Document Type : Research Paper
Author
Abstract
In this study, the effect of exogenous ascorbic acid treatment, as a strong antioxidant, on the enzymatic and non-enzymatic antioxidant system and oxidative stress was investigated in Solanum tuberosum L. cv. Carlton in vitro. Explants were cultured in liquid MS medium containing different concentrations of ascorbic acid (0, 0.5 and 1 m M) and NaCl (0 and 75 m M) for 4 weeks. NaCl stress reduced growth parameters and photosynthetic pigments, carotenoids, ascorbate pool, phenolics content and increased lipid peroxidation, electrolyte leakage, H2O2 level, proline content and the activity of lipoxygenase (LOX), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), guaiacol peroxidase (GPOD), ascorbate peroxidase (APX), and glutathione reductase (GR). Ascorbic acid via increasing most enzymatic antioxidants (SOD, CAT, GPOD, APX and GR) and most non-enzymatic antioxidants and proline, reduced lipid peroxidation, electrolyte leakage, H2O2 content and LOX activity and leading to promote protective reactions which were reflected in improving plants growth parameters.
Keywords
تأثیر آسکوربیک اسید در کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از تنش شوری در سیب زمینی
فاطمه دانشمند
تهران، دانشگاه پیام نور، گروه علمی زیستشناسی
تاریخ دریافت: 28/8/90 تاریخ پذیرش: 10/10/91
چکیده
در این مطالعه اثر آسکوربیک اسید برونزا بهعنوان یک آنتیاکسیدان قوی، بر فعالیت سیستم آنتیاکسیدان آنزیمی و غیر آنزیمی و تنش اکسیداتیو حاصل از تنش شوری در سیب زمینی Solanum tuberosum L. cv. Carlton با روش درون شیشهای مورد بررسی قرار گرفت. جداکشتهای ساقه حاوی گره و برگ، در محیط کشت مایع موراشیگ و اسکوگ (MS) که دارای غلظتهای مختلف آسکوربیک اسید (AsA) (0، 5/0 و 1 میلیمولار) و کلرید سدیم (0 و 75 میلی مولار) بود به مدت 4 هفته قرار گرفتند. تنش شوری موجب کاهش پارامترهای رشد و مقدار کلروفیل کل، کاروتنویید، حوضچه آسکوربات و ترکیبات فنلی گردید و مقدار پراکسیداسیون لیپیدها (مالون دآلدئید)، پراکسید هیدروژن (H2O2)، نشت یونی، پرولین و فعالیت لیپوکسیژناز (LOX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گایاکل پراکسیداز (GPOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون رداکتاز (GR) را افزایش داد. آسکوربیک اسید با افزایش فعالیت سیستم دفاع آنتی اکسیدانی آنزیمی نظیر SOD، CAT، GPOD، APX و GR و همچنین با افزایش فعالیت سیستم دفاع آنتی اکسیدانی غیر آنزیمی نظیر کاروتنویید، آسکوربات، ترکیبات فنلی و پرولین موجب کاهش تنش اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدها،H2O2 ، نشت یونی و فعالیت LOX، و در نتیجه موجب افزایش رنگیزههای فتوسنتزی و در نهایت بهبود پارامترهای رشد و افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش شوری گردید.
واژههای کلیدی: تنش شوری، آسکوربیک اسید، سیستم آنتیاکسیدان آنزیمی و غیر آنزیمی، شرایط درون شیشهای
نویسنده مسئول، تلفن: 03526232800، پستالکترونیکی: f.daneshmand@yahoo.com
مقدمه
تنش شوری یکی از تنشهای مهم محیطی و کاهش دهنده تولید محصول در محصولات کشاورزیست. غلظتهای بالای نمک در محیط اطراف ریشه موجب کاهش پتانسیل آبی، عدم تعادل تغذیهای، سمیت یونی، تغییر در متابولیسم سلولی، تنش اکسیداتیو و کاهش رشد و تولید محصول میگردد.
هنگامی که سلولها در شرایط تنش قرار میگیرند تعادل بین تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) و جاروب شدن آنها به هم میخورد و اغلب منجر به تنش اکسیداتیو میگردد. گونههای فعال اکسیژن برای سلول بسیار خطرناک بوده و موجب آسیب اکسیداتیو به لیپیدها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و از دست رفتن یکپارچگی غشاها و حتی مرگ سلول میگردند. گونههای فعال اکسیژن شامل آنیون سوپراکسید (O2·-)، پراکسید هیدروژن (H2O2)، رادیکال هیدروکسیل ((·OH و اکسیژن یکتایی 1O2 میباشد (33، 38).
گیاهان دارای سازوکارهای آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی برای مقابله با گونههای فعال اکسیژن میباشند. گیاهان دارای 5 سیستم اصلی آنزیمی جاروب کننده ROS میباشند که در مکانهای تولید ROS قرار دارند، این سیستمها عبارتند از: آنزیم سوپراکسیددیسموتاز، آنزیم کاتالاز، چرخه آسکوربات-گلوتاتیون (راهHalliwell-Asada )، چرخه آب-آب و چرخه گلوتاتیون (3، 8، 23). آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی مولکولهایی با وزن مولکولی پائین میباشند که هر یک دارای ساختار و خصوصیات شیمیایی خاص بوده و محل قرارگیری آنها نیز متفاوت میباشد. این ترکیبات به واسطه دادن الکترون یا هیدروژن نقش اساسی در جاروب کردن رادیکالهای آزاد دارند (3). آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی به دو گروه تقسیم میشوند: آنتیاکسیدانهای غشایی محلول در چربی شامل آلفاتوکوفرول، کاروتنوییدها و گزانتوفیلها و آنتی اکسیدانهای محلول در آب شامل گلوتاتیون، آسکوربات، ترکیبات فنلی و پرولین میباشند (43).
آسکوربیک اسید یک آنتی اکسیدان مهم در گیاهان میباشد. این ترکیب که در غشا داخلی میتوکندری سنتز میشود (36) در سیتوسول، دیواره سلولی، کلروپلاست، میتوکندری، واکوئل و آپوپلاست وجود دارد. آسکوربیک اسید نقشهای متعددی را در سلول بر عهده دارد. در کنترل چرخه سلولی و رشد سلول، رشد و نمو، طویل شدن دیواره و تنظیم سطح ردوکس سلول مؤثر است. آسکوربات پیش ساز اگزالات و تارتارات و همچنین کوفاکتور آنزیمهای دخیل در سنتز گلیکو پروتئینهای غنی از هیدروکسی پرولین، اتیلن، ژیبرلین و آنتوسیانین میباشد (3، 26). آسکوربیک اسید بهعنوان سوبسترای بسیاری از پراکسیدازها میباشد و یکی از اجزای اصلی چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و چرخه آب-آب بوده که در جاروب کردن ROS بسیار مؤثر میباشد (3، 23). آسکوربات همچنین میتواند در واکنش مستقیم با گونههای فعال اکسیژن نظیر سوپراکسید، اکسیژن یکتایی یا رادیکال هیدروکسیل اکسیده شود و یا بهعنوان عامل احیاکننده در بازسازی مجدد آلفا توکوفرول (آنتی اکسیدان باند شده به غشا) به کار گرفته شود و موجب حفاظت از غشا در برابر تنش اکسیداتیو گردد (23، 33). آسکوربات در همکاری با آلفا توکوفرول، رادیکالهای پراکسیل لیپید را از بین برده و مانع از گسترش پراکسیداسیون لیپید در غشا میگردد. در کلروپلاست، آسکوربیک اسید بهعنوان کوفاکتور آنزیم ویولاگزانتین د-اپوکسیداز عمل کرده و در پراکنش انرژی برانگیختگی اضافی کلروفیل شرکت میکند(3).
سیب زمینی چهارمین منبع تأمین کنندهی غذای مردم جهان بعد از گندم، برنج و ذرت میباشد و در بسیاری از کشورها در مناطق خشک و نیمهخشک کشت میگردد و در این مناطق کمبود آب یا آبهای شور مهمترین عامل محدودکنندهی رشد و تولید محصول میباشد. اگرچه سیبزمینی در گروه گیاهان با حساسیت متوسط به شوری قرار میگیرد اما این مقاومت در بین ارقام و گونههای وحشی سیب زمینی متفاوت میباشد.
در این مطالعه تأثیر آسکوربیک اسید برونزا بر کاهش اثرات ایجاد شده توسط شوری در سیبزمینی بهروش درونشیشهای در محیط کشت مایع موراشیک و اسکوگ (MS) مورد بررسی قرار گرفت (30). کشتهای درونشیشهای یک محیط یکنواخت و منظم را برای بررسی میزان مقاومت به شوری و سازوکارهای مقاومت به شوری فراهم میکند. این گونه کشتها یک محیط جایگزین مؤثر برای جلوگیری از برهمکنشهای پیچیدهی محیط و خاک است که موجب بررسی دقیقتر پاسخهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاه به تنش شوری میگردد(6).
مواد و روشها
ریز گیاهان سیب زمینی رقم زراعی Carlton از مرکز تحقیقات ژنتیک تهران تهیه شدند. این ریزگیاهان به قطعات 3-2 سانتیمتری تقسیم و این قطعات به ظرفهای اتوکلاو شده از جنس پلی پروپیلن با نام phytacon vesseles(Sigma) (به ارتفاع 78 میلی متر، قطر کف ظرف 86 میلی متر و قطر لبه ظرف 116 میلی متر) حاوی 30 میلی لیتر محیط کشت مایع موراشیک و اسکوگ (MS)، 3 درصد ساکارز و بدون آگار و هورمون با 7/5 = pH منتقل شدند و در اتاق با دمای°C 1 ± 25 و شدت نورS-1 M m-2µ120 منتقل و در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و بعد از گذشت یکماه از رشد گیاهان داخل این ظرفها از این گیاهان برای اعمال تیمار استفاده گردید.
برای اعمال تیمار غلظتهای 0و 75 میلی مولار کلرید سدیم به محیط کشت مایع موراشیک و اسکوگ (MS) که حاوی 3 درصد ساکارز و بدون آگار و هورمون با 7/5 = pH بود، اضافه شد و اتوکلاو گردید و بعد غلظتهای 0، 5/0 و 1 میلی مولار آسکوربیک اسید به محیط کشت اضافه شد و حدود 30 میلی لیتر از این محیط درون phytacon vessels ریخته شد. سپس گیاهان رشد یافته (در مرحله آماده سازی)، به قطعات 3-2 سانتیمتری تقسیم و 3 قطعه از هر کدام داخل یک phytacon vessels در شرایط استریل انتقال یافت و در اتاق کشت با شرایط ذکر شده در قبل به مدت 4 هفته نگهداری شد (داخل هر ظرف 3 گیاه و برای هر تیمار 3 تکرار). بعد از گذشت این مدت زمان، پارامترهای مورفولوژیک این گیاهان اندازهگیری گردید و اندام هوایی گیاهان در نیتروژن مایع فریز گردید و برای اندازهگیریهای بعدی در فریزر°C 80- قرار داده شد.
پارامترهای رشد:طول ساقه و وزن خشک اندام هوایی گیاهان در گروههای تیماری مختلف اندازهگیری گردید. طول ساقه بر حسب سانتیمتر و وزن خشک نمونهها بر حسب میلیگرم بر گیاه گزارش گردید.
رنگیزههای فتوسنتزی: اندازهگیری مقدار کلروفیل کل و کاروتنوییدها (کاروتنویید و گزانتوفیل) با استفاده از روش Lichtenthaler (1987) انجام شد (27) و غلظت رنگیزهها بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
پراکسیداسیون لیپیدها: برای سنجش مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشا، غلظت مالوندآلدئید که محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع میباشد اندازهگیری گردید و اندازهگیری مالون دآلدئید (MDA) به روشPacker وHeath (1969) انجام شد (20). برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1155 استفاده شد و نتایج حاصل از اندازهگیری بر حسب نانومول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
نشت یونی: برای سنجش میزان آسیب به غشا، میزان نشت یونی از روشBen Hamed و همکاران (2007) استفاده شد (10).
پراکسید هیدروژن (H2O2): سنجش پراکسید هیدروژن با استفاده از روش Velikova و همکاران (2000) انجام شد (41) و مقدار پراکسید هیدروژن در هر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر گزارش گردید.
پرولین: برای اندازهگیری پرولین از روش Bates (1973) استفاده شد (9) و برای محاسبهی مقدار پرولین از منحنی استاندارد پرولین استفاده و نتایج برحسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
آسکوربات کل: برای سنجش مقدار آسکوربات کل از روش De Pintoو همکاران (1999) استفاده شد (14) و با استفاده از آسکوربات منحنی استاندارد رسم گردید و نتایج بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.
ترکیبات فنلی کل:محتوای ترکیبات فنلی کل با استفاده از روش Sonald و Laima(1999) انجام شد (37) و با استفاده از گالیک اسید منحنی استاندارد رسم و غلظت ترکیبات فنلی کل بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
تهیه عصاره برای سنجش فعالیت آنزیمی: برای سنجش فعالیت آنزیمی، ابتدا آنزیمها از اندام هوایی گیاه در دمای 0-۴ درجه سانتیگراد استخراج شدند. بهاین منظور یک گرم بافت تر در یک هاون چینی محتوی سه میلیلیتر بافر فسفات 50 میلی مولار با 2/7 = pH که شامل اتیلن دی آمین تترااستیک اسید (EDTA) 1 میلی مولار، فنیل متان سولفونیل فلورید (PMSF) 1 میلی مولار و پلی وینیل پیرولیدون (PVP) 1 درصد بود، سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفوژ یخچالدار در g14000 و دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. از محلول رویی برای مطالعه فعالیت آنزیمها و نیز سنجش پروتئین استفاده گردید.
فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD)(EC 1.15.1.1): سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز با استفاده از سنجش مهار احیای نوری نیتروبلوتترازولیم (NBT) در 560 نانومتر انجام شد. یک واحد آنزیمی سوپراکسیددیسموتاز مقدار آنزیمی است که موجب 50 درصد ممانعت از احیاء نوری احیای نیتروبلوتترازولیم (با جلوگیری از تبدیل آن به فورمازان) میگردد. فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) در عصاره (به دست آمده از روش Bradford 1976 (11) بیان گردید (19).
فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)(EC 1.11.1.6): سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از محاسبه کاهش جذب H2O2 (کاهش مقدار H2O2) در 240 نانومتر و با روش Dhindsa و Motowe (1981) انجام شد (15). یک واحد آنزیمی کاتالاز مقدار آنزیمی است که 1 میلیمول H2O2 را در یک دقیقه تجزیه میکند.
فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)(EC 1.11.1.7): سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از گایاکول و اندازهگیری میزان جذب تتراگایاکول تشکیل شده از گایاکول در نتیجه فعالیت پراکسیداز، در 470 نانومتر انجام شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) موجود در 20 میکرولیتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford 1976) گزارش شد (31).
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)(EC1.11.1.1): سنجش فعالیت این آنزیم با کمک آسکوربات و طبق روش Nakano و Asada (1987) انجام شد (31). یک واحد آنزیمی آسکورباتپراکسیداز مقدار آنزیمی است که یک میلیمول آسکوربات را در یک دقیقه اکسید میکند (31). فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) موجود در 50 میکرولیتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford 1976) گزارش شد.
فعالیت آنزیم گلوتاتیون رداکتاز (GR) (EC 1.6.4.2): فعالیت آنزیم GR به وسیله اکسیداسیون NADPH توسط روش Foyer و Halliwell (1976) تعیین میشود (17). یک واحد فعالیت آنزیمی مقدار آنزیمی است که برای اکسیداسیون یک نانومول NADPH در یک دقیقه لازم است.
فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز (LOX)(EC 1.13.11.12): فعالیت این آنزیم براساس روش Minguez-Mosquera و همکاران (1993) انجام گردید (29). یک واحد آنزیمی مقدار آنزیمی است که 1 میکرومولار لینولئیک اسید را در یک دقیقه مورد استفاده قرار میدهد.
تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیلهای آماری در این مطالعه با آزمایش فاکتوریل و طبق طرح کاملا تصادفی با سه تکرار صورت گرفته و دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS تحت آنالیز واریانس قرار گرفته و اختلاف میانگینها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح اطمینان %95 مقایسه شدند.
نتایج
همه نتایج بهدست آمده در این مطالعه در جدول 1 آورده شده است. نتایج این آزمایش نشان داد که کاربرد کلرید سدیم در گیاهان سیب زمینی موجب کاهش پارامترهای رشد شامل طول ساقه و وزن خشک اندام هوایی و کاهش مقدار کلروفیل کل، کاروتنویید، حوضچه آسکوربات و ترکیبات فنلی شد و مقدار پرولین، پراکسیداسیون لیپیدها (مالون دآلدئید)، پراکسید هیدروژن (H2O2)، نشت یونی و فعالیت لیپوکسیژناز(LOX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گایاکل پراکسیداز (GPOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون رداکتاز (GR) را افزایش داد.
جدول 1- تأثیر تیمارهای شوری (NaCl) و آسکوربیک اسید (ASA) بر پارامترهای رشد، نشت یونی و مقدار مالون دآلدئید، پراکسیدهیدروژن، فعالیت لیپوکسیژناز، مقدار کلروفیل، کاروتنوئید، آسکوربات، پرولین، ترکیبات فنلی و فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون رداکتاز (GR)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکل پراکسیداز (GPOD). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح P≤ 0/05 است.
|
شاهد |
ASA (5/0 میلی مولار) |
ASA (1 میلی مولار) |
NaCl (75 میلی مولار) |
NaCl + ASA (5/0 میلی مولار) |
NaCl + ASA (5/0 میلی مولار) |
طول ساقه (سانتیمتر) |
00/24b |
66/26 a |
33/26 a |
33/9 d |
50/12 c |
00/12 c |
وزن خشک اندام هوایی (میلیگرم) |
91 b |
100 a |
101 a |
20 d |
30 c |
32 c |
نشت یونی (درصد) |
50/6 c |
20/5 d |
00/5 d |
00/50 a |
73/41 b |
76/40 b |
مالون دآلدئید (نانومول بر گرم وزن تر) |
73/8 c |
80/7 d |
51/7 d |
32/12 a |
26/10 b |
02/10 b |
پراکسیدهیدروژن (میکرومول بر گرم وزن تر) |
58/3 d |
93/2 e |
89/2 e |
62/11 a |
17/9 b |
53/8 c |
لیپوکسیژناز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
133/0c |
091/0 c |
096/0 c |
412/1 a |
211/1 b |
192/1 b |
کلروفیل کل (میکروگرم بر گرم وزن تر) |
00/84b |
34/90 a |
31/92 a |
39/11 d |
21/20 c |
06/20 c |
کاروتنوئید (میکروگرم بر گرم وزن تر) |
63/24c |
62/27 b |
79/29 a |
00/6 f |
07/9 e |
98/10 d |
آسکوربات (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
95/0 b |
07/1 a |
10/1 a |
30/0 e |
60/0 d |
69/0 c |
پرولین (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
0577/0e |
0687/0 d |
0688/0 d |
0890/0 c |
1003/0 a |
0950/0 b |
ترکیبات فنلی (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
06/2 b |
33/2 a |
20/2 a |
68/0 d |
94/0 c |
90/0 c |
سوپر اکسید دیسموتاز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
10/0 d |
15/0 c |
16/0 c |
34/0 b |
47/0 a |
44/0 a |
کاتالاز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
90/1 d |
58/2 c |
51/2 c |
46/4 b |
92/5 a |
03/6 a |
گلوتاتیون رداکتاز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
19/2 d |
58/2 c |
51/2 c |
22/3 b |
90/3 a |
81/3 a |
آسکوربات پراکسیداز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
50/0 e |
69/0 d |
65/0 d |
12/1 c |
70/1 b |
85/1 a |
پراکسیداز (یونیت بر میلیگرم پروتئین) |
95/1 d |
10/3 c |
88/2 c |
31/5 b |
75/7 a |
92/7 a |
استفاده از آسکوربیک اسید موجب بهبود پارامترهای رشد شامل طول ساقه و وزن خشک اندام هوایی و افزایش مقدار کلروفیل کل، کاروتنویید، حوضچه آسکوربات، ترکیبات فنلی و مقدار پرولین گردید و مقدار پراکسیداسیون لیپیدها (مالون دآلدئید)، پراکسید هیدروژن(H2O2)، نشت یونی و فعالیت لیپوکسیژناز(LOX) را کاهش داد، اما فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گایاکل پراکسیداز (GPOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون رداکتاز (GR) را افزایش داد.
بحث
نتایج این مطالعه نشان داد که با کاربرد نمک در محیط کشت پارامترهای رشد کاهش مییابد. کاهش رشد گیاه در تنش شوری میتواند نتیجه تأثیر تنش شوری در فرایندهای دخیل در تولید انرژی مثل فتوسنتز و تنفس باشد. تغییر در مقدار رنگیزههای فتوسنتزی، سمیت نمک و رقابت و اختلال در جذب و انتقال یونهای ضروری و عدم تعادل و کمبود عناصر ضروری، تنش اکسیداتیو ازجمله دلایلی است که در کاهش رشد در شرایط تنش شوری در گزارشهای مختلف ذکر شده است (33).
کاهش مقدار رنگیزههای فتوسنتزی یکی از اثرات تنشهای محیطی نظیر شوری و خشکی میباشد و این کاهش بستگی به نوع گیاه، مدت و شدت تنش و مرحله نموی گیاه دارد. یکی از اثرات تنشهای محیطی نظیر شوری و خشکی افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن و القای تنش اکسیداتیو میباشد (38). گونههای فعال اکسیژن منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و تغییر در نفوذپذیری غشا (نشت یونی) و خسارت به سلول میشوند. مقدار H2O2 تولید شده در سلول نیز نشاندهنده تعادل بین تولید و تجزیه گونههای فعال اکسیژن در سلول میباشد. غلظتهای بالای H2O2 بهعنوان عامل ایجاد کننده تنش اکسیداتیو به حساب میآیند (33). یکی دیگر از عوامل پراکسیداسیون لیپیدها فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز است. این آنزیم یک آنزیم اکسیداتیو است که واکنشهای پراکسیداسیون لیپیدها را کاتالیز میکند (7، 16). در این مطالعه مقدار تنش اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدها، نشت یونی، مقدار H2O2 و فعالیت لیپوکسیژناز تنش شوری افزایش یافت. افزایش پراکسیداسیون لیپید یا نشت یونی و مقدار H2O2 در شرایط تنش شوری ناشی از افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن در شرایط تنش اکسیداتیو میباشد که حذف، جاروب کردن و یا خاموش نمودن آنها خارج از توان گیاه بوده و نشان میدهد که سازوکارهای دفاعی ایجاد شده در گیاه در مقابل تنش اکسیداتیو کافی نبوده است.
در شرایط غیرتنش بین میزان تولید گونههای فعال اکسیژن و ظرفیت جاروب کردن آنها توسط سیستم دفاع آنتی اکسیدانی (آنزیمی و غیر آنزیمی) تعادل وجود دارد. اما در شرایط تنش میزان تولید گونههای فعال اکسیژن از ظرفیت جاروب کردن آنها توسط سیستم دفاع آنتی اکسیدانی بیشتر شده و درنتیجه تنش اکسیداتیو رخ میدهد. بنابراین برای مقابله با تنش اکسیداتیو تغییر ظرفیت سیستم دفاع آنتی اکسیدانی ضروری میباشد. آنزیمهایی مانند سوپر اکسیددیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون رداکتاز از آنزیمهای مهم سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در گیاهان میباشند (2). در این مطالعه فعالیت آنزیمهای سوپر اکسیددیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون رداکتاز در تنش شوری افزایش یافت.
آسکوربات از آنتی اکسیدانهای مهم سلولی میباشد که با واکنشهای آنزیمی و غیر آنزیمی در حذف گونههای فعال اکسیژن شرکت میکند. فعالیت عمده این ترکیب در چرخه آسکوربات و گلوتاتیون میباشد. در بررسی حاضر حوضچه آسکوربات در تنش شوری کاهش یافت. دلیل کاهش مقدار آسکوربات میتواند به علت تخریب مستقیم آسکوربات به وسیله -·O2 یا سایر رادیکالهای آزاد اکسیژن و همچنین مصرف آسکوربات برای سنتز زئازانتین و تولید مجدد آلفا توکوفرول باشد (22، 1).
در این تحقیق مقدار ترکیبات فنلی در تنش شوری کاهش یافت. البته کاهش ترکیبات فنلی در شرایط تنش شوری در گیاه فلفل گزارش شده است (32). با توجه به نقش ترکیبات فنلی در کاهش یا مهار پراکسیداسیون لیپیدها، جاروب کردن رادیکالهای آزاد و خاموش کردن اکسیژن یکتایی یا تجزیه پراکسیدها، این ترکیبات سلولها را علیه تکثیر زنجیره پی در پی اکسیداسیون و دفاع علیه گونههای فعال اکسیژن محافظت مینمایند (32).
در کلروپلاستها کاروتنوییدها بهعنوان رنگیزه کمکی عمل میکنند، اما نقش مهمتر آنها نقش آنتی اکسیدانی آنها میباشد (16، 25). زیرا این رنگیزهها مسئول خاموش کردن اکسیژن یکتایی و جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها و نهایت تنش اکسیداتیو میباشند (25). همچنین کاروتنوییدها از طریق چرخه گزانتوفیل باعث حفاظت از کلروفیل در مقابل فتواکسیداسیون میشوند(28). در این بررسی مقدار کاروتنویید در شرایط تنش کاهش نشان داد. گزارش شده است که کاهش مقدار کاروتنویید در شرایط تنش نیز به علت تجزیه بتاکاروتن و تشکیل زئازانترین در چرخه گزانتوفیل میباشد (39).
یکی از راههای مقابله با تنشهای محیطی نظیر شوری و خشکی، سنتز ترکیبات اسمززا و سازگار و محافظ اسمزی میباشد که پرولین ازجمله این ترکیبات میباشد. در این مطالعه نیز مقدار پرولین در گیاهان سیب زمینی تحت تنش شوری افزایش یافت.
مطالعه حاضر نقش آسکوربیک اسید را در افزایش مقاومت به تنش شوری در گیاهان سیب زمینی در شرایط تنش شوری نشان میدهد. آسکوربیک اسید موجب بهبود پارامترهای رشد در گیاهان کنترل و گیاهان تحت تنش گردید. مشابه با این آزمایش گزارش شده که آسکوربیک اسید موجب افزایش رشد گیاهان گوجه فرنگی تحت تنش شوری میگردد (35). علاوه بر این کاربرد آسکوربیک اسید توانست اثرات منفی تنش شوری بر جوانهزنی دانه برخی از هالوفیتها را کاهش دهد(24). Upadhyaya و همکاران (2010) نیز گزارش کردند افزایش بیان ژنهای دخیل در مسیر بیوسنتز آسکوربیک اسید و افزایش مقدار آسکوربیک اسید درونزا، موجب افزایش مقاومت گیاهان سیب زمینی به تنشهای محیطی نظیر شوری و خشکی شد (40). Afzali و همکاران (2006) نیز اثرات مثبت آسکوربیک اسید را بر گیاهان گندم تحت تنش شوری گزارش نمودهاند (4).
در مطالعه حاضر کاربرد برونزای آسکوربیک اسید موجب کاهش تنش اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدها، نشت یونی، مقدار H2O2 و فعالیت لیپوکسیژناز در گیاهان سیب زمینی تحت تنش شوری گردید. آسکوربیک اسید یک آنتی اکسیدان مهم است که سلولها را با جاروب کردن ROS از تنش اکسیداتیو محافظت مینماید. آسکوربیک اسید هم به طور مستقیم و هم به طور غیرمستقیم موجب حذف ROS میگردد. مثلا به طور غیرمستقیم از طریق فعالیت آسکوربات پراکسیداز میتواند H2O2 را حذف نماید. علاوه بر این آسکوربیک اسید کوفاکتوری مهم برای آنزیمهای دخیل در سنتز برخی از هورمونها نظیر ژیبرلین میباشد. به علاوه اینکه نقش کاربرد برونزای آسکوربیک اسید در افزایش تقسیم سلولی نیز گزارش شده است (1، 17). آسکوربیک اسید نقش دوگانهای را در سلول ایفا میکند، از یک طرف سبب تغییر چرخه سلولی و تحریک تقسیم سلولی میشود و از طرف دیگر افزایش رشد طولی و گسترش سلولی را موجب میشود (13، 12، 21).
در این بررسی نیز آسکوربیک اسید موجب افزایش سیستم دفاع آنتی اکسیدانی اعم از آنزیمی و غیر آنزیمی گردید. آسکوربیک اسید موجب افزایش مقدار آسکوربیک اسید، ترکیبات فنلی، کاروتنوییدها، پرولین و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان نظیر SOD، CAT، GPOD، APX و GR گردید.
مشابه با نتایج بهدست آمده در این آزمایش، کاربرد برونزای آسکوربیک اسید موجب بهبود پارامترهای رشد در گیاهان لوبیای تحت تنش شوری شد (42). این بهبود پارامترهای رشد با افزایش مقدار آسکوربات کل و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان نظیر SOD، CAT، APX و GR همراه بود (42). کاربرد برونزای آسکوربیک اسید مقدار آسکوربیک اسید را در کلروپلاست برگهای گیاهان گلرنگ افزایش داد و موجب حفاظت از همبستگی غشا و ممانعت از آسیب رسیدن به کلروپلاستها گردید (18). در گیاهان سویای تحت تنش اکسیداتیو ناشی از نیکل نیز کاربرد برونزای آسکوربیک اسید با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان نظیر CAT و APX موجب کاهش فعالیت LOX و کاهش مقدار MDA و کاهش تنش اکسیداتیو گردید (34).
در این مطالعه کاربرد آسکوربیک اسید موجب افزایش مقدار کلروفیل، کاروتنویید و ترکیبات فنلی گردید. در گیاهان سیبزمینی که بیان ژنهای مسیر تولید آسکوربیک اسید و در نهایت مقدار آسکوربیک اسید اندوژن افزایش یافته بود، تنشهای محیطی نظیر شوری و خشکی (مقدار رنگیزههای فتوسنتزی) نسبت به گیاهان کنترل کاهش کمتری را نشان داد (40). مشابه با نتایج این مطالعه در مورد افزایش مقدار پرولین، نقش پیش تیمار آسکوربیک اسید روی گیاهان گندم تحت تنش شوری بررسی گردید و مشاهده شد که آسکوربیک اسید اثرات تنش نمک را با افزایش تجمع پرولین بهبود میبخشد (5).
بهعنوان نتیجهگیری، تنش شوری موجب کاهش پارامترهای رشد و افزایش تنش اکسیداتیو در گیاهان سیب زمینی گردید. اما کاربرد آسکوربیک اسید موجب بهبود رشد گیاهان در شرایط تنش و غیر تنش گردید. آسکوربیک اسید، آسیب اکسیداتیو را با افزایش مقدار آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان نظیر SOD، CAT، GPOD، APX و GR کاهش داد که نتایج آن در کاهش مقدار مالون دآلدئید، نشت یونی و مقدار پراکسید هیدروژن و کاهش فعالیت آنزیم LOX و در نهایت افزایش رنگیزههای فتوسنتزی و بهبود پارامترهای رشد مشخص است.