Comparison of microwave assisted and traditional extraction of Urtica dioica L. and evaluation of its antioxidant activity by HPLC- DPPH assay

Document Type : Research Paper

Authors

University of Zabol

Abstract

Abstract
In the present study, the effects of two types of extraction methods: traditional and microwave-assisted extraction (MAE) on antioxidant activity of Urtica dioica L. was investigated. Water, methanol and ethanol extracts of leaf and stem of Urtica dioica L. were obtained from both traditional and MAE methods and evaluated for their radical scavenging capacity (RSC) by high performance liquid chromatography (HPLC)-separated antioxidants with the 2,2‘-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals (DPPH•). The antioxidant activities of all the extracts were determined by high performance liquid chromatography at 517nm using 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical (DPPH). It was determined that antioxidant activity of leaf and stem (ethanol extracts) of Urtica dioica L. by MAE method was higher compared to traditional method, however, was not significantly different (p>0.05). In conclusion, HPLC-DPPH assay did not show significant difference between MAE and traditional methods in antioxidant activity of leaf and stem of Urtica dioica L.
Key words: Antioxidant activity, MAE, HPLC-DPPH, Urtica dioica L.

Keywords

Main Subjects

مقایسه عصاره گیری به کمک ریزموج و عصاره گیری سنتی از  Urtica dioica L.  و ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی آن به روش HPLC وDPPH

غلامرضا مطلب1*، محمدرضا لهراسبی دشتکی2 و مسعود نجاتی یزدی نژاد2

1 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 31/4/93               تاریخ پذیرش: 28/10/93 

چکیده

در چند سال گذشته استخراج به کمک ریزموج (MAE) به طور قابل توجهی افزایش یافته است چنانکه مزایای اصلی آن (کاهش زمان استخراج و حجم حلال) بیشتر از روشهای استخراج سنتی می­باشد. در این تحقیق، تاثیرات دو نوع روش استخراج شامل استخراج به کمک ریزموج (MAE) و سنتی روی فعالیت آنتی­اکسیدانی گزنه مورد بررسی قرار گرفت. عصاره­های آبی، متانولی و اتانولی از برگ و ساقه گزنه از هر دو روش سنتی و ریزموج به دست آمدند و برای تعیین ظرفیت مهار رادیکال آزاد (RSC) به وسیله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، آنتی­اکسیدان­های جدا شده توسط رادیکال 2،2-دی­فنیل-1-پیکریل هیدرازیل (DPPH) مورد ارزیابی قرار گرفت. فعالیت آنتی ­اکسیدانی عصاره­ها توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در طول موج 517 نانومتر با استفاده از رادیکال آزاد 1،1-دی­فنیل-2-پیکریل­هیدرازیل تعیین شد. فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های برگ و ساقه (عصاره اتانولی) گزنه بدست آمده از روش ریزموج در مقایسه با روش سنتی بیشتربود، در حالی که اختلاف معنی­دار نبود (P>0.05).  البته روش های HPLC و DPPH نشان دادند که فعالیت آنتی­اکسیدانی برگ و ساقه گزنه، با  روش­های MAE و سنتی اختلاف معنی­داری نشان نمی­دهد.

واژه های کلیدی: فعالیت آنتی اکسیدانی٬ام آ ای٬اچ پی ال سی-دی پی پی اچ٬گزنه

* نویسنده مسئول، تلفن: 09386902201 ، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه 

 

گیاهان دارویی منابع طبیعی ارزشمندی هستند که امروزه مورد توجه قرار گرفته و به عنوان مواد اولیه برای تبدیل به داروهای بی­خطر برای انسان تلقی می­شوند. در این زمینه ایران یکی از غنی­ترین منابع گیاهان دارویی جهان به شمار می­رود که دارای تنوع بالای زیستگاهی برای انواع گیاهان می­باشد (5). بنابراین گیاهان را می­توان به عنوان منبعی از مواد شیمیایی مفید دانست که تنها بخشی از آن مورد بهره­برداری قرار گرفته است. این مواد شیمیایی را نه تنها به عنوان دارو، بلکه می­توان به عنوان الگو و نقطه شروعی برای ساخت آنالوگ­های دارویی به کار برد و همچنین از آنها به عنوان مدلی سودمند به منظور فهم و درک بهتر پدیده­های زیست­شناختی استفاده کرد (12). بسیاری از تحقیقات پزشکی و علمی بر این پایه استوار است که حضور رادیکال­های آزاد کنترل نشده در بدن علت مستقیم برخی از مشکلات جسمی است. رادیکال­­های آزاد، اتم­ها یا مولکول­هایی با یک الکترون جفت نشده هستند که باعث ناپایداری و  تمایل شدید به کسب الکترون می­گردد. از این رو، به مولکول­های ساختمانی بدن حمله می­کنند تا کمبود الکترونی خود را جبران نمایند. البته لازم به ذکر است که رادیکال­های آزاد به اجزای سلولی  مثلا یک رشته پروتئینی یا یک رشته DNA حمله می کنند و از یکی از اتم­های موجود در آمینواسید رشته پروتئینی یا نوکلئوتیدهای رشته­ی DNA الکترون می­گیرند و بنابراین ساختمان سلول دچار تغییر خواهد شد(10). مواد مختلفی مانند پوشش دانه‌ها، هسته انگور(10)، زیتون (17)، ضایعات کاکائو (2)، ضایعات پالپ هویج و غیره به عنوان منبع آنتی‌اکسیدان طبیعی مورد آزمایش قرار گرفته‌اند. گزنه، گیاهی دارویی است که از دوران ما قبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم از آن جهت تغذیه استفاده می­کردند. تاریخ استفاده درمانی از آن نیز به زمان­های دور باز می­گردد که برای درمان سرماخوردگی، زخم­های چرکین، درد ناشی از گزش مار، درد معده و مفاصل، خونریزی، بیماری­های پوستی (اگزما)، التهاب­های دهانی و کم­خونی مورد استفاده قرار می­گرفته است (18). گزنه با نام علمی L. Urtica dioica و نام انگلیسی Common nettle, Stinging nettle, Nettle، گیاهی از تیرهPolygonaceae  یا Urticaceae، جنس Urtica و گونه Dioica است. این گیاه دوپایه، علفی، چند ساله، پایا، سبز و ایستاده به ارتفاع 50 تا 120 سانتی­متر بوده و دارای کرک‌های گزنده می­باشد. از ریشه­های خزنده آن پاجوش­هایی در تمام جهات خارج می­گردد که باعث می­شود گیاه به صورت پایه­های متعدد در آمده و محل رویش خود را به طور کامل فرا گیرد. قسمت‌های مورد استفاده گزنه، برگ‌های تازه، ریشه و شیره حاصل از آن است. دانه آن نیز کم و بیش به مصارف درمانی می­رسد (15). گیاه گزنه ادرارآور، قابض، ضد انگل و کرم­کش بوده و در درمان التهاب کلیه، وجود خون در ادرار، مفرط بودن خون عادت ماهیانه، ازدیاد شیر مادران، ادرار و عرق نافع است. همچنین در علاج بیماری‌های قند و صفراوی، تب زرد و نیز بند آوردن خون مؤثر می­باشد. برای ورم­های پروستات (سرطان پروستات)، بیماری­های پوست و مو، آسم، آکنه، کمبود ویتامین C، تسکین درد طحال و کلیه مفید می­باشد (1 و 18). در این گیاه استرول‌ها، ساپونین‌ها، آمینواسیدها، کومارین‌ها، ترکیبات حاوی نیتروژن و مواد فنولی در اندام‌های هوایی و استرول‌ها و تری‌ترپنوییدها در ریشه گزنه شناسایی شده‌اند (9). گزنه همچنین دارای تانن، لسیتین، لعاب، فورمیک­اسید، نیترات­پتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن، آلومینیم، گوگرد و ویتامین C است (18). یکی از مطمئن ترین و کارآمدترین روشها برای استخراج ترکیبات موجود در بافتهای گیاهی استخراج به کمک امواج مایکروویو ((MAE است که از روشهای سریع و مؤثر به شمار می رود (10). این روش دارای مزایای زیادی نسبت به روشهای مرسوم استخراج میباشد از جمله میتوان به دمای پایین تر٬حلال مصرفی بسیار کمتر و راندمان استخراج بالاتر اشاره کرد (6(. روش MAE به عنوان روش استخراج به همراه تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی توسط معرف DPPH  و روش HPLC دارای سرعت عمل و دقت خوبی در غلظتهای پایین آنتی اکسیدان نیز قابل استفاده است (8). با توجه به انجام عصاره گیری سنتی این گیاه از دیرباز و عدم وجود سابقه پژوهش در مورد مقایسه میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ سنتی و عصاره­ استخراج شده به کمک امواج مایکروویو گیاه گزنه، در این تحقیق ضمن مقایسه عصاره گیری به کمک امواج ماکروویو (ریزموج) و عصاره گیری سنتی از برگ و ساقه گیاه گزنه فعالیت آنتی اکسیدانی آنها به روش HPLC-DPPH (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) ارزیابی گردید.  

مواد و روشها

مواد مصرفی گیاه خشک شده گزنه (Urtica dioica) جمع­آوری شده از منطقه قمصرکاشان، DPPH (سیگما–آمریکا)، متانول (مرک - آلمان)، اتانول (مرک – آلمان)، آب مقطر می باشد

تجهیزات آزمایشگاهی: دستگاه مایکرو­ویو (MILESTONE-ایتالیا)، دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC- JASCO مجهز به سیستم تزریق اتوماتیک به حجم 100 میکرولیتر- ژاپن)، دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis. دو پرتویی (RAYLEIGH UV-2100)، همزن برقی،پارافیلم.

روش انجام آزمایش: ابتدا برگهای گیاه از ساقه جدا گردید و هر یک به طور جداگانه تحت شرایط طبیعی محیطی و با استفاده از جریان هوابه مدت ده روز در سایه خشک شده و با استفاده از دستگاه آسیاب بصورت پودر درآمدند. سپس جهت استفاده در مراحل بعدی در دمای C˚4 نگهداری شدند.در این طرح، میزان آنتی­اکسیدان موجود در عصاره برگ و ساقه گیاه گزنه که در شرایط بهینه با روش مایکروویو استخراج شده بود، به طور غیرمستقیم توسط روش HPLC ارزیابی شد و با میزان آنتی­اکسیدان موجود در عصاره سنتی مورد مقایسه قرار گرفت. بدین منظور از DPPH بعنوان یک عامل اکسنده استفاده می­شود که در ناحیه مرئی دارای جذب بوده و از قانون بیر-لامبرت پیروی می­کند. در حضور ترکیبات آنتی اکسیدان (دارای ویژگی احیاء کنندگی) این معرف واکنش داده و میزان جذب آن کاهش می­یابد. همین کاهش در میزان جذب، مبنای ارزیابی محتوای آنتی­اکسیدانی عصاره نمونه گیاهی خواهد بود که در کروماتوگرام HPLC بصورت کاهش سطح زیر پیک ظاهر می­گردد. برای عصاره­گیری، پارامترهای نوع حلال (اتانولی، متانولی وآبی)، توان دستگاه مایکروویو، زمان عصاره­گیری و دمای استخراج بهینه شد.

تهیه محلول DPPH: جهت تهیه محلول  µM500 از DPPH، 00197/0 گرم از ماده جامد را برداشته و با اتانول به حجم 10 میلی­لیتر می­رسانیم (17).

بررسی طیف جذبی معرف DPPH: برای بررسی کروماتوگرام DPPH، محلول استاندارد تهیه شده به دستگاه HPLC تزریق شد. چنانکه شرایط کاری HPLC بصورت زیر تنظیم شده است:سرعت جریان فاز متحرک: ml/min 1، طول­موج دتکتور: nm 517، آب: متانول به نسبت (70:30)v/v ، ستون: Finepak sil C18-10 (4.6 x 250 mm, Jasco, Tokyo, Japan، ) حجم تزریق:  µl100 به صورت اتوماتیک.

تهیه عصاره گزنه: از پودر گیاه گزنه تهیه شده در مرحله قبل (برگ و ساقه) استفاده شد.

5/0 گرم از آن توسط ترازو، اندازه­گیری شده و در سل دستگاه مایکروویو قرار گرفت. به ظرف حاوی گیاه، 10 میلی­لیتر حلال (اتانولی، متانولی وآبی) اضافه شد. پارامترهای دستگاه بصورت پیش­فرض تنظیم شد: توان 300 وات، دما C ˚75 و زمان 15 دقیقه. در پایان استخراج، محلول فوق توسط کاغذ صافی150 میلی­متری صاف گردید. عصاره تهیه شده بلافاصله مورد استفاده قرار گرفت و یا اینکه تا زمان استفاده در دمای C˚4 در تاریکی قرار داده ­شد (3).

اندازه­گیری فعالیت آنتی­اکسیدانی گیاه گزنه: پس از عصاره­گیری، 1 میلی­لیتر از محلول DPPH، به 1 میلی­لیتر از عصاره مورد نظر اضافه شد. پس از 20 دقیقه تکان دادن در محیطی تاریک، محلول فوق به دستگاه HPLC تزریق شد.حجم تزریق شده به دستگاه برابر 20 میکرولیتر عصاره­های به­دست آمده از هر سه حلال (برگ و ساقه نیز به طور جداگانه) به صورت بالا واکنش داده و آنالیز شد. سپس بر اساس سطح زیر پیک کروماتوگرام مربوطه، بهینه­سازی نوبتی انجام شد.

بهینه­سازی توان دستگاه مایکروویو: عصاره گیری از برگ و ساقه، در توان­های 200، 300، 400 ، 500 و 600 وات طی ثابت نگه داشتن سایر عوامل انجام شد. سپس نمونه­ها با DPPH وارد واکنش شده و مورد بررسی قرار گرفتند (14).

بهینه­سازی زمان عصاره­گیری: عصاره­گیری با انتخاب توان مناسب و ثابت نگه داشتن سایر عوامل در زمان­های 2، 5، 10، 15و 20 دقیقه انجام شد (7).

بهینه­سازی دمای استخراج: عصاره­گیری در دماهای 60، 70، 80، 90، 100 و 110 درجه سانتی­گراد با انتخاب توان و زمان مناسب و ثابت نگه داشتن سایر عوامل انجام شد. سپس عصاره­ها با DPPH واکنش داده شده و بررسی گردیدند (3).

عصاره­گیری سنتی: 5/2 گرم پودر گیاه خشک شده گزنه (برگ یا ساقه) به 50 میلی­لیتر از هر حلال (معادل نسبت نمونه و حلال در روش مایکروویو) درون بشر اضافه شده و به مدت 48 ساعت روی همزن برقی با سرعت rpm 400 قرار گرفت. پس از جدا کردن ذرات جامد توسط کاغذ صافی عصاره ها برای انجام مراحل بعدی آزمایش در دمای C˚4 نگهداری شد (13).

مقایسه عصاره­گیری سنتی با عصاره­گیری توسط مایکروویو: 1 میلی­لیتر از عصاره سنتی را با محلول DPPH  به نسبت 1:1 وارد واکنش کرده و مخلوط واکنش توسط HPLC مورد آنالیز قرار گرفت. سپس نتایج مربوطه با نتایج مربوط به عصاره استخراج شده توسط مایکروویو، مقایسه گردید.

برای آنکه بهترین شرایط کاری برگزیده شوند، لازم است که متغیرهای آزمایشگاهی را در سطوح مختلف مورد ارزیابی آماری قرار دهیم.

بدین منظور، از نسخه 16 نرم افزار SPSS برای اجرای آنالیز واریانس از ANOVA One-Way و Multiple Comparison استفاده شد (هر اندازه گیری سه بار تکرار گردید).

نتایج

در این مطالعه، پس از بهینه کردن عوامل مؤثر بر فرآیند استخراج توسط امواج مایکروویو، میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ و ساقه استخراج شده توسط روش مایکرو­ویو با یکدیگر و همچنین با عصاره سنتی مقایسه گردید.

 

 

 

شکل1- طیف جذبی محلول DPPH استاندارد

 

پیک جذبی قوی مشاهده شده در طول موج nm517 مربوط به تک الکترون جفت نشده روی ساختار رادیکال آزاد می­باشد که توانایی رزونانس با حلقه­های کناری خود را دارد و محل انجام واکنش احیاء می­باشد. با انجام واکنش، این الکترون آزاد توسط تک الکترون آنتی­اکسیدان جفت می­شود و در واقع رادیکال آزاد خنثی می­گردد. این حالت در شکل 1 و 2 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل2- طیف جذبی محلول DPPH احیاء شده توسط آنتی­اکسیدان

 

 

این فرایند در کروماتوگرام HPLC بصورت کاهش ارتفاع و سطح زیر پیک ظاهر می­گردد که طبق فرمول زیر برای محاسبه میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ها بکار می­رود (17).

∆S = Sblank - Ssample

پارامترهای موجود بصورت زیر تعریف می­شوند:

تفاضل سطح زیر پیک ( میزان خاصیت آنتی­اکسیدان) ∆S = سطح زیر پیک محلول استاندارد DPPH Sblank =  سطح زیر پیک محلول استاندارد DPPH بعد از واکنش با عصاره گیاهی Ssample =

استخراج عصاره برگ گزنه به کمک مایکروویو: استخراج عصاره برگ گزنه جهت دست­یابی به شرایط بهینه، توسط آب مقطر و حلال­های­ آلی اتانول و متانول، در توان، زمان و دماهای مختلف انجام شد(14). ابتدا محلول 5/0 میلی مولار DPPH به HPLC تزریق شد و پس از 3 بار آنالیز، میانگین سطح زیر پیک آن به عنوان مرجع به دست آمد. سپس هر یک از عصاره­ها با محلول استاندارد DPPH وارد واکنش شده و میزان آنتی­اکسیدان هر عصاره مشخص شد. پیک مشاهده شده در بازه زمانی 3 تا 4 دقیقه مربوط به اتانول می­باشد (شکل4).

 

 

 

 

شکل 3-کروماتوگرامDPPHاستاندارد(طول موج nm 517،سرعت جریان ml/min1)

 

 

شکل 4- کروماتوگرام اتانول (طول موج nm 517،سرعت جریان ml/min1)

 

 

پس از آن، سطح زیر پیک عصاره­های اتانولی، متانولی و آبی پس از واکنش با DPPH، با سطح زیر پیک DPPH استاندارد مقایسه گردید. تفاوت سطح زیر پیک­ها، برابر با میزان آنتی­اکسیدانی است که برای خنثی کردن رادیکال­ آزاد DPPH صرف شده است (17).

بهینه­سازی نوع حلال استخراج: ابتدا برای انتخاب حلال مناسب، استخراج به کمک حلال­های مذکور (متانول-اتانول و آب) انجام شد که کروماتوگرام­های مربوطه در ادامه آمده است (به ترتیب شکلهای 5٬6٬7).

 

 

 

شکل 5- کروماتوگرام عصاره متانولی بعد از واکنش با DPPH (طول موج nm 517،سرعت جریانml/min 1)

 

 

شکل 6- کروماتوگرام عصاره اتانولی بعد از واکنش با DPPH (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل 7- کروماتوگرام عصاره آبی با DPPH (طول موج nm 517،سرعت جریان ml/min1)

 

 

 

شکل8- میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های آبی، متانولی و اتانولی استخراج شده به روش مایکروویو.

نتایج نشان می­دهند که میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره حلال­های آلی به مراتب بیشتر از محتوای عصاره آبی می‌باشد. با توجه به شکل8 تفاوت سطح زیر پیک در عصاره اتانولی بیشترین میزان بوده و بیانگر­ بالاترین میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی در بین سه عصاره اتانولی، متانولی و آبی در برگ گزنه است. آنالیز واریانس (ANOVA) ، بین حلال­های آلی و آب تفاوت معنی­داری نشان داد (p<0.05). اما تفاوت معنی­داری بین حلال­های آلی وجود نداشت (P>0.05). در عین حال در حلال اتانول میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان بیشتری وجود دارد. بنابراین، در ادامه بهینه­سازی فرایند استخراج از اتانول به عنوان حلال استخراجی استفاده شد.

بهینه­سازی توان دستگاه مایکروویو: استخراج در توان­های 200، 300، 400، 500 و 600 وات انجام شده و بررسی گردیدند. نتایج نشان دادکه ترکیبات آنتی­اکسیدانی در توان 600 وات حداکثر می­باشد.کروماتوگرام عصاره استخراج شده در توان 600 (شکل 9)، حداکثر میزان کاهش سطح زیر پیک را دارد که نشان­ دهنده بیشترین میزان محتوای ترکیبات آنتی­اکسیدانی در این عصاره است (حلال:اتانول).

 

شکل 10- مقایسه توان مایکروویو بر روی میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی

 

 

شکل 9- کروماتوگرام عصاره گرفته شده در توان 600 وات( حلال اتانول، طول موج nm 517،سرعت جریان ml/min1)

 

 

هر چندآنالیز واریانس (ANOVA) تفاوت معنی­داری بین توان­های مختلف نشان نداد (P> 0.05). این در حالی است که میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی در توان 600 وات بیشترین می­باشد. لذا در ادامه کار از توان 600 وات برای عصاره­گیری استفاده گردید.عصاره­گیری در زمان­های 2، 5، 10، 15و 20 دقیقه انجام شد و نتایج نشان دادکه عصاره­گیری در15 دقیقه بیشترین بازدهی را دارد (شکل11)و نشان­ دهنده بیشترین میزان محتوای ترکیبات آنتی­اکسیدانی در این عصاره است. البته بازده استخراج به مرور زمان در توان600 وات افزایش می­یابد.

 

 

شکل 11- کروماتوگرام عصاره­ استخراج شده پس از 15 دقیقه (حلال اتانول،توان600 وات،طول موج nm 517،سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل 12- مقایسه زمان استخراج با توان 600 وات بر روی میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی

میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ در 15 دقیقه بیشترین می­باشد. آنالیزواریانس(ANOVA) نیز بین زمان­های مختلف به ویژه 2 و 15دقیقه اختلاف معنی­داری نشان نداد (P>0.05). بنابراین،درادامه کارزمان 15 دقیقه بعنوان زمان بهینه برای عمل استخراج استفاده گردید. عصاره­گیری در درجه­ حرارت­های 60،70،80،90 ،100و110 درجه سانتی­گراد انجام گرفت. نتایج نشان داد که میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در عصاره استخراجی در دمای C˚110 بیشتر ازدماهای دیگراست.

 

 

شکل13- کروماتوگرام عصاره­ای که­­ در دمای C˚110 استخراج شده و با DPPH وارد واکنش شده ­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل14- استخراج میزان آنتی­اکسیدان عصاره­ها در درجه حرارت 60، 70، 80، 90، 100 و 110 درجه سانتی­گراد با دستگاه مایکروویو

گرچه آنالیزواریانس(ANOVA)ارتباط معنی­داری بین دما­ها نشان نداد (P> 0.05). اما در عین حال در دمای C˚110 میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی بیشتری وجود دارد؛ لذا این دما بعنوان درجه حرارت بهینه برای عمل استخراج استفاده گردید.

استخراج عصاره ساقه گزنه به کمک مایکروویو: بهینه­سازی نوع حلال استخراج: آنالیزواریانس (ANOVA) بین حلال­های اتانول وآب تفاوتی معنی­دار نشان داد (P<0.05) اما تفاوت معنی­داری بین حلال­های آلی وجود نداشت (P>0.05). در عین حال در حلال اتانول میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان بیشتری وجود دارد. بنابراین، در ادامه بهینه­سازی فرایند استخراج از اتانول به عنوان حلال استخراجی استفاده گردید.

 

 

شکل15- کروماتوگرام عصاره اتانولی بعد از واکنش با DPPH (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل16- میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های آبی، متانولی و اتانولی استخراج شده به روش مایکروویو.

بهینه­سازی توان دستگاه مایکروویو: نتایج نشان داد که ترکیبات آنتی­اکسیدانی درتوان 600 وات حداکثر می باشد(شکل17).

با افزایش توان دستگاه مایکروویو از 300 به 400 وات، میزان ترکیبات استخراج شده از ساقه گیاه کاهش می­یابد که می­تواند ناشی از تخریب برخی ترکیبات مؤثره حساس به ویژه گلیکوزیدها در این توان و دمای متناسب باآن باشد (3). اما در توان­های بالاتر از 400 وات با افزایش این ترکیبات مواجه می­شویم و این امر می­تواند به دلیل افزایش استخراج ترکیبات آنتی­اکسیدانی عصاره ساقه در دمای بالای حاصل از امواج مایکوویو باشد(7). گرچه آنالیز واریانس (ANOVA) تفاوت معنی­داری بین توان­های مختلف نشان نداد (P>0.05). اما میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی در توان 600 وات بیشینه می­باشد؛ لذا در ادامه از توان مذکور برای عصاره­گیری استفاده گردید.

 

 

شکل18- مقایسه توان مایکروویو بر روی میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی ساقه گزنه

بهینه­سازی زمان عصاره­گیری: نتایج نشان داد عصاره­گیری در زمان 20 دقیقه دارای بیشترین ترکیبات آنتی­اکسیدانی در این عصاره است.

 

 

 

 

 

شکل17- کروماتوگرام عصاره گرفته شده در توان 600 وات ( حلال اتانول، طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل19-کروماتوگرام عصاره استخراج شده پس از 20 دقیقه (حلال اتانول، توان 600 وات ، طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل20-مقایسه زمان استخراج با توان 600 وات بر روی میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی ساقه گزنه

بازده استخراج به مرور زمان در توان 600 وات افزایش می­یابد. با افزایش زمان تا 20 دقیقه، میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانت استخراج شده از ساقة گیاه به حداکثر می­رسد (7) گرچه آنالیز واریانس (ANOVA) بین زمان­های مختلف اختلاف معنی­داری نشان نداد(P> 0.05).

بهینه سازی دمای استخراج: نتایج نشان داد که ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در عصاره استخراجی در دمای C˚110 بیشتر از محتوای عصاره در دماهای دیگر است.

 

 

شکل21- کروماتوگرام عصاره­ای که­­ در دمای C˚110 استخراج شده و با DPPH وارد واکنش شده ­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل22-میزان آنتی­اکسیدان عصاره­هایی که در درجه حرارت 60، 70، 80، 90، 100 و 110 درجه سانتی­گراد با دستگاه مایکروویو استخراج شدند.

 

آنالیز واریانس (ANOVA) ارتباط معنی­داری بین دما­ها نشان نمی­دهد (P>0.05). بنابراین می­توان نتیجه گرفت دمای استخراج تأثیر چندانی در فرایند عصاره­گیری ندارد. در عین حال در دمای C˚110 میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی بیشتری وجود دارد؛ لذا این دما بعنوان درجه حرارت بهینه برای عمل استخراج استفاده شد.

استخراج عصاره برگ و ساقه گزنه به روش سنتی: استخراج عصاره­ها توسط حلال­های اتانول، متانول و آب انجام شد تا حالت بهینه هر یک از اندام­ها برای مقایسه با عصاره حاصل از روش مایکروویو بدست آید.

 

 

 

شکل23- کروماتوگرام عصاره­ اتانولی برگ به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل24- کروماتوگرام عصاره­ متانولی برگ به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل25- کروماتوگرام عصاره­ آبی برگ به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل26-کروماتوگرام عصاره­ اتانولی ساقه به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل27-کروماتوگرام عصاره­ متانولی ساقه به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل28-کروماتوگرام عصاره­ آبی ساقه به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

 

شکل29-مقایسه عصاره­های برگ بدست آمده به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

 

شکل30-مقایسه عصاره­های ساقه بدست آمده به روش سنتی که با DPPH وارد واکنش شده­است (طول موج nm 517، سرعت جریان ml/min 1)

نتایج نشان دادکه فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی ساقه گزنه بیشتر از سایر حلال­ها می­باشد شکل­های(29و30).همچنین، خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی برگ گزنه به مراتب بیشتر از عصاره اتانولی ساقه می­باشد. البته آنالیز واریانس (ANOVA) ارتباط معنی داری بین این دو عصاره نشان داد (P< 0.05). 

مقایسه خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ و ساقه در روش مایکروویو: پس از بهینه­سازی شرایط استخراج عصاره از هر دو اندام گیاه گزنه، کروماتوگرام­های مربوطه از نظر تفاضل سطح زیر پیک کروماتوگرام مقایسه شدند.نتایج نشان دادکه میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان برگ بیشتر از ساقه می­باشد.

 

شکل31-مقایسه فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ و ساقه گزنه

گرچه آنالیز واریانس (ANOVA) تفاوت معنی داری میان فعالیت آنتی­اکسیدانی اندام­های گیاه نشان نداد(P> 0.05).

مقایسه میزان آنتی­اکسیدان موجود در عصاره سنتی با مایکرو­ویو: عصاره گرفته شده توسط دستگاه مایکرو­ویو در شرایط بهینه، با عصاره سنتی مقایسه گردید.نتایج نشان دادکه میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره استخراجی توسط دستگاه مایکروویو بیشتر از عصاره سنتی می‌باشد.

 

شکل32-مقایسه روش­های استخراج

با توجه به نتایج بدست آمده، روش مایکروویو نسبت به روش سنتی عصاره­گیری باعث استخراج بهتر ترکیبات آنتی­اکسیدانی­ می­شودولی در عین حال آنالیز واریانس اختلاف معنی­داری بین عصاره­گیری به روش مایکروویو و سنتی نشان نداد  ( p> 0.05).

بحث

در این مطالعه، پس از بهینه کردن عوامل مؤثر بر فرآیند استخراج توسط امواج مایکروویو، میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ و ساقه استخراج شده توسط روش مایکرو­ویو با یکدیگر و همچنین با عصاره سنتی مقایسه گردید. نتایج نشان می­دهند که میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره حلال­های آلی به مراتب بیشتر از محتوای عصاره آبی می‌باشد. برای سیستم­هایی که از حلال­های آلی جهت استخراج استفاده می­کنند، اتانول بسیار قوی­تر عمل می­کند. زیرا اتانول تمام انرژی امواج مایکروویو را جذب کرده و تأثیر مستقیمی روی بافت نمونه وارد می­کند.این افزایش جذب، سبب افزایش دمای حلال و سپس گیاه شده که باعث شکستن دیواره سلول­ها می­گردد. در طی این فرایند، اجزاء درون سلول­ها به سرعت در محیط اطراف استخراج می­شوند (10). استخراج در توان­های 200، 300، 400، 500 و 600 وات انجام شده و بررسی گردیدند. نتایج نشان دادکه ترکیبات آنتی­اکسیدانی برگ و ساقه در توان 600 وات حداکثر می­باشد. نشان­ دهنده بیشترین میزان محتوای ترکیبات آنتی­اکسیدانی در این عصاره است (حلال:اتانول). باافزایش توان دستگاه مایکروویو از200 به300 وات،میزان ترکیبات استخراج شده از برگ گیاه کاهش می­یابد که می­تواند ناشی از تخریب برخی ترکیبات مؤثره حساس در این توان و دمای متناسب با آن باشد (3). اما در توان بالاتر از 300 وات با افزایش این ترکیبات مواجه می­شویم و این امر می­تواند به دلیل افزایش استخراج ترکیبات فوق در دمای بالای حاصل از امواج مایکروویو باشد (7). عصاره­گیری در زمان­های 2، 5، 10، 15و 20 دقیقه انجام گرفت و نتایج نشان دادکه عصاره­گیری در15 دقیقه بیشترین بازدهی رادارد. با افزایش زمان تا 15 دقیقه، میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانت استخراج شده از گیاه به حداکثر می­رسد (7). انتظار می­رود با گذشت زمان،غلظت ترکیبات استخراج شده افزایش یابد اما چنین اتفاقی نمی­افتد. این کاهش به­ علت تخریب ترکیبات فنولیک­اسیدو گلیکوزیدی بافت گیاه به دلیل افزایش زمان تابش الکترومغناطیسی می­باشد.احتمالاً زمان کافی برای تابش امواج مایکروویووافزایش درجه حرارت تا دمای جوش حلال در توان مذکور،15 دقیقه می­باشد. لذا طی این مدت زمان، ترکیبات اصلی گیاه به سرعت آزاد می­شوند و پس از آن ممکن است به دلیل تخریب ترکیبات مؤثره بافت گیاه توسط حرارت حاصل از امواج مایکروویو،بازده استخراج کاهش یابد (3). به عبارت دیگرمیزان خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره برگ در 15 دقیقه بیشترین می­باشد. نتایج نشان داد که میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در عصاره استخراجی در دمای C˚110 بیشتر ازدماهای دیگراست. با افزایش درجه حرارت سرعت آزاد شدن ترکیبات اصلی گیاه افزایش می­یابد. پس از آن سرعت این فرایند ثابت مانده تا زمانی که حلال از عصاره اشباع شود.دردمای °C100 بعلت تخریب برخی ترکیبات فنولی و گلیلوزیدی، میزان آنتی­اکسیدان­ها کاهش می­یابد (15 و3). در نهایت با افزایش دما تا 0C110 ترکیبات مؤثرة دیگری نیز از گیاه استخراج می­گرددکه خاصیت آنتی­اکسیدانی افزایش می­یابد. لذا این دما بعنوان درجه حرارت بهینه برای عمل استخراج استفاده گردید. استخراج به کمک حلال­های آب، اتانول و متانول انجام شد. نتایج نشان داد که میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره حلال­های آلی بیشتر از محتوای عصاره آبی می‌باشد و تفاوت سطح زیر پیک در عصاره اتانولی بیشترین میزان بوده که بیانگر­ بالاترین میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی در بین سه عصاره اتانولی، متانولی و آبی در ساقه گزنه است(شکل15).این افزایش جذب امواج،سبب افزایش دمای حلال شده که باعث شکستن دیواره سلول­ها می­گردد.در طی این فرایند، مواد مؤثرة بافت ساقه در محیط اطراف استخراج می­شوند (10). بنابراین، در ادامه بهینه­سازی فرایند استخراج از اتانول به عنوان حلال استخراجی استفاده گردید. نتایج نشان داد که ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در عصاره استخراجی در دمای C˚110 بیشتر از محتوای عصاره در دماهای دیگر است. با افزایش درجه حرارت تا نقطه جوش حلال و عصاره گیاه، سرعت آزاد شدن ترکیبات اصلی گیاه افزایش می­یابد. پس از آن با افزایش دما تا چند درجه سانتی­گراد، سرعت این فرایند ثابت مانده تا زمانی که حلال از عصاره اشباع شود. در نهایت با افزایش دما تا 0C110 ترکیبات مؤثرة دیگری نیز از گیاه استخراج می­گردد که خاصیت آنتی­اکسیدانی آن افزایش می­یابد در عین حال، در دمای C˚110 میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی بیشتری وجود دارد. نتایج نشان دادکه فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره اتانولی ساقه گزنه در روش سنتی بیشتر از سایر حلال­ها می­باشد. عصاره گرفته شده توسط دستگاه مایکرو­ویو در شرایط بهینه، با عصاره سنتی مقایسه گردید. نتایج نشان دادکه میزان ترکیبات آنتی­اکسیدان موجود در عصاره استخراجی توسط دستگاه مایکروویو بیشتر از عصاره سنتی می‌باشد.در عمل استخراج به کمک امواج مایکروویو،از پدیده­های فیزیکی و شیمیایی استفاده می­شود و همین امر تفاوت اساسی آن با دیگر روش­های مرسوم می­باشد.برهمکنش مستقیم امواج مایکروویوباآب موجود در گیاه سبب افزایش استخراج عصاره می­گردد.بنابراین در عصاره­گیری از گزنه(Urtica dioica) بهترین نتایج مربوط به عصاره­گیری توسط دستگاه مایکروویو بود (7و4). نتایج این تحقیق تأیید کننده نتایج مدرسی و همکاران در سال 2009 (11) است که نشان دادند عصاره حاصل از بوتانل و اتیل استات استخراج شده از گزنه بیشترین توانایی مهار رادیکال DPPH  با استفاده از روش سوکسله بود. با توجه به نتایج بدست آمده، روش مایکروویو نسبت به روش سنتی عصاره­گیری باعث استخراج بهتر ترکیبات آنتی­اکسیدانی­ می­شود ولی در عین حال آنالیز واریانس اختلاف معنی­داری بین عصاره­گیری به روش مایکروویو و سنتی نشان نداد ( p> 0.05).  

نتیجه­گیری و پیشنهادها 

با توجه به نتایج میانگین میزان ترکیبات آنتی­اکسیدانی عصاره استخراج شده به روش مایکروویو بیشتر از روش سنتی است. در روش مایکروویو، میزان حلال آلی کمتری استفاده می­گردد و زمان عصاره­گیری نیز بشدت کاهش می­یابد که از مزایای این تکنیک می­باشد که بهترین شرایط شامل: حلال اتانولی ٬ توان مایکروویو 600 وات٬ زمان استخراج با توان 600 وات برای برگ 15 دقیقه و برای ساقه 20 دقیقه٬دمای دستگاه برای برگ و ساقه 110درجه سانتیگرادبود. اما با توجه به آنالیز واریانس و معنادار نبودن تفاوت دو روش، می­توان روش کم­ هزینه­تر یعنی سنتی را پیشنهاد داد. در روش سنتی که همان خیساندن می­باشدزمان استخراج بسیار افزایش یافته و میانگین میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی نیز کاهش می­یابد که از معایب این روش می­باشدامااحتیاج به تجهیزات ساده­تری دارد و می تواند از لحاظ اقتصادی مقرون بصرفه­تر ­باشد.

در پایان، با توجه به نتایج بدست آمده پیشنهاد می­شود در مطالعات آینده از روش GC-MS برای مشخص کردن اجزاء عصاره­های استخراج شده استفاده شده و مقادیر نسبی آنها در دو روش فوق مقایسه گردد.

1. Ahandani, I.A., Asadisamani, M., Biranvand, M. (2010) The introduction of nettle.  Monthly of Barzegar 1042:43.
2. Azizah, A.H., Ruslawati, N.M., Swee Tee, T.(1999) Extraction and characterization of antioxidant from cocoa byproducts. Food Chemistry 64:199-202.
3.Chemat, S., Ait-Amar,H., Lagha, A.,Esveld, D.C.(2005) Microwave assisted  extraction kinetics of terpenes from caraway seeds. Chemical Engineering and Processing 44:1320-1326.
4. Craveiro, A.A., Matos, F.J.A., Alencar, J.W.(1989) Microwave extraction of an essential oil. Flavour Fragrance Journal 4:43-44.
5. Haghirossadat, F., Bernard, F., Kalantar, M., Sheikhha, M., Hokmollahi, F., Azimzadeh M. (2010) Bunium Persicum(Black Caraway) of Yazd province: Chemical assessment and Evaluation of its Antioxidant Effects. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences 18(3):284-291.
6. Handley, A.J.(1999) Extraction methods in organic analysis. John Wiley and Sons, Incorporated, 320pp.
7. Hayat, Kh.(2010) Effect of microwave treatment on phenolic content and antioxidant activity of citrus  mandarin pomace. Food Chemistry 123:423-429.
8. Hemwimon, S., Pavasant, P., Shotipruk, A. (2007) Microwave-assisted extraction of antioxidative anthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Separation and Purification Technology 54:44-50.
9. Kavtaradze, N., Alaniya, M.D., Aneli, N.J.(2001) Chemical Components of Urtica dioica, growing in GEORGIA. Chemistry of Natural Compounds 37:305-308.
10.   Keshavarzi, F. (2002) Free radicals and antioxidants. Aeij Press, 67pp.
11. Modarresi Cahardehli, A., Ibrahim, D., Sulayman, S.H.F.(2009) Antioxidant activity and total phenolic content of some medicinal plants in Urticaceae family. Journal of applied Biological Sciences 3(2):27-31.
12. Morteza-Semnani, K., Saeedi, M., Mahdavi, M., Rahimi, F. (2007) Antimicrobial effects of methanolic extracts of some species of Stachys and Phlomis. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences 17(57):57-66.
13. Nickavar, B., Alinaghi, A., Kamalinejad, M.(2008) Evaluation of the antioxidant properties of five Mentha species. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 7(3):  203-209.
14. Pan., Y., He, Ch., Hengshan, W., Xiaowen, J., Kai, W., Peizhen, Liu. (2010). Antioxidant activity of microwave-assisted extract of Buddleia officinalis and its major active component. Food Chemistry 121:497-502.
15. Visioli, F., Romani, A., Mulinacci, N., Zarini, S., Conte, D., Vincieri, F. F., Galli, C. (1999) Antioxidant and other biological activities of olive mill wastewaters. Journal  of Agriculture Food Chemistry 47:3397-3401.
16. Wang, L., Weller, C.L. (2006) Recent advances in extraction of nutraceuticals from  plants. Trends in Food Science and Technology 17:300-312.
17. Yamaguchi, T., Takamura, H., Matoba, T., Terao, J.(1998) HPLC method for  evaluation of the free radical-scavenging activity of Foods by using 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl. Bioscience Biotechnology Biochemistry 62(6):1201-1204.
18. Zargari, A. (2000) Medicinal Plants. University of Tehran Press, 340pp.
Volume 28, Issue 2 - Serial Number 2
August 2016
Pages 401-420
  • Receive Date: 22 July 2014
  • Revise Date: 20 December 2014
  • Accept Date: 18 January 2015
  • First Publish Date: 23 August 2015