Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Environmental pollution with heavy metals is increasing and lead is one of the most important pollutants of environmental. Pb not only affects plant growth and productivity but also enters into the food chain causing health hazards to man and animals. In this research Solanum melongena L. was selected and studied on ovule developmental stages of Eggplant, which is one of the main agricultural plants in Asia and Africa continent. For this aim, set this project as CRD design with 4 treatments including different concentrations of lead acetate 0mM, 3mM, 6mM and 9mM, were spread on the experimental plants. Then collect buds and flowers in different developmental stages and fixed in FAA 70, then subjected for developmental studies and studied with light microscopy after sectioning. Results of microscopically studies showed that lead treatment could influenced developmental staged of ovule. Degeneration of nuclei in embryo sac and changes in embryo sac include destroy of embryo sac, prevent of shaping embryo sac and plasmolysis in nucellus tissue.
Keywords
مطالعة اثر غلظتهای مختلف استات سرب بر مراحل تکوین تخمک در گیاه بادمجان (Solanum melongena L.)
مجید توکلی1*، عبدالکریم چهرگانی1 و 2 و حسین لاری یزدی1
1 بروجرد، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بروجرد، گروه زیستشناسی گیاهی
2 همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 5/12/90 تاریخ پذیرش: 18/5/91
چکیده
آلودگی محیطی با فلزات سنگین در حال افزایش است و سرب یکی از مهمترین آلودهکنندگان محیط است. برای این تحقیق گیاه بادمجان Solanum melongena انتخاب شد و مراحل تکوین تخمک در این گیاه که یکی از محصولات مهم کشاورزی در آسیا و آفریقا محسوب میشود، مطالعه شد. برای این منظور، در یک طرح کاملاً تصادفی 4 گروه تیماری شامل غلظتهای 0، 3، 6 و 9 میکرومولار استات سرب استفاده گردید. سپس گلها در مراحل مختلف نمو انتخاب شده و در محلول FAA تثبیت و پس از برشگیری با میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج مطالعات میکروسکوپی نشان داد که تیمار سرب میتواند مرحل تکوین تخمک را تحت تأثیر قرار دهد. برخی از این ناهنجاریها در مراحل تکوین تخمک شامل تحلیل هستههای کیسه رویانی، تخریب و تغییر شکل کیسه رویانی و پلاسمولیز سلولهای خورش میباشد.
واژههای کلیدی: Solanum melongena، بادمجان، تکوین، تخمک، سرب.
* نویسنده مسئول، تلفن: 09106060445 ، پست الکترونیکی: Tavakolimajid@Hotmail.Com
مقدمه
الگوی فعالیتهای صنعتی امروزی منجر به آلودگیهای زیستمحیطی بهویژه آلودگی با فلزات سنگین میشود (9). در دهة گذشته مشخص شد که آلایندههای محیطی، خیلی بیشتر از آن چیزی هستند که در گذشته تصور میشد و برخی از این آلایندهها به مدت طولانی در محیط باقی میمانند، و آنقدر تجمع مییابند که میتوانند به انسان آسیب بزنند (14). بیشتر این ترکیبات بهویژه فلزات سنگین و سرب اثرات سوء بر موجودات دارند (16). نتیجة تجمع این فلزات، کاهش در فعالیت متابولیسمی برخی میکروارگانیسمهای خاک و بهعلاوه نکروز و کلروز برگ در گیاهان عالیتر است (23).
در این پژوهش برای مطالعة اثرات سرب بر گیاهان از گیاه بادمجان استفاده شد که به لحاظ اقتصادی یک محصول مهم کشاورزی در آسیا و آفریقا محسوب شده، همچنین در اروپا و آمریکا نیز به مقدار کمتری کاشته میشود (24). در ایران بادمجان از دیرباز کشت شده و دارای خواص دارویی و غذایی فراوان است.
بنابراین، نتایج این پژوهش میتواند در شناسایی مراحل رویانزایی گیاه بادمجان تحت تیمار سرب و شناسایی اثرات سمی و بازدارندگی سرب بر رشد گیاه مؤثر باشد.
مواد و روشها
گیاه مورد استفاده در این طرح گیاه بادمجان زراعی قلمی واریتهی Serpentinum، با نام علمی
Solanum melongena L. از خانوادهی سیبزمینی Solanaceae بود.
برای این منظور، در یک طرح کاملاً تصادفی 4 گروه تیماری شامل غلظتهای 0، 3، 6 و 9 میکرومولار استات سرب استفاده شد. گلهای گیاه بادمجان بعد از کاشت در گلدان در مراحل مختلف تکوین گیاه از غنچه تا گل کامل جمعآوری شد. سپس نمونههای جمعآوری شده درون فیکساتور FAA (Formalin- Acetic Acid-Alcohol) به نسبت 5 : 10 : 85 به مدت 24 ساعت تثبیت شدند. سپس مازاد فیکساتور توسط آب جاری از بافت شسته شد. بعد از شستشوی نمونهها در الکل 70 درصد در یخچال ذخیره و نگهداری گردیدند.
برای آمادهسازی، ابتدا مراحل آبگیری، جایگزینی الکل با تولوئن و قالب گیری انجام شد و بعد نمونهها توسط یک دستگاه میکروتوم دستی برشگیری شدند. ضخامت برشها 7-6 میکرومتر انتخاب شد. سپس برشهای آماده شده را روی لام چسبانده و بعد از پارافینزدایی توسط تولوئن، به کمک هماتوکسیلین و ائوزین رنگآمیزی گردید. شفاف کردن نهایی نمونهها و لاملگذاری انجام شد. سپس مراحل اصلی تکوین تخمک توسط میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال مطالعه شده و عکسبرداری انجام شد.
نتایج
مراحل تکوین تخمک و دانههای گرده در گیاه بادمجان همانند مراحل تکوین در سایر گیاهان دولپهای توصیف شده توسط Buvat (1989) است (7).
پس از تشکیل پرچمها، تودهی مریستمی میانی باقیمانده بصورت پریموردیوم مادگی و بعد طرح اولیهی مادگی درمیآید (تصویر 1-a).
سطح خارجی تودة سلولی سازندة مادگی توسط اپیدرم یا روپوستی که از تحولات لایة سطحی تونیکایی بوجود آمده است، پوشیده شده است. کمی بعد طرح اولیة مادگی به سرعت طویل و کشیده شده و سه بخش خامه، کلاله و
تخمدان تمایز مییابند (تصویر 1-a).
همزمان با رشد و تمایز تخمدان، اولین آثار تشکیل تخمکها بصورت برجستگیهای کروی شکلی در دیواره محور میانی تخمدان پدیدار میشود. تمکن تخمکها از نوع محوری میباشد (تصویر 1-b و 1-c).
تخمک در این گیاه از نوع واژگون بوده و خیلی سریع جسم تخمک با بند زاویهدار شده و با افزایش میزان خمیدگی ضمن رشد به حالت واژگون درمیآید. خمیدگی تخمک با واکوئلدار شدن و رشد بیشتر سلولهای جهت مقابل خمیدگی مشخصتر میگردد (تصویر 1-d).
با رشد پریموردیوم تخمکی، طرح اولیة تخمکی ایجاد میشود که در آن سلولها یکسان نبوده و اثراتی از تمایز سلولی در آن دیده میشود، بطوریکه در تودة مرکزی تقسیمها به سرعت انجام شده و یکی از سلولها با رشد زیاد و افزایش حجم قابل توجه از سایر سلولها متمایز شده و سلول آرکئوسپور را بوجود میآورد (تصویر 1-e).
در طرفین جسم تخمک در سلولهای اپیدرمی و زیر اپیدرمی تقسیمهای شعاعی برخی سلولها پوستهی یک لایهای تخمک را بوجود میآورد. بطور معمول در دو طرف جسم تخمک حالت متقارن دیده میشود (تصاویر 1-e، 1-f، 1-g).
با رشد سریع و تمایز سلول آرکئوسپور تقسیم میوز خود را شروع کرده، ابتدا دیاد (تصویر 1-f) و بعد تتراد را بوجود میآورد که بطور معمول از نوع خطی است (تصویر 1-g). ضمن رشد و تمایز تودة سلولی خورش و پوستهی تخمکی سلول مادر کیسة رویانی که در رأس تخمک موقعیت مرکزی دارد، مشخص میگردد (تصویر 1-g).
بطور معمول هنگامیکه پوستة تخمک حدود یک سوم از جسم تخمک را میپوشاند دیاد و با تشکیل تتراد پوسته، بطور کامل مشخص و حدود سه چهارم جسم تخمک را میپوشانند.
تصویر 1- (a-h) مراحل تکوین تخمک در گیاه بادمجان Solanum melongena: a) تخمدان در حال نمو است، در حالیکه لایههای سازندهی بساک و بافت هاگزا مشخص است. St: پرچم، S: کاسبرگ، OV: تخمدان، Pe: گلبرگ (100X). b)؛ نمو تخمدان کامل شده و تخمکها در حال نمو میباشند (100X). c)؛ پریموردیوم تخمک بصورت برجستگی کوچکی در دیوارة تخمدان ظاهر میشود. Pr: پریموردیوم تخمک (1000X). d)؛ ادامة نمو پریموردیوم تخمک، سلولهای خورش شروع به تکثیر کرده و تخمک رشد مییابد. n: خورش (1000X). e)؛ تمایز سلول آرکئوسپور و آغاز شکلگیری پوستهی تخمک. یکی از سلولهای بافت خورش بزرگ شده و به سلول آرکئوسپور تمایز مییابد. Ar: آرکئوسپور، i: پوستهی تخمک (1000X). f) اولین تقسیم میوز در سلول مگاگامتوسیت. با شروع تقسیم میوز در سلول مگاگامتوسیت دیاد مشخص میشود. سلول بیرونی که به سمت سفت آینده قرار دارد بزرگتر و سلول درونی کوچکتر است. dy: دیاد (1000X). g) با ادامة میوز در مگاگامتوسیت تتراد مشخص میشود. سلول مادر مگاسپور که بزرگتر است، به سمت سفت قرار دارد. (1000X). h) ایجاد کیسة رویانی یک هستهای. سلول باقیمانده رشد کرده، هستة آن موقعیت مرکزی مییابد و کیسة جنینی یک هستهای ظاهر میشود. همزمان پوسته رشد کرده و دو لبة آن به هم میرسد (1000X). i). اولین تقسیم میتوز هستهای آغاز شده و کیسة رویانی 2 هستهای شکل میگیرد که این دو هسته توسط یک واکوئل در حال رشد از هم جدا میگردند (1000X). j). با انجام دومین تقسیم میتوز در دو قطب کیسة رویانی، کیسة رویانی 4 هستهای ظاهر میشود (1000X). k). کیسة رویانی بالغ، با سومین تقسیم میتوز کیسة رویانی 8 هستهای ظاهر میشود که با جایگزینی هستهها در موقعیتهای ویژه و جداربندی آنها کیسة رویانی بالغ حاصل میگردد. p: سفت (1000X).
از چهار سلول حاصل از تقسیمهای میوزی آرکئوسپور، سه سلول کوچکتر درونی تحلیل رفته و از تحول سلول بزرگتر باقیمانده که به سفت نزدیکتر است، با گسترش سیستم واکوئلی و افزایش حجم هسته و سیتوپلاسم خود به صورت سلولی حجیم درآمده و باقی میماند که هستة حجیم آن موقعیت مرکزی مییابد و آمادگی آن را برای تقسیم نشان میدهد (تصویر 1-h).
سپس هستة سلول مادر کیسة رویانی تقسیمهای میتوزی خود را شروع کرده، ابتدا موجب تشکیل دو هستة هاپلوئید جدید میگردد که از هم جدا میشوند (تصویر 1-i) و با تقسیم دوم میتوزی خود چهار هسته در کیسة رویانی بهوجود آورده (تصویر 1-j) و بعد از تقسیم سوم آنها، کیسة رویانی هشت هستهای بهوجود میآید، بطوریکه در هر قطب کیسة رویانی 4 هسته بهوجود میآید که بزودی جایگزینی ویژهای مییابند، بدینترتیبکه از هر قطب کیسه یکی از هستهها به سمت میانی کیسه مهاجرت کرده و هستة دوتایی میانی را تشکیل میدهند. سه هستة دور از سفت تشکیل متقاطرها (آنتیپودها) و سه هستة نزدیک سفت تشکیل دستگاه تخمزا، شامل تخمزا و دو هسته در طرفین به نام قرینهها (سینرژیدها) را میدهند و اطراف کیسة رویانی نیز از سلولهای خورش پوشیده شده است.
بعد از تشکیل کیسة رویانی و ایجاد سلولهای قابل لقاح یعنی تخمزا که هاپلوئید است و منشأ سلول تخم در آینده است و هستة دوتایی که دیپلوئید است و منشأ آندوسپرم آینده است تکوین تخمک پایان مییابد (تصویر 1-k).
بعد از ورود لولة گرده و وارد شدن یاختههای زایشی به درون کیسة رویانی و انجام لقاح مضاعف، سلول تخمزا، رویان و هستة دوتایی آندوسپرم را تشکیل میدهد که در مراحل بعد به مصرف تغذیة رویان میرسد.
بررسی لامهای میکروسکوپی در گیاهان تحت تیمار نشانههایی از تحلیل رفتن هستهها و تغییر شکل کیسة رویانی را نشان داد (تصویر 2-B). پدیدة پلاسمولیز در سلولهای خورش گیاهان تحت تیمار مشاهده شد، بطوریکه پروتوپلاسم از دیواره جدا شده و به یک طرف رانده شده است (تصویر 2-E). نشانههایی از واکوئوله شدن سلولهای بافت خورش در گروههای تیمار سرب مشاهده شد که با افزایش غلظت سرب شدت و مقدار سلولهای واکوئوله بیشتر میشد (تصویر 2-D). همچنین در گیاهان تحت تیمار آثاری از تحلیل و کوچک ماندن کیسة رویانی (تصویر 2-A) مشاهده شد.
تغییر شکل کسیة رویانی، عدم نفوذ مناسب کیسة رویانی و تخریب دیوارة کیسة رویانی (آندوتلیوم) از دیگر آثار مشاهده شده در اثر تیمار استات سرب در گیاه میباشد (تصاویر 2-A-F). در گیاهان تحت تیمار بینظمی در سلولهای بافت خورش و کیسة رویانی همراه با تجمع مواد سیاه رنگ در سلولهای بافت خورش مشاهده شد (تصویر 2-E). در گروههای تیمار استاتسرب کیسههای رویانی که بشدت واکوئوله شده بودند بهمراه کاهش شدید پروتوپلاسم کیسة رویانی مشاهده شدند (تصویر 2-E).
بحث
فلزات بخش طبیعی اکوسیستمهای خاکی هستند که در خاک، صخرهها، هوا، آب و موجودات زنده وجود دارند (4) و بر رشد، نمو و عملکرد گیاهان اثر میگذارند (2 و 5). در میان فلزات سنگین، سرب مهمترین آلودهکنندة محیط بهویژه در کشورهای صنعتی (22) است (20، 25).
تصویر 2- (A-F) برخی اثرات سرب بر مراحل تکوین تخمک در گیاه بادمجان Solanum melongena: A- پایداری بافت خورش و عدم نفوذ مناسب کیسة رویانی. کیسة رویانی L شکل در گروه تیمار استات سرب 9 میلیمولار مشاهده میشود. ES: کیسه رویانی (1000X). B- کیسة رویانی که از حالت دوکی تغییر شکل داده و در گروه تیمار استات سرب 9 میلیمولار (1000X). C- کوچک ماندن کیسة رویانی در گروه تیمار استات سرب 9 میلیمولار (1000X). D- بروز پدیدة پلاسمولیز و واکوئوله شدن در سلولهای دیوارة تخمدان گروه تیمار با استات سرب 6 میلیمولار (1000X). E- واکوئوله شدن، کاهش شدید پروتوپلاسم، تغییر شکل کیسة رویانی و تخریب دیوارة کیسة رویانی در گروه تیمار استات سرب 3 میلیمولار (1000X). F- تغییر شکل کیسة رویانی در گروه تیمار استات سرب 9 میلیمولار ، شکل کیسة رویانی از حالت دوکی شکل به علت کاهش رشد طولی و رشد عرضی بیشتر به حالت کروی تغییر مییابد. همچنین آثار ازهمگسیختگی بافت خورش و دیوارة تخمک مشاهده میشود. n: خورش (1000X).
در گیاهان اثرات مختلف سمی سرب، از قبیل اثر تنش اکسیداتیو و ممانعت از جذب مواد (13)، جلوگیری از رشد و سنتز کلروفیل (11)، شکستگی کروموزومی و تغییرات ژنی (15) و نقصان سیستم فتوسنتزی و تنفسی (19)، ممانعت از فعالیت آنزیمی برهمزدن تعادل مواد معدنی، قهوهای شدن ریشههای جوان (21)، تغییر در مراحل تکوین تخمک و کیسة رویانی، تغییر شکل تخمک و کاهش تعداد آنها، واکوئوله شدن سلولهای بافت خورش و مرگ سلولی (17) گزارش شده است.
بررسیهای انجام شده بر روی برشهای میکروسکوپی از نمونههای شاهد و تیمار نشان داد که روند کلی تکوین تخمک و دانة گرده در گیاهان تحت تیمار و گیاهان شاهد یکسان است.
بر اساس مشاهدات ما، تخمک در این گیاه واژگون و دارای یک پوسته میباشد. پس از تشکیل پریموردیوم تخمک پوستة یک لایهای تخمک شکل میگیرد که تشکیل آن در دو طرف جسم تخمک بطور معمول حالت قرینه داشته و همزمانی تشکیل آنها مشاهده میشود.
در بین سلولهای خورش، یکی تمایز یافته، رشد بیشتری میکند و آرکئوسپور را بوجود میآورد که با تقسیم میوز خود تتراد خطی را شکل میدهد، یکی از سلولهای نزدیک به سفت بزرگتر بوده و باقی میماند و بقیه تحلیل میروند. سلول باقیمانده طبق الگوی علف هفتبند (Polygonum) کیسة رویانی (تک اسپوری، هشت هستهای، هفت سلولی) را تشکیل میدهد (8).
هنگام نمو ابتدا کیسة رویانی دوهستهای، سپس کیسة رویانی چهارهستهای و در نهایت کیسة رویانی هشت هستهای شکل گرفته و بعد جداربندی صورت میگیرد. بدینصورت که سه سلول نزدیک سفت قرار میگیرند که دوتای کناری قرینهها را تشکیل داده و سلول میانی تخمزا را تشکیل میدهد که در مجموع دستگاه تخم (Egg apparatus) را تشکیل میدهد. دو هستة میانی تشکیل هستة دوتایی را میدهد و سه سلول قطب شالازی (بنی)، متقاطرها را تشکیل میدهند که قبل از لقاح تحلیل میروند و این یافته با یافتههای چهرگانی و صداقت (2009) پیرامون تکوین تخمک در گیاه لپیدیوم (10)، و همچنین با یافتههای حسینی (1385) پیرامون مطالعه مراحل تکوین تخمک در گیاه لوبیا (1) همسو است.
مراحل تکوین تخمک در گیاهان تحت تیمار نیز شبیه به گیاهان شاهد است، تنها برخی بینظمیها و ناهنجاریها در گیاهان تحت تیمار با سرب مشاهده شد.
یکی از ناهنجاریهای مشاهده شده در روند تکوین تخمک، عدم تقارن در تشکیل پوستة تخمک است که در گیاهان تحت تیمار بخصوص گروههای تیمار با استاتسرب، رشد پوستههای تخمک حالت قرینه نداشته و پوستة سمت خارجی تخمک، رشد بیتر و سریعتری دارد که این امر سبب تغییر شکل و خمیدگی در کیسة رویانی نیز میگردد. این یافته با نتایج رضایینژاد (1385) در بررسی اثر فلزات سنگین در گیاه فرفیون (3) و محسنزاده و همکاران (2011) پیرامون اثر فلزات سنگین بر گیاه رزدا (18) همسو میباشد.
بروز پدیدة پلاسمولیز یکی از ناهنجاریهای مشاهده شده در روند تکوین تخمک در سلولهای بافت خورش میباشد که با مشاهدات حسینی (1385)، که اثر ذرات ناشی از دود خروجی خودروهای دیزل را بر گیاه لوبیا آزمایش کرد (1)، و چهرگانی و کاویانپور (2007) که اثر بارانهای اسیدی را بر مراحل تکوین تخمک در گیاه لوبیا بررسی کردند (9) همسو است.
در نمونههای تحت تیمار آثار تحلیل هستهها در کیسة رویانی مشاهده شد، به گونهای که تعداد زیادی از تخمکها دارای کیسههای رویانی فاقد هسته میباشند. در بررسی اثر فلزات سنگین بر گیاهان ورث و فرفیون توسط رضایینژاد (1385) نیز تحلیل هستهها در کیسة رویانی (3) و در پژوهشهای محسنزاده و همکاران (2011) درباره اثر فلزات سنگین بر گیاه رزدا (18)، تخریب دستگاه تخمزا و نیز در پژوهشهای یوسفی و همکاران (2011) پیرامون اثرات فلزات سنگین بر گیاه کنوپودیوم تخریب سریع سلولهای کیسه رویانی (26) گزارش شده است.
در گیاهانی که تحت تیمار با استات سرب قرار داشتند، تعداد زیادی از تخمکها دارای کیسههای رویانی تغییر شکل یافته هستند، به گونهای که نسبت به گروه شاهد که کیسة رویانی شکل دوکی و کشیده دارد، تغییر شکل نشان داده و همزمان با کاهش رشد طولی، رشد عرضی آن افزایش یافته و شکلی بطور تقریبی کروی به خود میگیرد. با افزایش غلظت سرب شدت تغییر شکل بیشتر میشد و بیشترین اثر در گروه تیمار سرب 9 میلیمولار مشاهده میشود که این مورد با یافتههای یوسفی و همکاران (2011) پیرامون تأثیر فلزات سنگین بر گیاه کنوپودیوم (26)، آلبوقبایش و زرینکمر (2012) پیرامون بررسی اثرات سمیت سرب بر گیاه ماتریکاریا (6) همسو میباشد. همچنین در بافت خورش در گروههای تیمار آثار واکوئوله شدن سلولها مشاهده شدکه میتواند بعلت تجمع سرب در واکوئول سلولهای بافت خورش، و نشاندهندة یکی از مکانیسمهای مقاومت گیاه برای مقابله با عوارض سمیت سرب برای گیاه باشد و این مورد نیز با یافتههای حسینی (1385) در مورد گیاه لوبیا (1) همسو میباشد.
یکی دیگر از ناهنجاریهای مشاهده شده در کیسه رویانی، واکوئوله شدن شدید کیسة رویانی بود که این مورد با یافتههای محسنزاده و همکاران (2011) پیرامون اثرات فلزات سنگین بر گیاه رزدا (18) همسو میباشد. کاهش شدید پروتوپلاسم در کیسة رویانی و تخریب آندوتلیوم کیسة رویانی نیز از دیگر ناهنجاریهای مشاهده شده در تخمک میباشد که این مورد نیز با یافتههای یوسفی و همکاران (2011) درباره اثر فلزات سنگین بر گیاه کنوپودیوم (26) همسو است و با افزایش غلظت سرب در گیاهان تحت تیمار، شدت ناهنجاریها نیز افزایش نشان میداد. همچنین آثار ازهمگسیختگی در بین سلولهای بافت خورش در گیاهان تحت تیمار سرب نیز مشاهده شد که این موضوع بعلت میانکنش سرب و کلسیم در غشای سلولی و دیوارة سلولی و جایگزینی سرب بجای کلسیم در غشاء و دیوارة سلول میباشد که سبب ازهمگسیختگی سلولها و تخریب بافت سلولی خورش در تخمک میگردد و این مورد نیز با یافتههای ملایری و همکاران (2005) پیرامون اثرات فلزات سنگین بر گیاه افوربیا همسو میباشد (17).
کوچک ماندن کیسه رویانی و تخریب دیواره بافت خورش در اطراف کیسه رویانی نیز از دیگر یافتههای این پژوهش است که با یافتههای چهرگانی و کاویانپور (2007) پیرامون بررسی اثر بارانهای اسیدی بر گیاه لوبیا (9) همسو است.