Investigation of cell- type specific gene expression pattern in Volvox carteri alga under light stress conditions

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran

2 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran

3 Department of Cellular and Developmental Biology of Plants, Faculty of Natural Sciences, University of Bielefeld, Bielefeld, Germany

Abstract

UV-B radiation can penetrate into water deeper than each light wavelength. Complex eukaryotic organisms evolved in response to developmental and environmental signs such as UV-B radiation through the selective expression of a specific section of the same genome in different cell types. The foundation of multicellular organisms needs genetically predefined signaling pathways in diverse cell types. Cell types should be enabled to modulate appropriate adaptive reactions in ever-changing comprehensive environment. The multicellular green alga Volvox carteri consists of only two types with a distinct division of function. Here, the RNA-seq technique was employed to investigate transcriptome profiling of two separated cell types of V. carteri under 1h UV-B treatment. Our results revealed that almost one-third of the V. carteri genes (8392 genes out of 23778 genes) were significantly differentially expressed between the two cell types. The results showed that in somatic cells, potassium ion transmembrane transport and RNA phosphodiester bond hydrolysis were activated. However, in reproductive cells, mismatch repair (MMR), nucleosome assembly and chromosome assembly occurred after UV-B radiation. RNA-dependent DNA biosynthetic process was a common response of both cells to UV-B radiation. The cell type-specific genes were examined to determine cell function in response to UV-B radiation. Overall, two cell-types have initiated defense mechanisms and decreased the sensitivity of alga to UV-B radiation.

Keywords

Main Subjects

بررسی الگوی بیان ژن ویژه تیپ سلولی در جلبک Volvox carteri تحت شرایط تنش نوری

سولماز اخطاری1، کریم حسن‌پور2، جعفر رازقی1*، آرش کیانیان مومنی3 و علی موافقی1

1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی

2 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه ژنتیک و اصلاح نژاد دام

3 آلمان، بیله فلد، دانشگاه بیله فلد، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی سلولی و تکوینی گیاهی

تاریخ دریافت: 13/11/97              تاریخ پذیرش: 11/2/98

چکیده

 طول موج­های UV-B عمیقتر از هر طول موج دیگری به آب نفوذ می­کنند. موجودات یوکاریوتی پیچیده از طریق بیان انتخابی بخش ویژه­ای از ژنوم یکسان در انواع مختلف سلول، در پاسخ به نشانه­های نموی و محیطی از قبیلUV-B  تکامل‌یافته­اند. تشکیل موجودات پرسلولی به مسیر­های سیگنالینگ ژنتیکی از پیش تعریف شده در انواع مختلف سلول نیاز دارد. انواع مختلف سلول باید بتوانند پاسخ­های سازشی مناسب را نسبت به محیط در حال تغییر پیرامون خود، تنظیم کنند. جلبک سبز پرسلولی Volvox carteri تنها از دو تیپ سلولی با تقسیم کار بارز تشکیل شده است. در اینجا، از تکنیک RNA-seq برای بررسی پروفایل ترنسکریپتوم دو تیپ سلولی تفکیک شده V. carteriتحت یک ساعت تابش UV-B استفاده شد. نتایج نشان داد که تقریبا یک سوم از ژن­ها (8392 ژن از 23778 ژن) بطور معنی­داری بین دو تیپ سلولی بیان متفاوتی داشته­اند. برای شناسایی نحوه عملکرد­ هر یک از سلول­ها در پاسخ به تابش UV-B، ژن­های اختصاصی آنها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در سلول­های سوماتیک، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودی­استراز RNA فعال شده‌اند. درحالیکه در سلول­های زایشی، ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، گردایش نوکلئوزوم و کروموزوم بعد از تابش UV-B رخ­داده­است. فرایند بیوسنتز DNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بوده‌است. هر دو تیپ سلولی در مجموع سازوکار­های دفاعی را آغاز­کرده­اند و باعث کاهش حساسیت جلبک به این اشعه شده­اند.

واژه های کلیدی: Volvox carteri، تابش UV-B، ترنسکریپتوم، RNA-seq، سلول­های زایشی و سوماتیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 09144033450، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

در زیست شناسی همواره این سوال مطرح بوده است که چگونه موجودات پرسلولی، فرایند­های سلولی و فیزیولوژی خود را در پاسخ به نشانه­های محیطی مانند نور در روش ویژه نوع بافت/سلول (Tissue/cell-type specific-manner) تنظیم می­کنند. انواع مختلف سلول مطابق با نیازهایشان می­توانند مسیرهای متمایز سیگنالینگ نوری را راه­اندازی کنند. بنابراین، مسیر­های سیگنالینگ نور از پیش تعریف شده ویژه تیپ سلولی (Cell type-specific)، در طول تکامل توسعه یافته­اند. تنظیم پاسخ­های نموی و سازشی بوسیله نور پدیده­ای است که همواره مورد توجه بوده­است. با این‌حال، در مورد مکانیسم­های مولکولی که سیگنالینگ نوری ویژه تیپ سلولی را سازماندهی می‍کنند، شناخت کمی وجود دارد.

تابش UV-B خورشیدی که به سطح زمین می­رسد تنها مربوط به درصدی جزئی از کل انرژی خورشیدی است، اما تغییرات قابل توجهی را در محیط زیست اعمال می­کند. اثرات مخرب UV در جلبک­ها بر رشد (32)، مورفولوژی (56)، تکثیر (10)، تحرک (16)، تنفس (23)، photobleaching کلروفیلa، کاهش فتوسنتز (44)، کاهش محتوای کلروفیل (59)، تخریب پروتئین­های دریافت کننده نور (40)، تغییر پروفایل پروتئین (3)، مهار آنزیم­های متابولیسم نیتروژن (49) و سایر فعالیت­های آنزیمی(48) گزارش شده است. اشعه UV-B براحتی توسط اسید­نوکلئیک و کروماتوفور­های پروتئین جذب می­شود و مشارکت این ترکیبات در پاسخ موجودات به اشعه UV-B مستند شده‌است (22). دخالت این ترکیبات در پاسخ‌های بیولوژیکی به UV-B نشان می­دهد که اگر سیستم­های بیولوژیکی در معرض تابش UV-B قرار گیرند، سنتز پروتئین و فعالیت­های آنزیمی می­تواند تحت تاثیر قرارگیرد (51). در حال حاضر، جلبک­ها نه­تنها برای اینکه سپری محافظ را در برابر اشعه­هایUV توسعه داده­اند بلکه بعنوان یکی از قدیمی­ترین موجودات تولید کننده اکسیژن برای درک بهتر سازگاری به  UV-Bمورد توجه هستند. اشعهUV-B  می­تواند منجر به فعالسازی سازوکار­های دفاعی شود که در سطح رونویسی تنظیم شده­اند (33).

Volvox carteriاز ساده­ترین موجودات پر­سلولی متشکل از دو تیپ سلولی، با سازمان­یابی منحصر بفرد، فتواتوتروف، متحرک، با قطر 0.5 تا 2 میلیمتر و دوگانگی جنسی نر- ماده است (17 و 28). در طبیعت، در حوضچه­های آب شیرین، گودال­ها و نهرآب­ها زندگی می­کند و تا زمانیکه شرایط مطلوب است بصورت رویشی تکثیر می­شود. هر دو جلبک نر و ماده شامل تقریبا 4000-2000 سلول سوماتیک کوچک، با تمایزیابی نهایی و دو تاژکی هستند که در سطح جسم کروی شفافی از ماتریکس خارج سلولی غنی از گلیکوپروتئین قرار دارند. علاوه بر این، تقریبا 16 سلول زایشی بزرگ (گونیدی) (Reproductive cells (Gonidia)) و غیرمتحرک در زیر صفحات سلولی سوماتیک واندکی در زیر سطح اسفروئید قرار دارند. هر سلول یک کلروپلاست جامی شکل بزرگ برای انجام فتوسنتز دارد (28). سلول­های سوماتیک (Somatic cells) برای حرکت و نورگرایی تخصص یافته­اند، توانایی تقسیم شدن را از دست داده­اند و دستخوش مرگ برنامه­ریزی شده می­شوند. در حالیکه، سلول­های زایشی برای زادآوری تخصص یافته­اند و بصورت بالقوه فنا ناپذیرند (30 و 31). موجودات آبزی متحرک مانند Euglena gracilis در سرتاسر ستون آبی مهاجرت می­کنند تا با استفاده از ترکیبات گراویتاکسیس (Gravitaxis) و فتوتاکسیس (Phototaxis) موقعیت بهینه­ای را برای رشد فتواتوتروف شناسایی کنند در­حالیکه از تنش نوری بالقوه اجتناب­ نمایند (45). بنابراین، اگر­چه ممکن است V. carteri استراتژی­های متحرک اجتناب از UV-B را نشان­دهد اما در مورد سازش به تابش UV-B در آب، این ارگانیسم می­بایست اطمینان حاصل نماید که سلول­هایش از تابش فعال موثر برای فتوسنتز جلوگیری نمی­کنند (18). طول موج­های UV-B عمیقتر از نورهایی با طول موج­های بلندتر به آب نفوذ می­کنند. از طرفی، UV-B در سیستم­های آب شیرین بواسطه مقدار بسیار بالای مواد آلی محلول، معمولا سریعتر از سیستم­های دریایی تقلیل می­یابد. با این­حال، هنوز ممکن است که UV-B به عمق قابل توجهی نفوذ کند و در سیستم­های آب شیرین اهمیت یابد (11). بنابراین، برای درک تغییرات فیزیولوژیکی در سطح مولکولی در پاسخ به اثرات تابش UV-B با دوز پایین(0.056 mw.cm-2) ، تغییرات بیان ژن در سلول­های تفکیک شده جلبک V. carteri، در مقایسه با هم با استفاده از تکنیک RNA-seq مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. انتظار می­رود که پاسخ و عملکرد تیپ­های سلولی زایشی و سوماتیک در جهت سازش به تابش UV-B باشد.

 

مواد و روشها

شرایط کشت و رشد جلبک: جلبک Volvox carteri f.nagariensis female strain Eve 10 تیپ وحشی از دانشگاه بیله­فلد، آلمان بدست آمد و مورد استفاده قرار­گرفت. کشت­ها در محیط کشت ولوکس (43) در دمای 30-28 درجه سانتیگراد، چرخه 8-16 ساعت تاریکی- نورسفید فلورسنت (10000 لوکس) با میانگین100 μmol photons m-2s-1 تابش فعال فتوسنتزی نگهداری شدند.

تفکیک سلول­های زایشی و سوماتیک: کمی قبل از آغاز تقسیم شکافتگی، سلول­ها جداسازی شدند. برای بدست آوردن سلول­های زایشی، اسفروئید­ها در دستگاه (B. Braun, Melsungen, Germany) Dounce homogenizer 50 μm شکسته شد. سوسپانسیون سلولی بترتیب، ازفیلترهایμm  100و μm 40 عبور داده شد. سلول­های زایشی با استفاده از سانتریفیوژ جدا شدند (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo). فیلتر μm  10برای جداسازی سلول­های سوماتیک باقیمانده بکار برده­شد. در مرحله بعد سلول­های زایشی باقیمانده بر روی فیلتر چندین مرتبه با محیط کشت Volvox شسته شد و بررسی نهایی برای اطمینان از جداسازی با میکروسکوپ نوری انجام شد. برای بدست آوردن سلول­های سوماتیک، اسفروئید­ها در دستگاه Dounce homogenizer 50 μm شکسته شد. سوسپانسیون سلولی بدست آمده با محیط کشت رقیق شد و در دمای اتاق نگهداری شد. در این مدت قطعات درشت سلولی رسوب کردند. جداسازی سلول­های سوماتیک با میکروسکوپ نوری بررسی شد (41).

اعمال تیمار نوری: پرتودهی اشعه  UV-Bبا شدت نور 0.056 mw/cm-2 و با استفاده از لامپ­های کم باند UV-B (Philips TL40W/12RS) و برای یک ساعت انجام شد.

استخراج RNA کل: برای نمونه‌برداری از سلول­های تفکیک شده، سه تکرار زیستی به ازای گروه­های تیمار و کنترل در نظر گرفته شد. استخراج RNA ازهر نمونه با روش (Invitrogen, Carlsbad, CA) TRIzol Reagent مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بررسی کمیت و کیفیتRNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز الکتروفورز 1 درصد و اسپکتروفوتومتر Ultrospec 2100 pro UV/Visible spectrophotometer (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) صورت گرفت.

آماده‌سازی کتابخانه و RNA-Seq: بطور خلاصه، 1 میکروگرم RNA کل برای هر نمونه در معرض انتخاب پلیA قرار گرفت. قطعه قطعه شدن mRNA ها و سنتز cDNA­ و اتصال به آداپتورها انجام شد. با استفاده از توالی­یابی با پلتفرم Illumina HiSeq-2500، خوانش­های تک­انتهایی به طول 51 نوکلئوتید تولید شد (شماره دسترسی GSE124346).

آنالیز بیوانفورماتیک: از نرم افزار  FastQC(4) و  Trimmomatics (v0.32) (5) برای کنترل کیفیت و پیش پردازش خوانش­ها استفاده شد. مکان­یابی خوانش­ها بر روی ژنوم رفرنس V. carteri (v2) موجود در سایت فیتوزوم (https://phytozome.jgi.doe.gov) (14) با استفاده از نرم افزار TopHat2 (v2) (27) و پارامترهای پیش‌فرض انجام شد. سپس، با استفاده از نرم افزارCufflinks (v2.0.1) با پارامترهای پیش­فرض اسمبلی رونوشت­ها برای هر نمونه انجام شد. برای بررسی تفاوت بیان ژن بین سلول‌های زایشی و سوماتیک تحت تابش UV-B، نرم افزار  Cuffdiff (v2)(27) مورد استفاده قرار­گرفت.

انوتیشن: انوتیشن عملکردی ژن­های با تفاوت بیان میان سلول­های زایشی و سوماتیک تحت تابش UV-B، بوسیله ترم­های ژن­انتولوژی با استفاده از برنامه تحت وب Blast2GO آنالیز شد (9) و ژن­های با تفاوت بیان در سه گروه مولفه سلولی (Cellular component)، عملکرد مولکولی (Molecular function) و فرایند بیولوژیکی (Biological process) طبقه­بندی شدند. نتایج توزیع امتیاز (Score distribution) فرایند بیولوژیکی برای آنالیز غنی‌سازی مسیر مورد استفاده قرار گرفت.

نتایج

بررسی تفاوت بیان ژن و سایر ویژگی­های ژنی در مقایسه پروفایل بیان سلول­های زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: در آنالیز تفاوت بیان در مقایسه سلول­های زایشی با سوماتیک تعداد 23778 ژن، 59068 ایزوفرم، 37240TSS (transcription start site)، 15205(coding DNA sequences) CDS ، 23778 پروموتر، 37240 اسپلایسینگ در مجموع نمونه­ها مورد بررسی قرار­گرفت. نتایج آنالیز تفاوت بیان نشان داد که از مجموع تعداد ژن­ها و سایر ویژگی­های ژنی ذکر شده در شرایط القایی UV-B، تعداد 8392 ژن، 6380 ایزوفرم، 7817 TSS و 2225 CDS با بیان متفاوت در بین دو نمونه سلولی زایشی و سوماتیک وجود داشته است. سطح معنی­داری برای تعیین تفاوت بیان 5 درصد (p-value≤5) در نظر گرفته شد. در مقایسه تفاوت بیان بین این دو تیپ سلولی از بین 8392 لوکوس با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3871 لوکوس افزایش و سطح بیان تعداد 4521 لوکوس دیگر کاهش نشان داد. از بین 6380 ایزوفرم با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3015 ایزوفرم افزایش و تعداد 3365 ایزوفرم دیگر کاهش داشت. از بین 7817 TSS با بیان متفاوت، سطح بیان تعداد 3725 TSS افزایش و تعداد 4092 TSS دیگر کاهش داشت. همچنین از بین 2225 CDS با بیان متفاوت، سطح بیان 910 CDS مورد افزایش و سطح بیان 1315­تای دیگر کاهش یافته بود. در شکل 1 نمودار فراوانی ژن‌ها، ایزوفرم‌ها، TSSها و CDSهای معنی­دار در دو دسته بیش‌بیان و کم‌بیان نشان داده شده­اند. بر اساس شکل مشهود است که کاهش بیان نسبت به افزایش بیان، سهم بیشتری از ژن­ها را شامل شده‌است. شکل 2 نمودار توزیع آتش‌فشانی تفاوت بیان ژن بین این دو تیپ سلولی را در شرایط القایی UV-B نشان می­دهد. تیمار UV-B سطح بیان ژن را در هر دو تیپ سلولی تغییر داده‌است. نقاط قرمز (در بالای خط آستانه)نشان‌دهنده ژن‌هایی با بیان متفاوت هستند.

 

شکل 1 - نمودار ستونی ویژگی‌های مختلف ژنی با بیان متفاوت بین سلول­های زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B. نکته: N تعداد کل ویژگی‌های ژنی با بیان متفاوت، New تعداد ویژگی‌های ژنی انوتیت نشده، Down-regulated تعداد ویژگی‌های ژنی کم‌بیان و Up-regulated تعداد ویژگی­های ژنی بیش­بیان.

 

شکل 2- نمودار توزیع آتش­فشانی تفاوت بیان ژن بین سلول­های زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B. نقاط قرمز بالای خط آستانه مقطع بیانگر ژن­های با بیان متفاوت و نقاط سیاه زیر آن بیانگر ژن­های با بیان مشابه است.

بررسی ژن­های اختصاصی سلول­های زایشی و سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: برای بدست آوردن ژن­های اختصاصی هر یک از سلول­ها، ژن­های دیفرنشیال را دو بار تحت فیلتر قرار داریم. به این ترتیب که ابتدا ژن­های دیفرنشیالی که حداقل در یکی از دو گروه بیان بالای 1 (RPKM>1) داشتند، انتخاب شدند. در مرحله بعد این ژن­ها بر اساس توزیع طول لوکوس بررسی و فیلتر شدند. در نهایت، 110 ژن منحصرا در سلول زایشی و 35 ژن منحصرا در سلول سوماتیک بیان شدند، بعبارت دیگر تحت تیمار UV-B بیان ویژه تیپ سلولی را نشان دادند و 7312 ژن بصورت مشترک در هر دو تیپ سلولی بیان شده بودند. در شکل 3 نمودار ون، تفاوت بیان ژن بین دو تیپ سلولی زایشی و سوماتیک و همچنین ژن­های مشترک بین آنها را نشان می­دهد. نمودار نقشه گرمایی مربوط به ژن­های مشترک بین این دو تیپ سلولی در شکل 4 نشان داده شده‌است.

 

شکل 3 - نمودار ون همپوشانی ژن­های دیفرنشیال را بین دو تیپ سلولی زایشی (G) و سوماتیک (S) تحت تیمارUV-B  نشان می­دهد.

طبقه­بندی عملکردی ژن­های با بیان متفاوت معنی­دار در سلول­های زایشی با سوماتیک در شرایط القایی تیمار UV-B: اطلاعات ژن انتولوژی (Gene ontology) و رده عملکردی ژن­های با بیان متفاوتمعنی­دار در هر تیپ سلولی، از طریق آنالیز عملکردی ژن‌انتولوژی با استفاده از الگوریتم Blast2GO (http://www.blast2go.com) بدست آمد، که به درک ویژگی­های توزیع عملکردی ژن در نمونه­ها در سطح ماکرو کمک می­کند. آنالیز عملکردی ژن انتولوژی در سه گروه عملکردی (P≤0.05) غنی شده بود. 110 و 35 ژن با تفاوت بیان معنی­دار، بترتیب در سلول­های زایشی و سوماتیک در پایگاه داده GO انوتیت شدند.

 

شکل 4 - نمودار نقشه گرمایی بیان ژن. تفاوت بیان ژن بر اساس معیار RPKM در ژن­های مشترک دو تیپ سلولی (Gonidi-Somatic) در میان تکرار­های هر سلول نمایش داده شده است. قرمز: ژن­های بیش­بیان؛ زرد: ژن­های کم­بیان.

در شکل 5 غنی­سازی عملکردی ژن انتولوژی نشان داد که بعد از یک ساعت تیمار UV-B، 19 ترم بطور معنی­داری تغییر کرده­اند. در ژن انتولوژی مولفه سلولی، تنها 2 ترم یعنی غشا و فضای غشایی در هر دو سلول غنی بوده­اند، در حالیکه محصول ژن­های دیفرنشیال سلول زایشی در 8 ترم یعنی لومن محصور شده با غشا، سیمپلاست، اتصالات سلولی، کمپلکس محتوی پروتئین، فضای اندامکی، سلول، اندامک، فضای سلولی غنی بوده­اند. در ژن انتولوژی عملکرد مولکولی، فعالیت اتصال، فعالیت کاتالیزوری در هر دو سلول غنی بوده­اند. در­حالیکه، ترم فعالیت انتقالی تنها در سلول سوماتیک بصورت قابل­توجهی غنی بوده‌است. ژن انتولوژی فرایند بیولوژیکی نشان داد که هر دو تیپ سلولی در فرایند متابولیکی، فرایند­سلولی و مکان­یابی غنی بوده­اند. سه فرایند تنظیم زیستی، سازمان­یابی مولفه­سلولی یا بیوژنز و پاسخ به محرک تنها در سلول زایشی غنی بوده­اند. بررسی مسیرهای بیولوژیکی مبتنی بر توزیع امتیاز با استفاده از آنالیز Blast2GO انجام شد. نتایج نشان داد که در سلول­های سوماتیک در معرض UV-B، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودی­استراز  RNAفعال شده­اند. درحالیکه در سلول­های زایشی پاسخ به کمبود (تنش) آبی، ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، یکپارچگی DNA، بسته­بندی DNA، تنظیم رونوشت­برداری با الگوبرداری از DNA، آغاز رونوشت­برداری از DNA، بیوژنز مولفه‌سلولی، انتقال رتروگراد- اندوزوم به گلژی، گردایش نوکلئوزوم، گردایش کروموزوم و بیان ژن بعد از تابش UV-B رخ‌داده‌است. فرایند بیوسنتزDNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بوده‌است.

 

بحث

هدف از پژوهش حاضر بررسی پروفایل بیان ژن و تغییرات فیزیولوژیکی در سلول­های جلبک V. carteri درپاسخ به تابشUV-B بود. مطالعات نشان داده­اند که تنظیم بیان ژن گام موثری در تعیین تیپ سلولی و تمایز یابی می­باشد. در واقع موجودات یوکاریوتی پیچیده از طریق بیان انتخابی بخش ویژه­ای از ژنوم یکسان در انواع مختلف سلول، در پاسخ به نشانه­های نموی و محیطی تکامل یافته­اند (36). در Volvox برای مثال هر دو تیپ سلولی زایشی و سوماتیک دارای الگوی بیان متفاوتی هستند و ژن­هایی از رده­های عملکردی مختلف را نمایش می‌دهند (41 و 50). با این حال راجع به تغییرات بیان ژن ویژه تیپ سلولی در پاسخ به سیگنال‌های نوری، که یکی از مهمترین سیگنال­های محیطی برای کنترل رشد و نمو در Volvox است، شناخت کمی صورت­گرفته­است.

 

 

شکل 5 - آنالیز عملکردی ژن­های با تفاوت بیان در سلول­های زایشی (G) و سوماتیک (S) تحت تیمار UV-B بر اساس انتولوژی ژن. طبقه‌بندی انتولوژی ژن در سه دسته عملکردی یعنی فرایند بیولوژیکی، عملکرد مولکولی و مولفه سلولی نشان داده شده‌است.

 

مطالعات بیان ژن تحت شرایط نور مرئی نشان داده‌است که الگوی ترنسکریپتوم هر تیپ سلولی می­تواند بصورت متفاوتی در پاسخ به نور محیطی تغییر کند (25، 26 و 29). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که الگوی ترنسکریپتوم این دو تیپ سلولی در پاسخ به نور نامرئی UV-B نیز بصورت متفاوتی تغییر کرده‌است. بطور جالب توجهی، تعداد ژن­هایی که اختصاصاً در سلول زایشی بیان معنی­دار دارند، بیشتر از سلول­های سوماتیک است. با اینحال، شمار بالای ژن­های مشترک بین این دو تیپ سلولی، بیانگر تقسیم ابتدایی کار در این جلبک کلونال است. برای شناخت بیشتر عملکرد این دو تیپ سلولی در پاسخ به تیمار، مسیر­های بیولوژیکی پاسخگو مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی مسیرهای بیولوژیکی مبتنی بر توزیع امتیاز با استفاده از آنالیز Blast2GO نشان داد که بطور کلی سلول­های تفکیک شده در معرض تابش UV-B، دستخوش آسیب شده­اند و به دنبال آن پاسخ به آسیب DNA آغاز شده است. فرایند بیوسنتزDNA وابسته به RNA، پاسخ مشترک هر دو سلول به تابش UV-B بوده است. حضور شکست­های دو رشته‌ایDNA= DNA double-strand break (DSBها) در DNA شدیدترین رویدادی است که سلول می­تواند متحمل شود.DSB ­ها یکپارچگی ژنوم را به مخاطره می­اندازند که به­دنبال آن جهش، بازآرایی کروموزومی و در صورت عدم ترمیم مرگ سلولی رخ می­دهد (19). برای مبارزه با این تهدیدات، سلول­ها دو مکانیسم اصلی ترمیم را ایجاد کرده­اند: نوترکیبی همولوگی (HR= Homologous Recombination) و اتصال پایانه­های غیرهمسان (NHEJ= None Homologous End-Joining) (8). سوبستراهای همولوگ DNA که سبب تسهیل ترمیم می­شوند، در مقایسه با سوبستراهای همولوگی که به شکل رونوشت RNA حضور دارند، فراوانی کمتری دارند (35). مولکول‌های RNA با رونوشت­برداری معکوس بهcDNA، می­توانند بوسیله مکانیسم غیرالگوبرداری توسط NHEJ یا یک مکانیسم الگوبرداری توسط HR در سایت­های DSB در DNA  وارد شوند (39، 42 و 58). علاوه بر این، مطالعات در سیستم مدل مخمر نشان داده­اند که نسخه رونوشت RNA درون زاد، نه تنها بطور غیرمستقیم از طریق تشکیل واسطه کپی DNA (cDNA)، بلکه همچنین بطور مستقیم در مکانیسم محرک همولوژی در جوانه زنی مخمر می­تواند بعنوان الگویی برای ترمیم  DSBمورد استفاده قرار‌گیرد (24).

در سلول های سوماتیک در معرض UV-B، انتقال تراغشایی پتاسیم و هیدرولیز باند فسفودی­استراز RNA فعال شده، جذب Na + و خروجK + از سلول­ها (شار یونی) تسهیل می‌گردد. تابش UV در مخمر باعث افزایش گرادیان غلظت بین داخل و خارج سلول و در نهایت افزایش شار خالص یونی شده­است (46). علاوه بر این، اشعه UV از طریق فعال شدن کانال K + غشایی باعث ایجاد آپوپتوز درسلول­های لوسمی میلوبلاست انسان و سلول­های اپی­تلیال قرنیه خرگوش شده‌است (53 و 54). این پدیده یک واکنش اولیه در پاسخ به اشعه  UVاست .مطالعات نشان داده­اند که اشعه UV موجب ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﺑﻴﺶ از ﺣﺪ کانال­های K+در غشا می­شود که یک رویداد زودهنگام است که می­تواند انتقال سیگنال را میانجیگری کند و موجب آپوپتوز در پاسخ به اشعه UV گردد (53).

اشعه  UVمی­تواند باعث ایجاد آسیب­های مختلفی مانند تغییرات فتوشیمیایی، کراس­لینک و آسیب اکسیداتیو به RNA شود. جذب مستقیم UV-B توسط اسیدهای نوکلئیک photoproductهای بسیار ناکارآمدی را تولید می­کند که در فعالیت مولکول­های حساس به نور در داخل سلول دخالت می­کنند (1، 2 و 6). اشعه  UVباعث هیدرولیز پیوند 5′فسفو دی استر به photoproduct می­شود. پایداری پیوند فسفودی­استر به نوکلئوتید­های جانبی بستگی دارد (15). تغییرات RNA می­تواند عملکرد هر دو  RNAکد‌کننده و غیر کد‌کننده را در روش­های متعددی از جمله مداخله در میانکنش­های جفت باز در رونویسی و ترجمه mRNA ها و یا با تغییر خصوصیات شیمیایی نوکلئوتیدهای RNA ریبوزومی مورد نیاز برای کاتالیز RNA در ریبوزوم، تحت تاثیر قرار دهد. از عواقب عملکردی آسیب RNAمی‌توان به کاهش سنتز پروتئین و تولید پپتیدهای متراکم و کوتاه و در نتیجه کراس­لینک ریبوزومی و یا اکسیداسیون mRNA اشاره­کرد (47). تحت تابش UV-B کراس لینک‌هایی میان -RNAپروتئین در تخم­های حشرات (21)، و همچنین در ذرت (7) مشاهده شده‌‌است. آسیب اکسیداتیو به RNA در مدل­های جانوری سالخورده، بهنگام انحطاط عصبی انسان و سلول­های در معرض UV گزارش شده‌است. بطور خلاصه، آسیب RNA به مهار عملکرد سلول می‌انجامد و ممکن است بر زیستایی سلول تأثیر منفی داشته‌باشد. به دنبال آن، سلول ممکن است با مکانیسم‌های دفاعی متفاوت از جمله مکانیسم­های تعمیر اختصاصی برای اشکال خاصی از آسیب و همچنین مسیرهای برگشت طبیعی، به آسیب RNA پاسخ دهد (57).

مهمترین مسیرهای بیولوژیکی فعال شده در سلول­های زایشی بعد از تابش UV-B بشرح زیر بوده است: ترمیم برشی عدم تطابق (MMR= Miss Match Repair)، گردایش نوکلئوزوم و کروموزوم. سیستم ترمیم برشی عدم تطابق (MMR)، علاوه بر نقش­های آن در ویرایش خطاهای همانندسازی و سایر عملکردها، همچنین در ترمیم و رفع سمیت سلولی حاصل از ضایعات DNA که ناشی از شرایط نامطلوب ژنوتوکسیک مانند نور UV و برخی مواد سرطان­زا می­باشد، درگیر می­شود (12، 20 و 32). علاوه بر NER= Nucleotide Excision Repair ، MMR به ضایعات ناشی از UV حداقل در مرحله G1 پاسخ می­دهد. هر دو مسیر ممکن است بصورت افزایشی برای ترمیم ضایعات عمل کنند یا با یکدیگر رقابت کنند. مطالعات نشان داده اند که به دنبال اشعه UV مسیرهای تعمیر چندگانه در سلول القا می‌شوند، که با فعال کردن برخی از اعضای خانواده پروتئینی لیگازهای یوبی­کویئتین، پروتئین‌های هدف را در فاز G1 چرخه سلولی تخریب می­کنند (51). به‌این‌ترتیب، با ترمیم کارآمد آسیب DNA، یکپارچگی ژنوم و زیستایی سلول حفظ می­شود. دریافت و سیگنالینگ حضور آسیب DNA به دستگاه بازرسی چرخه سلولی برای حفظ یکپارچگی ژنومی و تنظیم پیشروی چرخه سلولی بسیار مهم است (55). نقاط بازرسی پاسخ به آسیب DNA با متوقف کردن چرخه سلولی، زمان لازم برای ترمیم DNA را فراهم می­کنند. این استراتژی از تکثیر و تفکیک کروموزوم­های آسیب دیده جلوگیری می­کند که در غیر این صورت می­تواند منجر به بی­ثباتی ژنوم شود. یکپارچگی  DNA یا پیشروی چرخه سلولی را می توان با علامت‌گذاری در سطح کروماتین مشاهده کرد. علاوه بر این، بین ترمیمDNA  و گردایش کروماتین، اتصال مکانیکی مشاهده‌ شده‌است (13). انکوباسیونDNA  آسیب دیده توسط اشعه UV در عصاره‌های آزاد سلولی که دستخوش ترمیم شده‌اند، نشان داد که گردایش de novo نوکلئوزوم با ترمیم برش نوکلئوتیدی (NER) همراه می‌شود (13). برای NER ضایعاتDNA در کروماتینیک مدل کلی پیشنهاد شده است که در آن unfolding ساختارهای نوکلئوزومی، دسترسی به آنزیم­های ترمیمDNA را تسهیل می­کند که بوسیله refolding سریع دنبال می‌شود (37). تنظیم مجدد ساختار کروماتینی پیشین در طول NER می تواند به ارتباط مکانیکی بین NER و گردایش کروماتین مرتبط باشد. عملکرد دیگرگردایش de novo کروماتین ممکن است مشارکت در ادراک آسیبDNA  باشد. در طی پردازش آسیب DNA، گسترش ساختارهای کروماتینی بسیار حفاظت می‌شود که برای سیگنالینگ به دستگاه چرخه سلولی پراهمیت است. بطور خلاصه، پیامدهای عملکردی اتصال مسیر مشترک گردایش کروماتین به وقایع متفاوت پردازش آسیب DNA عبارتند از 1- تشکیل ساختاری که بوسیله دستگاه بازرسی چرخه سلولی تشخیص داده می‌شود؛ 2- سرکوبی یا دخالت در میانکنش‌های DNA؛ و 3- بازآرایی مجدد ساختار کروماتین پیشین (38).

نتیجه‌گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که هر دو تیپ سلولی بطور فعال و موثری به تیمار پاسخ داده‌اند و در مجموع سازوکارهای دفاعی را آغاز کرده‌اند. از طرفی، بررسی این پاسخ­ها نشان داد که الگوی ترنسکریپتوم هر یک از این سلول­ها بصورت متفاوتی در پاسخ به نور محیطی تغییر یافته‌است. بعنوان مثال می­توان به فعالیت کانال­های K+ در سلول­های سوماتیک در معرض تابش UV-B اشاره­کرد. با توجه به اینکه عملکرد ممانعتی موثر سلول‌های سوماتیک به حفظ یکپارچگی غشا و اتصالات محکم بین سلول­ها وابسته است، می­توان تصور کرد که این سلول­ها بعنوان فیلتر عمل می­کنند تا با حفاظت از سلول­های زایشی به بقای ارگانیسم کمک‌نمایند. البته در حال حاضر نمی­دانیم که کدام مسیر سیگنالینگ بواسطه UV-B باعث فعال­شدن کانال­های K+در این سلول­ها شده ­است .سایر پاسخ­ها در هر یک از سلول­ها بمنظور حفظ یکپارچگی ژنوم می­باشد. بطور خلاصه، هر یک از سلول­ها با ترمیم آسیب ناشی از UV-B باعث کاهش حساسیت جلبک به این اشعه شده ‌است.

سپاسگزاری

این پروژه با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاری‌های علمی بین­المللی انجام شده‌است و از این طریق از مسئولین مربوطه سپاسگزاری می­شود.

1-      باقریه نجار م.ب. و عالیشاه ع. 1389. تاثیر جهش ژن RecQsim گیاه ارابیدوپسیس بر سرعت رشد و حساسیت گیاه به اشعه ماورای بنفش و مایتومایسین- سی. مجله زیست شناسی ایران، 23 (6): 781-790.
2-      رنجبر ا. و موسوی ع. 1396. اثرات تابش اشعه ماوراء بنفش- ب (UV-B) و عنصر فلزی سنگین کادمیوم بر برخی وپژگی‌های فیزیولوژیکی گیاه کاهو (Lactuca sativa). مجله پژوهشهای گیاهی (زیست شناسی ایران)، 30 (4): 978-989.
 
3-      Abdel-Kareem, M. S. M. 1999. Influence of ultraviolet radiation on growth, photosynthetic pigments and protein profile of Dunaliella salina Teod, Chlorophyceae. Egyptian Journal of Botany, 39, 77-95.
4-      Andrews, S. 2010. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data [Internet]. Cambridge, UK: Babraham Bioinformatics, The Babraham Institute.
5-      Bolger, A. M., Lohse, M., and Usadel, B. 2014. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics, 30(15), 2114-2120.
6-      Cadet, J., Sage, E., and Douki, T. 2005. Ultraviolet radiation-mediated damage to cellular DNA. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 571(1-2), 3-17.
7-      Casati, P., and Walbot, V. 2004. Crosslinking of ribosomal proteins to RNA in maize ribosomes by UV-B and its effects on translation. Plant physiology, 136(2), 3319-3332.
8-      Ceccaldi, R., Rondinelli, B., and DAndrea, A. D. 2016. Repair pathway choices and consequences at the double-strand break. Trends in cell biology, 26(1), 52-64.
9-      Conesa, A., Gotz, S., Garcia-Gomez, J. M., Terol, J., Talon, M., and Robles, M. 2005. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics, 21(18), 3674-3676.
10-   Cordi, B., Donkin, M. E., Peloquin, J., Price, D. N., and Depledge, M. H. 2001. The influence of UV-B radiation on the reproductive cells of the intertidal macroalga, Enteromorpha intestinalis. Aquatic toxicology, 56(1), 1-11.
11-   De Bakker, N. V. J. 2011. The effects of UVB radiation on charophycean algae and bryophytes.
12-   Fu, D., Calvo, J. A., and Samson, L. D. 2012. Balancing repair and tolerance of DNA damage caused by alkylating agents. Nature Reviews Cancer, 12(2), 104 -120.
13-   Gaillard, P. H. L., Moggs, J. G., Roche, D. M., Quivy, J. P., Becker, P. B., Wood, R. D., and Almouzni, G. 1997. Initiation and bidirectional propagation of chromatin assembly from a target site for nucleotide excision repair. The EMBO journal, 16(20), 6281-6289.
14-   Goodstein, D.M., Shu, S., Howson, R., Neupane, R., Hayes, R.D., Fazo, J., Mitros, T., Dirks, W., Hellsten, U., Putnam, N. and Rokhsar, D.S. 2011. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic acids research, 40(D1), D1178-D1186.
15-   Grossman, L. 1974. Enzymes involved in the repair of DNA. In Advances in radiation biology (Vol. 4, pp. 77-129). Elsevier.
16-   Hader, D. P. 1991. Effects of enhanced solar ultraviolet radiation on aquatic ecosystems. In Biophysics of photoreceptors and photomovements in microorganisms (pp. 157-172). Springer, Boston, MA.
17-   Hallmann, A. 2011. Evolution of reproductive development in the volvocine algae. Sexual plant reproduction, 24(2), 97-112.
18-   Harris, E. H. 2009. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use (Vol. 1). Academic Press.
19-   Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., and Liu, J. 2010. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual review of genetics, 44, 113-139.
20-   Hsieh, P., and Yamane, K. 2008. DNA mismatch repair: molecular mechanism, cancer, and ageing. Mechanisms of ageing and development, 129(7-8), 391-407.
21-   Jackle, H., and Kalthoff, K. 1979. Photosynitized formation of RNA-protein crosslinks in an insect egg (Smittza spec., Chironomidae, Diptera). Photochemistry and photobiology, 29(5), 1039-1040.
22-   Jobson, R. W., and Qiu, Y. L. 2011. Amino acid compositional shifts during streptophyte transitions to terrestrial habitats. Journal of molecular evolution, 72(2), 204-214.
23-   Kashian, D. R., Prusha, B. A., and Clements, W. H. 2004. Influence of total organic carbon and UV-B radiation on zinc toxicity and bioaccumulation in aquatic communities. Environmental science and technology, 38(23), 6371-6376.
24-   Keskin, H., Meers, C., and Storici, F. 2016. Transcript RNA supports precise repair of its own DNA gene. RNA biology, 13(2), 157-165.
25-   Kianianmomeni, A., and Hallmann, A. 2014. Algal photoreceptors: in vivo functions and potential applications. Planta, 239(1), 1-26.
26-   Kianianmomeni, A., Stehfest, K., Nematollahi, G., Hegemann, P., and Hallmann, A. 2009. Channelrhodopsins of Volvox carteri are photochromic proteins that are specifically expressed in somatic cells under control of light, temperature, and the sex inducer. Plant physiology, 151(1), 347-366.
27-   Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., and Salzberg, S. L. 2013. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome biology, 14(4), R36.
28-   Kirk, D. L. 2005. Volvox: a search for the molecular and genetic origins of multicellularity and cellular differentiation (Vol. 33). Cambridge University Press.
29-   Kirk, M. M., and Kirk, D. L. 1985. Translational regulation of protein synthesis, in response to light, at a critical stage of Volvox development. Cell, 41(2), 419-428.
30-   Kirk, M. M., and Kirk, D. L. 2004. Exploring germ-soma differentiation in Volvox. Journal of biosciences, 29(2), 143-152.
31-   Schmitt, R. 2003. Differentiation of germinal and somatic cells in Volvox carteri. Current opinion in microbiology, 6(6), 608-613.
32-   Li, G. M. 2008. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell research, 18(1), 85-98.
33-   Liu, X. J., Duan, S. S., and Li, A. F. 2007. Overcompensation effect of Pavlova viridis under ultraviolet (UV-B) stress. Ying yong sheng tai xue bao= The journal of applied ecology, 18(1), 169-173.
34-   Logemann, E., Tavernaro, A., Schulz, W., Somssich, I. E., and Hahlbrock, K. 2000. UV light selectively coinduces supply pathways from primary metabolism and flavonoid secondary product formation in parsley. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(4), 1903-1907.
35-   Meers, C., Keskin, H., and Storici, F. 2016. DNA repair by RNA: templated, or not templated, that is the question. DNA repair, 44, 17-21.
36-   Meyerowitz, E. M. 2002. Plants compared to animals: the broadest comparative study of development. Science, 295(5559), 1482-1485.
37-   Moggs, J. G., and Almouzni, G. 1999. Chromatin rearrangements during nucleotide excision repair. Biochimie, 81(1-2), 45-52.
38-   Moggs, J. G., Grandi, P., Quivy, J. P., Jonsson, Z. O., Hubscher, U., Becker, P. B., and Almouzni, G. 2000. A CAF-1–PCNA-mediated chromatin assembly pathway triggered by sensing DNA damage. Molecular and cellular biology, 20(4), 1206-1218.
39-   Morrish, T.A., Gilbert, N., Myers, J.S., Vincent, B.J., Stamato, T.D., Taccioli, G.E., Batzer, M.A. and Moran, J.V. 2002. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition. Nature genetics, 31(2), 159-165.
40-   Necchi Jr, O. 2005. Light-related photosynthetic characteristics of freshwater rhodophytes. Aquatic Botany, 82(3), 193-209.
41-   Nematollahi, G., Kianianmomeni, A., and Hallmann, A. 2006. Quantitative analysis of cell-type specific gene expression in the green alga Volvox carteri. BMC genomics, 7(1), 321.
42-   Nevo-Caspi, Y., and Kupiec, M. 1996. Induction of Ty recombination in yeast by cDNA and transcription: role of the RAD1 and RAD52 genes. Genetics, 144(3), 947-955.
43-   Provasoli, L. 1960. Artificial media for fresh water algae: problems and suggestions. The ecology of algae, 2, 84-96.
44-   Rautenberger, R., and Bischof, K. 2008. UV-susceptibility of photosynthesis of adult sporophytes of four brown Antarctic macroalgae (Phaeophyceae). Reports in Polar and Marine Research, 571, 263-269.
45-   Richter, P., Helbling, W., Streb, C., and Hader, D. P. 2007. PAR and UV effects on vertical migration and photosynthesis in Euglena gracilis. Photochemistry and photobiology, 83(4), 818-823.
46-   Sanders, R. T., and Giese, A. C. 1959. The effect of ultraviolet light on the sodium and potassium composition of resting yeast cells. The Journal of general physiology, 42(3), 589-607.
47-   Shan, X., Chang, Y., and Lin, C. L. G. 2007. Messenger RNA oxidation is an early event preceding cell death and causes reduced protein expression. The FASEB Journal, 21(11), 2753-2764.
48-   Shiu, C. T., and Lee, T. M. 2005. Ultraviolet-B-induced oxidative stress and responses of the ascorbate–glutathione cycle in a marine macroalga Ulva fasciata. Journal of Experimental Botany, 56(421), 2851-2865.
49-   Sinha, R. P., and Hader, D. P. 2000. Effects of UV-B radiation on cyanobacteria. Recent Res. Devel. Photochem. and Photobiol, 4, 239-246.
50-   Tam, L. W., and Kirk, D. L. 1991. Identification of cell-type-specific genes of Volvox carteri and characterization of their expression during the asexual life cycle. Developmental biology, 145(1), 51-66.
51-   Tanaka, M., Takahara, M., Nukina, K., Hayashi, A., Sakai, W., Sugasawa, K., Shiomi, Y. and Nishitani, H. 2017. Mismatch repair proteins recruited to ultraviolet light-damaged sites lead to degradation of licensing factor Cdt1 in the G1 phase. Cell Cycle, 16(7), 673-684.
52-   Vu, C. V., Allen Jr, L. H., and Garrard, L. A. 1981. Effects of supplemental UV‐B radiation on growth and leaf photosynthetic reactions of soybean (Glycine max). Physiologia Plantarum, 52(3), 353-362.
53-   Wang, L., Li, T., and Lu, L. 2003. UV-induced corneal epithelial cell death by activation of potassium channels. Investigative ophthalmology and visual science, 44(12), 5095-5101.
54-   Wang, L., Xu, D., Dai, W., and Lu, L. 1999. An ultraviolet-activated K+ channel mediates apoptosis of myeloblastic leukemia cells. Journal of Biological Chemistry, 274(6), 3678-3685.
55-   Weinert, T. 1998. DNA damage checkpoints update: getting molecular. Current opinion in genetics and development, 8(2), 185-193.
56-   Wu, H., Gao, K., Villafañe, V. E., Watanabe, T., andHelbling, E. W. 2005. Effects of solar UV radiation on morphology and photosynthesis of filamentous cyanobacterium Arthrospira platensis. Applied and environmental microbiology, 71(9), 5004-5013.
57-   Wurtmann, E. J., and Wolin, S. L. 2009. RNA under attack: cellular handling of RNA damage. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 44(1), 34-49.
58-   Yu, X., and Gabriel, A. 1999. Patching broken chromosomes with extranuclear cellular DNA. Molecular cell, 4(5), 873-881.
59-   Zvezdanovic, J., Cvetic, T., Veljovic-Jovanovic, S., andMarkovic, D. 2009. Chlorophyll bleaching by UV-irradiation in vitro and in situ: absorption and fluorescence studies. Radiation Physics and Chemistry, 78(1), 25-32.
Volume 33, Issue 3
September 2020
Pages 492-504
  • Receive Date: 02 February 2019
  • Revise Date: 12 March 2019
  • Accept Date: 01 May 2019
  • First Publish Date: 22 September 2020