCl به 7/2 برابر میزان آن در نمونه‌های کنترل و در نمونه‌های رشد یافته در غلظت‌های 100 و 250 میلی‌مولار نمک بترتیب به 1/2 و 7/1 برابر فعالیت مشاهده شده در نمونه‌های کنترل رسید.

 

 

شکل2- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (الف)، آسکوربات پراکسیداز (ب) و سوپراکسید‌دسموتاز (ج) در شاخساره‌های کشت بافتی مورد معطر. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P < است.

 

اثر تنش شوری روی محتوای پرولین برگ: نتایج نشان داد که در تنش شوری شدید (250 میلی مولارنمک)، محتوای پرولین برگ‌های نوشاخه‌های کشت بافتی مورد، به طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل3-الف ). در مقابل در شوری 100 و 150 میلی مولار NaCl، محتوای پرولین به میزان 23 و 17 درصد افزایش یافته است. از این نظر تفاوت معنی‌داری میان دو سطح شوری 100 و 150 میلی‌مولار دیده نمی‌شود.

اثر تنش شوری روی محتوای ROS : تغییرات محتوای ROS طی مواجهه با سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) در نوشاخه‌های رشد یافته در شیشه گیاه مورد، در شکل 3-ب نشان داده شده است. نتایج بیانگر افزایش نسبتاً شدید محتوای ROS در نمونه‌های تحت تنش شدید شوری (250 میلی‌مولار نمک) است. در این غلظت از نمک، محتوای ROS تا 2/2 برابر نمونه‌های شاهد افزایش یافت. در حالی که محتوای ROS در نمونه تحت تنش150میلی‌مولار نمک فاقد اختلاف معنی‌دار با نمونه‌های شاهد است، در نمونه‌های تحت شوری100 میلی‌مولار، میزان ROS در سطحی پائین‌تر از نمونه‌های کنترل برآورد گردید.

اثر تنش شوری روی تغییرات طیف FT-IR : منحنی‌های حاصل از آنالیز طیف منطقه مادون قرمز در محدوده 900 تا 1800 هر تیمار در شکل 4 نشان داده شده است.

 

شکل 3- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl) بر محتوای پرولین (الف) و سطح ROS (ب) در شاخساره‌های کشت بافتی مورد معطر. مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0P <  است.

 

همان‌طور که ملاحظه می‌گردد، هر ناحیه طیف مربوط به ترکیبات خاصی می‌باشد. بنابر نتایج حاصل، حداکثر پیک مربوط به ترکیبات مختلف از جمله کربوهیدرات‌ها، اسیدهای نوکلئیک، چربی‌ها و پروتئین‌ها در تیمار‌های مختلف متفاوت بوده است. با توجه به اینکه ناحیه مربوط به آمید 2 در تمام منحنی‌های مربوط به تیمارهای کنترل و شوری تغییر قابل ملاحظه‌ای نداشته است. برای محاسبه میزان تغییرات ترکیبات مختلف، حداکثر جذب هر پیک با استفاده از حداکثر جذب پیک آمید 2، نرمال‌سازی شد. نتایج آورده شده در نمودار 3-5 نشان داد که تیماردهی نمونه‌ها با غلظت نمک 150 و 250 میلی‌مولار، باعث افزایش میزان کربوهیدرات‌ها در برگ‌های مورد شده است، در حالی‌که سطح کربوهیدرات در نمونه‌های کنترل و شوری 100 میلی‌مولار نمک از نظر آماری معنی‌دار نبود. در این میان بیشترین افزایش کربوهیدرات نسبت به نمونه کنترل در غلظت 250 نمک حاصل شد. در طیف FT-IR ناحیه مربوط به آمید 1 (حدود cm-11655) با میزان پروتئین در نمونه‌ها رابطه مستقیم دارد. نتایج بیانگر آن است که میزان پروتئین در نمونه‌های تحت تیمار با غلظت‌های 150 و 250 نمک، نسبت به نمونه‌های کنترل و غلظت 100 نمک، افزایش یافته است. در این رابطه بیشترین میزان افزایش پروتئین در نمونه‌های تحت تیمار با غلظت 250 میلی‌مولار NaCl، مشاهده شد. از سویی نتایج  FT-IRنشان داد که تیمار نمک در غلظت‌های150 و 250 باعث افزایش میزان چربی‌ها در برگ‌های مورد معطر شده است. در اینجا برخلاف آنچه که در مورد پروتئین و کربوهیدرات دیده شد، بیشترین میزان چربی در تیمار با غلظت میلی‌مولار نمک حاصل شد و افزایش بیشتر نمک به محیط کشت باعث کاهش روند تولید چربی‌ها در مورد شده است. نتایج همچنین نشان داد که شوری در غلظت‌های مورد استفاده در این آزمایش، تأثیری بر میزان اسید‌های نوکلئیک برگ‌های مورد معطر نداشته است.

بحث و نتیجه گیری

ترکیب محیط کشت نقش مهمی در موفقیت ریزازدیادی دارد. محیط‌های کشت مختلفی برای کشت موفق مورد، بمنظور استقرار و اندام‌زایی گیاه بهینه‌سازی شده است، از جمله این موارد می‌توان به دستورالعمل ریز‌‌ازدیادی از طریق کشت مریستم توسط Nobre (46) جنین زایی سوماتیک توسط  Parra و Amo-Marco (48) اشاره نمود. در تحقیق حاضر محیط کشت M8، غنی شده با 5/1میلی‌گرم بر لیتر BAP و2/0میلی‌گرم برلیترNAA، برای القای بیشترین تعداد نوساقه (11 عدد در هر گره جداکشت) برای گیاه مورد بهینه‌سازی گردید.   

 

شکل 4- منحنی‌های حاصل از آنالیز طیف منطقه مادون قرمز در محدوده 900 تا 1800 (الف) و نمودار مقایسه نسبتهای میزان کربوهیدرات به آمید 2 ، آمید 1 به آمید 2، لیپید به آمید 2 و اسیدهای نوکلئیک به آمید 2 (ب) در شاخساره‌های کشت بافتی  Myrtus communisتیمار شده با مقادیر سطوح مختلف تنش شوری (کنترل و غلظت‌های 100، 150 و 250 میلی مولار NaCl). مقادیر میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0P < است.

 

Shekafandeh (2007) بیشترین میزان پرآوری با 27 نوشاخه در هر گره جداکشت مورد را در یک محیط MS ½ اصلاح شده با 2 میلی‌گرم بر لیتر BPA و 2/0میلی‌گرم برلیتر NAA گزارش نموده است (56). در پژوهش Grigoriadou و  Leventakis(1999) نیز ایجاد حداکثر 3 نوساقه روی هر جداکشت‌ گرهی، در محیط MS اصلاح شده با 3 میکرومول BAP، 3/0 میکرومول GA3 و 05/0 میکرومول NAA، گزارش گردیده است (26). نتایج تا حدی مشابهی نیز توسط Şan و همکاران (2015) با ایجاد 4 نوساقه در هر جداکشت حاصل از کشت رأس ساقه در محیط MS حاوی 3/0 میلی‌گرم بر لیتر TDZ و 01/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA به دست آمده­ است (53). در این میان اما بالاترین نرخ پرآوری کشت بافت Myrtus با 8/34 نوساقه در هر جداکشت روی یک محیط MS حاوی 2 میلی‌گرم برلیتر BAP و2/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA توسط Scarpa و همکارانش (2000) گزارش شده است (54). شاید دلیل عمده این میزان تفاوت در میزان پرآوری جداکشت‌های گیاه مورد در شرایط کشت بافت را بتوان به تفاوت موجود در ژنوتیپ‌های متنوع مورد استفاده در تحقیقات مختلف نسبت داد. گیاهان بومی اقلیم مدینترانه‌ای از جمله M. communis، در طول حیات خود با تنش‌های محیطی مختلفی از جمله خشکی، شوری و تشعشع شدید خورشیدی مواجه‌اند (38). این گونه‌ها سطوح متفاوتی از تحمل به تنش را از خود نشان می‌دهند. شوری یکی از اصلی‌ترین این تنش‌ها است که از عوامل اصلی کاهنده رشد، محصول و پراکنش گیاهان در بوم­های خشکی است. تأثیر این تنش بر پارامترهای رشد و فیزیولوژی گیاه
M. communis در شرایط کشت در خاک و در شیشه، همواره مورد توجه محققین مختلفی بوده است (3و 21). مشخص شده که M. communis در مواجهه با تنش‌ها، شدت فتوسنتز خود را کاهش داده و میزان تنفس خود را در حد ثابتی نگه می­دارد (25). با این حال به دلیل اثرات ترکیبی تنش‌ها در محیط طبیعی، امکان بررسی پاسخ گیاهان به یک تنش خاص نظیر شوری به شیوه­ای مستقل وجود ندارد. نتایج تحقیق حاضر بیانگر وجود اثر منفی شوری بر شاخص­های رشدی نظیر طول، وزن تر و وزن خشک شاخساره و نیز تعداد نوساقه حاصل از جداکشت‌های مورد است. کاهش رشدی که می‌تواند به واسطه کاهش پتانسیل جذب آب، ورود میزان زیاد عنصر سدیم و نیز سایر عناصر (مانند کلر که به تدریج همراه سدیم جذب می‌شوند) به درون گیاه باشد. در هنگام شوری بسیاری از عناصر به طور غیر‌متعارف جذب ریشه شده و سمیت زیادی برای گیاه ایجاد می‌کنند که می‌تواند در ادامه متابولیسم طبیعی گیاه را مختل نماید. این امکان نیز وجود خواهد داشت که در این شرایط، گیاه بخشی از انرژی حاصل از فتوسنتز را به جای تخصیص به رشد، به تولید محلول­های سازگارکننده بمنظور تعدیل اسمزی سلول‌ها اختصاص دهد (10). در تحقیقی Di Cori و همکارانش (2013) گزارش کردند که غلظت بالای NaCl (250 میلی‌مولار) پس از 15 و 30 روز می‌تواند طول ساقه مورد را در مقایسه با محیط کشت شاهد، کاهش دهد (21). تیمار گیاهچه‌ها با غلظت‌های کمتر از 100 میلی‌مولار نمک در این حال، تأثیری روی کاهش طول ساقه نداشت. مشابه با نتایج ما، آنها نشان دادند که مواجهه گیاه با شوری باعث کاهش ضریب MKI در مقایسه با گیاهان شاهد می‌شود. کاهش ارزش MKI در گیاهان تحت تنش شوری مؤید افزایش درصد کلروز و نکروزشدگی آن‌ها در مقایسه با گیاهان شاهد است. نتیجه‌ای که توسط تحقیقات سایر محققین نیز در مواجهه با تنش شوری نیز گزارش شده است (16، 35 و 57).

بنابر نتایج حاصل، محتوای نسبی آب برگ تنها در شوری بالا (غلظت 250 میلی مولار نمک) با کاهش معنی دار مواجه شد. به نظر می‌رسد در سطوح پائین‌تر نمک، سازگاری‌های اسمزی تا حدی باعث جلوگیری از کاهش شدید سطح RWC شده است. اصولاً کاهش پتانسیل آب، یکی از فوری‌ترین پاسخ‌های گیاهان تحت تنش شوری است. نتایج مشابهی در سایر گیاهان تحت تنش شوری همچون نخود (24) و کهور سفید (40) گزارش شده است. افزایش ناپایداری غشاء‌های زیستی مورد معطر در غلظت‌های بالای نمک که با افزایش محتوای مالون‌دی‌آلدهید و نشت الکترولیت به محیط قابل رصد است، یکی از متداول‌ترین پاسخ‌های گیاهان به تنش شوری محسوب می‌شود که حتی در گیاهان شاخص مقاوم به شوری نظیر سالیکورنیا هم در سطح مشخصی از نمک، دیده می‌شود (5). در گزارشی، افزایش نشت الکترولیت در گیاه شمعدانی تحت تنش شوری نیز توسط حسنوند و همکاران (1394) گزارش گردیده است (1). در شوری بالا، هنگامی که ظرفیت دفاع آنتی‌اکسیدانی کاهش می‌یابد، تشکیل رادیکال‌های آزاد افزایش یافته و منجر به تجزیه و تخریب بسیاری از متابولیت‌های سلولی می‌گردد. حمله ROSها به لیپیدهای غشای پلاسمایی در سلول‌ بر ساختار، سیالیت و نفوذپذیری غشای سلولی اثرات تخریبی وارد آورده و در این حالت نشت الکترولیت‌ها از خلال غشاء و پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع لیپیدها افزایش می‌یابد (52). افزایش ناپایداری غشاء در گیاهانی متعددی از جمله کدوحلوایی (55)، خیار (34) و رزماری (32) تحت تنش بالای شوری گزارش شده است. اثر کاهنده نمک روی محتوای کلروفیل و کاروتنوئید و شاخص مقاومت گیاه مورد معطر حاصل از این تحقیق، با روند کلی کاهش رنگیزه‌های فتوسنتزی گیاهان تحت تنش شوری، مطابقت دارد (47). کاهش کلروفیل در مواجهه با شوری می‌تواند ناشی از کاهش سنتز یا تجزیه آنزیمی این رنگیزه باشد (61). همچنین تخریب رنگدانه‌ها در شرایط تنشی می‌تواند تا حد زیادی متأثر از تنش‌های اکسیداتیو موازی با تنش شوری صورت پذیرد. نتایج مشابهی در مواجهه گیاهان مختلف با تنش شوری گزارش شده است (32). در بسیاری از موارد این چنینی، کاهشی در محتوای رنگدانه‌ای در اثر تنش را، به تخریب فراساختاری پلاستیدها و غشاهای تیلاکوئیدی نسبت می‌دهند (6). با این وجود افزایش میزان کاروتنوئید در گیاه مورد تحت تنش در غلظت 100 میلی مولار نمک را شاید بتوان نقش کاروتنوئید‌ها بعنوان بخشی از مکانیزهای دخیل در حفاظت سلول در مقابله با تنش نسبت داد که از صرفه‌جویی بهینه‌تری در انرژی بهره می‌برند (7). از آنجایی که کاروتنوئید‌ها عمدتاً در ارتباط با مراکز واکنش فتوسنتزی یافت می‌شوند که در تنش‌ها مستعد آسیب هستند، مشاهده کاهش عمومی کاروتنوئید‌ها در سطوح بالای شوری دور از انتظار نیست (20). بررسی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان برگ‌های مورد، مؤید اثر افزایشی شوری روی فعالیت هر سه آنزیم تحت بررسی (CAT، APX و SOD) در غلظت‌های 100 و150میلی مولار نمک بود. با این توضیح که CAT و APX در غلظت 100 و SOD در غلظت 150 میلی­مولار نمک بیشترین میزان افزایش فعالیت را از خود نشان دادند. یک افت معنی‌دار و مشخص در غلظت 250 میلی­مولار نمک در فعالیت هر سه آنزیم ثبت گردید. در مقابل میزان ROS در این غلظت به طور معنی‌داری افزایش یافته است. در شرایط نامساعد محیطی، بسته شدن روزنه‌ها سبب کاهش غلظت CO2 در بافت مزوفیل، اختلال در واکنش‌های تثبیت کربن و در نهایت افزایش تولید رادیکال‌های سوپر اکسید (O2-)، پراکسید هیدروژن ((H2O2 و رادیکال هیدروکسیل (OH-) می‌گردد که با صدمات تخریبی فراوانی در سلول همراه است (19و 51). تولید این مولکول‌ها، یکی از اجتناب ناپذیرترین عواقب تنش خشکی در اجزای مختلف سیستم‌های سلولی از جمله کلروپلاست، پراکسی‌زوم‌ها و میتوکندری‌ها است (49). افزایش فعالیت آنزیم های آنتی‌اکسیدانی (CAT، APX و SOD) در غلظت‌های 100 و 150، بخشی از نقش کلیدی این آنزیم‌ها در مسیر سم‌زدایی از ROSها، حذف مالون‌دی‌آلدهید و حفظ ثبات و پایداری دیواره سلولی است. کاهش فعالیت این آنزیم‌ها در غلظت‌های بالای شوری (250 میلی مولار) نسبت به غلظت‌های کمتر (100، 150 و حتی کنترل در مورد APX) را شاید بتوان به اثرات منفی عمومی نمک بر مسیرهای سنتز پروتئین‌های آنتی‌اکسیدانی نسبت داد (47). برابر نتایج حاصل از آنالیز FTIR، افزایش غلظت نمک اثری روی اسیدهای نوکلئیک نداشته و آن به این معنی است که هیچ یک از سطوح تنش شوری به کار رفته در این تحقیق، نتوانسته باعث ایجاد تغییرات گسترده و شکست ساختاری در ژنوم و تجزیه آن شود. در مقابل، آنالیز FTIR همچنین نشان داد که گیاه مورد تحت تنش شوری به نوعی محتوای کربوهیدرات، آمید (تا سطح 250 میلی مولار نمک)، پروتئین و لیپید (تا سطح 150 میلی‌مولار نمک) را درون سلول­هایش افزایش داده است­. قبلاً نشان داده شده که پاسخ‌هایی مشابه با آنچه در تنش خشکی رخ می‌دهد، در تنش شوری نیز قابل ملاحظه است (45). در این راستا، گیاهان تلاش می‌کنند که پتانسیل اسمزی خود را از طریق افزایش سنتز ترکیبات سازگارکننده بمنظور جذب بهتر آب در گیاه تحت تنش شوری، ارتقاء دهند. پرولین، کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌های محلول از جمله مهمترین سازگارکننده‌ها هستند که در سیتوزول سنتز و انباشته می‌شوند تا به جذب بهتر آب در مواجهه با شوری و حفظ تورژسانس برای تداوم رشد، کمک کنند (31). برخی محققین به نقش پرولین بعنوان جاروب‌کننده رادیکال‌های آزاد و محافظ سلول ها در برابر آسیب‌های اکسیداتیو اشاره کرده اند (29). پرولین یک اسمولیت سازگار رایج است و با تنظیم اسمزی و محافظت از غشاها، پروتئین‌ها و آنزیم‌ها از اثرات مخرب تنش‌های اسمزی در گیاهان جلوگیری می‌کند (2).

تغییر سطح لیپید در گیاهان واجد اسانس مانند مورد معطر در مواجهه با تنش را می‌توان بر اثرگذاری شرایط تنش محیطی بر میزان تولید محصولات متابولیسم ثانویه و از جمله اسانس‌های روغنی در این گیاهان قلمداد نمود (8). تأثیر مثبت و منفی نمک بر تولید اسانس و در کل سطح لیپید گیاهان به سطح شوری وارده به گیاه بستگی دارد. اثر مثبت در سطوح پائین شوری و اثر عکس آن در غلظت‌های بالاتر را در گیاهانی همچون گشنیز(Coriandrum sativum)  (44)، گل همیشه بهار (Calendula officinalis) (33) و مریم گلی (Salvia officinalis) (58) گزارش گردیده است. دراین رابطه افت کمیت پروتئین و لیپید در غلظت 250 میلی‌مولار نمک را احتمالاً باید به حساس بودن مسیرهای بیوسنتز آنها به غلظت‌های بالای نمک نسبت داد.

سپاسگزاری

این تحقیق تحت حمایت دانشگاه های پیام نور مرکز اردستان و دانشگاه کاشان انجام شده است. نگارندگان بر خود لازم می‌دانند ضمن تشکر از مدیران ارشد دانشگاه‌های مذکور، از زحمات سرکار خانم مهدیه صادقی، مدیر آزمایشگاه پیام نور اردستان تشکر و قدردانی نمایند.

  1. 1- حسنوند، ف.، رضایی‌نژاد، ع.، و فیضیان، م.، 1394. تأثیر سیلیسیک اسید بر برخی ویژگی‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی شمعدانی معطر(Pelargonium graveolens L.) تحت تنش شوری ناشی از کلرید کلسیم، مجله پژوهش های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، دوره 30، شماره 2، صفحات 309-317.

    2- عباسی فر، ا.ر.، محمدی خلیفه لوئی، ز.، خدیوی، ع.، و اکرمیان، م.، 1398. تأثیر پرولین و 24-اپی براسینولید بر شاخص‌های رشد و صفات بیوشیمیایی مرزه تابستانه (.Satureja hortensis L). مجله پژوهش های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، دوره 32، شماره 4، صفحات 873-885.

     

    1. Acosta-Motos, J.R., Diaz-Vivancos, P., Álvarez, S., Fernández-García, N., Sánchez-Blanco, M.J., and Hernández, J.A., 2015. NaCl-induced physiological and biochemical adaptative mechanisms in the ornamental Myrtus communis L. plants. Journal of Plant Physiology, 183, PP: 41-51.
    2. Aebi, H., 1984. Catalase in vitro, Methods in Enzymology, Elsevier, 105, PP: 121-126.
    3. Aghaleh, M., Niknam, V., Ebrahimzadeh, H., and Razavi, K., 2009. Salt stress effects on growth, pigments, proteins and lipid peroxidation in Salicornia persica and S., europaea., Biologia Plantarum, 53(2), PP: 243-248.
    4. Ahmad, M.A., Murali, P., and Panneerselvam, R., 2013. Drought stress induced biochemical alterations in two varieties of Paspalum scrobiculatum L., International Journal of Current Science, 7, PP: 80-96.
    5. Asada, K., 1999. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons, Annual Review of Plant Biology, 50(1), PP: 601-639.
    6. Aziz, E.E., Al-Amier, H., and Craker, L.E., 2008. Influence of salt stress on growth and essential oil production in peppermint, pennyroyal, and apple mint. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 14(1-2), PP: 77-87.
    7. Bates, L., Waldren, R., and Teare, I., 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies, Plant and soil, 39(1), PP: 205-207.
    8. Bayuelo-Jiménez, J.S., Debouck, D.G., and Lynch, J.P., 2003. Growth, gas exchange, water relations, and ion composition of Phaseolus species grown under saline conditions, Field Crops Research, 80(3), PP: 207-222.
    9. Beauchamp, C., and Fridovich, I., 1971. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels, Analytical biochemistry, 44(1), PP: 276-287.
    10. Bindschedler, L.V., Minibayeva, F., Gardner, S.L., Gerrish, C., Davies, D.R., and Bolwell, G.P., 2001. Early signalling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured French bean cells involve cAMP and Ca2+, New Phytologist, 151(1), PP: 185-194.
    11. Camarda, I., and Valsecchi, F., 1983. Myrtaceae. In. I. Camarda e F. Valsecchi. Alberi earbusti spontanei della Sardegna, Edizioni Gallizzi, Sassari,45, PP: 370-374.
    12. Carillo, P., Annunziata, M.G., Pontecorvo, G., Fuggi, A., and Woodrow, P., 2011. Salinity stress and salt tolerance. Abiotic stress in plants-mechanisms and adaptations. IntechOpen, 1, pp: 21-38.
    13. Cassaniti, C., Leonardi, C., and Flowers, T.J., 2009. The effects of sodium chloride on ornamental shrubs, Scientia Horticulturae, 122(4), PP: 586-593.
    14. Chan, Z., Grumet, R., and Loescher, W., 2011. Global gene expression analysis of transgenic, mannitol-producing, and salt-tolerant Arabidopsis thaliana indicates widespread changes in abiotic and biotic stress-related genes, Journal of Experimental Botany, 62(14), PP: 4787-4803.
    15. Christaki, E., Bonos, E., Giannenas, I., and Florou-Paneri, P., 2012. Aromatic plants as a source of bioactive compounds, Agriculture, 2(3), PP: 228-243.
    16. Comba, M.E., Benavides, M.P., and Tomaro, M.L., 1998. Effect of salt stress on antioxidant defence system in soybean root nodules, Functional Plant Biology, 25(6), PP: 665-671.
    17. Demiral, T., Turkan, I., Sekmen, A.H., and Ismail, T., Chapter 8 - Signalling Strategies During Drought and Salinity, Recent News, Advances in Botanical Research, Academic Press, Volume 57, PP: 293-317.
    18. Demmig-Adams, B., and Adams Iii, W., 1992. Photoprotection and other responses of plants to high light stress, Annual Review of Plant Biology, 43(1), PP: 599-626.
    19. Di Cori, P., Lucioli, S., Frattarelli, A., Nota, P., Tel-Or, E., Benyamini, E., Gottlieb, H., Caboni, E., and Forni, C., 2013. Characterization of the response of in vitro cultured Myrtus communis L. plants to high concentrations of NaCl. Plant Physiology and Biochemistry, 73, PP: 420-426.
    20. Erturk, U., Sivritepe, N., Yerlikaya, C., Bor, M., Ozdemir, F., and Turkan, I., 2007. Responses of the cherry rootstock to salinity in vitro, Biologia Plantarum, 51(3), PP: 597-600.
    21. FAO, 2013. The state of food and agriculture Rome, FAO.
    22. Fedina, I., and Tsonev, T., 1997. Effect of pretreatment with methyl jasmonate on the response of Pisum sativum to salt stress, Journal of Plant Physiology, 151(6), PP: 735-740.
    23. Gratani, L., Catoni, R., and Varone, L., 2013. Morphological, anatomical and physiological leaf traits of Q., ilex, P., latifolia, P., lentiscus, and M., communis and their response to Mediterranean climate stress factors, Botanical Studies, 54(1), 35 p.
    24. Grigoriadou, K., and Leventakis, N., 1999. Preliminary study on large scale in vitro propagation of Myrtus communis L., IV International Symposium on New Floricultural Crops, 541 p.
    25. Gucci, R., Massai, R., Casano, S., Gravano, E., and Lucchesini, M., 1997. The effect of drought on gas exchange and water potential in leaves of seven Mediterranean woody species. Impacts of global change on tree physiology and forest ecosystems, Springer, PP: 225-231.
    26. Heath, R.L., and Packer, L., 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I., Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation, Archives of Biochemistry and Biophysics, 125(1), PP: 189-198.
    27. Hong, Z., Lakkineni, K., Zhang, Z., and Verma, D.P.S., 2000. Removal of feedback inhibition of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress., Plant Physiology, 122(4), PP: 1129-1136.
    28. Ings, J., Mur, L.A., Robson, P.R., and Bosch, M., 2013. Physiological and growth responses to water deficit in the bioenergy crop Miscanthus x giganteus, Frontiers in plant science, 4, 468 p.
    29. Kerepesi, I., and Galiba, G., 2000. Osmotic and salt stress-induced alteration in soluble carbohydrate content in wheat seedlings, Crop Science, 40(2), PP: 482-487.
    30. Kiarostami, Kh., Mohseni, R., and Saboora, A., 2010. Biochemical changes of Rosmarinus officinalis under salt stress. Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 6(3), pp: 114-122.
    31. Khalid, K.A., and da Silva, J.A.T., 2010. Yield, essential oil and pigment content of Calendula officinalis L., flower heads cultivated under salt stress conditions. Scientia Horticulturae, 126(2), PP: 297-305.
    32. Khan, M.M., Al-Mas’oudi, R.S., Al-Said, F., and Khan, I., 2013. Salinity effects on growth, electrolyte leakage, chlorophyll content and lipid peroxidation in cucumber (Cucumis sativus L.), International Conference on Food and Agricultural Sciences Malaysia: IACSIT Press.
    33. Koffler, B.E., Luschin-Ebengreuth, N., and Zechmann, B., 2015. Compartment specific changes of the antioxidative status in Arabidopsis thaliana during salt stress. Journal of Plant Biology, 58(1), PP: 8-16.
    34. Lichtenthaler, H., and Welburn, W., 1983. Determination of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents." Biochemical Society Transaction, pp: 591-592.
    35. Liu, C., Liu, Y., Guo, K., Fan, D., Li, G., Zheng, Y., Yu, L. and Yang, R. 2011. Effect of drought on pigments, osmotic adjustment and antioxidant enzymes in six woody plant species in karst habitats of southwestern China, Environmental and Experimental Botany, 71(2), PP: 174-183.
    36. Llusia, J., Peñuelas, J., Alessio, G., and Ogaya, R., 2011. Species-specific, seasonal, inter-annual, and historically-accumulated changes in foliar terpene emission rates in Phillyrea latifolia and Quercus ilex submitted to rain exclusion in the Prades Mountains (Catalonia), Russian Journal of Plant Physiology, 58(1), PP: 126-132.37.
    37. McKinney, H., 1923. Influence of soil temperature and moisture on infection of wheat seedlings by Helminthosporium sativum, Journal of Agricultural Research, 26(5), PP: 195-218.
    38. Meloni, D.A., Gulotta, M.R., Martínez, C.A., and Oliva, M.A., 2004. The effects of salt stress on growth, nitrate reduction and proline and glycinebetaine accumulation in Prosopis alba, Brazilian Journal of Plant Physiology, 16(1), PP: 39-46.
    39. Mendes, M., Gazarini, L., and Rodrigues, M., 2001. Acclimation of Myrtus communis to contrasting Mediterranean light environments-effects on structure and chemical composition of foliage and plant water relations, Environmental and Experimental Botany, 45(2), PP: 165-178.
    40. Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 15(3), 41, PP: 473-497.
    41. Nakano, Y., and Asada, K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts, Plant and cell physiology, 22(5), PP: 867-880.
    42. Neffati, M., and Marzouk, B., 2008. Changes in essential oil and fatty acid composition in coriander (Coriandrum sativum L.) leaves under saline conditions, Industrial crops and products, 28(2), PP: 137-142.
    43. Nemati, I., Moradi, F., Gholizadeh, S., Esmaeili, M., and Bihamta, M., 2011. The effect of salinity stress on ions and soluble sugars distribution in leaves, leaf sheaths and roots of rice (Oryza sativa L.) seedlings, Plant, Soil and Environment, 57(1), PP: 26-33.
    44. Nobre, J., 1994. In vitro shoot proliferation of Myrtus communis L., from field-grown plants, Scientia horticulturae, 58(3), PP: 253-258.
    45. Parida, A.K., and Das, A.B., 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review, Ecotoxicology and Environmental Safety, 60(3), PP: 324-349.
    46. Parra, R., and Amo-Marco, J., 1998. Secondary somatic embryogenesis and plant regeneration in myrtle (Myrtus communis L.), Plant Cell Reports, 18(3), PP: 325-330.
    47. Phaniendra, A., Jestadi, D.B., and Periyasamy, L., 2015. Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 30(1), PP: 11-26.
    48. Philpot, M.J., 2004. The sacred tree in religion and myth, Dover Publications, 192 p.
    49. Sairam, R. K., and Saxena, D. C., 2000. Oxidative stress and antioxidants in wheat genotypes: possible mechanism of water stress tolerance, Journal of Agronomy and Crop Science, 184(1), PP: 55-61.
    50. Sairam, R.K., Rao, K.V., and Srivastava, G., 2002. Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science, 163(5), PP: 1037-1046.
    51. Şan, B., Karakurt, Y., and Dönmez, F., 2015. Effects of thidiazuron and activated charcoal on in vitro shoot proliferation and rooting of Myrtle (Myrtus communis L.), Journal of Agricultural Sciences, 21(2), PP: 177-183.
    52. Scarpa, G.M., Milia, M., and Satta, M., 2000. The influence of growth regulators on proliferation and rooting of in vitro propagated myrtle, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 62(3), PP: 175-179.
    53. Sevengor, S., Yasar, F., Kusvuran, S., and Ellialtioglu, S., 2011. The effect of salt stress on growth, chlorophyll content, lipid peroxidation and antioxidative enzymes of pumpkin seedling. African Journal of Agricultural Research, 6(21), PP: 4920-4924.
    54. Shekafandeh, A., 2007. Effect of different growth regulators and source of carbohydrates on in and ex vitro rooting of Iranian myrtle. International Journal of Agricultural Research, 2, PP: 152-158.
    55. Slabu, C., Zörb, C., Steffens, D., and Schubert, S., 2009. Is salt stress of faba bean (Vicia faba) caused by Na+ or Cl–toxicity? Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 172(5), PP: 644-651.
    56. Taarit, M.B., Msaada, K., Hosni, K., and Marzouk, B., 2010. Changes in fatty acid and essential oil composition of sage (Salvia officinalis L.) leaves under NaCl stress, Food Chemistry, 119(3), PP: 951-956.
    57. Tattini, M., Traversi, M.L., Castelli, S., Biricolti, S., Guidi, L., and Massai, R., 2009. Contrasting response mechanisms to root-zone salinity in three co-occurring Mediterranean woody evergreens: a physiological and biochemical study. Functional Plant Biology, 36(6), PP: 551-563.
    58. Tavakkoli, E., Fatehi, F., Coventry, S., Rengasamy, P., and McDonald, G.K., 2011. Additive effects of Na+ and Cl–ions on barley growth under salinity stress, Journal of Experimental Botany, 62(6), PP: 2189-2203.
    59. Yang, F., Xiao, X., Zhang, S., Korpelainen, H., and Li, C., 2009. Salt stress responses in Populus cathayana Rehder, Plant Science, 176(5), PP: 669-677.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 35, Issue 1
April 2022
Pages 125-141
  • Receive Date: 21 September 2019
  • Revise Date: 17 July 2020
  • Accept Date: 28 September 2020