Document Type : Research Paper
Authors
1 Bu-Ali Sina University
2 Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran
3 Medical Science University
Abstract
The effect of salicylic acid and methyl jasmonate elicitors on the growth speed and the secondary metabolites production was investigated in G.glabra hairy roots. Considering the importance of the Glycyrrhizin and Isoliquiritigenin secondary metabolites in the roots of this plant, a method of the induction of transformed hairy roots was used in this study. Hairy roots culture was established by Inoculated leaf and stem explants with Agrobacterium rhizogenes of the three-week old seedlings. The presence of T-DNA in the hairy root lines was performed by PCR. The effect of Salicylic acid was caused an increase in the production of Glycyrrhizin. Correlation of test results showed an inverse relationship between dry weight and amount of Glycyrrhizin in the treatment with salicylic acid. The highest amount of Glycyrrhizin and the lowest dry weight was obtained in 500 micro-molar concentration. Treatment of the hairy roots with salicylic acid was caused a significant decrease in Isoliquiritigenin. Also results showed, methyl jasmonate reduces the production of Glycyrrhizin and Isoliquiritigenin.
Keywords
اثر محرکهای اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات بر میزان تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در ریشههای مویین شیرینبیان ((Glycyrrhiza glabra L.
زهرا شیرازی1، خسرو پیری1*، اصغر میرزایی اصل1، طاهره حسنلو2 و طیبه قیاسوند3
1 همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی
2 کرج، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، گروه فیزیولوژی مولکولی
3 همدان، دانشگاه علوم پزشکی، مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی
تاریخ دریافت: 13/11/90 تاریخ پذیرش: 11/4/91
چکیده
در این پژوهش اثر محرکهای اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات روی سرعت رشد و تولید متابولیتهای ثانویه در ریشههای مویین شیرینبیان مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به اهمیت متابولیتهای ثانویه گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین موجود در ریشههای این گیاه، از روش القاء ریشههای مویین تراریخت استفاده شد. کشت ریشههای مویین با تلقیح ریزنمونههای برگ و ساقه از گیاهچههای سه هفتهای با آگروباکتریوم ریزوژنز ایجاد شد. حضور T-DNA در لاینهای ریشه مویین توسط PCR تأیید گردید. اثر محرک اسید سالیسیلیک سبب افزایش تولید گلیسیریزین شد. نتایج آزمون همبستگی، رابطه معکوسی بین وزن خشک و مقدار گلیسیریزین را در نتیجه تیمار با اسید سالیسیلیک نشان داد. بیشترین مقدار گلیسیریزین و کمترین مقدار وزن خشک در غلظت 500 میکرومولار حاصل شد .تیمار ریشههای مویین با اسید سالیسیلیک باعث کاهش معنیدار ایزولیکویریتیجنین شد. همچنین نتایج نشان داد، استفاده از متیل جاسمونات باعث کاهش تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین میشود.
واژههای کلیدی: شیرینبیان، ریشههای مویین، گلیسیریزین، ایزولیکویریتیجنین، محرکها
* نویسنده مسئول، تلفن: 09188130783، پست الکترونیکی khpiri@gmail.com
مقدمه
شیرینبیان ((Glycyrrhiza glabra L. از گیاهان دارویی تیره نخودیان (Fabaceae) میباشد. اندام مورد مصرف آن ریشه و استولون است که دارای ترکیباتی مانند تریترپنساپونینها، چالکونها و 300 نوع فلاونوئید میباشد (2، 3 و11). بسیاری از اثرات درمانی ریشه شیرینبیان بعلت دو گروه از ترکیبات ساپونینی و فلاونوئیدی است (28). استفاده از شیرینبیان در اختلالات کبدی حاد، هپاتیت B و C مزمن، هموفیلی و اختلالات سیستم ایمنی مؤثر میباشد. ترکیب گلیسیریزین در صنایع غذایی و همچنین در درمان اختلالات ریوی، گوارشی، کبدی، صفراوی و زخمهای معده استفاده میشود (13 و 45). از عصاره آن داروهایی مانند (Aspalon)R و Glycyron)R) تولید میشود (9، 19 و 28). ایزولیکویریتیجنین چالکونی ساده و پیش ماده تولید ترکیبات فلاونوئیدی است و دارای اثرات استروژنی، آنتیاکسیدان، ضد حساسیت و ضد التهاب بوده و بهعنوان داروی ضد سرطان و مؤثر در درمان آریتمی میباشد (18). با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیتهای ثانویه کند میباشد، استفاده از روشهای بیوتکنولوژی در شرایط این ویترو (in vitro) این موقعیت را فراهم میسازد که تولید در شرایط کنترل شده و در زمان کوتاهتری انجام گیرد (36 و 44). در برخی از روشهای بیوتکنولوژی مانند کشت سلول و سوسپانسیون سلولی نیز مقدار تولید متابولیتهای ثانویه بدلیل عدم تمایز بافت کم است و برخی از متابولیتها فقط در بافتهایی که تمایز مورفولوژیکی نشان میدهند، تجمع مییابند. ازجمله روشهای کشت تمایز یافته، کشت ریشه میباشد (1 و 8). کشت ریشه بصورت ریشههای نابجا و ریشههای تراریخت انجام میشود (15). سیستم کشت ریشه در گیاهان معمولا سرعت رشد کمتری نشان داده و نیاز به فیتوهورمونی خارجی دارد (4). روش جایگزین برای تولید مواد دارویی با منشأ ریشه، تراریختی گیاهان با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنز و ایجاد سیستم کشت ریشه مویین میباشد (17 و 44). این باکتری از محل زخم وارد گیاه شده و با انتقال قطعهT-DNA پلاسمید Ri به درون ژنوم سلول گیاهی، ریشههای نئوپلاستیک را در گیاه ایجاد میکند (14، 16، 40، 43 و 49). سرعت رشد بالا، انشعابات فراوان، نگهداری آسان در محیط عاری از هورمونهای گیاهی، پایداری ژنتیکی و بیوسنتزی از مزایای کشت ریشههای مویین میباشد (1، 16، 23، 27 و 40). بدلیل مقدار پایین تولید متابولیت با استفاده از تکنولوژی کشت بافت، از روشهای متعددی برای جبران آن استفاده میگردد (23). یکی از روشها استفاده از محرکها (Elicitors) میباشد که معمولا باعث تسریع در تشکیل متابولیتهای ثانویه میشوند (35). مکانیسمهای دفاعی گیاه با شناسایی این سیگنالها (محرک) بوسیله گیرندههای موجود در غشای پلاسمایی و تولید ترکیبات اسید جاسمونیک و اسید سالیسیلیک اندوژن فعال میشود. فعال شدن پاسخ دفاعی سبب سنتز پروتئینهای مرتبط با مکانیسمهای دفاع سلولی و القاء تولید متابولیتهای ثانویه با ایجاد یکسری تغییرات سلولی میگردد (42). در بیشتر موارد اضافهکردن محرکها در غلظتهای کم به سیستمهای سلولی، بیوسنتز ترکیبات خاصی را تحریک و یا بهبود میبخشد (32 و 34). با توجه به نوع گیاه و نوع متابولیت مورد نظر، میتوان از عصارههای استخراج شده از ارگانسیمها و یا از برخی مواد شیمیایی بهعنوان محرک استفاده نمود (12). در این تحقیق از دو محرک متیل جاسمونات و اسید سالیسیلیک بهمنظور بررسی تولید گلیسیریزین، ایزولیکویریتیجنین و سرعت رشد ریشههای مویین شیرین بیان استفاده شد که این دو محرک در القاء و سنتز متابولیتهای ثانویه ریشههای تراریخت بسیاری از گونههای گیاهی مؤثر میباشند.
مواد و روشها
القاء ریشههای مویین: بذرهای گیاه شیرینبیان از شرکت پاکان بذر اصفهان (منطقه ورزنه اصفهان) تهیه گردید و بذرها به مدت 40 دقیقه در اسید سولفوریک غلیظ (98 در صد) قرار گرفتند، سپس چندین بار با آب مقطر استریل آبکشی شده و پس از آن روی محیط MS (31) نیمه جامد کشت شدند. برای تهیه کشت سوسپانسیون باکتری، از آگروباکتریوم ریزوژنز سویه AR15834 که از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج تهیه گردید، استفاده شد. برای تلقیح ریزنمونههای بدست آمده از گیاهچههای یک کلونی از باکتری کشت شده در محیط کشت جامد LB در شرایط استریل برداشته شد (37) و در محیط کشت مایع LB دارای آنتیبیوتیک ریفامپسین کشت گردید. در مرحله بعد محیط LB مایع آلوده شده به باکتری به اتاق رشد با دمای °C 28 منتقل شد و روی شیکر با سرعت 110 دور در دقیقه به مدت 24 ساعت در شرایط تاریکی قرار گرفت تا باکتری رشد کرده و فعال شود. برای تراریختی، جذب نوری در طول موج 600 نانومتر حدود 6/0 تنظیم گردید. ریزنمونههای برگ و ساقه از گیاهچههای سه هفتهای به مدت 20 دقیقه در سوسپانسیون باکتری قرار گرفتند، سپس به محیط کشت MS نیمه جامد منتقل شدند و در اتاق رشد در دمای °C 2±25 و و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. 48 ساعت بعد از همکشتی برای حذف باکتری، ریزنمونهها به محیط نیمه جامد MS دارای 500 میلیگرم در لیتر سفوتاکسیم منتقل گردیدند. برای حذف کامل باکتری در واکشتهای بعدی از غلظتهای پائینتر سفوتاکسیم استفاده گردید. تراریختی ریشههای مویین را میتوان با ردیابی ژنهای موجود روی T-DNA این باکتری که مهمترین آنها ژنهای rolA، rolB وrolC میباشند، تأیید نمود. تأیید تراریختی ریشههای مویین شیرینبیان از طریق تکنیک PCR و پس از اطمینان از حذف باکتری در ریشهها انجام شد. بدین منظور ابتدا استخراج DNA از ریشههای مویین و طبیعی گیاه با استفاده از بافر استخراج CTAB انجام شد. تکثیر ژن rolB با آغازگرهای اختصاصی
Forward primer 5'- ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA -3'
Reverse primer 5'- TTAGGCTTC TTTCATTCGGTTTACTGCAGC -3'
و برای 37 چرخه شامل واسرشت در دمای °C 94 به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای °C58 به مدت 1 دقیقه و گسترش در دمای °C 72 به مدت 1 دقیقه انجام شد. در نهایت بعد از تأیید مولکولی ریشههای مویین یک لاین برای بررسی اثر محرکها انتخاب شد.
اثر محرکها بر سرعت رشد و محتوای تولید متابولیتهای ثانویه: بعد از تهیه محیط کشت MS مایع، در ارلنهای 250 میلی لیتری به مقدار 50 میلی لیتر از محیط توزیع شد و عمل استقرار ریشههای (3-2) سانتیمتری دارای انشعاب (با وزن خشک حدود 5-4 میلیگرم) در محیط مایع انجام گردید. همه نمونهها برای ادامه رشد روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه قرار گرفتند. بعد از پایان دوره 55 روزه، بهمنظور بررسی تأثیر محرکها در رشد ریشهها و تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین، محرکهای متیل جاسمونات در 4 غلظت (200، 100، 50، 0 میکرو مولار) و اسید سالیسیلیک در 4 غلظت (500، 250، 125، 0 میکرو مولار) به محیط کشت اضافه گردید و ریشهها به مدت 72 ساعت در محیط حاوی محرکها قرار گرفتند. برای تعیین سرعت رشد ریشهها بر اساس وزن خشک تولید شده، ریشهها برداشته شده و پس از خشک شدن کامل اندازهگیری شدند. برای اندازهگیری گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین ابتدا ریشهها به روش هایاشی و همکاران (21) عصارهگیری شدند و بررسی کمی به وسیله دستگاه HPLC انجام شد. کلیه نتایج در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و توسط نرمافزار SPSS نسخه 16 آنالیز شد. استاندارد گلیسیریزین از شرکت فلوکا و ایزولیکویریتیجنین از شرکت ایندو فاین تهیه گردید. نمونهها برای اندازهگیری گلیسیریزین به روش هارست و همکاران (24) بعد از حل شدن در آب مقطر به دستگاه HPLCبا مشخصات ستون ( mm9/3×150) RPC18، اندازه منافذ 5 میکرومتر و فاز متحرک شامل اسید استیک، آب و متانول بهترتیب به نسبت 6: 34 :60 انجام شد. برای ایزولیکویریتیجنین به روش لیو و همکاران (29) بعد از حل شدن در متانول 100 درصد به دستگاه با مشخصات ستون ( mm6/4×250RPC18 (، اندازه منافذ 5 میکرومتر و فاز متحرک شامل اسید استیک (یک درصد) و استونیتریل به نسبت 55 : 45 تزریق شد.
شکل1- کشت ریشههای مویین شیرین بیان در محیط مایع
نتایج
القاء ریشههای مویین: گیاه شیرینبیان با تلقیح به سویهAR15834 باکتری آگروباکتریوم ریزوژنز پاسخ مثبت نشان داد و استفاده از این سویه باعث تولید ریشههای مویین در ریزنمونهها شد. ریشههای مویین تولید شده از نظر مورفولوژی خصوصیاتی از قبیل رشد سریع، انشعابات فرعی زیاد در محیط فاقد هورمون را از خود بروز دادند و بهراحتی از ریشههای معمولی قابل تشخیص بودند. ریشههای مویین پس از انتقال به محیط MS مایع سریعتر از نمونههای کشت شده روی محیط نیمه جامد مشابه رشد کردند (شکل 1).
تأیید تراریختی ریشههای مویین: الکتروفورز ژل آگارز محصولات PCR در دستگاه ژل داکیومنت مشاهده شد. برای هر یک از نمونههای ریشه مویین و پلاسمید باکتری (شاهد مثبت) تک باند مشاهده گردید (شکل 2).
بررسی اثر اسید سالیسیلیک بر تولید متابولیتهای ثانویه و وزن خشک ریشههای مویین: تجزیه واریانس دادهها نشان داد که غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک بر تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در سطح احتمال یک درصد تأثیر معنیداری داشت. مقایسه میانگین وزن خشک ریشههای مویین تیمار شده با اسید سالیسیلیک تفاوت معنیداری را در سطح احتمال یک درصد نشان نداد ولی در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنیداری مشاهده شد (جدول 1).
اسید سالیسیلیک باعث افزایش معنیدار در تولید گلیسیریزین شد و بیشترین مقدار گلیسیریزین بر اثر تیمار با 500 میکرومولار اسید سالیسیلیک بدست آمد. در غلظتهای پایینتر اسید سالیسیلیک میزان تولید گلیسیریزین تفاوت معنیداری با شاهد نداشت. تیمار ریشههای مویین با اسید سالیسیلیک باعث کاهش معنیدار ایزولیکویریتیجنین شد. البته کمترین مقدار این ماده در 500 میکرومولار بدست آمد.
جدول1- مقایسه میانگین میزان تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین به روش Duncanدر غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک در سطح احتمال 1 درصد و وزن خشک در سطح احتمال 5 درصد
اسید سالیسیلیک (Mμ) وزن خشک((mg گلیسیریزین(μg/g) ایزولیکویریتیجنین(μg/g)
0 ab 6/280 b 83/27 a 36/90
125 a 337 b 52/10 b 73/23
250 a 55/321 b 95/17 b 42/25
500 b 55/154 a2/97 b 72/17
آزمون وزن خشک در سطح احتمال 1 درصد معنی دار نشد
جدول2- آزمون همبستگی بین وزن خشک، مقدار گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین بر اثر تیمار با اسید سالیسیلیک
گلیسیریزین ایزولیکویریتیجنین وزن خشک
گلیسیریزین 1
ایزولیکویریتیجنین 267/0- 1
وزن خشک ٭٭993/0 - 150/0 1
جدول3- مقایسه میانگین وزن خشک، میزان تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین به روش Duncan در غلظتهای مختلف متیل جاسمونات در سطح احتمال 1 درصد
متیل جاسمونات(Mμ) وزن خشک((mg گلیسیریزین(μg/g) ایزولیکویریتیجنین(μg/g)
0 a6/280 a 83/27 a 36/90
50 a 6/234 ab 77/16 b 16/14
100 a 8/431 a 05/20 b 73/8
200 a 3/323 b 73/2 b 22/10
اگرچه کمترین مقدار ایزولیکویریتیجنین در غلظت 500 میکرومولار اسید سالیسیلیک حاصل شد ولی در این غلظت رنگ محیط بر خلاف تیمار با سایر غلظتها تغییر نمود و بافت ریشه، قهوهای و نرم شد که ممکن است در این غلظت فلاونوئیدها از جمله ایزولیکویریتیجنین وارد محیط کشت شدهباشند (شکل3). برای پاسخ دقیقتر نیاز به بررسی مولکولی همزمان ژنهای مسیر تولید ایزولیکویریتیجنین در این غلظت میباشد.
شکل2- نتایج ژل محصولات PCRریشههای مویین شیرین بیان. چاهک شماره1: مارکر مولکولی (Kb1)، چاهک شماره :7 پلاسمید باکتری، چاهک شماره 9: ریشه طبیعی، چاهک شماره 2: آب مقطر و بقیه چاهکها: ریشه های مویین
کمترین میزان وزن خشک (154 میلیگرم) ریشهها در تیمار500 میکرومولار اسید سالیسیلیک مشاهده شد. نتایج آزمون همبستگی (جدول 2) نیز رابطه معکوس بین وزن خشک و مقدار گلیسیریزین را در نتیجه تیمار با اسید سالیسیلیک نشان داد. در بررسی آزمون همبستگی بین ایزولیکویریتیجنین و گلیسیریزین رابطه معنیداری بر اثر تیمار با اسید سالیسیلیک مشاهده نشد که میتواند نشان دهنده تنظیم متفاوت این ترکیبات در گیاه باشد.
شکل3- تغییر رنگ محیط در غلظت 500 میکرومولار اسید سالیسیلیک (سمت چپ)
بررسی اثر متیل جاسمونات بر تولید متابولیتهای ثانویه و وزن خشک ریشههای مویین: نتایج تجزیه واریانس دادهها در غلظتهای مختلف متیل جاسمونات و سطح احتمال یک درصد بر تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین تأثیر معنیداری داشتند. میانگین وزن خشک ریشهها در غلظتهای مختلف متیل جاسمونات تفاوت معنیداری با نمونههای شاهد نشان نداد، ولی افزایش وزن در غلظت های 100 و 200 میکرومولار مشاهده شد (جدول 3). بیشترین تأثیر برای افزایش وزن خشک با غلظت 100 میکرومولار متیل جاسمونات بدست آمد، هرچند این اختلاف معنیدار نبود. اما نتایج کاهش تولید مواد مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین را با استفاده از متیل جاسمونات نشان داد. در بررسی آزمون همبستگی وزن خشک، تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین بر اثر تیمار با متیل جاسمونات رابطه معنیداری مشاهده نشد.
بحث
نتایج وا و همکاران (46) روی ریشه¬های مویین گیاه Evcommia ulmodes نشان داد که غلظت¬های بالای سالیسیلیک باعث تغییر رنگ و مورفولوژی ریشه¬ها و ترشح ترکیبات به محیط می¬شود، که دلیل آن را جلوگیری از اثرات سمی سالیسیلیک بیان کردند. خلیلی و همکاران (26) با به¬کار بردن محرک اسید سالیسیلیک روی ریشه¬های مویین Silybum marianum، کاهش وزن ریشه¬ها و در مقابل افزایش ماده مؤثر سیلیمارین و فلاونولیگنان¬های تاکسیفلینوسیلیبین و کاهش ایزوسیلیبین را گزارش نمودند، که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. همچنین در مطالعات اثر اسید سالیسیلیک روی ریشه¬های مویین Azadira chtaindica، افزایش تولید ترکیبات مؤثره در این ریشه¬ها مشاهده¬گردید (33). در مطالعات مانث و همکاران (30) روی ریشه¬های Vicia faba کاهش قابل توجه رشد ریشه و ایجاد سمیت بر اثر تیمار با غلظت¬های بالای 5/3 میلی¬مولار اسید سالیسیلیک مشخص گردید.
در بیشتر گزارشها تیمار با متیل جاسمونات باعث القاء و افزایش بیوسنتز ترکیبات ثانویه شده است و در گزارشهای معدودی نیز کاهش تولید متابولیت¬ها را سبب می¬شود. شبانی و همکاران (7) با بکار بردن متیل جاسمونات روی گیاهچه¬های شیرین¬بیان، افزایش ترکیبات فنولیک و فلاونوئیدی کل در ریشه¬های این گیاه را گزارش کردند. همچنین شبانی و همکاران (38) کاهش وزن خشک ریشه و افزایش تولید گلیسیریزین را در نتیجه تیمار گیاهچههای شیرین بیان با متیل جاسمونات گزارش کردند. در تحقیقات تاگوچی و همکاران (41) استفاده از اسید جاسمونیک در غلظت های 100 - 0 میکرو¬مولار، مقدار متابولیت¬های تروپان آلکالوئیدی را کاهش داد. در گزارشهای سلیمانی و همکاران (6) ماده مؤثره آرتمیزینین با بکار بردن محرک اسید جاسمونیک روی ریشه¬های مویین Artemisia annua کاهش یافت.
گیاه شیرینبیان ترکیبات ثانویه مختلفی را تولید میکند و گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین تنها دو گروه از این ترکیبات میباشند و در مسیر تولید تریترپنوئید ساپونین گلیسیریزین در این گیاه، ترکیبات ثانویه دیگری مانند انواع استرولها و تریترپنوئیدها تولید میشوند. در تحقیقات هایاشی و همکاران (22) بکار بردن محرک متیل جاسمونات در کشت سلولی شیرینبیان، میزان سویا ساپونین را افزایش داد، در صورتیکه حتی با محرک نیز گلسیریزین تولید نشد. افزایش تولید گلیسیریزین در شیرینبیان معمولا با کاهش تولید سایر تریترپنوئید ساپونینها (سویا ساپونین یک و دو) و بعکس همراه میباشد (22). در مورد مسیر فلاونوئیدی شیرینبیان، چالکونهای مختلفی تولید میشوند و ایزولیکویریتیجنین یکی از آنها و ایزومر ساختمانی ترکیب لیکویریتیجنین است و این دو ترکیب قابل تبدیل به یکدیگر میباشند (25، 39، و 47). افزایش گلیسیریزین در مقابل کاهش ایزولیکویریتیجنین با بکار بردن اسید سالسیلیک، کاهش ایزولیکویریتیجنین با هر دو محرک، کاهش هر دو متابولیت با متیل جاسمونات و حتی اثرات متفاوت یک محرک در غلظتهای مختلف روی یک ماده مؤثره را میتوان به تفاوت مسیر بیوسنتزی گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین و مسیر سیگنالی متفاوتی که دو محرک در غلظتهای مختلف منجر به فعال شدن آنها میگردند، نسبت داد. با شناخت کامل ژنهای مسیر بیوسنتزی گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین که موضوع تحقیقات مولکولی مختلف است و مطالعه اثر محرکهای اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات میتوان پاسخ دقیقی به چگونگی عمل این محرکها داد. همچنین اثر متنوع محرکها به عوامل مختلفی مانند غلظت محرک، مدت زمان همکشتی سلول با آنها، نوع کشت (کشت سوسپانسیونی، شاخساره یا ریشه)، مرحله رشد سلول و ژنوتیپ گیاه بستگی دارد (48). مرادی و همکاران (10) با بکار بردن اسید سالیسیلیک در کشت گیاهچه و ریشه مویین شابیزک، دلیل تغییرات بیان دو ژن PMT وH6H در مسیر تولید آتروپین و اسکوپولامین را به اثرات متفاوت غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک در بیان ژنهای مذکور در اندامهای مختلف گزارش کردند. در این تحقیق از ریشههای مویین 55 روزه به منظور بررسی اثر دو محرک و مدت زمان همکشتی 72 ساعت با محرکها استفاده شد و تنها ژنوتیپ در دسترس و قابل استفاده از منطقه ورزنه اصفهان بود. در صورتیکه با تغییر هر یک از این شرایط، ممکن است نتایج متفاوتی بدست آید.
در غلظت 500 میکرومولار اسید سالیسیلیک کاهش رشد و افزایش گلیسیریزین و تغییر مورفولوژیکی ریشهها (قهوهای و نرم شدن بافت ریشه) مشاهده شد. با توجه به اینکه در مطالعات هایاشی و همکاران (20) مقدار گلیسیریزین اندازهگیری شده در ریشههای گیاهچه-های دو هفتهای شیرینبیان کم بود ولی با افزایش سن گیاه افزایش یافت. در بررسیهای داورپناه و همکاران (5) ریشههای مسن شیرینبیان دارای بیشترین مقدار گلیسیریزین بودند و زمان مطلوب برداشت ریشهها در پایان فصل پاییز (پایان فصل رشد) گزارش شد. میتوان نتیجه گرفت احتمالا تولید گلیسیریزین در مراحل پایانی رشد ریشه، زمانیکه سلولهای ریشه بهسمت پیری میروند، افزایش مییابد و استفاده از عواملی که منجر به پیری سلولها میشوند برای افزایش تولید گلیسیریزین میتواند مفید باشد.
سپاسگزاری
از گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا و و کلیه کسانی که بهنحوی در انجام این تحقیق همکاری نمودند، صمیمانه تشکر و قدردانی به عمل می آید.