Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Effects of Different Phosphorus Concentrations on Biomass and Growth in Green Microalgae Chlorococcum sp.

Document Type : Research Paper

Authors

27314

Abstract

A large number of factors affects in the rise and fall of biomass and growth in microalgae populations. One of the most important factors is phosphorus (orthophosphate) in microalgae culture medium. In this study, effects of six treatments including; BBM (Bold’s Basal Medium) as control, BBM+soil extract, BBM+5, 10, 15, and 25 mg/L of Na3PO4.12H20 each as one treatment on dry biomass, growth and chlorophyll a of Chlorococcum sp. were investigated in completely randomize design with three replicates under laboratory conditions. Results showed that the maximum algal densities were peaked on 10-day culture with BBM+ 25 (11.04×106 cells/mL) and BBM+soil extract (11.54×106 cells/mL). In addition, the mean highest dry biomasses were obtained 0.792 and 0.773 mg/mL at BBM+soil extract and BBM+25, respectively. Results showed that the highest mean chlorophyll a was at BBM+ 25 (11.39 mg/L) and BBM+soil extract (11.20 mg/L). The mean maximum specific growth rate (SGR) and minimum doubling time (Dt) were obtained from BBM+ soil extract (0.128 /dayand 5.43 days) and BBM+25(0.124 /day and 5.60 days).

Keywords

تأثیر غلظت‌های مختلف فسفر بر زیست‌توده و رشد در جلبک سبز کلروکوکوم sp.)  (Chlorococcum

امیدوار فرهادیان*، سید مجتبی فلاحی و نصرالله محبوبی صوفیانی 

اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات 

تاریخ دریافت: 16/1/91               تاریخ پذیرش: 12/10/91 

چکیده 

فاکتورهای بسیاری بر افزایش و کاهش زیست‌توده در جمعیت جلبک‌های میکروسکوپی تأثیر می‌گذارد. یکی از مهمترین فاکتورها میزان فسفر (ارتوفسفات) محیط کشت جلبک‌های میکروسکوپی است. در این مطالعه تأثیر 6 تیمار شاملBBM (Bold Basal’s Medium) به‌عنوان شاهد، BBM + عصاره خاک (دارای 01/0 درصد وزنی فسفر)، BBM + 5، 10، 15 و 25 میلی‌گرم در لیتر همگی از فسفات سدیم (Na3PO4. 12H2O) هریک به‌عنوان یک تیمار در یک طرح کامل تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار بر زیست‌توده (Biomass)، رشد و میزان کلروفیل a در جلبک سبز کلروکوکوم در شرایط آزمایشگاهی بررسی گردید. نتایج نشان داد که بالاترین میانگین تراکم جلبکی در تیمار 25 BBM+ (106× 04/11سلول در هر میلی لیتر) و در تیمار عصاره خاک + BBM (106× 54/11سلول در هر میلی لیتر) در روز 10 پرورش بود، همچنین بالاترین میانگین زیست‌توده خشک در  BBM+ عصاره خاک و BBM + 25 به‌ترتیب 792/0 و 773/0 میلی‌گرم در میلی­لیتر بدست آمد. نتایج نشان داد که بالاترین میانگین کلروفیل a بدست آمده در تیمار 25 BBM+ (39/11 میلی‌گرم در لیتر) و تیمار BBM + عصاره خاک (20/11 میلی گرم در لیتر) بود. بالاترین میانگین میزان رشد ویژه(SGR)  و کمترین زمان دوبرابر شدن جمعیت (Dt) در تیمار BBM + عصاره خاک (128/0 در روز ، 43/5 روز) و تیمار 25+ BBM  (124/0 در روز، 60/5 روز) بدست آمد.

واژه‌های کلیدی: جلبک سبزChlorococcum ، محیط کشت BBM، فسفر (ارتو فسفات)، میزان رشد ویژه، کلروفیل a، عصاره خاک  

* نویسنده مسئول، تلفن: 3913564-0311 ، پست‌الکترونیکی: omfarhad@cc.iut.ac.ir 

مقدمه


امروزه از جلبکهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی بطور اصلی در غذای دام‌ها و آبزیان پرورشی، و همچنین به‌عنوان کودهای زیستی استفاده می‌شود. جلبک­ها بدلیل منابع غذایی کاملی که برای لاروها در آغاز زندگیشان تولید می­کنند بهترین گزینه برای استفاده در پرورش آبزیان هستند. وجود اسیدهای چرب، کاروتنوییدها، ویتامین­ها و مواد مغذی مورد نیاز لاروها در جلبک­ها، بر اهمیت بکارگیری آنها می­افزاید (4). از سوی دیگر، زیست‌توده جلبکی را می‌توان طی فرایندهای پیرولیز (Pyrolysis) و تخمیر (Fermentation) برای تولید سوخت‌های زیستی و فراورده‌هایی با قابلیت تولید انرژی تجدیدپذیر استفاده نمود (11 و 12). برای مثال تولید بیودیزل در کشور آلمان از حدود 2890 میلیون تن در سال 2007 به  5302 میلیون تن در سال 2008 رسیده است که نشان‌دهنده اهمیت این منابع انرژی در حال حاضر است (11 و 12). بنابراین تولید سوخت‌های زیستی از جلبک‌های میکروسکوپی مقادیر زیادی زیست‌توده جلبکی لازم دارد (11 و 12). تولیدکنندگان (جلبکها و گیاهان) فسفر محلول را جذب کرده و آن را با روشهای مختلف به فسفر آلی تبدیل می‌کنند. فسفر در چربی‌های موجود در غشاء سلولی، بسیاری از کوآنزیم‌ها‌، DNA، RNA و حتی ATP مشارکت دارد. مصرف‌کنندگان فسفر را از طریق خوردن تولیدکنندگان بدست می‌آورند (4). فسفر یازدهمین ماده معدنی است که به فراوانی در پوسته زمین یافت می‌شود و حالت گازی ندارد. فسفر طبیعی معدنی بطور اساسی بصورت فسفات است که به شکل آپاتیت یافت می‌شود. فسفات بعلت سنگین بودن وزن مولکولی هرگز در اتمسفر وجود ندارد و علاوه بر موجودات زنده بصورت محلول در آب وجود دارد. فرایندهای چرخه فسفر در سیستم‌های آبی و خشکی مشابه می‌باشند (4). یکی از اشکال مهم فسفات ارتوفسفات (H2PO4- , HPO42-) است که طی فرایندهای طبیعی حاصل می‌شود، اما بطور عمده از طریق فاضلابهای تصفیه نشده یا ناقص تصفیه شده، از پساب‌ها و یا رواناب‌های کشاورزی و آبزی پروری و استفاده از انواع کودهای فسفردار حاصل می‌شود. اگرچه جلبکها و گیاهان عناصر کلیدی در انتقال فسفات به موجودات زنده هستند اما اهمیت فسفر بطور اصلی به نقش آن در رشد موجودات مربوط است. بطور عمومی فسفر بصورت ارتوفسفات عامل محدودیت رشد موجودات در سیستم‌های آب شیرین است، زیرا تمام آن مصرف شده و رشد تولیدکنندگان متوقف می‌شود (36).

Redfield در سال 1934 نشان داد که تولید بیوماس جلبکهای دریایی نیاز به کربن، نیتروژن و فسفر به نسبت‌های 105 ، 15 و 1 دارد (32) و بعداً توسط Uhlmann and Albrecht در سال 1968 به جلبکهای آب شیرین نیز تعمیم داده شد (37). بطور طبیعی زمانی که میزان فسفر در آب افزایش می‌یابد میزان زیست‌توده جلبکی نیز افزایش می‌یابد. در کمتر از 100 میکروگرم فسفر در لیتر ارتباط بین زیست‌توده و فسفر خطی است، در حالی‌که در بالاتر از این سطح عوامل دیگری از قبیل نور بطور افزایشی بر زیست‌توده تأثیر می‌گذارند (31). بطور متوسط هر 1 میکروگرم فسفر می‌تواند 1 گرم کلروفیل a را تولید نماید (37). از سوی دیگر، با توجه به موقعیت­های اکولوژیکی تولیدکنندگان، نسبت بهینه N:P از1 : 45 تا1 :5/8 بسیار متفاوت می‌باشد. گونه­های تثبیت‌کننده نیتروژن مثل جلبک سبز-آبی اغلب نسبت بالای N:P را دارند. برای مثال شکوفایی (Bloom) جلبک Trichodesmium در نسبت N:P بین 1 :125 تا 1 :42 رخ می­دهد. در حالی‌که در جلبک‌های سبز نسبت N:P مقدار1 :30 و در دیاتوم­ها این مقدار 10:1 و در Dinophyceae 12:1 می‌باشد  (37).

جنس کلروکوکوم Chlorococcum از جلبکهای سبز در آبهای شیرین است که به خانواده Chlorococcaceae و رده  Chlorophyceae تعلق دارد. کلروکوکوم‌ها در هر دو محیط آبی و خاکی زندگی می­کنند و دارای 1 تا چند کلروپلاست­ به همراه پیرونویید منفرد ستاره‌ای شکل از مشخصات سلولی آنهاست. اندازه سلولهای کلروکوکوم بین 8/7 تا 2/15 میکرون است و رنگ آن سبز و به صورت تکی و یا کلنی وجود دارد (5، 7، 23). اسپورهای کلروکوکوم در شرایط نامساعد و تاریکی حیات خود را حفظ می­کنند و زمانی که در شرایط مساعد رشد در آب شیرین قرار می­گیرند قادر به تشکیل هزاران سلول جدید هستند. جلبک‌های کلروکوکوم‌ها قادر به تشکیل کلونی (Colonization) در محیط­های خاکی و مرطوب، بر روی سنگ­ها بوده و بطور پریفیتیک زندگی می‌کنند. وجود چنین ویژگی‌هایی باعث شده تا این گونه امروزه به‌عنوان گونه‌ای مناسب در آبزی پروری بخصوص پرورش جلبک‌های میکروسکوپی در تولید کارتنوئیدها مطرح شود (5، 7، 23).  Zhangو همکاران در سال 1997 (39) بیان کردند که جلبک کلروکوکوم در pH‌های گوناگون رشد و پرورش می‌یابد و گزارش دادند که بیشترین میزان رشد ویژه 01/0 تا 06/0 در ساعت در pH‌های 4 و 8 است، در حالی‌که 032/0 در ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 055/0 در ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد بود. همچنین آنها گزارش کردند با افزایش میزان نیتروژن محیط کشت از 4 تا 8 گرم در لیتر، میزان زیست توده در جلبک کلروکوکوم افزایش می‌یابد و در روز 10 پرورش در حدود 1 گرم در لیتر است. با توجه به اینکه این گونه قادر است pH‌های گوناگون را تحمل نماید کاندید مناسبی برای پرورش در مقایسه با سایر گونه‌ها ازقیبل کلرولا (Chlorella) و یا سندسموس (Scenedesmus) در محیط‌های باز است. این گونه مطالعات بیشتری لازم دارد تا بتوان از قابلیتهای آن در ایران برای مصارف صنعتی و دارویی نیز استفاده نمود.

هدف از انجام این تحقیق تأثیر غلظت‌های مختلف فسفر محیط کشت بر زیست‌توده، میزان رشد و کلروفیل a در جلبک سبز  Chlorococcum می‌باشد که در شرایط آزمایشگاهی و کنترل شده انجام شد. اطلاعات حاصل از این تحقیق را می‌توان در تحقیقات در خصوص حذف فسفر از آبهای با فسفر بالا و یا آبهای با درجه یوتروفیکاسیون بالا برای پالایش آبها و حذف فسفر و همچنین تولید زیست‌توده جلبکی برای مصارف مختلف دارویی و صنعنی استفاده نمود.

مواد و روشها

جمع‌آوری و خالص‌سازی جلبک Chlorococcum : جمع­آوری نمونه­های جلبکی با نمونه‌برداری آب از استخرهای پرورش ماهی انجام گردید. سپس با استفاده از میکرو­پیپت سلول‌های فیتوپلانکتونی را بطور ناخالص جدا نموده و با بهره­گیری از محیط کشت جامد آگار(Agar-Agar)  و تجدید مداوم کشت ذخیره خالص جلبکی تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت جامد به 250 میلی لیتر آب مقطر، 2 گرم آگار جامد به محیط کشت BBM (Bold Basal’s Medium) در موارد بعدی بر اساس روش Nichols در سال 1973 اضافه شد  محیط کشت تهیه شده در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید. آنگاه محلول حاصل را بصورت مایع و تقریبا گرم و در شرایط ضدعفونی و استریل شده در پتری‌دیش­های پلاستیکی (50 میلی‌متری) ریخته و درب آن با پارافیلم بسته شد. پس از آنکه محیط کشت تهیه شده در دمای اتاق به حالت جامد تبدیل گردید، نمونه ناخالص تهیه شده از استخرهای پرورش ماهی را بر روی محیط کشت قرار داده تا کلنی­های جلبکی بعد از 20 روز تشکیل شود. در مرحله بعد با مشاهده کلنی‌های جلبک کروکوکوم با میکروسکوپ و بعد از حصول اطمینان، کار پرورش آن با استفاده از با محیط کشت مایع BBM انجام گردید. جلبک­ها بعد از کشت­های متوالی در لوله آزمایش، ارلن مایرهای 50 میلی لیتری، 100 میلی لیتری و بدست آوردن تراکم نسبتا قابل ملاحظه‌ای از جلبک مورد نظر، کشت در ارلن مایرهای دو لیتری انجام شد.

عصاره خاک و اندازه­گیری کربن، نیتروژن و فسفر: به‌منظور تهیه عصاره خاک، خاک با آب مقطر به نسبت 1 به 4 مخلوط و بعد اتوکلاو و به مدت 7 روز به حالت ثابت گذاشته شد. سپس با استفاده از کاغذ صافی فیلتر گردید و مایع حاصل پس از سه روز نگهداری در استوانه مدرج آزمایشگاهی به حجم 1000 میلی لیتر رسانده شد؛ بخش رویی آن به آرامی و با دقت جداسازی گردید تا در تیمار عصاره خاک استفاده شود.

آنالیزهای لازم خاک مورد استفاده نشان داد که  دارای 52/0 درصد وزنی ماده آلی، 01/0 درصد وزنی نیتروژن و 01/0 درصد وزنی فسفر بود. اندازه‌گیری کربن با استفاده از روش Black و  Wilkie در 1934 بر اساس اکسیداسیون مرطوب مواد آلی انجام شد. از روش Kjeldal در سال 1965 برای اندازه­گیری نیتروژن با استفاده از اسید سولفوریک غلیظ (96 درصد) در دمای 370  درجه سانتیگراد و کمک از کاتالسیت (شامل سولفات مس، پتاسیم ، دی اکسید سلنیوم) برای افزایش نقطه‌جوش تا تبدیل رنگ سبز به صورتی انجام شد. فسفر به روش Olson در سال 1965 با بکارگیری اسید آسکوربیک به‌عنوان ماده احیاء‌کننده بطریق کالریمتری با کمک اسپکتروفتومتر(JENWAY6400)  با قرائت میزان جذب در طول موجهای 880 نانومتر و 720 نانومتر بدست آمد (6).

نحوه انجام آزمایش: کشت جلبک کلروکوکوم در 6 تیمار شامل BBM، BBM + عصاره خاک، BBM + 5 میلی‌گرم در لیتر، BBM + 10 میلی‌گرم در لیتر،  BBM + 15 میلی‌گرم در لیتر و BBM + 25 میلی‌گرم در لیتر تماماً از فسفات سدیم (Na2HPO4. 12H2O) در یک طرح کامل تصادفی با سه تکرار در هر تیمار در ارلن مایرهای 2 لیتری به مدت 14 روز انجام شد. برای تهیه تیمارهای آزمایش ابتدا محلولی با غلظت 100 میلی‌گرم در لیتر فسفات سدیم تهیه گردید و بعد برای تهیه تیمارها با استفاده از آب مقطر دوبار تقطیر شده عمل رقیق سازی انجام گردید. جلبک‌ها در شرایط 24 درجه سانتی­گراد و شدت نور 60 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی کشت شدند. در روز ابتدایی از هر تیمار نمونه­هایی برای اندازه­گیری تعداد سلول جلبک برداشته شد و در پایان آزمایش نیز زیست‌توده خشک، تراکم سلول جلبک و میزان کلروفیل a  اندازه‌گیری شد و براساس تراکم سلول‌های جلبک میزان رشد ویژه (SGR ) (Specific Growth Rate) و زمان  دوبرابر شدن جمعیت  (Dt)   (Doubling Time) مورد محاسبه قرار گرفت.

اندازه‌گیری تراکم جلبک‌ها، وزن خشک، کلروفیل a، میزان رشد و زمان دوبرابر شدن جمعیت : شمارش جلبک‌ها با استفاده از لام هموسیتومتر و با روش پیشنهاد شده توسطMartinez  و Chakroff در سال 1975 بعد از تثبیت نمونه‌ها در محلول لوگل ایدین (مقدار 1/0 میلی لیتر در هر 3 میلی لیتر نمونه) انجام شد. زیست‌توده خشک جلبک‌ها با استفاده از روش پیشنهاد شده توسط Lavens و Sorgeloos در سال 1996 با توزین حجم معینی از جلبک‌های شمارش شده بدست آمد. اندازه‌گیری کلروفیل a نمونه‌ها پس از فیلتراسیون نمونه‌ها و افزودن استون و سانتریفیوژ آنها با قرائت میزان جذب نمونه‌ها بوسیله اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 664، 647 و 630 نانومتر با روش شرح داده شده بوسیله Parsons و همکاران 1984 انجام شد. سپس میزان کلروفیل a با استفاده از رابطه =11.85(OD664) - 1.54(OD647) - 0.08 (OD630) کلروفیلa  (بر حسب میلی‌گرم بر لیتر) محاسبه گردید.

میزان رشد ویژه (SGR) با استفاده از رابطه SGR= (ln N2-lnN1)/∆t محاسبه گردید که در آن N2 تعداد سلولهای جلبک در انتهای آزمایش و N1 تعداد سلولهای جلبک در ابتدای آزمایش و t∆ مدت زمان انجام آزمایش است (26). زمان دوبرابر شدن (Dt) جمعیت جلبک‌ها با استفاده از رابطه  Dt=ln 2 /SGRمحاسبه گردید (26).

تجزیه و تحلیل آماری:  تحلیل آماری داده‌ها با تجزیه واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) پس از حصول اطمینان از مفروضات تجزیه واریانس انجام شد. برای مقایسه میانگین‌ها از آزمون دانکن در سطح معنی‌دار 5% استفاده شد (38). کارهای آماری لازم با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS انجام گردید (33).

نتایج

آنالیز واریانس یک‌طرفه نتایج بدست آمده از تراکم سلول جلبک، زیست‌توده خشک، کلروفیل a، میزان رشد ویژه و زمان دو برابر شدن جمعیت جلبک سبز کلروکوکوم در تیمارهای مختلف آزمایشی اختلاف معنی داری را نشان داد (P<0.05) (جدول1). شکل 1 میانگین تراکم جلبک کلروکوکوم را در تیمارهای مختلف آزمایشی در طی روزهای مختلف پرورش نشان می‌دهد. در این مطالعه افزودن 25 میلی­گرم در لیتر فسفات سدیم به محیط کشت BBM باعث رشد مناسب و سریع جلبک سبز کلروکوکوم در روز 4 پرورش گردید، این روند با شدت تا روز 8  پرورش ادامه پیدا کرد و از روز 8 تا 10 افزایش تراکم جلبک قابل ملاحظه نبود و از روز 10 تا 14 روند کاهشی در تراکم اندازه‌گیری شد. در تیمار BBM + عصاره خاک یک روند افزایشی مداوم در طول پرورش کلروکوکوم دیده شد. بطورکلی نتایج شمارش در روزهای مختلف نشان داد که بالاترین تراکم جمعیت جلبک کلروکوکوم در شرایط آزمایش طراحی شده در روز 12 پرورش است.


جدول1- تجزیه واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) تأثیر تیمارهای آزمایشی بر پارامترهای مختلف اندازه‌گیری شده در پرورش جلبک سبز کلروکوکوم

 

منابع تیمار

درجه

 آزادی

مجموع

 مربعات

میانگین

مربعات

میزان

 F

سطح معنی‌دار

 

تراکم سلول

 

تیمار

5

1013×9/6

1013×378/1

4/473

000/0

خطا

12

1011×5/3

1010×910/2

 

 

کل

17

1013×9/6

 

 

 

 

کلروفیل a

 

تیمار

5

209/150

042/30

4/61247

000/0

خطا

12

006/0

000/0

 

 

کل

17

215/150

 

 

 

 

زیست‌توده خشک

 

تیمار

5

584/0

117/0

3/380

000/0

خطا

12

004/0

000/0

 

 

کل

17

588/0

 

 

 

میزان رشد  ویژه

            ) (SGR 

 

تیمار

5

006/0

001/0

0/448

000/0

خطا

12

000/0

000/0

 

 

کل

17

006/0

 

 

 

 

زمان دوبرابر شدن جمعیت  (Dt)

تیمار

5

045/83

609/16

1/290

000/0

خطا

12

687/0

057/0

 

 

کل

17

732/83

 

 

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 


روزهای پرورش 

شکل 1- میانگین (خطای استاندارد ±) تغییرات تراکم جمعیت کلروکوکوم در تیمارهای آزمایشی در روزهای پرورش (داده ها میانگین سه تکرار در هر تیمار هستند).

الف

 

ب

 

ج 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 2- میانگین (خطای استاندارد ±) الف: تراکم سلول جلبکی، ب: زیست‌توده خشک، ج: میزان کلروفیل a پرورش جلبک کلروکوکوم در تیمارهای آزمایشی (حروف مشخص شده در هر نمودار که دارای حداقل یک حرف مشابه هستند از نظر آماری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد اختلاف معنی‌داری ندارند ) (P>0.05).

 

شکل 3- میانگین (خطای استاندارد ±) الف: میزان رشد ویژه (SGR)، ب: زمان دو برابر شدن جمعیت جلبک کلروکوکوم در تیمارهای آزمایشی (حروف مشخص شده در هر نمودار که دارای حداقل یک حرف مشابه هستند از نظر آماری با آزمون دانکن در سطح 5 درصد اختلاف معنی‌داری ندارند)(P>0.05).

 

 

a

 

d

 

d

 

c

 

b

 

a

 

الف

 

a

 

d

 

a

 

b

 

c

 

ب

 

d

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



مقایسه میانگین‌های تراکم جلبک کلروکوکوم در تیمارهای مختلف نشان داد که بیشترین تراکم سلول جلبکی در تیمار عصاره خاک + BBM (106× 54/11 سلول در میلی لیتر) و بدنبال آن 25+ BBM، 15+ BBM، 10 + BBM، 5+ BBM و BBM (شاهد) بود (شکل2- الف). مقایسه زیست‌توده خشک در تیمارهای مختلف در این آزمایش نشان داد که بالاترین میانگین وزن خشک بدست آمده مربوط به تیمارهای  BBM+ عصاره خاک و تیمار 25+  BBMبه مقدار 792/0 و 773/0 میلی‌گرم در میلی­لیتر بود، در حالی‌که پایین‌ترین میانگین زیست‌توده خشک متعلق به تیمار BBM به میزان 345/0 میلی­گرم در میلی­لیتر بود (شکل2-ب). نتایج اندازه­گیری میزان کلروفیل a نشان داد که بالاترین میانگین کلروفیل بدست آمده مربوط به تیمار BBM + 25 (39/11 میلی‌گرم در لیتر) و تیمار BBM + عصاره خاک (20/11 میلی‌گرم در لیتر) و پایین­ترین میانگین میزان کلروفیل بدست آمده از تیمار شاهد BBM (25/4 میلی­گرم در لیتر) بدست آمد (شکل2-ج). چنین نتایجی بیان می‌کند که افزودن فسفر به محیط کشت BBM باعث افزایش جمعیت جلبک‌ها و بهبود زیست‌توده خشک و کلروفیل a در جمعیت کلروکوکوم می‌گردد. نتایج مقایسه SGR و Dt محاسبه شده از جمعیت در شکل 3 ارائه شده است.  بالاترین میانگین SGR بدست آمده مربوط به تیمار  BBM+ عصاره خاک و تیمار 25+ BBM به‌ترتیب 128/0 و 124/0 در روز بود و پایین‌ترین میانگین SGR مربوط به تیمار BBM 056/0 در روز مشاهده گردید (شکل 3-الف). بطور مشابهی کمترین زمان دوبرابر شدن جمعیت این جلبک در تیمار  BBM+ عصاره خاک و تیمار 25+ BBM به‌ترتیب 44/5 و 60/5  روز محاسبه شد (شکل 3- ب).

بحث و نتیجه‌گیری

عوامل مؤثر در مصرف فسفات در جلبک‌ها عمدتا غلظت فسفات، شدت نور و دمای آب هستند (29). رشد و پرورش جلبک‌های میکروسکوپی باعث مصرف مواد مغذی محیط‌های کشت بخصوص فسفر می‌شود که در ساخت ترکیبات درون سلولی نظیر فسفولیپیدها، نوکلئوتیدها و اسیدهای نوکلئوئیک نقش اساسی دارد (29). 

در این مطالعه نتایج نشان داد که روند افزایش تراکم جلبک کلروکوکوم در تمام تیمارهای آزمایشی استفاده شده تقریبا یکسان بود، اما اضافه نمودن فسفر تا میزان 25 میلی‌گرم در لیتر به محیط کشت BBM موجب افزایش معنی‌داری (P<0.05) در تراکم سلولها، میزان رشد ویژه، زیست‌توده خشک و کلروفیل a در جلبک کلروکوکوم در مقایسه با سایر تیمارها شد. نتایج مشابهی توسطBorowitzka  و Borowitzka در سال 1988 در مورد پرورش کلروکوکوم با استفاده از ارتوفسفات‌های سدیم و پتاسیم ارائه شد. آنها گزارش کردند که دوره رشد سریع (Exponential Phase) این جلبک در غلظت 25 میلی‌گرم در لیتر از فسفات بود که در 9 روز آغازین از پرورش بود و بعد از آن کاهش یافت. در این مطالعه دوره رشد سریع در 8 روز آغازین بود.

 بهبود رشد و زیست‌توده جلبک کلروکوکوم با استفاده از عصاره خاک + BBM نشان داد که این تیمار در مقایسه با سایر تیمارها عملکرد مناسبتری بخصوص در روزهای پایانی آزمایش دارد. علت احتمالی را می‌توان به لحاظ داشتن میزان فسفر بالای خاک (حدود 100 میلی‌گرم در لیتر) و تا حدودی میزان سایر یونها و حتی اشکال متنوع فسفر در آن دانست که باعث افزایش مناسب در کارایی جلبک و بخصوص کلروفیل a می‌شود. استفاده از عصاره خاک توسط McNuff در سال 2007 بیان شد. او استفاده از 20 میلی لیتر عصاره خاک و 5 میلی لیتر از محلول Chalkley’s Medium (شامل 12/0 گرم کلرید کلسیم، 08/0 گرم کلرید پتاسیم و 2 گرم کلرید سدیم در یک لیتر آب مقطر) را برای پرورش جلبک کلروکوکوم توصیه نمود.

De Pauw و  Pruder در سال 1986 گزارش کردند که ترکیبات شیمیایی محیط­کشت جلبک­ها بخصوص ارتوفسفات نه تنها بر  زیست‌توده و رشدجلبکی بلکه بر اندازه و شکل سلولها، محتوای رنگدانه‌ها و ترکیبات بیوشیمیایی آنها نیز مؤثر است. به عبارت دیگر، محدودیت­های غذایی در جلبک­ها به‌خصوص منابع فسفات باعث کاهش رشد در زئوپلانکتون‌های تغذیه‌کننده از این جلبک­ها می­گردد. در این خصوص، Sundbom و Vrede در سال 1997 بیان کردند که اضافه کردن 58/0 میکرومولار فسفر در روز به محیط کشت باعث می‌شود تا رشد سلولها و محتوای اسیدهای چرب ضروری جلبک سبز Scenedesmus به طور معنی­داری در مقایسه با اضافه نمودن 40/0 و 24/0 میکرومولار فسفر در روز افزایش یابد. کم و همکاران در سال 1391 از ضایعات کارخانه پودر ماهی برای تولید جلبک استفاده نمودند و با داشتن میزان 1/12 میلی‌گرم در لیتر فسفات تغییر قابل ملاحظه‌ای در رشد جلبک کلرلا مشاهده نگردید (2).

در این تحقیق افزایش میزان فسفر محیط کشت بر میزان زیست‌توده و محتوای کلروفیل a در جلبک کلروکوکوم تأثیر افزایشی معنی‌داری داشت (جدول 1، شکل 2) و می‌توان بیان کرد که غلظت فسفر در آب­ها مهمترین معیار تنظیم‌کننده زیست‌توده فیتوپلانکتونها می­باشد، و محتوای کلروفیل a در جلبک­های مختلف بشدت تحت تأثیر میزان فسفر موجود در محیط می­باشد. مکانیسم جذب فسفر برای تشکیل زیست‌توده و تولید کلروفیل از طریق جذب لوکسری (Luxury uptake) است (24 و30). فسفر در درون سلولهای جلبکی طی فرایندهای متعدد مصرف می‌شود. دو مسیر اصلی، تولید پلی‌فسفات‌ها و تولید موادی مانند فسفولیپیدها یا RNA هستند که برای متابولیسم لازم هستند. این بدان معنی است که مقدار فسفر در دسترس برای تولید پلی‌فسفات‌ها عمدتا به میزان جذب فسفات از طریق دیواره سلولی جلبکها بستگی دارد که این میزان در مراحل بعدی میزان فسفر را برای رشد و تکتیر جلبکها فراهم می‌نماید. انتقال فسفر در جلبکها توسط Miyachi و همکاران در سال 1964 بیان شده است (24) و توسطPowell  در سال 2009 مورد بررسی دقیق‌تر قرار گرفت (30).

با توجه به اینکه منابع کربن و نیتروژن در محیط پرورش در افزایش میزان جذب سایر عناصر ضروری مهم است، بنابراین افزایش کلروفیل a ارتباط مستقیم به استفاده از منابع نیتروژن (مثلا نیترات و آمونیوم) و فسفات‌ها دارد (18)، ازاین‌رو کاهش عملکرد جلبک کلروکوکوم در روزهای پایانی آزمایش (روزهای 12 تا 14) در مقایسه با روزهای قبل را می‌توان به کاهش ترکیبات نیتروژن‌دار محیط کشت‌های مورد آزمایش نسبت داد (13 و 20). Hessen در سال 1992 گزارش کرد که عدم تناسب بین نیتروژن به فسفر موجب کاهش رشد هم در جلبک‌ها و هم در موجودات مصرف‌کننده می‌شود. Buapet و همکاران در سال 2008 بیان نمودند که در گونه Ulva reticulate اضافه نمودن فسفر به تنهایی به محیط کشت جلبک بدون اضافه کردن منبع نیتروژن هیچگونه تأثیری در زیست‌توده و مقدار کلروفیل a نداشت که این مسئله مبین آن است که نسبت N:P بسیار مهم است.

در این تحقیق استنباط ما این است که تفاوت در میزان ترکیبات نیتروژن‌دار در تیمارهای مختلف در روزهای پایانی آزمایش وجود دارد. به‌طوری‌که چنین تأثیری در  تیمار عصاره خاک +BBM به لحاظ بالا بودن نیتروژن خاک تأثیری بر  تراکم سلولی جلبک‌ها در روزهای پایانی آزمایش نداشت، اما در سایر تیمارها موجب کاهش تراکم جلبک کلروکوکوم گردید. از سوی دیگر میزان مصرف فسفر در جلبک‌ها تابع سایر عوامل ازجمله نور و دمای آب نیز می‌باشد (29). به‌عنوان مثال  Hessen و همکاران در سال  2002 بیان نمودند که نسبت فسفر به کربن در جلبک‌های سبز Selenastrum با کاهش شدت نور افزایش می‌یابد و یا بطور مشابهیMartinez  و همکاران در سال 1999 گزارش کردند که متابولیسم فسفر با کاهش نور در جلبکScenedesmus obliquus افزایش نشان می‌دهد. علت چنین شرایطی را می‌توان به مکانیسم‌های جذب فسفر یعنی تجمع (accumulation) و مصرف (consumption) در سلولهای جلبکی نسبت داد. در شدت نورهای بالا (برای مثال 150 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) جلبک‌ها به سرعت پلی‌فسفات‌ها را مصرف می‌کنند، به‌طوری‌که فسفر محلول تجمع کمی در سلولهای جلبکی می‌نماید؛ از سوی دیگر، مصرف آنها در شرایط نوری کم احتمالا بواسطه سرعت رشد پایین به تأخیر می‌افتد و پس از مدت 5 تا 7 روز مقدار ذخیره فسفر در شرایط نوری کم افزایش می‌یابد و باعث افزایش متابولیسم فسفر می‌گردد (30).  در این مطالعه تأثیر نور بطور حدواسط و شدت نسبتا ثابت در نظر گرفته شد و پرورش در دوره نوری 12 ساعت نور با شدت ثابت انجام شد.

معمولا میزان مصرف فسفات از محیط کشت می‌تواند تابع دمای آب باشد. به‌طوری‌که Picot و همکاران در سال 1992 گزارش کردند که این میزان بین 15 درصد در دوره سرد (نظیر زمستان) و 30 درصد در دوره گرم (نظیرتابستان) تغییر می‌کند. دمای آب هم بر واکنش‌های بیولوژیکی و هم بر ترکیب سلولی تأثیر می‌گذارد، به‌طوری‌که بر میزان فسفات در جلبک‌ها تأثیر مثبت دارد (28).

Powell و همکاران در سال 2008 بیان کردند که غلظت فسفات بر درصد فسفر جلبک‌ها تأثیر معنی‌داری ندارد، در حالی‌که Aitchison و Butt در سال 1973 دریافتند که غلظت فسفات بطور قابل ملاحظه‌ای بر مقدار فسفات زیست‌توده جلبکی تأثیرگذار است. با توجه به اینکه Powell و همکاران در سال 2008 غلظت فسفات را 5 و 15 میلی‌گرم در لیتر در نظر گرفتند،  احتمالا آنها نتوانستند تأثیر مستقیم غلظت فسفات را بر زیست‌توده بدست آورند. علاوه بر این، سعادت نیا و همکاران در سال 1389 بیان کردند که جلبک‌های سبز-آبی در مزارع برنج نقش مهمی را در رشد گیاه برنج و تا حدودی بهبود شرایط کمی و کیفی خاک دارند (1).

یافته‌های این تحقیق نشان داد که جلبک کلروکوکوم می‌تواند در محیط کشت‌های با فسفر کم نظیر BBM در مقایسه با محیط‌های دارای حدود 100 میلی‌گرم در لیتر (تیمار BBM + عصاره خاک) یا 50 میلی‌گرم در لیتر (تیمار BBM+ 25 میلی‌گرم در لیتر) در مدت زمان کوتاه 10-8 روز پرورش یابد و رشد و زیست‌توده مناسبی تولید نماید. Gonzales و همکاران در سال 1997 مصرف 55 درصد از فسفر را از پسابهای صنعتی و کشاورزی با غلظت کل فسفر 111 میلی‌گرم در لیتر با پرورش Chlorella vulgaris و Scenedesmus dimorphus بدست آوردند. بطور کلی میزان مصرف فسفر در گونه‌های مختلف متفاوت است. به‌عنوان مثال 7/10 میلی‌گرم فسفر در روز در گونه Chlorella pyrenoidosa (33)، 83/20 میلی‌گرم در لیتر در روز در گونه Scenedesmus intermedius و 15/10 میلی‌گرم در روز برای گونه Nannochloris sp.  (17) می‌توان ذکر نمود. Lau و همکاران در سال 1997 (18) بیان کردند که اگر غلظت‌های فسفات بین 7/7 و 149 میلی‌گرم در لیتر از محیط پرورش باشد میزان کلروفیل a از 20/0 تا 52/0 میلی‌گرم در روز افزایش می‌یابد. بطور کلی استنباط و گمان ما این است که جلبک کلروکوکوم برای جذب فسفر از منابع غنی از فسفر بسیار مناسب است که به مطالعه و بررسی بیشتری نیاز دارد.

سپاسگزاری

از معاون محترم پژوهشی دانشکده منابع طبیعی دانشگاه صنعتی اصفهان و معاون محترم پژوهشی دانشگاه صنعتی اصفهان به دلیل ایجاد شرایط مناسب در انجام این تحقیق کمال تشکر و سپاسگزاری را داریم.

  1.  سعادت نیا، ه.، ریاحی، ح.، فخاری، ج. 1389.  استفاده از جلبک های  سبز-آبی جدا شده از یک شالیزار در استان گیلان بعنوان کود زیستی در گیاه برنج (Oryza sativa) . مجله زیست شناسی ایران جلد23 ، شماره 6، 824-816.   
  2.  کم، ص. ب ، عابدیان کناری، ع. و یونسی، ح. ا .1391 . تولید پروتئین تکیاخته از پساب کارخانجات تولید پودرماهی با استفاده از کشت مخمر جلبک  Chlorella sp. ، باکتری   Pseudomonas aeruginosa و مخمر  Saccharomyces cerevisiae . مجله زیست شناسی ایران جلد 25 شماره 2، 171-158.
    1. Aitchison, P.A. and Butt, V.S. 1973. The relation between the synthesis of inorganic polyphosphate and phosphate uptake by Chlorella vulgaris. Journal of Experimental Botany, 24: 497-510.
    2. Barsanti, L. and Gualtieri, P. 2006. Algae: Anatomy, Biochemistry, and Biotechnology, CRC Press, Taylor and Francis Group.320 pp.
    3. Becker, E.W. 1994. Microalgae: Biotechnology and microbiology. Cambridge University Press, Cambridge, Great Britain. 293 pp.
    4. Black, C.A. 1982. Method of Soil Analysis, Vol.2, Chemical and Microbiological Properties, American Society. 211 pp.
    5. Bold, H.C. and Parker, B.C. 1962. Some supplementary attributes in the classification of Chlorococcum species. Archives Mikrobiology, 42: 267-88.
    6. Borowitzka, M.A. and Borowitzka, L.J. 1988. Dunaliella. In: Microalgal Biotechnology, M.A. Borowitzka and L.J. Borowitzka (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp. 27-58.
    7. Buapet, P., Hiranpan, R., Ritchie, R.J. and Prathep, A. 2008. Effect of nutrient inputs on growth, chlorophyll, and tissue nutrient concentration of Ulva reticulata from a tropical habitat. Science Asia, 34: 245–252.

 

10. De Pauw, N. and Pruder, G. 1986. Use and production of microalgae as food in aquaculture: practice, problems and research needs. Realism in Aquaculture: Achievements, Constraints, Perspectives. Aquaculture, 27:77-106.

11. Demirbas, A. and Demirbas, M.F. 2010. Algae energy: Algae as a new source of biodiesel. Springer, 199 pp.

12. Demirbas, A. 2006. Biogas potential of manure and straw mixtures. Energy Sources A, 28:71–78.

13. Dhargalkar, V.K. 2004. Effect of different temperature regimes on the chlorophyll a concentration in four species of Antarctic macroalgae. Seaweed Research Utilization, 26: 237 - 243.

  1. 14.   Gonzales, L.E., Canizares, R.O. and Baena, S. 1997. Efficiency of ammonia and phosphorus removal from a Colombian agro industrial wastewater by the microalgae Chlorealla vulgaris and Scenedesmus dimorphus. Bioresource Technology, 60: 259–262.
  2. 15.   Hessen, D.O. 1992. Nutrient element limitation of zooplankton production. American Naturalist, 140: 799-814.
  3. 16.   Hessen, D.O. Faerovig, P.J. and Andersen, T. 2002. Light, nutrients, and P:C ratios in algae: Grazer performance related to food quality and quantity. Ecology, 83: 1886–1898.
  4. 17.   Jimenez-Perez, M.V., Sanches-Castillo, P., Romera, O., Fernandez-Moreno, D. and Perez-Martinez, C. 2004. Growth and nutrient removal in free and immobilized planktonic green algae isolated from pig manure. Enzyme Microbial Technology, 34: 392–398.
  5. 18.   Lau, P.S., Tom, N.F.Y. and Wong, Y.S. 1997. Wastewater nutrients (N and P) removal by carrageenan and alginate immobilized Chlorella vulgaris. Environmental Technology, 18: 945–51.
  6. 19.   Lavens, P. and Sorgeloos, P. 1996. Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical, 295 pp.

20. Li, Y., Horsman, M., Wang, B., Wu, N. and Christopher, Q.L. 2008. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans. Applied Microbiology and Biotechnology, 81:629–636.

21. Martines, M.P. and Chakroff, J.B.P. 1975. Direct phytoplankton counting technique using the hemacytometer. Philippine Agricultural Scientist, 59:43-50.

22. Martinez, M. E., Jimenez, J. M., and El Yousfi, F. 1999. Photoautrophic consumption of phosphorus by Scenedesmus obliquus in a continuous culture. Influence of light intensity. Process Biochemistry, 34: 811–818.

23. McNuff, B. 2007. Hypsibius dujardini collection notes and culture protocol. British National Grid, Ref. SD741078.

24. Miyachi, S., Kanai, R., Mihara, S., Miyachi, S.  and Aoki, S. 1964. Metabolic role of inorganic polyphosphates in Chlorella cells. Biochimica et Biophysica Acta, 93: 625-634.

25. Nichols, H.W. 1973. Growth media–freshwater. In: Stein, J.R. (Ed.), Handbook of Phycological Methods – Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge University Press, Cambridge, p. 7–24.

26. Omori, M. and Ikeda, T. 1984. Methods in marine zooplankton ecology. John Wiley and Sons Inc, New York, 332 pp.

27. Parsons, T.R., Maita, Y. and Lalli, C.M. 1984. A manual of chemical and biological methods for seawater analysis. Pergamon Press, Oxford.

28. Picot, B., Bahlaoui, A., Moersidik, B., Baleux, B., and Bontoux, J. 1992. Comparison of the purifying efficiency of high rate alga pond with stabilization pond. Water Science Technology, 25: 197-206.

29. Powell, N., Shilton, A.N., Pratt, S. and Chisti, Y. 2008. Factors influencing luxury uptake of phosphorus by microalgae in waste stabilization ponds. Environmental Science and Technology, 42: 5958-5962.

30. Powell, N. 2009. Biological phosphorous removal by microalgae in waste stabilization ponds. Ph. D. thesis, Massey University, Palmerston North, New Zealand, 108 pp.

31. Prairie, Y.T., Duarte, C. M. and Kalff, J. 1989. Unifying nutrient chlorophyll relationship in lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science, 46:1176-1182.

32. Redfield, A.C. 1934. On the proportions of organic derivatives in sea water and their relationship to the composition of plankton. In: James Johnston Memorial Volume, Liverpool University Press, Liverpool, pp. 176-192.

33. SPSS, 2002. Statistical Package of Social Science, Version, 11.5. Chicago, IL, USA.

34. Sundbom, M. and Vrede, T. 1997. Effects of fatty acid and phosphorus content of food on the growth, survival and reproduction of Daphnia. Freshwater Biology, 38:665-674.

35. Tam, N.F.Y. and Wong, Y.S., 1994. Feasibility of using Chlorella pyrenoidosa in the removal of inorganic nutrients from primary settled sewage. Algal Biotechnology in the Adia-Pacific region. Phang (Ed.), University of Malaya, pp. 291–299.

36. Tunney, H., Carton, O.T., Brookes, P.C., and Johnston, A. E. 1997. Phosphorus loss from soil to water. CAB International, 467 pp.

37. Uhlmann, D. and Albrecht, E. 1968. Biogeochemische Faktoren der Eutrophier-ung von Trinkwassen-Talsperren. Limnologica (Berlin), 6: 225-245.

38.  Zar, J.H. 1984. Bioststistical analysis, 2nd edition. Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, New York, USA, 718 p.

39.  Zhang, D.H., Lee, Y.K. and Phang, S.M. 1997. Composition and accumulation of secondary carotenoids in Chlorococcum sp. Journal of Applied Phycology, 9:147–155.

Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 27, Issue 3 - Serial Number 3
November 2014
Pages 478-489
  • Receive Date: 04 April 2012
  • Revise Date: 29 December 2012
  • Accept Date: 01 January 2013