اثر پروپیل گالات بر کارایی فتوسیستم II در جلبک سبز تک سلولی Dunaliella salina با استفاده از اندازه‌گیری فلوئورسنس کلروفیل a

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه سیستان و بلوچستان

2 دانشگاه اصفهان

27515

چکیده

در این پژوهش آثار پروپیل گالات که از فعالیت اکسیداز انتهایی پلاستید دخیل در تنفس کلروپلاستی جلوگیری می¬‏کند، بر کارایی فتوسیستم ‏II‏ در جلبک سبز تک سلولی ‏Dunaliella salina‏ با استفاده از اندازه¬گیری کینتیک ‏فلوئورسنس کلروفیل ‏a‏ مطالعه شده است. تیمار کشتهای جلبکی با غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی¬مولار پروپیل ‏گالات نشان داد که کارایی فتوسیستم ‏II‏ در حضور غلظتهای تا 1 میلی¬مولار افزایش یافته و از فرآیند تنفس ‏کلروپلاستی در غلظتهای 1 و 2 میلی¬مولار پروپیل گالات جلوگیری می¬شود. با وجود این، هیچ تأثیر منفی معنی¬داری ‏در روند انتقال الکترون فتوسیستم ‏II‏ مشاهده نمی¬شود. شدت فلوئورسنس کلروفیل ‏a‏ در جلبک ‏D. salina‏ تیمار ‏شده با 4 میلی¬مولار پروپیل گالات به شدت کاهش پیدا کرده و به یک سطح تقریبا صاف می¬رسد. چنین کاهشی در ‏میزان ‏Fv/Fo‏ (پارامتر متناسب با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده¬ آب)، ‏Φpo‏ (کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی ‏اولیه) و ‏ΦEo‏ (میزان انتقال الکترون در زنجیره¬ انتقال الکترون) نیز مشاهده می¬شود. افزایش شدت فلوئورسنس در ‏سطح ‏K‏ (300 میکرو ثانیه) نیز با کاهش ایجاد شده در این شاخص¬ها هماهنگ می¬باشد. نتایج نشان می¬دهد که کاهش ‏کارایی فتوسیستم ‏II‏ در حضور غلظت 4 میلی¬مولار پروپیل گالات از تأثیر این ممانعت کننده بر کمپلکس تجزیه کننده¬ ‏آب در سمت دهنده¬ فتوسیستم ‏II‏ ناشی می¬شود. بنابراین، می¬توان پروپیل گالات را به عنوان یک ممانعت کننده¬ ‏اختصاصی فتوسیستم ‏II‏ علاوه بر نقش آن در ممانعت کنندگی تنفس کلروپلاستی در نظر گرفت.‏

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of propyl gallate on photosystem II efficiency in unicellular green alga Dunaliella salina as probed by chlorophyll fluorescence measurements

نویسنده [English]

  • alireza einali 1

1

2

چکیده [English]

Effects of propyl gallate, an inhibitor of plastid terminal oxidase involved in ‎chlororespiration, on photosystem II efficiency in Dunaliella salina were investigated, ‎using chlorophyll a fluorescence transient measurements. Trated cultures with propyl ‎gallate concentrations of 0.1, 0.5, 1, 2 and 4 mM showed that photosystem II efficiency ‎increased in the presence of concentrations up to 1 mM and chlororespiration process ‎was inhibited at propyl gallate concentrations of 1 and 2 mM. Nonetheless, no negative ‎significant effect was observed on photosystem II electron flow. However, the ‎fluorescence intensity drastically decreased and almost reached a plateau in 4 mM ‎propyl gallate-treated cells. Such reduction was also found for Fv/Fo (the activity of the ‎water splitting complex), Φpo (efficiency of quantum yield of primary photochemistry) ‎and ΦEo (quantum yield for electron transport). The decrease of these parameters was ‎also coordinated with appearance of fluorescence intensity increase at 300 µs step. The ‎data showed that the decrease of photosystem II efficiency in the presence of 4 mM ‎propyl gallate is because of its effects on water splitting complex on the donor side of ‎photosystem II. Therefore, it may be supposed ‎

کلیدواژه‌ها [English]

  • Propyl gallate
  • chlorophyll fluorescence
  • Photosystem II
  • Water splitting complex
  • ‎Dunaliella salina ‎

اثر پروپیل گالات بر کارایی فتوسیستم II در جلبک سبز تک سلولیDunaliella salina با استفاده از اندازه­گیری فلورسنس کلروفیل a 

علیرضا عینعلی1، منصور شریعتی2* و مرضیه پائیزی2

1 زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده­ علوم، گروه زیست‌شناسی

2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده­ علوم، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 3/10/91               تاریخ پذیرش: 21/7/92 

چکیده

در این پژوهش اثر پروپیل گالات که از فعالیت اکسیداز انتهایی پلاستید دخیل در تنفس کلروپلاستی جلوگیری می‌کند، بر کارایی فتوسیستم II در جلبک سبز تک سلولی Dunaliella salina با استفاده از اندازه­گیری کینتیک فلورسنس کلروفیل a مطالعه شده است. تیمار کشت‌های جلبکی با غلظت‌های 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی­مولار پروپیل گالات نشان داد که کارایی فتوسیستم II تا غلظت‌های 1 میلی­مولار افزایش یافته و از فرایند تنفس کلروپلاستی در غلظت‌های 1 و 2 میلی­مولار پروپیل گالات جلوگیری می­شود. با وجود این، هیچ تأثیر منفی معنی­داری در روند انتقال الکترون فتوسیستم II مشاهده نشد. شدت فلورسنس کلروفیل a در جلبک D. salina تیمار شده با 4 میلی­مولار پروپیل گالات به شدت کاهش پیدا کرده و به یک سطح تقریبا صاف می­رسد. چنین کاهشی در میزان Fv/Fo (پارامتر متناسب با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده­ آب)، Φpo (کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه) و ΦEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره­ انتقال الکترون) نیز مشاهده می­شود. البته افزایش شدت فلورسنس در سطح K (300 میکرو ثانیه) نیز با کاهش ایجاد شده در این شاخص­ها هماهنگ می­باشد. نتایج نشان می­دهد که کاهش کارایی فتوسیستم II در حضور غلظت 4 میلی­مولار پروپیل گالات از تأثیر این ممانعت‌کننده بر کمپلکس تجزیه کننده­ آب در سمت دهنده­ فتوسیستم II ناشی می­شود. بنابراین، می­توان پروپیل گالات را به‌عنوان یک ممانعت‌کننده­ اختصاصی فتوسیستم II علاوه بر نقش آن در ممانعت‌کنندگی تنفس کلروپلاستی در نظر گرفت.

واژه­های کلیدی: پروپیل گالات، فلورسنس کلروفیل a، فتوسیستم II، کمپلکس تجزیه کننده­ آب،Dunaliella salina  

* نویسنده­ مسئول، تلفن: 7932472-0311، پست الکترونیکی:mansour_shariati@yahoo.com

مقدمه

 

پروپیل گالات از مشتقات استری اسید گالیک است که به‌عنوان جاروب کننده­ رادیکال­های آزاد با ویژگی­های آنتی اکسیدانی، آثار زیستی وسیعی را در گیاهان سبب می­شود (7، 13، 27، 30، 43). این ترکیب از فسفریلاسیون پروتئین­های کلروفیل a و b کمپلکس­های جمع‌آوری کننده­ نور جلوگیری می­کند. همچنین، از تجزیه­ پروتئین D1 تحت تابش نور شدید نیز ممانعت بعمل می­آورد (‎17-13، 17). این ترکیب به طور گسترده­ای در مطالعات فتوسنتزی به‌عنوان ممانعت کننده­ اختصاصی اکسیداز انتهایی پلاستید (PTOX) که در فرایند تنفس کلروپلاستی دخالت دارد، استفاده می­شود (9، 16، 23). تنفس کلروپلاستی عبارت است از یک زنجیره انتقال الکترون تنفسی در غشای تیلاکوئیدی کلروپلاستها که هر دو فرایند احیای غیر فتوشیمیایی و اکسیداسیون پلاستوکینون‌ها را همراه با مصرف اکسیژن مولکولی دربر می‌‌گیرد (5، 6). بنابراین با توجه به تأثیر پروپیل گالات در زنجیره­ انتقال الکترون، تغییرات ایجاد شده توسط این ممانعت‌کننده به راحتی از طریق اندازه­گیری‌های فلورسنس کلروفیل a قابل بررسی است.

بررسی فلورسنس کلروفیل a ابزاری مفید برای مطالعه­ فرایندهای انتقال الکترون فتوسیستم II است (15، 18، 21، 36، 37). به‌طوری‌که بلافاصله پس از تابش نور به یک نمونه­ فتوسنتزی سازگار شده با تاریکی، شدت فلورسنس در مدت 2 میلی­ثانیه به علت احیای پذیرنده­ اولیه­ فتوسیستم II (QA) از یک سطح پایه (سطح O یا Fo) به یک سطح بالاتر (سطح J یا FJ) افزایش می­یابد. افزایش سطح J به سطح I (یا FI) در مدت تقریبی 30 میلی­ثانیه و به علت پر شدن مخزن پلاستوکینون رخ می­دهد. در نهایت، سطح فلورسنس از FI به سطح بیشینه (سطح P یا Fm) رسیده که این حالت نشان‌دهنده­ تجمع الکترون­ها در سمت پذیرنده­ فتوسیستم I می­باشد (37، 39). کارایی فتوسیستم II بر اساس آزمون JIP و توسط مجموعه­ای از شاخص­های ساختاری و کاربردی حاصل از افزایش چند مرحله‌ای سطح فلورسنس کلروفیل تعیین می­گردد (34، 36، 37، 38، 40). آزمون JIP بر مبنای تئوری جریان انرژی در غشاهای زیستی، بدون کوچک­ترین آسیبی به موجود زنده و با استفاده از تغییرات حاصل از کینتیک فلورسنس کلروفیل a، هر گونه تغییر در دستگاه فتوسنتزی را نشان می‌دهد. به همین علت این روش به صورت گسترده در بررسی رفتار دستگاه فتوسنتزی به‌ویژه فتوسیستم II کاربرد دارد (1، 22، 25، 41).

Dunaliella، یک جلبک سبز تک سلولی فاقد دیواره بوده، قابلیت انعطاف‌پذیری فراوانی دارد و به دلیل دارا بودن کلروپلاست مشابه با گیاهان عالی، سرعت رشد بالا، کشت مداوم و آسان و همچنین قابلیت منحصر به فرد در ارائه پاسخ‌های بیوشیمیایی مناسب به انواع تنش­های فیزیولوژیکی و سایر ترکیبات شیمیایی به‌عنوان یک سیستم مدل برای مطالعات فتوسنتز، جذب و انتقال و فرایندهای متابولیسمی استفاده می­شود (3، 10). اغلب مطالعات انجام شده در مورد اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II در زمینه­ ممانعت از تنفس کلروپلاستی در گیاهان عالی بوده و گزارش­های اندکی در مورد این اثر در جلبک­های سبز وجود دارد. گذشته از این، اثر مستقیم غلظت­های مختلف پروپیل گالات بر ساختار و عملکرد فتوسیستم II و همچنین روند رشد در گیاهان تاکنون بررسی نشده است. ازاین‌رو در این تحقیق سعی می­گردد با استفاده از آنالیز چند مرحله­ای افزایش فلورسنس کلروفیل a (OJIP)، این اثر بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II و رشد سوسپانسیون­های جلبکی مشخص شود. همچنین جایگاه عمل پروپیل گالات در زنجیره­ انتقال الکترون فتوسنتزی مورد بحث قرار می­گیرد.

مواد و روشها

منابع تأمین و کشت جلبک: جلبک Dunaliella salina سویه UTEX 200 مورد استفاده در این تحقیق از کلکسیون کشت جلبک دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه شد. تهیه محیط کشت مایع با غلظت 1 مولار NaCl، بر اساس روش‌های یاد شده در منابع قبلی انجام شد (32). عمل انتقال سلول‌های جلبکی از مخزن‌های جلبکی به محیط کشت مایع در داخل ارلن مایر­های 250 میلی لیتری اتوکلاو شده و در شرایط کاملاً استریل انجام شد. کشت­های جلبکی در اتاق کشت و در دمای Cº 25 و شدت نور 70 میکرو مول فوتون بر مترمربع بر ثانیه به مدت 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی بر روی دستگاه شیکر به صورت مداوم و با سرعت 100 دور در دقیقه قرار گرفتند. زمانی که کشت‌های جلبکی به مرحله نمایی رشد رسیدند، توسط غلظت‌های مختلف پروپیل گالات تیمار شدند.

تیمار کشتهای جلبکی با غلظت‌های مختلف پروپیل گالات: زمانی که جلبک‌ها در مرحله نمایی رشد بودند، محلول پروپیل گالات در غلظتهای 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی مولار تهیه و به داخل ارلن­ها اضافه شد. قبل از اضافه کردن ممانعت کننده، به‌منظور همسان سازی سوسپانسیون­های جلبکی و یکسان نمودن نقطه ابتدایی منحنی­های رشدی، محتوای کلیه ارلن­ها با یکدیگر مخلوط شد. نمونه­های جلبکی با استفاده از محیط کشت در حجم نهایی 100 میلی­لیتر طوری آماده شدند که تعداد اولیه­ سلولها در آنها بطور تقریبی 106 × 5 سلول بر میلی­لیتر باشد. کشت‌های جلبکی تیمار شده با پروپیل گالات برای مدت 96 ساعت در اتاق کشت با همان شرایط توصیف شده در بالا قرار گرفتند. کشتهای جلبکی فاقد ممانعت کننده به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شدند.

شمارش سلولی، استخراج و اندازه­گیری رنگیزه­ها: تعداد سلول­ها بلافاصله پس از اضافه کردن ممانعت کننده و  96 ساعت پس از آن توسط لام هموسایتومر در سه تکرار شمارش شد و میزان رشد سلولی بر اساس درصد تغییرات تعداد سلول پس از 96 ساعت نسبت به زمان صفر بیان شد. به‌منظور استخراج کلروفیل کل و بتاکاروتن، یک میلی لیتر از سوسپانسیون­های جلبکی به میکروتیوب منتقل و در g 10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از حذف محلول رویی، به رسوب باقی مانده یک میلی لیتر استون 80% اضافه و پس از ورتکس شدید، عمل سانتریفیوژ به مدت 2 دقیقه تکرار شد. محلول رویی از میکروتیوب‌ها استخراج و برای اندازه­گیری میزان رنگیزه­ها بکار رفت. میزان کلروفیل کل از طریق روش اسپکتروفوتومتری اندازه­گیری شد (2). میزان بتاکاروتن با استفاده از ضریب جذب برابر ) 2273 = (E1%1cm در طول موج 480 نانومتر محاسبه شد (4).

اندازه­گیری فلورسنس کلروفیل a : به‌منظور اندازه­گیری فلورسنس کلروفیل a در زمان­های صفر و 96 ساعت پس از اضافه کردن پروپیل گالات، یک میلی­لیتر از محلول جلبکی به شیشه مخصوص اندازه­گیری فلورسنس منتقل شد و بعد شیشه­ها به مدت 10 دقیقه در تاریکی نگهداری شدند. نشر سریع فلورسنس کلروفیل a از 10 میکروثانیه تا 1000 میلی­ثانیه با استفاده از دستگاه Handy PEA (Plant Efficiency Analyser, Hansatech, UK)، با تابش یک پالس نور شدید (3500 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه) در یک اتاقک کاملا تاریک اندازه­گیری شد. شدت فلورسنس در 50 میکروثانیه به‌عنوان سطح O (Fo) و شدت فلورسنس حداکثر به‌عنوان سطح P (Fm) در نظر گرفته شد (36، 37). تغییرات شدت فلورسنس القا شده توسط پروپیل گالات در 300 میکروثانیه (سطح K) از طریق نرمال سازی مقادیر سیگنال فلورسنس بین سطوح O و  Jبر اساس فرمول زیر و با استفاده از اختلاف سیگنال بین نمونه‌های شاهد و تیمار شده با مقادیر مختلف ممانعت‌کننده تعیین شد (28). 

WOJ = (Ft-Fo)/(FJ-Fo)

که در این فرمول،  WOJبرابر مقادیر سیگنال فلورسنس نرمال شده بین سطوح O و J، Fo شدت فلورسنس در 50 میکروثانیه، FJ  شدت فلورسنس در 2 میلی­ثانیه و Ft  شدت فلورسنس در فاصله زمانی بین 50 میکروثانیه و 2 میلی­ثانیه پس از تابش پالس نور شدید می­باشد. در نهایت اطلاعات به‌دست آمده از نشر فلورسنس توسط آزمون JIP و با استفاده از نرم‌افزار BiolyzerHP3 (Labrotory of Bioenergetics, University of Geneva, Switzerland) آنالیز شدند (36). شاخص­های حاصل از آزمون JIP مورد استفاده در این پژوهش و توصیف آنها در جدول 1 آمده است.

اندازه­گیری میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II : میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II با استفاده از دستگاه پلاروگراف و از طریق یک الکترود سنجش اکسیژن نوع Clark (Hansatech Ltd, UK) که در محفظه­ای حاوی سلول‌های جلبکی قرار دارد، اندازه­گیری شد (11). سوسپانسیون­های جلبکی در مرحله نمایی رشد از طریق سانتریفیوژ در g 2000 به مدت 5 دقیقه رسوب داده شده و در بافر واکنش با نسبت 1:6 حل شدند. ترکیب بافر واکنش شامل 25/0 میلی مولار پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 25/0 میلی مولار دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 2/0 میلی مولار منیزیم کلراید، 25 میلی مولار سدیم بیکربنات و 1 مولار نمک NaCl و اسیدیته برابر 5/7 است. غلظت کلروفیل بافر واکنش طوری تنظیم شد که نمونه مورد آزمایش حاوی 40 میکروگرم کلروفیل بر میلی­لیتر باشد. شدت نوری برابر با 400 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه برای انجام آزمایش بکار رفت. مقادیر اکسیژن آزاد شده به صورت نانومول بر میکروگرم کلروفیل در دقیقه بیان گردید.

 

جدول 1- شاخص­های بیوفیزیکی حاصل از اندازه­گیری فلورسنس کلروفیل و آزمون JIP

شاخص 

توصیف شاخص

ABS/RC

میزان کل جذب نور توسط کلروفیل­های آنتن نسبت به مراکز واکنش فعال

Fo

شدت فلورسنس  در  µs50 (مرحله­ O)

FK

شدت فلورسنس  در  µs300 (مرحله­ K)

FJ

شدت فلورسنس  در  ms2 (مرحله­ J)

FI

شدت فلورسنس  در   ms30 (مرحله­ I )

Fm

بیشینه شدت فلورسنس (مرحله­ P)

FV

فلورسنس  متغیر بیشینه  (FV=Fm–Fo)

Fv/Fo

کارایی کمپلکس تجزیه کننده­ آب در سمت دهنده فتوسیستم II

ΦDo

میزان اتلاف انرژی به صورت انرژی گرمایی

ΦEo

میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II

ΦPo

میزان عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه

 


تجزیه و تحلیل آماری: همه­ آزمایشها در سه تکرار مستقل برای هر تیمار انجام شد. میانگین و انحراف معیار (Standard deviation ±SD) برای هر تیمار اندازه­گیری و اختلاف آماری معنی­دار بین نمونه­های شاهد و تیمار شده با پروپیل گالات با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون Holm-Sidak در سطح 05/0 (P < 0.05) تعیین شد.

نتایج

اثر پروپیل گالات بر رشد سلولی و میزان رنگیزه­ها: اثر پروپیل گالات بر میزان رشد سلول در شکل 1- الف نشان داده شده است. همان طور که در شکل مشاهده می­گردد، پس از گذشت 96 ساعت از اضافه کردن ممانعت کننده به سوسپانسیون­های جلبکی، در بیشتر موارد تعداد سلول­ها افزایش می­یابد. در غلظت 1/0 میلی­مولار ممانعت کننده، تفاوت معنی­داری نسبت به غلظت صفر ممانعت کننده (شاهد) ملاحظه نمی­شود. با این حال در غلظت 5/0 میلی­مولار افزایش معنی­دار و در غلظت­های 1 و 2 میلی­مولار کاهش معنی­داری ملاحظه می­گردد. در حالی که در غلظت 4 میلی­مولار ممانعت کننده تقسیم سلولی به طور کامل متوقف می‌گردد.

اضافه کردن ممانعت کننده تا حد 5/0 میلی­مولار باعث افزایش میزان کلروفیل کل و بتاکاروتن می‌شود، در حالی که غلظت­های بالاتر از 5/0 میلی­مولار ممانعت کننده باعث کاهش تدریجی آن می‌گردند، به‌طوری که در غلظت 4 میلی­مولار، این رنگیزه­­ها به طور کامل از بین می­روند (شکل 1- ب و پ).

اثر پروپیل گالات بر شدت فلورسنس کلروفیل a : اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسیستم II در زمانهای صفر و 96 ساعت پس از  تیمار سلول­های جلبک با غلظت‌های مختلف این ممانعت کننده با استفاده از اندازه­گیری نشر سریع فلورسنس کلروفیل (O-J-I-P) در شکل 2 نشان داده شده است. همان طور که ملاحظه می­شود شدت فلورسنس پس از 96 ساعت در حضور غلظت­های 1/0، 5/0 و 1 میلی­مولار ممانعت کننده دارای بالاترین سطوح I و P در مقایسه با شاهد هستند. کشت‌های تیمار شده با غلظت 2 میلی­مولار ممانعت کننده شیب صعودی فلورسنس پایین‌تری نسبت به شاهد نشان می­دهند. کینتیک فلورسنس در تیمار با غلظت 4 میلی­مولار به شدت کاهش یافته و به سطح تقریبا یکنواختی می­رسد.

 

 

شکل 1- اثر غلظت­های مختلف پروپیل گالات بر درصد تغییرات: (الف) تعداد سلول، (ب) غلظت کلروفیل کل و (پ) میزان بتاکاروتن 96 ساعت پس از تیمار با ممانعت کننده    مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می­باشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنی­دار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) می­باشد.

 

 

شکل 2- اثر غلظت‌های 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی­مولار پروپیل گالات بر کینتیک OJIP فلورسنس کلروفیل a. (الف) زمان صفر، (ب) 96 ساعت پس از تیمار با ممانعت کننده

 

آنالیز شدت فلورسنس بین سطوح O و (WOJ) J که بیانگر شدت فلورسنس کلروفیل a در سطح K (F300µs) می­باشد (شکل 3) نشان‌دهنده­ افزایش شدید شدت فلورسنس در 300 میکرو ثانیه در تیمار با غلظت 4 میلی­مولار ممانعت کننده است.

اثر پروپیل گالات بر میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II : بررسی میزان اکسیژن آزاد شده در حضور غلظت‌های مختلف پروپیل گالات نشان‌دهنده­ اثر ممانعت‌کنندگی این ترکیب بر میزان تولید اکسیژن فتوسنتزی می­باشد (شکل 4). همان طور که در شکل ملاحظه می­شود، غلظتهای 1/0 و 5/0 میلی­مولار پروپیل گالات تأثیر معنی­داری بر کاهش میزان اکسیژن فتوسنتزی ندارند؛ در حالی که غلظتهای بیشتر از 5/0 میلی­مولار سبب کاهش معنی­دار آن شده، به طوری که در حضور غلظت 4 میلی­مولار، تولید اکسیژن فتوسنتزی متوقف می­شود.

بررسی تغییرات جریان الکترون فتوسیستم II در حضور پروپیل گالات: افزایش میزان پروپیل گالات تا غلظت 1 میلی مولار باعث افزایش تدریجی میزان Fv/Fo که شاخص مرتبط با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده­ آب در سمت‌دهنده­ فتوسیستم II است (20، 29)، می­شود. این افزایش در ΦEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II) نیز مشاهده می­شود. در حالی که این غلظت‌ها تأثیر معنی­داری بر میزان شاخص ΦPo (کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه) نداشته است. با وجود این، تمامی این شاخص­ها در حضور غلظت­­ 4 میلی­مولار ممانعت کننده به شدت کاهش پیدا می­کنند (شکل5). همچنین غلظت­های 1/0 تا 2 میلی­مولار پروپیل گالات تأثیری بر ΦDo (میزان اتلاف انرژی) و نسبت ABS/RC (میزان کل جذب نور توسط کلروفیل­های آنتن نسبت به مراکز واکنش فعال) ندارد. به‌طوری‌که تنها غلظت 4 میلی­مولار ممانعت کننده باعث افزایش شدید این شاخص­ها در مقایسه با شاهد می­شود (شکل 6).

 

 

شکل 3- اثر غلظت‌های 1/0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی­مولار پروپیل گالات بر شدت فلورسنس کلروفیل a  در سطح K. مقادیر نسبت به شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) نرمال شده­اند.

 

شکل 4- میزان آزاد شدن اکسیژن فتوسنتزی در سلول­های D. salina در معرض غلظت‌های مختلف پروپیل گالات    مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می­باشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنی­دار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) می­باشد.

 

شکل 5- تغییرات Fv/Fo، PoΦ و EoΦ در کشت‌های جلبکی تیمار شده با غلظت‌های مختلف پروپیل گالات    مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می­باشد. علامت ستاره نشانگر وجود تفاوت معنی­دار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) می­باشد.

 

 

شکل 6- تغییرات ABS/RC و DoΦ در کشت‌های جلبکی تیمار شده با غلظت‌های مختلف پروپیل گالات     مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می­باشد. علامت ستاره بیانگر وجود تفاوت معنی­دار بین مقادیر مختلف و شاهد (غلظت صفر ممانعت کننده) می­باشد.

 


بحث

همانند گزارش­های پیشین در مورد گیاهان عالی، جلبک­های سبز و سیانوباکتری‌ها مبنی بر افزایش چند مرحله­ای فلورسنس سلول­های سازگار شده با تاریکی (1، 25، 39)، سلول­های جلبک Dunaliella نیز یک افزایش چند مرحله­ای فلورسنس را پس از قرار گرفتن در تاریکی از خود نشان می­دهند (شکل2). شدت فلورسنس کلروفیل a در مراحل مختلف صعود (O-J-I-P) بیانگر میزان احیای QA، QB و مخزن پلاستوکینون است (18، 24). بررسی شدت فلورسنس نشان داد که سلولهای جلبکی تیمار شده با غلظت‌های 1/0 تا 1 میلی­مولار پروپیل گالات سطوح I و P بالاتری در مقایسه با شاهد دارند. بالاتر بودن سطح I نشان­‌دهنده­ مخزن پلاستوکینون احیاتر و تجمع بیشتر اولین پذیرندة­ الکترون (QA-) در حضور پروپیل گالات است (37). این رویداد می­تواند بیانگر توقف فرایند تنفس کلروپلاستی در نتیجه­ ممانعت از اکسیداز انتهایی پلاستید (PTOX) توسط پروپیل گالات باشد. از طرفی، زمانی که تولید اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II با استفاده از روش پلاروگراف تعیین می‌گردد، یک همبستگی منفی بین کاهش تدریجی در میزان آزاد شدن اکسیژن با افزایش غلظت ممانعت کننده مشاهده می­شود. به هر حال غلظت ممانعت کننده تا حد 2 میلی­مولار تأثیر منفی بر فعالیت کمپلکس تجزیه کننده­­ آب و روند جریان انتقال الکترون فتوسیستم II ندارد (شکل­ 5). بنابراین چنین به نظر می­رسد که کاهش معنی­دار میزان اکسیژن آزاد شده از فتوسیستم II در حضور غلظت‌های 1 و 2 میلی­مولار پروپیل گالات به علت ممانعت از جریان الکترونی بین فتوسیستم II و اکسیژن یا در حقیقت ممانعت از عملکرد PTOX دخیل در فرایند تنفس کلروپلاستی ­باشد. مطالعات پیشین نشان دادند که میزان آزاد شدن اکسیژن فتوسنتزی به محض اضافه کردن پروپیل گالات به سلول­های کلامیدوموناس کاهش می­یابد (8، 9، 14). این کاهش سریع در میزان اکسیژن آزاد شده به دلیل خاصیت آنتی اکسیدانی پروپیل گالات نیست، زیرا هیچ یک از سایر آنتی اکسیدان­ها مانند سوپر اکسید دسموتاز، کاتالاز، آلفا توکوفرول و آسکوربات میزان اکسیژن آزاد شده را تغییر نمی­دهند (9). این نتایج پیشنهاد می­کنند که کاهش در میزان آزاد شدن اکسیژن در حضور غلظت­های تا حد 2 میلی­مولار ممانعت کننده، بدون تأثیر بر جریان الکترونی، ناشی از ممانعت از تنفس کلروپلاستی است.

کاهش شدید شدت فلورسنس و رسیدن آن به یک سطح تقریبا صاف در حضور غلظت­های 4 میلی­مولار ممانعت کننده می­تواند به علت کاهش ظرفیت فتوسیستم II برای انتقال الکترون از سیستم تجزیه کننده­ آب به سمت فتوسیستم I ­باشد. مشابه با کاهش شدید شدت فلورسنس در حضور این غلظت­، کاهش شدیدی نیز برای Fv/Fo، شاخصی متناسب با فعالیت کمپلکس تجزیه کننده­ آب در سمت دهنده­ فتوسیستم II (20، 29)، کارایی عملکرد کوانتومی فتوشیمیایی اولیه (Φpo) و میزان انتقال الکترون در زنجیره­ انتقال الکترون فتوسیستم II (ΦEo) مشاهده می­شود (شکل 5). همگام با چنین کاهشی، افزایش مشاهده شده در نسبت ABS/RC که ناشی از کاهش در تعداد مراکز واکنش فعال و یا افزایش در تعداد مولکول‌های آنتنی می­باشد (38)، می­تواند بیانگر آسیب برگشت‌ناپذیر به فتوسیستم II باشد (20). به هر حال نتایج ما بیانگر کاهش شدید در تعداد مراکز واکنش فعال است (نتایج نشان داده نشده است). تجمع مراکز واکنش غیرفعال، با افزایش اتلاف انرژی جذب شده به صورت گرما (شکل 6) همراه است. از سوی دیگر کارایی کمپلکس تجزیه کننده­ آب به‌عنوان حساس­ترین بخش در زنجیره­ انتقال الکترون فتوسنتزی محسوب می­شود (20). کاهش در فعالیت این بخش از آسیب به سیستم انتقال الکترون فتوسنتزی ناشی می­شود (29). همچنین، نتایج نشان داد که تغییرات در هر دو شاخص Fv/Fo و Φpo  با افزایش شدت فلورسنس در 300 میکروثانیه (سطح K) هماهنگ است (شکل3). افزایش در شدت فلورسنس در محدوده­ 300 میکرو ثانیه نشان‌دهنده­ اثر ممانعت کنندگی در سیستم تجزیه کننده­ آب در سمت دهنده­ فتوسیستم II می­باشد (12، 35). بنابراین می­توان چنین تصور کرد که کاهش کارایی فتوسیستم II از ممانعت ایجاد شده توسط غلظت 4 میلی­مولار پروپیل گالات بر کمپلکس تجزیه کننده­ آب ناشی می­شود.

تیمار سلول­های جلبکی با غلظت‌های تا 5/0 میلی­مولار پروپیل گالات اثر مثبتی هم بر فتوسنتز و هم بر شاخص­های فیزیولوژیک مانند رشد سلول و میزان رنگیزه­ها دارد. مطالعات روی گیاه آرابیدوپسیس نشان داد که پروپیل گالات در غلظت­های پایین می­تواند سبب افزایش عملکرد کوانتومی فتوسیستم II شود (26). همچنین سایر مطالعات روی اثر پروپیل گالات بر روند انتقال الکترون فتوسنتزی بیان کننده­ نقش این ممانعت کننده در غلظت­های پایین در ممانعت از تجزیه­ پروتئین D1 است (12، 33). این امر نشان می­دهد که ممانعت کنندة تنفس کلروپلاستی در این محدوده­ غلظت می­تواند به‌عنوان یک محافظت کننده از سیستم فتوسنتزی عمل کند. با توجه به توقف رشد سلول در کشت‌های تیمار شده با غلظت 4 میلی­مولار پروپیل گالات (شکل­ 1)، می­توان چنین نتیجه گرفت که ممانعت از فعالیت فتوسیستم II در این شرایط می­تواند ناشی از اثر ممانعت نوری ایجاد شده در حضور غلظت بالای پروپیل گالات باشد. مطالعات گذشته نیز نشان داده­اند که ممانعت از کمپلکس تجزیه کننده­ آب، حساسیت فتوسیستم II را به ممانعت نوری افزایش می­دهد (42) و این امر می­تواند سبب تسریع تجزیه پروتئین D1 شود (19).

با توجه به نتایج به‌دست آمده از این پژوهش می­توان چنین جمع‌بندی نمود که غلظت 4 میلی­مولار پروپیل گالات به طور مستقیم بر اجزای فتوسیستم II اثر گذاشته و احتمالا باعث القای پدیده­ ممانعت نوری در جلبک Dunaliella شده است. همچنین، با در نظر گرفتن نحوة اثر این غلظت­ از ممانعت کننده­ بر فتوسنتز و رشد سلول­های جلبکی، سمت دهنده­ فتوسیستم II به‌عنوان جایگاه عمل ممانعت کننده در غلظت بالاتر از 2 میلی­مولار شناخته شد. بنابراین می­توان پروپیل گالات را به‌عنوان یک ممانعت کننده­ اختصاصی فتوسیستم II علاوه بر نقش آن در ممانعت کنندگی تنفس کلروپلاستی در نظر گرفت.

سپاسگزاری

 بدین‌وسیله از مسئولان محترم تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان به دلیل حمایت مالی در انجام این تحقیق قدردانی می‌گردد. نویسندگان مقاله از دست‌اندرکاران قطب تنش‌های گیاهی در دانشگاه اصفهان نیز تشکر و قدردانی می‌نمایند.

1-    Appenroth, K.J., Stockel, J., Srivastava, A. and Strasser, R.J. 2001. Multiple effects of chromate on the photosynthetic apparatus of Spirodela polyrhiza as probe by OJIP chlorophyll a fluorescence measurements. Environmental Pollution. 115, 49–64.
2-   Arnon, D. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts: polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology. 24, 1-15.
3-   Avron, M. and Ben-Amotz, A. 1992. Dunaliella, physiology, biochemistry and biothechnology. CRC Press. Boca Raton.
4-   Ben-Amotz, A. and Avron, M. 1983. On the factors which determine massive β-Carotene accumulation in the halo-tolerant alga Dunaliella bardawil. Plant Physiology. 72, 593-597.
5-   Bennoun, P. 1994. Chlororespiration revisited: mitochondrial-plastid interactions in Chlamydomonas. Biochimica et Biophysica Acta, Bioenergetics. 1186, 59–66.
6-   Bennoun, P. 1982. Evidence for a respiratory chain in the chloroplast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 4352-4356.
7-   Chaudhuri, A. and Kar, R.K. 2008. Inhibition of seed germination by propyl gallate, a free radical scavenger and recovery of germination by hydrogen peroxide and ethylene in Vigna Radiata. World Journal of Agricultural Science. 4, 914-921.
8-   Cournac, L., Latouche, G., Cerovic, Z., Redding, K., Ravenel, J. and Peltier, G. 2002. In vivo interactions between photosynthesis, mitorespiration, and chlororespiration in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology. 129, 1921–1928.
9-   Cournac, L., Redding, K., Ravenel, J., Rumeau, D., Josse, E.M., Kuntz, M. and Peltier, G. 2000. Electron flow between photosystem II and oxygen in chloroplasts of photosystem I-deficient algae is mediated by a quinol oxidase involved in chlororespiration. Journal of Biological Chemistry. 275, 17256–17262.
10-Cowan, A.K., Rose, P.D. and Horne, L.G. 1992. Dunaliella salina: a model system for studying the response of plant cells to stress. Journal of Experimental Botany. 43, 1535-1547.
11-Delieu, T. and Walker, D.A. 1972. An improved cathode for measurement of photosynthetic oxygen evolution by isolated chloroplasts. New Phytologist. 71, 201-225.
12-Dewez, D., Ali, N.A., Perreault, F. and Popovic, R. 2007. Rapid chlorophyll a fluorescence transient of Lemna gibba leaf as an indication of light and hydroxylamine effect on photosystem II activity. Photochemical and Photobiological Science. 6, 532–538.
13-Elich, T.D., Edelman, M. and Mattoo, A.K. 1997. Evidence for light-dependent and light independent protein dephosphorilation in chloroplasts. FEBS Letter. 411, 236-238.
14-Forti, G. and Caldiroli, G. 2005. State transitions in Chlamydomonas reinhardtii. The role of the Mehler reaction in state 2-to-state 1 transition. Plant physiology. 137, 492-499.
15-Fricke, W. and Peters, W.S. 2002. The biophysics of leaf growth in salt-stressed barley. A study at the cell level. Plant Physiology. 129, 374–388.
16-Gamboa, J., Munoz, M. and Quiles, M.J. 2009. Effects of antimycin A and n-propyl gallate on photosynthesis in sun and shade plants. Plant Science. 177, 643–647.
17-Georgakopoulos, J.H. and Argyroudi-Akoyunoglou, J.H. 1998. Thylakoid protein phosphorilation is suppressed by free radical scavengers. Correlation between PSII core protein degradation and thylakoid protein phosphorylation. Photosynthesis Research. 58, 269-280.
18-Govindjee, J. F 1995. Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. Australian Journal of Plant Physiology. 22, 131–160.
19-Jegershold, C., Virgin, I. and Stryring, S. 1990. Light-dependent degradation of the D1 protein in photosystem II is accelerated after inhibition of the water splitting reaction. Biochemistry. 29, 6179–6186.
20-Kalaji, H.M., Govindjee, Bosa, K., Koscielniak, J. and Zuk-Golaszewska, K. 2011. Effects of salt stress on photosystem II efficiency and CO2 assimilation of two Syrian barley landraces. Environmental and Experimental Botany. 73, 64-72.
21-Krause, G. H. and Weis, E. 1991. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: basics. Annual Review of Plant Physiology. 42, 313-349.
22-Krüger, G. H. J., Tsimilli-Michael, M. and Strasser, R.J. 1997. Light stress provokes plastic and elastic modifications in structure and function of photosystem II in camellia leaves. Physiologia Plantarum. 101, 265-277.
23-Kuntz, M. 2004. Plastid terminal oxidase and its biological significance. Planta. 218, 896-899.
24-Lazar, D. 2006. The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. Functional Plant Biology. 33, 9–30.
25-Lu, C.M. and Vonshak, A. 2002. Effects of salinity stress on photosysten II function in cyanobacterial Spirulina platensis cells. Physiologia Plantarum. 114, 405–413.
26-Maksymiec, W. Wojcik, M. and Krupa, Z. 2007. Variation in oxidative stress and photochemical activity in Arabidopsis thaliana leaves subjected to cadmium and excess copper in the presence or absence of jasmonate and ascorbate. Chemosphere. 66, 421-427.
27-Nagata, T., Todoriki, S. and Kikuchi, S. 2004. Radial expansion root cells and elongation of root hairs of Arabidopsis thaliana induced by massive doses of gamma irradiation. Plant & Cell Physiology. 45, 1557-1565.
28-Oukarroum, A., El Madidi, S., Schansker, G. and Strasser, R.J. 2007. Probing the responses of barley cultivars (Hordeum vulgare L.) by chlorophyll a fluorescence OLKJIP under drought stress and rewatering. Environmental and Experimental Botany. 60, 438–446.
29-Pereira, W.E., deSiqueira, D.L., Martinez, C.A. and Puiatti, M. 2000. Gas exchange and chlorophyll fluorescence in four citrus root stocks under aluminium stress. Journal of Plant Physiology. 157, 513–520.
30-Raghavan, S. and Hultin, H.O. 2005. Model system for testing the efficacy of antioxidants in muscle foods.  Journal of Agricultural Food Chemistry. 53, 4572–4577.
31-Schoen, M. 1988. Cell counting. In: Lobban, C., Champan, D., Kermer, B.P. (Eds), Experimental phycology. Cambridge University Press, Cambridge.
32-Shariati, M. and Lilley, McC. 1994. Loss of intracellular glycerol from Dunaliella by electroporation at constant osmotic pressure: Subsequent restoration of glycerol content and associated volume changes. Plant Cell & Environment. 17, 1295-1304.
33-Sopory, S.K., Greenberg, B.M., Mehta, R.A., Edelman, M. and Mattoo, A.K. 1990. Free radical scavengers inhibit light-dependent degradation of the 32 kDa photosystem II reaction center protein. Zeitschrift für Naturforschung. 45C, 412-417.
34-Stirbet, A.D., Rosenau, P., Stroder, A.C. and Strasser, R.J. 2001. Parameter optimization of fast chlorophyll fluorescence induction model. Mathematics and Computers in Simulations. 56, 443–450.
35-Strasser, B.J. 1997. Donor side capacity of photosystem II probed by chlorophyll a fluorescence transients. Photosynthesis Research. 52, 147–155.
36-Strasser, R.J., Srivastava, A. and Tsimilli Michael, M. 2000. The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples. In: Yunus M, Pathre U, Mohanty P (Eds) Probing Photosynthesis: Mechanisms, Regulation and Adaptation. Taylor and Francis, London, pp 445–483.
37-Strasser, R.J., Tsimilli-Michael, M. and Srivastava, A. 2004. Analysis of the Chlorophyll Fluorescence Transient. In: Papageorgiou GC, Govindjee (Eds) Chlorophyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis, Advances in Photosynthesis and Respiration, Vol. 19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands pp 321–362.
38-Strasser, B.J. and Strasser, R.J. 1995. Measuring fast fluorescence transients to address environmental questions: the JIP test. In: Mathis, P. (Eds), Photosynthesis: from Light to Biosphere, vol. 5. Kluwer Academic Publisher, The Netherlands, pp 977–980.
39-Strasser, R.J., Srivastava, A. and Govindjee, J. F 1995. Polyphasic chlorophyll a fluorescence transient in plants and cyanobacteria. Photochemistry and Photobiology. 61, 32–42.
40-Strasser, R.J. and Stirbet, A.D. 2001. Estimation of the energetic connectivity of PSII centres in plants using the fluorescence rise O–J–I–P fitting of experimental data to three different PSII models. Mathematics and Computers in Simulations. 56, 451–461.
41-Tsimilli-Michael, M., Eggenberg, P., Biro, B., Koves-Pechy, Voros, I. and Strasser, R.J. 2000. Synergistic and antagonistic effects of Arbuscular mycorrhizal fungi and Azospirillum and Rhizobium nitrogen-fixers on the photosynthetic activity of alfalfa, probed by the polyphasic chlorophyll a fluorescence transient O–J–I–P. Applied Soil Ecology. 15, 169–182.
42-Wang, W.Q., Chapman, D.J. and Barber, J. 1992. Inhibition of water splitting increases the susceptibility of photosystem II to photoinhibition. Plant Physiology. 99, 16–20.
43-Zurita, J.L., Josb, A., Pesoa, A.D., Salgueroa, M., Lopez-Artigueza, M. and Repetto, G. 2007. Ecotoxicological effects of the antioxidant additive propyl gallate in five aquatic systems. Water Research. 41, 2599-2611.
دوره 27، شماره 5
اسفند 1393
صفحه 915-926
  • تاریخ دریافت: 03 دی 1391
  • تاریخ بازنگری: 02 شهریور 1392
  • تاریخ پذیرش: 21 مهر 1392