تنش­های محیطی اثرات متنوعی بر رشد و نمو گیاهان می گذارند. شوری یکی از مشکلات اصلی در تولید محصولات کشاورزی و تعیین کننده پراکنش گیاهان در طبیعیت می­باشد. شوری از طریق ایجاد سمیت یونی، کمبود عناصر غذایی و خشکی فیزیولوژیکی بر جنبه های مختلف فیزیولوژیکی گیاهان تاثیر می­گذارد (31). بسیاری از تنش­های محیطی همچون شوری، خشکی، عناصر سنگین و نور با ایجاد تنش ثانویه اکسیداتیو آسیب گیاهان را تشدید می­کنند. به هنگام تنش اکسیداتیو به دلایل مختلف گونه­های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species, ROS) تشکیل می شوند. کلروپلاست­ها، میتوکندری­ها، پراکسیزوم­ها و غشاهای سلولی جایگاه اصلی تولید ROS محسوب می­شوند. ROSها شامل رادیکال­های آزاد (سوپراکسید ^-O₂^•، هیدروکسیل OH^•، پرهیدروکسیل HO₂^• و رادیکال­های آلکوکسیل (RO^• و اشکال غیررادیکالی (پراکسید هیدروژن و اکسیژن یکتایی) می­باشند (18) که در صورت ضعف مکانیسم­های حفاظتی منجر به تخریب سلولی به وسیله اکسیداسیون لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک خواهند شد (8). ROSها در همه گیاهان در مقادیر مختلف  طی متابولیسم طبیعی تولید می­شوند ولی افزایش و تجمع بیش از حد آن­ها در شرایط نامطلوب ایجاد می­شود. ROSها فرآیندهایی مانند رشد و نمو، چرخه سلولی، مرگ سلولی برنامه­ریزی شده، پاسخ به تنش­های غیرزیستی و دفاع در برابر پاتوژن­ها را کنترل می­کنند (18). گیاهان برای خنثی کردن اثرات تخریبی گونه­های فعال اکسیژن دارای سیستم­های آنتی­اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی هستند. آسکوربیک اسید یکی از آنتی اکسیدان های غیرآنزیمی جاروب کننده رادیکال­های آزاد برای حفاظت  سلول ها در مقابل آسیب­های اکسیداتیو می­باشد (8). این مولکول، ترکیب 6 کربنی است که به عنوان آنتی­اکسیدان محلول در سلول­های جانوری و گیاهی عمل می نماید. گیاهان، قارچ­ها و بسیاری از جانوران به طرق متفاوت توانایی بیوسنتز آسکوربیک اسید را دارند. انسان به دلیل نداشتن برخی آنزیم­های مسیر بیوسنتز آسکوربیک اسید فاقد این توانایی می­باشد (35). آسکوربیک اسید درفضاهای آپوپلاستی، سیتوزول، میتوکندری­ها، پراکسی­زوم­ها، گلی­اکسی­زوم­ها و واکوول­ها در غلظتی در حد چند  میلی­مولار وجود دارد (13). در گیاهان آسکوربیک اسید نقش­ زیادی در عملکردهای فیزیولوژیکی ازجمله تقسیم سلولی، گسترش دیواره سلولی و سایر پدیده­های رشدی ایفا می­کند و منبع اصلی و مستقیم ویتامین C برای انسان محسوب می­شود (13). گزارش هایی از بهبود رشد گیاهان در شرایط شوری به وسیله کاربرد برون زای آسکوربیک اسید  نیز در دست است (4).

شاهی گیاهی یک­ساله، متعلق به تیره براسیکاسه و به ارتفاع حدود 30 تا 50 سانتی­متر می­باشد. منشا آن به منطقه وسیعی از مصر تا تبت نسبت داده شده است. برگ و ساقه آن رنگ سبز روشنی دارد و گل­هایش سفید است. شاهی اثر ضد آسکوربوت قوی داشته، اشتهاآور، مدر و تصفیه کننده خون است و دانه آن به عنوان داروی خلط­آور مصرف می­شود (2). به دلیل ماهیت آنتی اکسیدانی آسکوربیک اسید و تاثیر آن در بهبود رشد گیاهان تحت تنش، در پژوهش حاضر تاثیر آن بر جنبه های اکسیداتیو تنش شوری در گیاه شاهی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

بذرهای سالم  و یک دست گیاه شاهی (Lepidium sativum L. cv. Red Mobarakeh) انتخاب و با هیپوکلریت سدیم 1% ضدعفونی و با آب مقطر شستشو داده شدند. بذرها پس از 4 ساعت نگهداری در آب مقطر به گلدان­های حاوی پرلیت انتقال یافته و با محلول غذایی هوگلند تغذیه شدند. گلدان­ها در شرایط نوری تنظیم شده 14 ساعت نور و 10 ساعت تاریکی در شدت نور فتوسنتزی 250 میکرو­مول فوتون بر متر مربع و رطوبت 30 تا 40 درصد و دمای 2±25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. پس از 14 روز، دانه رست­ها به چهار گروه تقسیم شدند: گروه اول با محلول هوگلند (تیمار شاهد)، گروه دوم با محلول هوگلند حاوی 1 میلی­مولار آسکوربیک اسید (تیمار ASA)، گروه سوم با محلول هوگلند حاوی 225 میلی­مولار  NaCl (تیمار NaCl) و گروه چهارم با محلول هوگلند حاوی 1 میلی­مولار آسکوربیک اسید و 225 میلی­مولار  NaCl(تیمار ASA+NaCl) به مدت هشت روز تیمار شدند. 24 ساعت بعد از آخرین تیمار برگ­ها و ریشه­ها جهت آنالیز استفاده شدند.

تعیین وزن تر: ابتدا گرد و غبار و نمک احتمالی باقیمانده در سطح بخش­های هوایی و ریشه­ها پس از شستشو با آب مقطر و خشک کردن مجدد حذف و سپس وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها با ترازوی حساس اندازه­گیری شد.

سنجش محتوای H₂O₂ : مقداری بافت برگی و ریشه­ای تر با بافر فسفات پتاسیم (50 میلی­مول و 5/6=pH) همگن و به مدت 25 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. مقداری از عصاره رویی با تیتانیوم کلراید 1% مخلوط و به مدت 25 دقیقه دیگر سانتریفیوژ شد. میزان جذب مایع رویی در طول موج nm 410 تعیین (22) و محتوای H₂O₂ با استفاده از ضریب تصحیح M^-1 cm^-1μ 28/0 بر حسب μmol g^-1 وزن تر ارزیابی شد.

 سنجش محتوای مالون­دی­آلدئید: مقداری بافت برگی و ریشه­ای تر با تری کلرواستیک اسید (TCA) %1/0 همگن و به مدت 5 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. مقداری از محلول رویی با TCA 20% حاوی تیوباربیتوریک اسید %5/0 مخلوط و 30 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. واکنش درآب یخ متوقف و پس از سانتریفیوژ میزان جذب مایع رویی­ در طول موج­های532 و 600 نانومتر تعیین (3) و محتوای مالون­دی­آلدئید از روی ضریب تصحیح
mM^-1 cm^-1 155 برحسب μmol g^-1 وزن تر ارزیابی شد.

سنجش شاخص پایداری غشا (Membrane Stability Index, MSI): قطعات برگی هم اندازه در فالکون­های حاوی آب مقطر در دمای آزمایشگاه به مدت 24 ساعت روی دستگاه شیکر تکان داده شده و میزان هدایت الکتریکی (C₁) محلول ها اندازه­گیری شد. سپس همان قطعات در اتوکلاو تخریب و پس از آن به مدت 1 ساعت روی دستگاه شیکر تکان داده شده و دوباره میزان هدایت الکتریکی (C₂) محلول ها تعیین و شاخص پایداری غشا از رابطه زیر محاسبه شد (33):

MSI = [1- (C₁/C₂)]×100

استخراج عصاره آنزیمی: مقداری بافت ریشه­ای تر در دمای C° 4 با بافر فسفات سدیم حاوی EDTA و پلی­وینیل پلی­پیرولیدون (mM 100 و 5/7 =pH) همگن و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور و دمای C° 4  سانتریفیوژ شد. از محلول رویی جهت سنجش فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز مقداری از مایع رویی با بافر فسفات (mM 50 و 8/7 = pH) حاوی گایاکول mM 40 و آب اکسیژنه mM 20 مخلوط شد. میزان تولید تتراگایاکول در nm 470 در 1 دقیقه اندازه­گیری و فعالیت آنزیمی با استفاده از ضریب تصحیح mM^-1 cm^-1 39/6 به صورت واحد آنزیمی بر میلی­گرم پروتئین گزارش شد. میزان پروتئین هر نمونه بر اساس روش برادفورد اندازه­گیری شد (23).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: مقداری از مایع رویی با بافر فسفات (mM100 و 5/7 =pH) و آب اکسیژنه mM 2 مخلوط و بعد از 3 دقیقه معرف تیتانیوم اضافه و  پس از سانتریفیوژ در 4000 دور، میزان جذب مایع رویی در nm 420 اندازه­گیری شد. مقدار پروتئین هر نمونه بر اساس روش برادفورد تعیین و با استفاده از منحنی استاندارد آب اکسیژنه با غلظت­های 10-0 میلی­مول بر لیتر تعیین فعالیت کاتالاز به صورت واحد آنزیمی بر میلی­گرم پروتئین گزارش شد (39).

تجزیه و تحلیل آماری: برای انجام تجزیه های آماری از نرم افزار  SPSS نسخه 16 و برای رسم نمودارها از Excel استفاده شد. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

نتایج

وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها: طبق نتایج به دست آمده شوری موجب کاهش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها نسبت به شاهد شد. آسکوربیک اسید باعث افزایش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها شد. وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری افزایش معنی دار نشان داد ولی نسبت به تیمار شاهد تفاوت معنی داری نداشت (شکل 1).

شکل 1- مقادیر میانگین  وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شرایط شاهد شد. آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها شد. محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری کاهش نشان داد ولی نسبت به تیمار شاهد در برگ­ها تفاوت معنی داری نداشت (شکل 2).

شکل 2- مقادیر میانگین محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

محتوای مالو­ن­دی­­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها: شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شد. این در حالی است که تیمار آسکوربیک اسید محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها را به طور معنی­داری کاهش داد. محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه شاهد تفاوت معنی داری نداشت ولی نسبت به تیمار شوری کاهش یافت (شکل 3).

شکل 3- مقادیر میانگین محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

پایداری غشاهای سلولی: نتایج حاصل از اثرات شوری روی شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها نشان داد که شوری موجب کاهش معنی­دار MSI برگ­ها نسبت به شاهد شد. تیمار آسکوربیک اسید باعث افزایش معنی­دار MSI برگ­ها شد. MSI برگ­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه شاهد و گیاهان تحت تنش شوری افزایش معنی داری داشت (شکل 4).

شکل 4- مقادیر میانگین  MSI برگ­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها: فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها هم در تنش شوری و هم تحت تیمار آسکوربیک اسید افزایش معنی­دار نسبت به شرایط شاهد نشان داد. همچنین در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها نسبت به تیمار شوری و شاهد افزایش معنی­داری نشان داد (شکل 5).

شکل 5- مقادیر میانگین  فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها: در ریشه گیاهان، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم کاتالاز و آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار فعالیت آنزیم نسبت به شرایط شاهد شد. در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید، فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها نسبت به تنش شوری و شاهد کاهش معنی­داری یافت (شکل 6).

شکل 6- مقادیر میانگین فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها با 4 تکرار±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0P< است.

بحث 

وزن تر بخش­های هوایی  و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب کاهش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 1). کاهش رشد، عمده­ترین اثر شوری بر گیاهان است (10). تنش شوری بر کاهش رشد گیاهان به طرق مختلف تاثیر می گذارد. کاهش جذب آب در شرایط شوری از اثرات اولیه روی گیاهان می باشد که این مسئله بر رشد تاثیر جدی می گذارد (اثر اسموتیک شوری). با گذشت زمان و انباشتگی یون های سمی در بافت های برگی فرآیند فتوسنتز آسیب دیده و کاهش رشد مضاعف می شود. جلوگیری از رشد گیاه در شرایط شوری ممکن است از طریق افزایش تولید برخی هورمون ها به ویژه آبسیزیک اسید صورت بگیرد (29). همچنین شوری نیاز انرژیایی لازم برای حفظ حالت طبیعی سلول را افزایش داده و در نتیجه انرژی کمتری برای نیازهای رشدی باقی می­ماند. برخی از گیاهان در شرایط تنشی توان آنتی اکسیدانی خود جهت مقابله با شرایط جدید را افزایش می دهند (10). تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها در حضور و عدم حضور نمک شد. ASA با افزایش جذب نیتروژن (از طریق سنتز مالات و تبادل آن با نیترات) می­تواند به افزایش رشد گیاه کمک کند (6). همچنین ASA در سنتز گلیکوپروتئین­های اکستانسین غنی از هیدروکسی پرولین دیواره نقش دارد (14). ASA یکی از ترکیبات مهم در حفظ حالت ردوکس سلولی می­باشد که در شرایط تنشی در عملکرد مناسب سلول دخالت می­کند. این ترکیب به عنوان کوفاکتور مهم در بیوسنتز برخی هورمون­های گیاهی از جمله جیبرلین (37)، می­تواند سبب افزایش تقسیم و توسعه سلولی و رشد گیاه شود. گزارش­هایی از افزایش مقدار ASA  در طی تنش شوری روی گیاهان وجود دارد (26). از طرف دیگر تیمار برون زای گیاهان با ASA می تواند با حفظ فتوسنتز و رنگدانه های فتوسنتزی در شرایط تنش شوری رشد گیاهان را بهبود بخشد (19). اثر بهبودی کاربرد ASA در رشد گیاهان دیگر از جمله لوبیا (5) و نخود (5 و 8) نیز گزارش شده است.

محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شده است (شکل 2). افزایش میزان پراکسید هیدروژن در طی تنش شوری در گیاهان دیگر نیز  گزارش شده است (6 و 20). تنش شوری همانند بسیاری از تنش های محیطی می تواند به تنش ثانویه اکسیداتیو در گیاهان منجر شود (11). اکسیژن­های فعال توسط فعالیت­های متابولیکی مختلف در کلروپلاست­ها، میتوکندری­ها، پراکسی­زوم­ها، میکروبادی­ها، NADPH اکسیدازهای متصل به غشاهای سلولی و پراکسیدازهای دیواره سلولی تولید می­شوند (30). گیاهان وقتی در معرض تنش­های محیطی قرار می­گیرند، اشکال مختلفی از اکسیژن­های فعال، که به بافت­های گیاهی صدمات اکسیداتیو وارد می سازند، را تولید می­کنند (38). در شرایط تنشی تعادل تولید و حذف گونه­های فعال اکسیژن به هم خورده و مقدار آنها افزایش می­یابد. در میان گونه­های فعال اکسیژن، H₂O₂ از اهمیت خاصی برخوردار است. H₂O₂ دارای پایداری ببیشتر و نیمه عمر طولانی است و به آسانی از غشاهای سلولی عبور می­کند (40).  هیدروژن پراکسید همچنین در برخی غلظت ها به عنوان مولکول علامتی عمل می کند، بطوریکه با پیش تیمار این ترکیب، تحمل به شوری در گیاهان می تواند افزایش یابد (17).

نتایج نشان داد که تیمار آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای H₂O₂ برگ­­ها و ریشه­ها می شود. مطابق با نتایج این پژوهش، کاهش سطح H₂O₂  با کاربرد ASA در گندم تحت تنش شوری نیز گزارش شده است (6). همچنین محتوای H₂O₂ برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری نیز کاهش یافت. گیاهان به طور طبیعی مکانیسم­هایی برای از بین بردن گونه­های فعال اکسیژن دارند. از جمله مکانیسم های دفاعی افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان می باشد. ASA یک مولکول آنتی­اکسیدان درون زا و محلول در آب است که در گیاهان به عنوان ماده اولیه در چرخه سم­زدایی آنزیمی H₂O₂ عمل می­کند (8). ASA به طور مستقیم رادیکال­های هیدروکسیل و سوپراکسید را حذف و H₂O₂ را به کمک آسکوربات پراکسیداز به آب احیا می­کند (4).

محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 3). رادیکال­های آزاد اکسیژن توانایی انجام واکنش­های اکسیداسیون با اسیدهای چرب غیراشباع را دارند که منجر به پراکسیداسیون لیپیدها و تخریب غشاهای سلولی می شود (27). گونه های فعال اکسیژن به فسفولیپیدها در محل پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع و پیوند استری بین گلیسرول و اسیدهای چرب آسیب می­رسانند. اندازه­گیری محصولات پراکسیداسیون یکی از قابل­قبول­ترین روش­های اندازه­­گیری صدمات اکسیداتیو به غشاهای سلولی است. پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع، آلدئیدهایی را تولید می­کند که این محصولات آلدئیدی به عنوان شاخص تنش اکسیداتیو بیان می­شوند (38). پراکسیداسیون چربی ها به عنوان یک فرآیند متابولیکی طبیعی تحت شرایط عادی نیز صورت می پذیرد ولی در شرایط تنشی تشدید می شود. پیامد عمل گونه­های فعال اکسیژن نه تنها آسیب به چربی هاست بلکه پروتئین­ها و DNA نیز صدمه دیده و در شایط حاد منجر به مرگ سلولی می­شوند (18). افزایش پراکسیداسیون چربی ها در شرایط تنش شوری در گیاهان دیگر نیز گزارش شده است (3 و 12).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تیمار آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها شد. همچنین محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری کاهش یافت (شکل 3). ASA با خنثی­سازی رادیکال­های اکسیژن از طریق مصرف اکسیژن­های فعال و تولید مونو دهیدروآسکوربات از بروز آسیب به سلول و چربی های غشاها جلوگیری کرده و سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدی می­شود (37). مونو دهیدروآسکوربات دوباره توسط مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز به آسکوربات تبدیل می­شود. تاثیر کاهندگی پراکسیداسیون چربی ها با کاربرد برگی ASA، در گیاه کلزای تحت تنش شوری نیز مشاهده شده است (1).

پایداری غشاهای سلولی: بر اساس نتایج، شوری موجب کاهش معنی­دار شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها نسبت به شاهد شد (شکل 4). یکی دیگر از روش­ها برای بررسی عملکرد فیزیولوژیکی سلول ها، سنجش نفوذپذیری غشاهای سلولی و تغییرات ساختاری آنها است. غشاهای سلولی  محتوای درونی سلول ها را از محیط بیرونی جدا می کنند. غشا اولین جایگاهی است که در معرض تنش شوری قرار می­گیرد (7). هرگونه تغییر در ساختار غشاهای سلولی عملکرد سلول ها را متاثر می کند. همانطور که در بخش قبلی بیان شد، پراکسیداسیون چربی­ها به وسیله گونه­های فعال اکسیژن طی تنش شوری یکی از مکانیسم­های مهم تخریب غشاهای سلولی می باشد.  با آسیب به ساختار و یکپارچگی غشاها نقل و انتقال یون ها و متابولیت ها از تعادل خارج شده و این مسئله عوارض مخربی برای سلول خواهد داشت (36).

همان طور که در شکل 4 نشان داده است، تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها شد. همچنین شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری افزایش یافت. یکی از دلایل اصلی تاثیر مثبت ASA در حفظ و پایداری ساختار غشاهای سلولی تاثیر آن در تولید مجدد ویتامین E از رادیکال مربوطه می­باشد (30). همچنین ویتامین E رادیکال­های لیپوپراکسی را پاکسازی و رادیکال αتوکوفروکسیل را تولید می­کند که توسط ASA دوباره به شکل احیا بر می­گردد و از این طریق باعث انسجام غشایی می­شود. ویتامین E آنتی­اکسیدان­ محلول در چربی بسیار مهمی بوده و در غشاهای غنی از اسیدهای چرب غیراشباع کلروپلاست­ها وجود دارد که از پراکسیداسیون اسیدهای چرب جلوگیری کنند. زنجیره فیتیل آنها به اسیدهای چرب آزاد متصل شده و از هم گسیختگی اسیدهای چرب در غشاها را به حداقل می­رساند. همچنین ASA با کاهش تجمع پراکسید هیدروژن از پراکسیداسیون لیپیدی و تغییر نفوذپذیری غشاها جلوگیری کرده و مانع نشت یونی می­شود (16). تاثیر ASA در کاهش اثرات شوری روی پایداری غشاهای سلولی گیاهان دیگر از جمله پیاز نیز گزارش شده است (34).

 فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 5). نقش آنزیم­های آنتی­اکسیدان همانند پراکسیداز و کاتالاز در کاهش آسیب وارده به ماکرومولکول­ها و نهایتا ساختارهای سلولی توسط ROS ثابت شده است. درمجموع، بین توان آنتی اکسیدانی (آنزیمی و غیر آنزیمی) و درجه تحمل به انواع تنش ها همبستگی وجود دارد (5). پراکسیداز یک پروتئین دارای هِم است که برای اکسیداسیون سوبستراهای مختلف از H₂O₂ استفاده می­کند. این آنزیم به طور عمده در دیواره سلولی قرار داشته و دارای نقش­های مختلفی از جمله اکسیداسیون ترکیبات فنلی، پلی­مریزاسیون به منظور سنتز لیگنین و پاکسازی H₂O₂ می­باشد (25). H₂O₂ یک مولکول علامتی مهم در پاسخ به تنش­های زیستی و غیرزیستی می­باشد که باعث القای سنتز تعدادی از آنزیم های دفاعی در گیاهان شده و موجب تغییر تحمل گیاه علیه تنش­های مذکور می­شود. در این بررسی، افزایش فعالیت پراکسیداز با افزایش تولید پراکسید هیدروژن همراه بود. افزایش فعالیت این آنزیم نشان­ دهنده این است که پراکسیداز نقش مهمی را در سمیت­زدایی از پراکسید هیدروژن ایفا می­کند. افزایش فعالیت پراکسیداز در ریشه و ساقه گیاه Crithmum maritimum (9) و برگ های تحت تنش شوری در مقایسه با گیاه شاهد گزارش شده است. میزان افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در گونه های گیاهی و حتی ارقام مختلف یک گونه تحت تنش شوری یکسان نمی باشد (21). الگوی فعالیت آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز در ریشه گیاهان ممکن است در تنش کوتاه مدت و دراز مدت شوری متفاوت باشد به طوری که در ریشه کلم تیمار شوری پس از یک روز موجب کاهش ولی پس از هفت روز موجب افزایش فعالیت این آنزیم ها شد (20).

بر اساس داده های شکل 5، تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها شد. همچنین فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری افزایش یافت. افزایش فعالیت آنزیم در سویا (15) و نیشکر (28) تحت تنش شوری توسط تیمار برون زای ASA نیز گزارش شده است. همان طور که در قبل بیان شد، پراکسیدازها می­توانند به عنوان آنتی­اکسیدان عمل نمایند. بنابراین، آسکوربیک اسید برای آنزیم­ آسکوربات پراکسیداز که در تجزیه H₂O₂ نقش دارد به عنوان سوبسترا عمل می­کند (24) و احتمالا بتواند با تامین سوبسترای مورد نیاز آنزیم در سم­زدایی H₂O₂ نقش ایفا کند.

فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها: بر اساس نتایج ارایه شده در شکل 6، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها نسبت به گیاهان شاهد شد. در تنش شوری یکی از مهمترین ترکیبات سمی تولید شده ناشی از رادیکال­های آزاد اکسیژن، پراکسیدهیدروژن می­باشد. کاتالاز یک آنزیم تترامر حاوی هِم است که در تمام موجودات هوازی وجود داشته و در تجزیه H₂O₂ نقش دارد. گونه های فعال اکسیژن علاوه بر اینکه متابولیت­های سمی برای سلول هستند، نقش مهمی در انتقال علایم در فرآیندهای سلولی به عنوان پیامبر ثانویه برای فعال شدن فاکتورهای رونویسی و بیان ژن­ها ایفا می­کنند (5). افزایش فعالیت کاتالاز در هر دو رقم حساس و مقاوم به شوری در گیاه گندم گزارش شده است (32). از طرف دیگر، این آنزیم در گیاه شورپسند Cakile maritima  در شرایط شوری دارای نقش حفاظتی نمی باشد (10). در شرایط تنش شوری، مقدار H₂O₂ در سلول­ها افزایش می­یابد که کاتالاز یکی از تخصصی­ترین و اصلی­ترین آنزیم­های پاکسازی­کننده H₂O₂ محسوب می شود.

نتایج شکل 6 حاکی از کاهش معنی دار فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها در تیمار آسکوربیک اسید می باشد. همچنین فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری کاهش یافت. یکی از مکانیسم­های مهم عملکردی آسکوربیک اسید پاکسازی موثر گونه های اکسیژن فعال و حفاظت سلول ها از آسیب اکسیداتیو می باشد. آنزیم کاتالاز، H₂O₂ را به آب و اکسیژن تبدیل و در طی این واکنش آسکوربیک اسید به عنوان دهنده هیدروژن عمل می­کند (20). کاهش  فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار ASA، می­تواند دلیلی بر خنثی شدن رادیکال­های آزاد اکسیژن به وسیله ASA (شکل 2) و بهبود وضع رشدی (شکل 1) و فیزیولوژیکی (شکل 4) گیاهان باشد.  

جمع­بندی

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که شوری 225 میلی مولار NaCl منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاه شاهی شده و کاربرد ریشه­ای آسکوربیک اسید به عنوان آنتی­اکسیدان می­تواند اثرات مضر و تنش اکسیداتیو حاصل از شوری را بهبود بخشد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه شهید مدنی آذربایجان به خاطر حمایت مالی و آقای علیرضا محمدپور به سبب همکاری آزمایشگاهی سپاسگزاری می نمایند.