بررسی پاسخ­های دفاع آنتی­اکسیدانی در کشت ساقه (Artemisia annua L.) تحت تنش نیترات نقره

لیلا شبانی^* و بهنوش صغیرزاده

شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 4/12/93                تاریخ پذیرش: 25/7/94

چکیده

در گیاهان، سیستم­های دفاعی متعددی برای مقابله با شرایط تنش­زا، همانند آلودگی محیط رویش آنها به فلزات سنگین، با یکدیگر همکاری می‌کنند. در این پژوهش به بررسی اثر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر شاخص رشد، رنگیزه­های فتوسنتزی، میزان H₂O₂، پراکسیداسیون لیپید، میزان پرولین و فعالیت سیستم­های دفاعی آنزیمی در کشت ساقه گیاه آرتمیزیا
(Artemisia annua L.) با استفاده از تکنیک کشت بافت پرداخته شده است. به‌منظور نشان دادن اثرات فلز سنگین نقره بر این شاخص‌ها، آزمایش­ها در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. غلظت­های متفاوت (0، 001/0، 01/0، 1/0، 1 و 2 میلی­مولار) نیترات نقره به محیط کشت مایعMS  حاوی ساقه آرتمیزیا اضافه شد. نتایج نشان داد که نسبت وزن تر به وزن خشک نمونه­های تحت تیمار در غلظت 1/0 میلی‌مولار نیترات نقره نسبت به نمونه شاهد 77/75% افزایش یافت. میزان کلروفیل a و b در غلظت 001/0 میلی‌مولار افزایش و کلروفیل a تنها در غلظت 1/0 میلی­مولار نسبت به شاهد کاهش یافت. از میان آنزیم­های آنتی­اکسیدان اندازه­گیری شده تنها آنزیم کاتالاز در تمام غلظت­ها افزایش نشان داد. الیسیتور نیترات نقره باعث افزایش میزان پرولین، H₂O₂ و پراکسیداسیون لیپیدی در تمام غلظت­ها شد. نتایج این پژوهش نشان داد که نقره موجود در ساقه‌ها باعث تجمع ترکیباتی مثل پراکسید هیدروژن شده که به‌عنوان یک مولکول پیام‌رسان عمل کرده و باعث القای دفاع آنتی­اکسیداتیو در برگ­ها می‌شود.

واژه­های کلیدی: دفاع آنتی­اکسیدانی، درمنه یکساله، پرولین، فلزات سنگین، نیترات نقره

* نویسنده مسئول، تلفن: 03814424405 ،  پست الکترونیکی: shabani-l@sci.sku.ac.ir

مقدمه

گیاهان جنس Artemisia بوته­های چندساله و آروماتیک متعلق به راسته Asterales، خانواده Asteraceae و طایفه Anthemedeae هستند و به عنوان گیاهان اغلب اجتماعات گیاهی در استپ­های خشک و نیمه خشک شناخته شده‌اند.  A. annuaبا نام فارسی (گندواش) گیاهی یکساله است که جدا از 400 گونه دیگر جنس Artemisia که اغلب دو ساله یا پایا هستند قرار می­گیرد و نام‌گذاری این گونه به این دلیل می­باشد (9). پودر سر شاخه­ای بیشتر گونه‌های این گیاه دارای ماده سانتونین است. این ماده یکی از ترکیبات گلیکوزیدی موجود در بعضی از گونه­های جنس درمنه است و از قدیم به دلیل خاصیت ضد انگلی و سایر خواص دارویی در طب سنتی و جدید مصرف دارویی داشته است. اهمیت جنس درمنه در حال حاضر به دلیل ترکیبات مهم دارویی و اثرات درمانی قابل توجه، در حال افزایش است. ترکیبات ثانویه جنس درمنه تا به امروز به عنوان داروی ضد مالاریا، ضد باکتری، ضد قارچ، آنتی­اکسیدان و سایتوتوکسیک مورد مصرف قرار گرفته­ است (18).

بررسی­ها نشان می­دهد که مقادیر بالای فلزات سنگین (چه آنها که ضروری­اند و چه آنها که ضروری نیستند) می­توانند تولید رادیکال­های آزاد و گونه­های اکسیژنی فعال و در نتیجه آسیب اکسیداتیو را در گیاهان تحریک کنند (28). براساس خصوصیات فیزیکی و شیمیایی فلزات سنگین، می­توان سه مکانیسم مولکولی احتمالی از قبیل تولید گونه­های فعال اکسیژن از طریق خود اکسیداسیون و یا واکنش­هایی مانند واکنش فنتون و ایجاد تنش اکسیداتیو، مهار گروه­های فعال عملکردی در مولکول زیستی و جایگزینی با یون­های فلزی ضروری در ماکرومولکول­های زیستی و آنزیم­ها برای سمیت آنها مطرح کرد.

ROSها در همه گیاهان در درجات و مقادیر مختلف و در نتیجه متابولیسم طبیعی تولید می‌شوند ولی افزایش و تجمع بیش از حد آنها منجر به تنش و آسیب اکسیداتیو می­گردد (4). در اثر شرایط تنش­زا، تولید اکسیژن فعال افزایش می‌یابد. اکسیژن فعال در گیاه از طریق فرایندهای اکسیدکنندگی محتویات سلول، اثرات مخرب جبران ناپذیری بر گیاه می­گذارد. گیاهان دارای مکانیزم­های متفاوتی برای حذف یا کاهش این ترکیبات مخرب می­باشند که در سطوح مختلف تنش وارده، ظاهر می­شوند. یکی از این سیستم­های تدافعی، سیستم آنزیمی پرکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز است که رادیکال­های آزاد را به پراکسید هیدرژن تبدیل می­کند. در ادامه پراکسید هیدروژن توسط پرکسیداز تبدیل به آب می­شود. فعالیت این آنزیم­ها در مواجه با تنش­های محیطی تحریک می­شود و از این طریق مقاومت گیاه را به این شرایط تغییر می­دهد (2، 29). از طرفی اسید آمینه پرولین تحت شرایط نامطلوب محیطی در گیاه تجمع پیدا می­کند. نقش پرولین در تنش، جلوگیری از تخریب آنزیم­ها، جلوگیری از تجزیه ماکرومولکول­ها و دخالت در حفظ استحکام دیواره سلولی و پاکسازی رادیکال‌های هیدروکسیل (.OH) تولید شده تحت تنش در گیاهان عنوان شده است (36).

به خوبی مشخص شده است که تجمع فلزات سنگین از جمله نقره در غلظت­های بالا، احتمال اثرات کشنده آن را افزایش می­دهد. سمیت نقره در محیط­های آبی به غلظت یون­های نقره آزاد وابسته است و کاهش میزان دسترسی زیستی به یون نقره از سمیت آن می­کاهد. به طور کلی در میان ترکیبات نقره­دار، ترکیبات قابل حل مانند نیترات نقره سمیت بیشتری نسبت به اشکال غیرقابل حل نقره دارند. حساسیت گونه­های گیاهی عالی خشکی‌زی در برابر سمیت ناشی از نقره متنوع است. در گونه­های گیاهی حساس، رشد و جوانه زنی در 5/7 میلی­گرم در لیتر نیترات نقره تضعیف شده است (27).

افزایش تولید آرتمیزینین در کشت بافت گیاه A. annua یکی از اهداف بسیاری از گروه­های تحقیقاتی می­باشد. این هدف تنها از طریق شناخت بیشتر مسیر بیوشیمیایی سنتز این ماده و تنظیم آن توسط فاکتورهای خارجی به‌کار رفته امکان پذیر می­باشد. تحریک (elicitation) راهبرد مؤثری برای تولید ترکیبات ثانویه به‌ویژه در کشت سلول و اندام گیاهان در نظر گرفته می­شود. برخی از الیسیتورها مثل کیتوزان، اسید سالیسیلیک، متیل جاسمونات، اسید جیبرلیک و عصاره مخمر برای بهبود تولید آرتمیزینین استفاده شده­اند (8). با وجود آنکه پژوهش‌های زیادی در زمینه آثار سمی فلزات سنگین بر رشد و متابولیسم گیاهان مختلف انجام شده است، ولی اطلاعات درباره راه­های کاهش آسیب‌های ناشی از سمیت آنها در گیاهان اندک است. همچنین ازآنجایی که فلزات سنگین در محیط کشت این ویترو منجر به تنش اکسیداتیو و تولید گونه های فعال اکسیژن بعنوان تنش ثانویه می شوند، بنابراین این پژوهش با هدف بررسی پاسخ­های دفاع آنتی­اکسیدانی و نقش مولکول سیگنال پراکسید هیدروژن در گیاهی با پتانسیل بالای تولید متابولیت ثانویه باارزش آرتمیزینین تحت تنش نیترات نقره انجام شد.

مواد و روشها

بذرهای گیاه A. annua مورد استفاده در این پژوهش از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران خریداری شد که از شهر گیلان در تاریخ 16/12/2012 جمع­آوری شده بود. بذرهای گیاه A. annua بعد از ضد عفونی‌شدن با محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد در شرایط کاملاً استریل درون شیشه­های مخصوص کشت بافت حاوی محیط کشت MS، قرار داده شدند. شیشه­های کشت در تاریکی، دمای 25 درجه سانتی­گراد و رطوبت 30 درصد درون اتاقک رشد نگهداری شدند. بعد از 8 روز بذرها جوانه زدند و برای جلوگیری از اتیوله شدن گیاهچه­ها، لامپ‌های اتاقک رشد با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی روشن گردیدند. پس از یک ماه گیاهچه­ها از محیط­های کشت قبلی خارج و به محیط کشت­های جدید انتقال داده شدند و در طول سه ماه هر 20 روز واکشت داده شدند. پس از سه ماه کشت گیاهان در شرایط این ویترو، گیاهان یکسان (با 15-10 سانتی­متر ارتفاع) برای ادامه آزمایش انتخاب شدند. ساقه­های (با 3 گره) A. annua به محیط کشت مایع MS منتقل شدند، به محیط‌های کشت فوق، نیترات نقره در شش غلظت 0، 001/0، 01/0، 1/0، 1 و 2 میلی­مولار اضافه گردید. محیط کشت فاقد نیترات نقره به‌عنوان کنترل در نظر گرفته شد. محیط­های کشت به اتاقک رشد منتقل و بر روی شیکر با دور آرام (100 rpm) قرار داده شدند. ساقه­ها در این محیط برای 7 روز رشد کردند و بعد در سه تکرار از هر ظرف کشت برای آزمایش‌ها جمع آوری شدند.

اندازه‌گیری وزن تر و وزن خشک ساقه­های گیاه: وزن تر گیاهان پس از یک هفته رشد در غلظت­های مختلف نیترات نقره، پس از خارج کردن گیاهان از محیط کشت و خشک کردن آب اضافی نمونه­ها روی کاغذ صافی اندازه­گیری شد. به‌منظور اندازه­گیری وزن خشک، نمونه­ها داخل پاکت­های کاغذی، به مدت 72 ساعت در آون 70 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند.

اندازه‌گیری رنگیزه­های فتوسنتزی: برای اندازه­گیری کلروفیل­ها از روش Arnon (5) استفاده شد. 05/0 گرم از بافت تازه گیاهان با استفاده از استون 80 درصد در محیطی تاریک بر روی یخ درون هاون چینی سائیده شد. عصاره حاصل برای 3 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد، با دور rpm 4000 سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت حاصل به کوت منتقل و جذب آن در طول موج­های 645 و 663 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل JENWAY 6300) خوانده شد. سپس میزان کلروفیل a و کلروفیل b بر حسب میلی­گرم در هر گرم وزن تر بافت گیاهی طبق روابط 1 و 2 محاسبه گردید.

Chlorophyll a = {(12.7 × D 663) – (2.69 × D 645)} × V /1000 × W                                             رابطه 1

Chlorophyll b = {(22.9 × D 645) – (4.93 × D 663)} × V /1000 × W                                               رابطه 2

D= جذب نوری، V= حجم نهایی عصاره (میلی­لیتر)، W= وزن بافت (گرم)،

اندازه­گیری میزان H₂O₂ : برای اندازه­گیری H₂O₂ از روش Alexieva و همکاران (3) استفاده شد. برای عصاره­گیری 05/0 گرم بافت تازه گیاه در هاون سرد شده با 5/1 میلی­لیتر TCA (تری­کلرواستیک­اسید) 1/0 درصد سائیده شد. عصاره تهیه شده به مدت 15 دقیقه با سرعت g 12000 در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. 500 میکرولیتر از عصاره­ها با 500 میکرولیتر بافر فسفات (7pH = ) و 1 میلی­لیتر محلول KI 1 مولار ترکیب و در طول موج 390 نانومتر خوانده شد.

اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون لیپید غشاء: برای اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپید غشاء از روش Heath و Packer (12) استفاده شد. ابتدا 025/0 گرم از بافت اندام هوایی در 5 میلی­لیتر TCA 1/0درصد کاملاً هموژنیزه و یکنواخت گردید. مخلوط هموژنیزه در g10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. به یک میلی­لیتر محلول رویی حاصل 4/5 میلی­لیتر TCA 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک­اسید 5/0 درصد اضافه شد. مخلوط به­ مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی­گراد در حمام آب گرم قرار گرفت و بعد به سرعت روی یخ سرد شد. مخلوط حاصل در  g10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و جذب محلول رویی حاصل با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 532 نانومتر خوانده شد و مقدار جذب غیر اختصاصی در 600 نانومتر از این مقدار کسر گردید. میزان مالون­دآلدهید با استفاده از ضریب خاموشی mM^-1 cm^-1155 محاسبه شد.

عصاره­گیری و اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان: 05/0 گرم از بافت تازه گیاهان به همراه کمی ازت مایع درون هاون، روی یخ سائیده شدند. سپس 1 میلی­لیتر از بافر استخراج آنزیم (50 میلی مولار بافر فسفات سدیم با 8/7=pH) به آنها اضافه گردید و همچنان روی یخ سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 20 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتی­گراد و با دور rpm 13000 سانتریفیوژ شدند. از محلول رویی برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان استفاده گردید.

فعالیت آنزیم کاتالاز: 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی و 950 میکرولیتر از محلول واکنش حاوی mM 10 آب اکسیژنه در سالین­بافرفسفات (PBS) افزوده شد و منحنی کاهش جذب نوری در مدت 120 ثانیه در طول موج 240 نانومتر رسم گردید (1). میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از رابطه 3 محاسبه شد.

EA= {∆OD×(1000/A)×B}/EC×C                  رابطه 3

EA= میزان فعالیت آنزیم بر حسب واحد (احیای یک میلی­مولار پراکسیدهیدروژن در دقیقه) در گرم وزن تر برگ، ∆OD= تغییرات میزان جذب، A= مقدار نمونه، B= مقدار بافر استخراج، EC= ضریب خاموشی معادل 039/0 میکرو­مول بر سانتی­متر، C= وزن بافت تر

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: سنجش فعالیت این آنزیم با استفاده از روش Beyer و Fridovich (7) انجام شد. طبق این روش 1 میلی‌لیتر مخلوط واکنش و 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی به همراه 10 میکرولیتر ریبوفلاوین (004/0 درصد) در لوله آزمایش ریخته شد. مخلوط به‌دست آمده برای 7 دقیقه در یک محفظه دارای دو لامپ فلورسنت 20 وات قرار داده شد. افزایش در جذب به‌واسطه تشکیل فورمازان در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. فعالیت آنزیم با تعیین درصد ممانعت در دقیقه محاسبه گردید. 50 درصد ممانعت برابر با 1 واحد فعالیت آنزیم در نظر گرفته شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برای اندازه­گیری فعالیت این آنزیم 625 میکرولیتر بافر سالین فسفات (50 میلی مولار، 8/7=pH) حاوی EDTA (2/0 میلی مولار)، 50 میکرولیتر H₂O₂ (250 میلی مولار)، 175 میکرولیتر اسید آسکوربیک (5/0 میلی مولار)، 50 میکرولیتر آلبومین سرم گاوی (g/mlµ 50) و 100 میکرولیتر از نمونه مخلوط گردید و در طول موج 290 نانومتر خوانده شد. تنظیمات دستگاه به صورت کینتیک در طول موج 290 نانومتر به مدت 60 ثانیه بود (25). بعد از خواندن میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با کمک رابطه 3 محاسبه گردید.

EC= ضریب خاموشی برابر 8/2 میکرومول بر سانتی­متر

فعالیت آنزیم گایاکول­ پراکسیداز: اندازه­گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با استفاده از روش Lin و Kao (20) انجام شد. طبق این روش 3 میلی­لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی­مولار با 7pH= ، 35/3 میکرولیتر گایاکول 9 میلی­مولار، 51/4 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 19 میلی­مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. کینتیک جذب در طول موج 470 نانومتر در دستگاه اسپکترفوتومتر در طول 1 دقیقه اندازه­گیری شد. ضریب خاموشی، 6/26 میلی­مول بر سانتی­متر در نظر گرفته شد. میزان فعالیت آنزیم با استفاده از رابطه 3 محاسبه شد.

فعالیت آنزیم گلوتاتیون­ ردوکتاز: این اندازه­گیری طبق روش Foyer و Halliwell (20) انجام شد. 250 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات 100 میلی­مولار 8/7 = pH، 120 میکرولیتر NADPH 1 میلی­مولار، 50 میکرولیتر گلوتاتیون اکسید شده 10 میلی­مولار و 480 میکرولیتر آب مقطر مخلوط شدند. به مخلوط واکنش حاصل 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی افزوده و مصرف NADPH در یک دقیقه در طول موج 340 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر با مد کینتیک خوانده شد. فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از رابطه 3 محاسبه گردید. EC= ضریب خاموشی معادل 2/6 میلی­مول بر سانتی­متر در نظر گرفته شد.

اندازه­گیری پرولین: اندازه­گیری میزان پرولین به روش Troll و Lindsley (34) انجام شد. در ابتدا 05/0 گرم از بافت تازه گیاه در هاون سرد شده با 1 میلی­لیتر اتانول 70 درصد سائیده شد. پس از قرار گرفتن عصاره حاصل در 4 درجه سانتی­گراد برای 24 ساعت، به مدت 5 دقیقه در g14000 سانتریفیوژ شد. 250 میکرو­لیتر از محلول رویی، با 470 میکرو­لیتر اتانول 70 درصد و 1 میلی­لیتر مخلوط واکنش رقیق گردید و از این محلول برای سنجش میزان پرولین استفاده شد. میزان جذب در طول موج 520 نانومتر قرائت گردید و مقدار پرولین به کمک منحنی استاندارد از پیش تهیه شده محاسبه شد.

آزمایش‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجرا گردید. تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SAS انجام شد. برای مقایسه میانگین داده‌‌ها از آزمون حداقل تفاوت معنی­داری (LSD) (05/0>P) استفاده شد و در نهایت نمودارها با نرم افزار اکسل رسم گردید.

نتایج و بحث

بروز لکه­های قهوه­ای و سیاه رنگ روی برگ ساقه­های A. annua موجود در محیط کشت­های حاوی تیمار 1 و 2 میلی­مولار نیترات نقره، احتمالاً نشان‌دهنده سمیت شدید نقره در این دو غلظت بود، بنابراین ساقه­های نکروزه شده در این دو غلظت برای بررسی تحقیقات مناسب تشخیص داده نشدند. به همین دلیل بررسی شاخص­های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی فقط در غلظت­های 001/0، 01/0 و 1/0 میلی مولار انجام شد.

نتایج حاصل از تجزیه واریانس اثر نیترات نقره بر صفات اندازه گیری شده A. annua در جدول 1 آمده است.

جدول 1- تجزیه واریانس (مقادیر میانگین مربعات) تأثیر نیترات نقره بر صفات مختلف در ساقه­های A. annua

*: بیانگر معنی­دار بودن در سطح 05/0 و ns: بیانگر عدم اختلاف معنی­دار است.

1- تأثیر نیترات نقره بر نسبت وزن تر/ وزن خشک: طبق نتایج به­دست آمده در این پژوهش، نسبت وزن تر و وزن خشک تنها در غلظت 1/0 میلی­مولار نیترات نقره افزایش معنی­داری نسبت به شاهد نشان داد (شکل 1). یکی از علت­های مهم آسیب بافتی در گیاهانی که در معرض فلزات سنگین قرار می­گیرند، ایجاد تنش اکسیداتیو است. رادیکال­های فعال اکسیژن عمدتاً در کلروپلاست و میتوکندری تولید می­شوند و آسیب­های اکسیداتیو بر چربی­ها، پروتئین­ها و ­اسیدهای نوکلئیک وارد می­کنند، در نتیجه سبب اختلال در متابولیسم طبیعی سلول، اختلال در فرایند­های مهم تنفس و فتوسنتز و کاهش رشد می­شوند (22). با توجه به افزایش نسبت وزن تر به وزن خشک ساقه­ها در غلظت 1/0 میلی­مولار نیترات نقره احتمالاً الیسیتیشن مورد نظر محتوای آب ساقه­های گیاه A. annua را در اثر تخریب غشاها افزایش داده است.

شکل 1- تأثیر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر نسبت وزن تر به وزن خشک اندام هوایی درA. annua. (حروف غیر یکسان بیانگر اختلاف معنی‌دار میانگین‌ها در سطح 05/0 با آزمون LSD است)

2- تأثیر نیترات نقره بر میزان کلروفیل a و کلروفیل b: در غلظت 001/0 میلی­مولار نیترات نقره، میزان کلروفیل a و کلروفیل b افزایش معنی­داری نسبت به شاهد یافت و در غلظت 1/0 میلی‌مولار نیترات نقره، میزان کلروفیل a کاهش معنی­داری نشان داد (شکل 2). کلروفیل نقش یگانه و اثرگذار در زندگی گیاهان عالی دارد. از آنجایی که تجزیه کلروفیل پاسخ عمومی به تنش است، می­توان نتیجه گرفت که تغییرات در میزان کلروفیل یکی از شاخص­های مهم تنش محیطی است و تحمل گونه‌ها به تنش را توصیف می­کند. جانشینی یون Mg²⁺ در مولکول کلروفیل با فلزات سمی مشخص مانند مس، روی، کادمیوم یا جیوه در طی تنش­های فلزات سنگین در گیاهان عالی نشان داده شده است که باعث کاهش فتوسنتز می­شود (22)، به طوری که ساختار و فعالیت مولکول کلروفیل و همچنین فعالیت آنزیم ریبولوز 1 و 5- بیس­ فسفات-‌کربوکسیلاز اکسیژناز را تغییر می‌دهد. همچنین در زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی و دسترسی به واسطه­ها (از جمله سیتوکروم b6f و b559) اختلال ایجاد می­کند. Schat و همکاران (31) نشان دادند که اضافه کردن فلزات سنگین کروم (25، 50 و 100 میکرومولار) و نقره (5، 10 و 15 میکرومولار) به سلول­های سالم سیانوباکتریوم و اسپیرولیناپلاتنیس باعث دگرگونی در فعالیت زنجیره انتقال الکترون و فتوسیستم II می­شود. همچنین فلزات سنگین معمولاً از طریق مهار فعالیت آنزیم، فرایندهای متابولیکی را ممانعت می­کنند، بنابراین کاهش میزان کلروفیل در اثر فلزات سنگین به علت مهار فعالیت آنزیم­های بیوسنتز کلروفیل می­باشد. برای مثال کادمیوم با مهار فعالیت آنزیم پروتوکلروفیلید ردوکتاز با واسطه برهم‌کنش با گروه­های سولفیدریل و نیز مهار آنزیم آمینولولینیک­اسید (ALA) سنتاز باعث کاهش کلروفیل می­شود (35). به علاوه نتایج نشان داد که یون­های فلزات سنگین وابسته به غلظت بر روی انتقال الکترون در جایگاه­های چندگانه از قبیل مهار آنزیم شکست آب (واقع در جایگاه اکسیداسیون فتوسیستم II) اثر می­گذارند و انتقال انرژی را تغییر می­دهند. Huang و Tao (17) گزارش کردند که محتوای کلروفیل در حضور غلظت بالای فلز مس در جوانه­های گیاه Pinus sylvestris کاهش یافت و این کاهش در محتوای کلروفیل می­تواند ناشی از پراکسیداسیون غشاهای کلروپلاست توسط مس باشد. از آنجایی‌که کلروپلاست­ها غشاهای بسیار حساس دارند، احتمال دارد که فلزات سنگین از جمله نقره بر سلامت غشای پلاستیدها و بر فتوسنتز اثر بگذارند. از علل دیگر کاهش کلروفیل توسط فلزات سنگین تأثیر بر جمع شدن در مولکول­های کلروفیل در کمپلکس‌های رنگدانه – پروتئین فتوسیستم­ها و مهار سنتر پروتئین سیستم جمع‌آوری کننده نور II (LHC II) در مرحله نسخه برداری است که منجر به فتواکسیدشدن کلروفیل تازه تشکیل شده می­گردد (15). Pandey و Sharma (26) نشان دادند که غلظت­های بالای نیکل، کادمیوم و کبالت منجر به کاهش قابل توجه در غلظت کلروفیل a و b در گیاه کلم شده است.

همچنین از آن‌جایی که محتویات کلروفیلی گیاه، یکی از شاخص­های عملکرد هورمون اتیلن است، بررسی تأثیر نیترات نقره (به عنوان یک مهارکننده دریافت اتیلن توسط گیرنده‌های آن در گیاه) بر میزان کلروفیل کل، به صورت غیر مستقیم اطلاعاتی درباره تأثیر اتیلن بر کلروفیل و فرایند فتوسنتز فراهم می­آورد. یون‌های نقره با جانشینی در جایگاه فعال گیرنده‌های اتیلنی موجود در غشاء پلاسمایی سلول‌ها و یا شبکه اندوپلاسمی به­جای کوفاکتور مس، می‌توانند گیرنده‌ها را غیر فعال و مانع از پاسخ به اتیلن در گیاه شوند (3). بنابراین افزایش غلظت کلروفیل­های a و b در غلظت 001/0 میلی­مولار نیترات نقره به طور واضح تأثیر آن را به عنوان بازدارنده فعالیت اتیلن نشان می‌دهد. در نتیجه ساقه­های تیمار شده با 001/0 میلی­مولار نیترات نقره با افزایش میزان کلروفیل می‌تواند میزان تثبیت دی‌­اکسیدکربن و متعاقباً فتوسنتز را افزایش دهند و باعث افزایش بیوماس گیاه شوند. کاهش میزان کلروفیل تحت تأثیر هورمون اتیلن در شرایط کشت in vitro گزارش شده است و مشخص شده که میان سطح اتیلن موجود در ظروف کشت بافت و سطح کلروفیل اندازه‌گیری شده رابطه‌ای معکوس وجود دارد (19) که این کاهش توسط کاربرد بازدارنده‌های بیوسنتز یا فعالیت اتیلن مهار شده است.

شکل 2- تأثیر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر مقادیر کلروفیل a (الف) و کلروفیل b (ب) در برگ A. annua. (حروف غیر یکسان بیانگر اختلاف معنی‌دار میانگین‌ها در سطح 05/0 آزمون LSD است)

3- تأثیر نیترات نقره بر میزان H₂O₂ و پراکسیداسیون لیپید غشاء: میزان H₂O₂ و پراکسیداسیون لیپید غشاء نمونه­های تحت تیمار نیترات نقره در تمام غلظت­ها افزایش معنی‌داری نسبت به شاهد نشان داد (جدول 2). یکی از تغییرات بیوشیمیایی که در گیاه تحت تنش ایجاد می­شود تجمع گونه­های فعال اکسیژن است که محصول اجتناب ناپذیر متابولیسم طبیعی سلول می­باشد. کلروپلاست و میتوکندری سلول­های گیاهی از مهمترین تولیدکننده­های گونه­های فعال اکسیژن هستند. الکترون­های نشت‌یافته از زنجیره انتقال الکترون می توانند با اکسیژن مولکولی حاصل از متابولیسم طبیعی گیاه، ترکیب شده و تولید گونه­های فعال اکسیژن نمایند. این گونه­های اکسیژن سمی و بسیار واکنش پذیرند و در غیاب مکانیسم­های حفاظتی می­توانند متابولیسم طبیعی سلول را به میزان زیادی مختل کنند. این رادیکال­ها از طریق پراکسیداسیون لیپیدها و در نتیجه تخریب غشاء، تخریب پروتئین­ها، غیر فعال کردن آنزیم­ها، از بین بردن رنگیزه­ها و اختلال در عملکرد DNA، تنش ثانویه اکسیداتیو ایجاد می­کنند که منجر به خسارتهای جدی به ساختارهای سلولی و گیاه می­گردد (29). طبق گزارشهای Hsu و Kao (14) تنش کادمیوم باعث افزایش مقدار H₂O₂ در برگ­های برنج شده است. همچنین افزایش میزان پراکسید هیدروژن به عنوان شاخص تنش اکسیداتیو تحت تیمار سرب در گیاهچه های یونجه گزارش شده است (12). در این تحقیق افزایش میزان H₂O₂ احتمالاً به دلیل برهم خوردن تعادل بین تولید رادیکال­های آزاد و فاکتورهای مؤثر در حذف آنها در حضور فلز سنگین نقره است. همچنین ممکن است الکترون­های نشت کرده از زنجیره انتقال الکترون افزایش یافته، با اکسیژن مولکولی ترکیب شده و تولید گونه­های فعال اکسیژن بیشتر از نمونه شاهد شده باشد.

در شرایط تنش­زا فرایندهای مخرب غشاء فعال شده و منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء می­شوند. به عنوان مثال رادیکال­های آزاد تنش اکسیداتیو حاصل از شرایط محیطی نامناسب باعث آسیب رساندن به لیپیدها و اسیدهای چرب غشایی شده و رادیکال­های لیپید و پراکسی و هیدروکسی پراکسی تولید می­کنند. رادیکال­های جدید تولید شده می‌توانند واکنش­های اکسیداسیون لیپیدها را تسریع کنند. گزارش شده است که با افزایش میزان پراکسیداسیون لیپید در گیاهان تحت تنش کادمیوم، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز افزایش می­یابد. این آنزیم اکسیژناسیون اسیدهای چرب غیراشباع و با زنجیره طولانی را کاتالیز می­کند (29). پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، نفوذ پذیری غشاء را تحت تأثیر قرار می­دهد، به علاوه اکسیژناسیون اسیدهای چرب غیر اشباع پیام­آورهای ثانویه­ای را برای مقابله با تنش تولید می‌کنند. Gallego و همکاران (11) نشان دادند که تیمار برگ­های آفتابگردان با فلزات سنگین آهن، مس و کادمیوم منجر به افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز می­شود. در این تحقیق نیز میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء نسبت به شاهد افزایش یافت که این مشاهده با توجه به افزایش H₂O₂ در تمام غلظت‌های نیترات نقره قابل توجیه می­باشد. در واقع در اثر تولید اکسیژن­های فعال در حضور نیترات نقره، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء افزایش می­یابد.

جدول 2- تغییرات میزان H₂O₂ و پراکسیداسیون لیپید نسبت به افزایش غلظت نیترات نقره در ساقه­های A. annua

4- تأثیر نیترات نقره بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان: فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تیمار نیترات نقره در تمام تیمارها نسبت به شاهد افزایش معنی­داری داشت (شکل 3- الف). فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در تیمار 01/0 و 1/0 میلی­مولار به ترتیب 04/25% و 43/30% نسبت به شاهد کاهش معنی­داری یافت (شکل 3- ب). فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز تنها در تیمار 1/0 میلی­مولار 69/53% نسبت به شاهد کاهش معنی­داری نشان داد (شکل 3- ج). فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در تیمار 01/0 میلی­مولار، 89/44% افزایش و در تیمار 1/0 میلی­مولار، 93/53% کاهش معنی­داری نشان داد (شکل 3- د). همچنین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در تیمارهای 001/0 و 01/0 میلی‌مولار به ترتیب 33/13% و 51/11% نسبت به شاهد کاهش معنی­داری یافت (شکل 3- ه). همان طور که ذکر شد تنش فلزات سنگین افزایش تولید O₂^- و H₂O₂ را در گیاهان به همراه دارد. افزایش فعالیت آنزیم­های کاتالاز و گایاکول پراکسیداز توسط نیترات نقره نشان می­دهد که این آنزیم­ها با همکاری هم در حذف پراکسید هیدروژن عمل می­کنند و نیز دلیلی بر شروع دفاع آنتی­اکسیدان می­باشد، به طوری که به عنوان مثال پاسخ ناکافی یک آنزیم به نیترات نقره توسط افزایش فعالیت آنزیمی دیگر جبران می­شود. کاتالاز در پراکسی­زوم سلول­های گیاهی حضور دارد و مهمترین آنزیم برای حذف پراکسید هیدروژن است. این آنزیم سلول­ها را از اثرات سمی پراکسید هیدروژن از طریق تجزیه آنها به اکسیژن مولکولی و آب، بدون تولید رادیکال­های آزاد حفاظت می­کند (6). طبق نتایج حاصل توسط Schutzendubel و همکاران (32)، اضافه کردن کادمیوم 50 میکرومولار به کشت هیدروپونیک ریشه­هایPinus sylvestris در 6 ساعت اول باعث افزایش فعالیت کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز می­شود و بعد از 12 ساعت کاهش می­یابد، در حالی که در 6 ساعت اول باعث کاهش فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز می­شود و بعد از 12 ساعت باعث افزایش فعالیت این آنزیم نسبت به شاهد می­شود. همچنین افزایش فعالیت آنزیم های گلوتاتیون پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز تحت تنش سلنیم و بدنبال آن کاهش تنش اکسیداتیو در گیاهچه های گندم گزارش شده است (13). در این تحقیق با توجه به اینکه فعالیت آنزیم کاتالاز در تمام تیمارها افزایش یافته می­توان نتیجه گرفت که حذف اکسیژن­های فعال بیشتر از سایر آنزیم­ها بر عهده کاتالاز بوده و پاسخ ناکافی سایر آنزیم­ها را جبران کرده است. فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز تنها در تیمار 01/0 میلی­مولار نیترات نقره افزایش معنی­دار یافت که احتمالا به فعالیت آنزیم کاتالاز کمک شده است. سایر آنزیم­ها در تمام تیمارها یا تغییر معنی­داری نداشته یا کاهش یافتند. تغییرات ایجاد شده در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان ممکن است در ارتباط با تنش اکسیداتیو وارده به گیاه در اثر تجمع ROSها در پی تیمار فلز سنگین نقره و همچنین تشدید فرایند پراکسیداسیون لیپیدهای همسو با این تنش باشد. در کل افزایش فعالیت آنزیمی می­تواند برابر با افزایش سرعت سمیت‌زدایی ROSها در گیاه باشد. احتمالاً از علت­های کاهش فعالیت آنزیم­ها می­تواند تشدید اثرات مخرب نقره و یا ROSها القا شده بر ساختار و فعالیت این آنزیم­ها باشد. مشخص شده که نقره می­تواند جانشین فلزاتی که به عنوان کوفاکتور آنزیمی در ساختار آنزیم قرار دارند، گردد و به این ترتیب بر فعالیت آن اثر منفی داشته باشد (28).

شکل 3- تأثیر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر فعالیت آنزیم کاتالاز (الف)، آسکوربات پراکسیداز (ب)، گایاکول پراکسیداز (ج)، گلوتاتیون ردوکتاز (د) و سوپراکسیددیسموتاز (ه) در ساقه­هایA. annua. (حروف غیر یکسان بیانگر اختلاف معنی‌دار میانگین‌ها در سطح 05/0 آزمون LSD است)

5- تأثیر نیترات نقره بر میزان پرولین: میزان پرولین در تمام غلظت­های نیترات نقره افزایش چشم‌گیری نسبت به شاهد نشان داد (شکل 4). اسیدآمینه پرولین تحت شرایط نامطلوب محیطی در گیاه تجمع می­یابد. پرولین در محدوده وسیعی از گونه­های گیاهی تحت تنش­های مختلفی مانند خشکی، شوری، دما، نور زیاد و فلزات سنگین مجتمع می­شود (21).

تنش­ها از جمله تنش فلزات سنگین، با سرعت بخشیدن به پیری برگ، میزان پرولین را افزایش می­دهند. Shah و همکاران (33) دلیل افزایش پرولین در گیاه تیمار شده با کادمیوم را تلاش برای حفظ اسیدیته سیتوزولی و یا راهی برای حفاظت آنزیمی گیاهان تحت تنش توسط این اسیدآمینه اعلام کردند. Schat و همکاران (31) دلیل افزایش پرولین تحت تیمار کادمیوم در گیاه Silene vulgaris را کمبود آب مؤثر از تنش کادمیوم، نه اثر مستقیم کادمیوم بر این اسید آمینه دانستند. تجمع پرولین در زمان تنش، حاصل تغییر در سرعت بیوسنتز و تجزیه این اسیدآمینه می­باشد. در این حالت میزان فعالیت آنزیم­های مربوطه، همچنین غلظت­های مؤثر پیش سازها و فراورده­های آن مهم است (32). در این تحقیق می­توان پیش­بینی کرد که افزایش میزان پرولین در تمام غلظت­های نیترات نقره به جلوگیری از آسیب اکسیداتیو القا شده توسط نیترات نقره کمک کرده است.

شکل 4 - تأثیر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر میزان پرولین در ساقه­هایA. annua. (حروف غیر یکسان بیانگر اختلاف معنی‌دار میانگین‌ها در سطح 05/0 آزمون LSD است)