Micropropagation of Haworthia attenuatae using Kinetin and Benzylaminopurine Naphthalene acetic acid in combination with

Document Type : Research Paper

Authors
Nafiseh Najarian Kermani 1
Mahdieh Parsaeian 2
Ziba Ghasimi Hagh 2
1 Department of Agronomy and Plant Breeding, Shahrood University of Technology, Shahrood, I.R. of Iran.
2 Assistant Prof, Shahrood University of Technology.
10.22034/jpr.2022.2191
Abstract
The usual method of Haworthia attenuatae propagation hasn’t commercial returns due to the low number of offsets and rooting of leaf cuttings. In the present study, micro-propagation of this plant was evaluated using leaf explants and BAP, and KIN (0.5, 1 and 2 mg / l) in combination with NAA (0, 0.01, 0.1 and 0.5 mg/l). The results showed that the maximum number of shoots was regenerated using BAP in combination with NAA from the basal leaf segment explant. The maximum number of leaves (3.55) and the longest leaves (0.61 cm) were obtained on medium containing 2 mg/l BAP and 0.01 mg/l NAA using the basal leaf segment explant and the widest Leaves (0.44 to 0.48 cm) was observed on the medium containing 2 mg/l BAP without or with low concentration of NAA. The results of KIN application showed that the longest leaves (0.56 cm) with the maximum numbers (2.45) were obtained on medium containing 2 mg/l KIN and 0.01 mg/l NAA from the entire leaf explant. More over, the widest leaves (0.87 cm) was produced on medium supplemented with 2 mg/l KIN. The findings of rooting on MS and½ MS media supplemented with 0, 0.5, 1, 1.5 mg/l NAA showed that the highest number (4.33) and the longest roots (2.16 cm) were produced on ½MS medium containing 0.5 mg/l NAA. 90% of rooted plantlets were adapted to the greenhouse environment. Totally, the accurate optimization of this protocol can be applied to commercial micro-propagation of H. Attenuatae from leaf explants.

Keywords

Subjects

ریزازدیادی گیاه Haworthia attenuatae با استفاده از کینتین و بنزیل‌آمینوپورین بهمراه نفتالین‌استیک‌اسید

نفیسه نجاریان کرمانی1 ، مهدیه پارسائیان1* و زیبا قسیمی حق2

1 ایران، شاهرود، دانشگاه صنعتی شاهرود، دانشکده­ کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

2 ایران، شاهرود، دانشگاه صنعتی شاهرود، دانشکده­ کشاورزی، گروه باغبانی و گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 14/10/1400          تاریخ پذیرش: 26/01/1401

چکیده

روش معمول ازدیاد  Haworthia attenuatae (Haw.) Rowelyبدلیل کم بودن تعداد پاجوش­ها و نرخ ریشه‌زایی پایین قلمه برگی، بازده تجاری خوبی ندارد. در پژوهش حاضر ریزازدیادی این گیاه با استفاده از ریزنمونه­­‌های برگی و کاربرد سیتوکینین‌هایBAP  وKIN (5/0، 1و 2 میلی­گرم در لیتر) در ترکیب با اکسین NAA  (0، 01/0، 1/0 و 5/0 میلی­گرم در لیتر) در محیط MS بررسی گردید. نتایج نشان داد که کاربرد BAP و NAA شاخساره­های باززا شده­ی بیشتری را از ریز نمونه­ی تحتانی برگ تولید نمود. حداکثر تعداد برگ (55/3 عدد) و طویل­ترین برگ­ها (61/0سانتی­متر) در تیمار2 میلی­گرم در لیتر BAP و 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA در باززایی از ریزنمونه­ی تحتانی برگ حاصل شد. عریض‌ترین برگ­­ها (44/0 تا 48/0 سانتی­متر) با مصرف 2 میلی­گرم در لیتر BAP بهمراه عدم مصرف و سطوح 01/0 و 1/0 مصرف NAA تولید شدند. نتایج استفاده از KIN نشان داد که با تیمار 2 میلی­گرم در لیتر KIN  و 01/0  میلی­گرم در لیتر NAA طویل‌ترین برگ­ها (56/0سانتی‌متر) به تعداد بالا (45/2 عدد)، از ریزنمونه­ی برگ­کامل بدست آمد. همچنین عریض‌ترین (87/0 سانتی­متر) برگ­ها با اعمال2 میلی­گرم در لیتر KIN بدست آمدند.  نتایج ریشه­زایی شاخساره­های باززا شده در محیط­های MS و MS½ با غلظت­های 0، 5/0 ، 1 ، 5/1 میلی­گرم در لیتر NAA نشان داد که بیشترین تعداد (33/4 عدد) و طویل­ترین ریشه­ها (16/2 سانتی­متر) در محیط کشت MS½  با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA تولید گردیدند. 90 درصد شاخساره‌های ریشه‌دار با محیط گلخانه سازگار شدند. بنابراین، بهینه سازی دقیق این پروتکل در ریزازدیادی تجاری  H. attenuatae با استفاده از ریزنمونه­های برگی کاربردی خواهد بود.

واژه های کلیدی: ریزازدیادی، Haworthia attenuatae، تنظیم کننده­های رشد گیاهی، ریزنمونه برگی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02332544021  پست الکترونیکی: mahparsa.cb@shahroodut.ac.ir

مقدمه

 

جنس هاورتیا از ساکولنت‌های تک لپه­ای و کوچک جثه­ی خانواده­ی Asphodelaceae می­باشد که بلحاظ رشدی گیاهانی چندساله، گوشتی و گلدار هستند. این گیاهان نسبت به دیگر گیاهان گوشتی به نور متوسط متحمل‌تر هستند و از این رو با توسعه آپارتمان نشینی در گروه گیاهان محبوب در کل دنیا، جهت استفاده در باغ­های مینیاتوری، مراکز اداری و بالکن‌ها قرار گرفته اند (9). همچنین در مناطق با زمستان ملایم درترکیب با سنگریزه ها در طراحی فضای سبز کشت می­گردند. هاورتیاها تنوع مورفولوژیکی زیادی در مناطق بومی خود از جمله آفریقای جنوبی، سوازیلند، موزامبیک و نامیبیا دارند که این امر جلب توجه گیاه­شناسان و گردآورندگان ساکولنت­ها را در پی داشته است (9 و 10). با توسعه پرورش گونه‌های مختلف هاورتیا، امروزه این گیاهان در بازارهای گل جهانی داد و ستد می‌شوند (10 و 20). در بین گونه‌های مختلف هاورتیا، H. attenuatae بدلیل دارا بودن خطوط سفید رنگ و راه راه در برگ­های ضخیم، نوک تیز، سبز رنگ و سفت خود به هاورتیای گورخری نیز معروف است. این گونه بدلیل داشتن زیبایی خاص، هم اکنون در کشورمان ایران هم پای بازارهای گل جهانی ارزش اقتصادی خوبی پیدا کرده­ است (9). هاورتیاها به هر دو روش جنسی و غیرجنسی امکان ازدیاد دارند با این­حال، ازدیاد جنسی آنها بدلیل خودناسازگاری، تولید کم بذر، کند رشد بودن گیاهان بذری و وجود تنوع ژنتیکی به­ندرت توسط تولیدکنندگان مورد استفاده قرار می­گیرد (24). علاوه بر این، ازدیاد غیرجنسی این گیاهان نیز در مقیاس تجاری از طریق اندام‌های غیرجنسی نظیر پاجوش و قلمه برگی با محدودیت مواجه است. چرا که اولاً تهیه نمونه­های مادری سالم و کافی دشوار است، ثانیا درصد ریشه‌زایی قلمه­های برگی پایین است (9 و 24). این در حالی است که ریزازدیادی با حذف محدودیت­های فصلی و محیطی می‌تواند بعنوان یک راهکار مناسب جهت ازدیاد در گونه­های هاورتیا جایگزین گردد (18 و 19). با این وجود، موفقیت این روش متاثر از برخی عوامل بیرونی نظیر نوع محیط کشت پایه و ترکیبات معدنی و آلی اضافه شده به آن، تنظیم کننده‌های رشدی گیاه، دما، کمیت (شدت) ،کیفیت و مدت زمان تابش نور و نیز عوامل درونی شامل نوع ریزنمونه، موقعیت ریزنمونه در گیاه مادری و اثر متقابل این عوامل است. تا کنون، کالوس‌زایی و باززایی غیرمستقیم گونه­های مختلف هاورتیا  با استفاده از هورمون‌های اکسینی NAA, 2,4-D و IAA و سیتوکینینی BAP, TDZ و KIN در محیط­های پایه White و MS گزارش شده است (10، 17 و 20). علاوه براین، باززایی مستقیم آنها در محیط پایه MS   با استفاده از ریزنمونه­ی برگی و ترکیب هورمون‌های اکسینی و سیتوکینین­های BAP و KIN درگونه‌های H. retusa, H. emelyae, H. mirabilis و H. mutica  (28) و نیز با استفاده از ریزنمونه­ی گل‌آذین و هورمون‌های BAP و Zeatin در گونه‌های H. attenuate, H. coorctata و H. limifolia  (27) و همچنین با کاربرد ریزنمونه­های برگی و ساقه و ترکیب هورمون‌های BAP و IAA در گونه­ی H. cymbioformis گزارش گردیده است (21).

 نظر به عدم وجود منابع تحقیقاتی کافی در ریزازدیادی تجاری گونه­ی H. attenuatae جهت تامین تقاضای رو به رشد این ساکولنت آپارتمانی و نیز محدودیت­های ازدیاد طبیعی این گیاه، راهکار کشت بافت در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت. در این راهکار، باززایی مستقیم این گیاه در محیط پایه MS تغییر یافته (استفاده از آهن Fe-EDDHA بجای Fe-EDTA) با استفاده از دو نوع ریزنمونه­ی برگی و تیمار هورمون­هایBAP و KIN بهمراه اکسین NAA با هدف بهینه‌سازی تکثیر انبوه غیرجنسی این گونه در شرایط درون شیشه­ای مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

بمنظور ریزازدیادی H. attenuatae ابتدا گیاهان سالم از گلخانه­ای تجاری در شهرستان شاهرود تهیه گردیده و به آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه صنعتی شاهرود منتقل شدند. برای حذف آلودگی­های سطحی، نخست ریزنمونه‌های برگی بمدت 30 دقیقه در زیر آب جاری قرار داده شدند و سپس در زیر هود ایرفلولامینار، 1 دقیقه در الکل 70 درصد غوطه‌ور شدند. بعد از دوبار شستشو با آب مقطر استریل، ریزنمونه‌ها در هیپوکلریت سدیم 20 درصد بمدت 10 دقیقه غوطه‌ورگردیدند. در مرحله پایانی سه بار با آب مقطر استریل آبکشی شده و نهایتا ریزنمونه‌های استریل شده در زیر هود، روی کاغذ صافی استریل گذاشته شدند تا سطح آن‌ها خشک شود.

محیط پایه مورد استفاده در این مطالعه، موراشیگ و اسکوک (MS) ( 23) تغییر یافته بود به این ترتیب که در فرمول آن بجای 6/37 میلی گرم در لیتر آهن (FeNaEDTA) Ethylenediamine tetraacetate ferric sodium iron از 110 میلی گرم در لیتر آهن (Fe-EDDHA) Ethylenediamine di-2-hydroxyphenyl acetate ferric بعنوان جایگزین استفاده گردید. بررسی باززایی شاخساره در دو آزمایش جداگانه در قالب فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی انجام شد. در هر دو آزمایش، فاکتور اول نوع ریز­­نمونه‌ شامل برگ کامل و قسمت تحتانی برگ (به اندازه 2 سانتی­متر) و فاکتور دوم، نوع هورمون سیتوکینینی BAP (در آزمایش اول) یا KIN (در آزمایش دوم) هریک با غلظت­های 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر و فاکتور سوم هورمون اکسین NAA با غلظت‌های0، 01/0، 1/0، 5/0 میلی­گرم در لیتر بود. واکشت ریزنمونه­ها بطور مرتب هر چهار هفته یک بار انجام گردید. ریشه‌زایی شاخساره‌های باززا شده، در یک آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی بررسی شد که فاکتور اول نوع محیط پایه (محیط­ MS و MS½  تغییر یافته) و فاکتور دوم غلظت‌های هورمون اکسین NAA (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر) بود. برای پیشگیری از اثرات منتقل شونده تیمارهای هورمونی مرحله باززایی و یکسان سازی آزمایشات ریشه‌زایی، شاخساره‌های باززا شده بمدت یک ماه در محیط بدون هورمون نگهداری شدند و سپس تیمارهای ریشه‌زایی در شاخساره‌هایی با اندازه یکسان اعمال گردید. در این پژوهش، هریک از تیمارها با 3 تکرار و بر روی 3 ریزنمونه از شاخساره‌­ی باززا شده به اندازه تقریبی 2 سانتی­متر در هر تکرار اعمال گردید. در محیط‌های کشت، 50 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک، 7 گرم در لیتر آگار و 30 گرم در لیتر ساکارز (8/5= pH) اضافه گردید. کشت­ها در دستگاه فیتوترون با دمای 2°C ± 25 و با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با استفاده از لامپ فلورسنت با شدت نور45 میکرومول بر مترمربع در ثانیه قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی شاخساره‌های باززا شده شامل تعداد شاخساره و تعداد برگ آنها ثبت گردید. طول و عرض شاخساره­ها و نیز طول و عرض برگ­های تولید شده با استفاده از کولیس اندازه­گیری شد. در شاخساره‌های باززا شده، در مرحله ریشه‌زایی تعداد و طول ریشه‌ها نیز ثبت شدند. گیاهچه‌های ریشه‌دار شده از محیط‌های کشت خارج ‌گردیده و پس از شست‌وشوی آرام ریشه‌ها با جریان آب و حذف آگار، در گلدان های کوچک حاوی کوکوپیت و پرلیت با نسبت وزنی 1:2 کشت گردیدند. مرحله سازگاری با انتقال گلدان‌ها به زیر پوشش­های پلاستیکی انفرادی در گلخانه‌ای با دمای 2°C ± 25، رطوبت نسبی 80 درصد و شدت نوری 10000 لوکس آغاز شد و پس از گذشت 10 روز، پوشش گلدان‌ها برداشته شد و درصد بقای گیاهچه‌های سازگارشده پس از 2 ماه یادداشت برداری گردید.

در این مطالعه، تجزیه داده‌ها با نرم افزار SAS انجام شد و نمودارها با استفاده از  نرم افزار Excel رسم گردیدند. مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از آزمون LSD  (p< 0.05) توسط نرم افزار MSTAT-C انجام شد و آزمون t زوجی برای مقایسه­ی بین هورمون­های سیتوکینینی بتفکیک هر ریز نمونه و برای هر صفت بطور جداگانه صورت گرفت.

نتایج

با گذشت 8 هفته از آغاز هر دو آزمایش و با عنایت به اینکه در عدم مصرف سیتوکینین­ها باززایی مشاهده نگردید، باززایی شاخساره‌ها از ریزنمونه­های برگی H.attenuatae  در سطوح مختلف مصرف ( 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) سیتوکینین­ها آغاز گردید. به­طوری که هر دو ریزنمونه­ی برگی انتخاب شده، از قابلیت باززایی شاخساره در سطوح مختلف ترکیبات هورمونی برخوردار بودند (شکل 1 و 2).

نتایج تجزیه واریانس داده­های حاصل از بررسی باززایی در این گیاه برای صفات تعداد، طول و عرض شاخساره مبین معنی­داری (در سطح یک درصد) آثار ساده­ی هورمون­های NAA، BAP و KIN، همچنین آثار متقابل آنها در هر دو آزمایش بود (جداول 1 و 2).

 

شکل 1 - باززایی شاخساره H. attenuatae از ریزنمونه تحتانی و برگ کامل با تیمار هورمونی  BAPو NAA

a تا c: باززایی و رشد از ریزنمونه برگ کامل، شاخساره اولیه باززا شده (a)، یک ماه پس از باززایی (b) و دو ماه پس از باززایی (c)

d تا f: باززایی و رشد از ریزنمونه تحتانی برگ، شاخساره اولیه باززایی شده (d)، یک ماه پس از باززایی (e) و دو ماه پس از باززایی (f)

 

شکل 2 - باززایی شاخساره H. attenuatae از ریزنمونه تحتانی و برگ کامل با تیمارهای هورمونی  KINو NAA.

a تا c: باززایی و رشد از ریزنمونه برگ کامل، شاخساره اولیه باززا شده (a)، دو ماه پس از باززایی (b&c).  d تا f: باززایی و رشد از ریزنمونه تحتانی برگ، شاخساره اولیه باززا شده (d)، دو ماه پس از باززایی (e&f).

 

 

در آزمایش اول (در شرایط کاربرد سیتوکینین BAP)، اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون NAA برای صفات تعداد و عرض شاخساره و اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون BAP برای صفت طول شاخساره­ی گیاهان باززا شده در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول1). صفت تعداد شاخساره نیز بطور معنی­داری (در سطح یک درصد) از برهمکنش سه جانبه­ی تیمار­های هورمونی و نوع ریزنمونه تاثیر پذیرفت (جدول1).

در آزمایش دوم (در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN )، اثر متقابل نوع ریزنمونه و هریک از هورمون­های NAA و KIN برای صفات تعداد و طول شاخساره معنی­دار بود(جدول2). در حالی­که معنی­داری اثر سه جانبه­ی ترکیبات تیماری تنها درصفت عرض شاخساره مشاهده گردید (جدول2).

 

 

جدول1 - تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گیاهان باززا شده هاورتیا تحت سطوح مختلف تیمارهای هورمونی BAP، NAA و نوع ریزنمونه برگی

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات صفات

 

 

تعداد شاخساره

طول شاخساره

عرض شاخساره

تعداد

برگ

طول

برگ

پهنای

برگ

BAP

2

55/0**

43/0**

11/0**

05/3**

11/0**

13/0**

NAA

3

46/0**

16/0**

07/0**

31/2**

03/0**

01/0*

ریزنمونه

1

04/0ns

04/0*

005/0ns

001/0 ns

004/0ns

01/0*

NAA×BAP

6

42/0**

21/0**

3/0**

01/3 **

01/0**

1/0**

ریزنمونه × NAA

3

17/0**

01/0ns

01/0**

01/0 ns

009/0ns

004/0ns

ریزنمونه × BAP

2

01/0ns

05/0**

01/0ns

05/0 ns

005/0 ns

004/0 ns

ریزنمونه×NAA × BAP

6

28/0**

007/0ns

02/0 ns

21/0ns

01/0**

01/0 ns

خطای آزمایش

48

03/0

009/0

003/0

13/0

004/0

002/0

ضریب تغییرات (%)

 

41/22

95/15

22/20

70/21

00/15

05/15

* و ** بترتیب معنی داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد و ns عدم معنی داری را نشان می­دهد.

 

جدول2 تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گیاهان باززاشده­ی هاورتیا تحت سطوح مختلف تیمارهای هورمونی،KIN، NAA و نوع ریزنمونه­ی برگی

 

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات صفات

 

 

 

 

تعداد شاخساره

طول شاخساره

عرض شاخساره

تعداد برگ

طول برگ

پهنای برگ

 

KIN

2

22/0**

12/0**

09/0**

07/0**

12/0**

09/0**

 

NAA

3

45/0**

07/0**

04/0**

44/2**

015/0**

005/0 ns

 

ریزنمونه

1

04/0*

008/0ns

001/0ns

54/0 **

005/0ns

008/0ns

 

NAA×KIN

6

08/0**

08/0**

04/0**

07/2 **

02/0**

01/0**

 

ریزنمونه × NAA

3

24/0**

03/0**

002/0ns

27/0 **

009/0ns

002/0ns

 

ریزنمونه × KIN

2

06/0*

07/0**

003/0ns

91/0 **

01/0 ns

002/0 ns

 

ریزنمونه × NAA ×  KIN

6

04/0ns

01/0ns

02/0 **

61/0ns

005/0ns

007/0 ns

 

خطای آزمایش

48

01/0

003/0

002/0

05/0

01/0

002/0

 

ضریب تغییرات (%)

 

17/14

89/11

46/10

02/16

01/16

85/14

* و ** بترتیب معنی داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد و ns عدم معنی داری را نشان می­دهد.

 
                       

 

 

تعداد شاخساره: با عنایت به معنی­دار شدن اثر متقابل سه جانبه­ی تیمارهای هورمونی و نوع ریز نمونه، ارزیابی میانگین تعداد شاخساره­های تولید شده از ریزنمونه­های مختلف تحت تیمارهای هورمونی NAA و BAP نشان داد که کاربرد ترکیب هورمونی 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA بهمراه 2 میلی­گرم در لیتر BAP، روند تولید شاخساره را در هر دو ریزنمونه­ی تحتانی(55/1 عدد) و کامل (33/1 عدد) برگ به بالاترین سطح در این آزمایش رساند (شکل3). در آزمایش دوم و در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN، نتایج مقایسه میانگین ترکیبات هورمونی NAA و  KIN بر این صفت، مبین تولید بیشترین تعداد شاخساره (99/0، 97/0 و 95/0  عدد) بترتیب در تیمارهای هورمونی 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بهمراه کاربرد 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر KIN و نیز در تیمار هورمونی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA با 1 میلی­گرم در لیتر KIN بود (جدول3).

 

 

شکل 3 - مقایسه میانگین اثر متقابل ترکیبات هورمونی  BAP، NAA  و نوع ریزنمونه بر تعداد شاخساره­های باززا شده در کشت درون شیشه­ای گیاه  H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

جدول3 - مقایسه میانگین آثار متقابل جداگانه­ی نوع سیتوکینین BAP و KIN بهمراه اکسین NAA در باززایی گیاه H.attenuatae

پهنای برگ

طول برگ

تعداد برگ

عرض شاخساره

طول شاخساره

تعداد شاخساره

NAA (mg/l)

cytokinin (mg/l)

KIN

BAP

KIN

KIN

BAP

BAP

KIN

BAP

KIN

31/0fgh032/0±

27/0d044/0±

36/0de021/0±

07/1e054/0±

23/1ef104/0±

33/0e040/0±

41/0hi010/0±

40/0ef022/0±

47/0de077/0±

0

5/0

28/0h013/0±

25/0d025/0±

33/0e026/0±

1e001/0±

13/1f090/0±

31/0e027/0±

38/0i025/0±

38/0f039/0±

44/0e052/0±

01/0

5/0

36/0def029/0±

36/0b031/0±

46/0b035/0±

67/2a460/0±

76/1c186/0±

51/0bc034/0±

74/0a115/0±

61/0c084/0±

95/0a152/0±

1/0

5/0

31/0fgh009/0±

30/0cd018/0±

39/0cd023/0±

34/1d149/0±

34/1def149/0±

40/0d021/0±

44/0ghi021/0±

45/0ef020/0±

60/0c092/0±

5/0

5/0

29/0gh013/0±

25/0d025/0±

36/0de016/0±

12/1de066/0±

22/1ef142/0±

36/0de025/0±

41/0hi025/0±

41/0ef021/0±

69/0bc138/0±

0

1

37/0cde029/0±

37/0b029/0±

43/0bc024/0±

13/1de066/0±

30/1def151/0±

40/0d030/0±

5/0fg028/0±

51/0cde036/0±

58/0cd041/0±

01/0

1

41/0bcd020/0±

35/0bc013/0±

47/0b025/0±

9/1b174/0±

40/2b100/0±

64/0a044/0±

6/0cd048/0±

94/0a040/0±

97/0a019/0±

1/0

1

34/0efg021/0±

33/0bc008/0±

42/0bc033/0±

05/1e055/0±

55/1cde205/0±

42/0d030/0±

47/0fgh047/0±

47/0def047/0±

99/0a005/0±

5/0

1

49/0a024/0±

48/0a028/0±

55/0a031/0±

15/1de068/0±

26/1ef100/0±

51/0bc016/0±

59/0de035/0±

62/0c046/0±

60/0c057/0±

0

2

43/0b030/0±

46/0a018/0±

56/0a037/0±

45/2a130/0±

55/3a112/0±

56/0b047/0±

66/0bc069/0±

97/0a075/0±

66/0bc149/0±

01/0

2

41/0bcd010/0±

44/0a022/0±

54/0a011/0±

37/1cd094/0±

70/1cd160/0±

49/0c037/0±

53/0ef036/0±

57/0cd026/0±

76/0b106/0±

1/0

2

42/0bc038/0±

37/0b034/0±

53/0a039/0±

6/1c102/0±

77/1c204/0±

55/0bc040/0±

71/0ab081/0±

77/0b035/0±

74/0b109/0±

5/0

2

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

جدول4 - مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون KIN در باززایی گیاه H. attenuatae

تعداد برگ

طول شاخساره

تعداد شاخساره

 

نوع ریزنمونه

KIN (mg/l)

79/1a 220/0±   

54/0c 080/0±

65/0c 125/0±

 

برگ کامل

5/0

24/1cd 122/0±

44/0d 015/0±

58/0c 030/0±

 

تحتانی برگ

5/0

19/1d 075/0±

43/0d 021/0±

76/0b 076/0±

 

برگ کامل

1

41/1bc 152/0±

56/0bc 032/0± 

85/0a 063/0±

 

تحتانی برگ

1

74/1a 158/0±

60/0ab 052/0±

63/0c 079/0±

 

برگ کامل

2

55/1b 165/0±

64/0a 036/0±

75/0b 076/0±

 

تحتانی برگ

2

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

طول شاخساره: نتایج مقایسه میانگین طول شاخساره­های رشد­ یافته تحت تیمارهای هورمونی NAA و BAP نشان داد که بیشترین میانگین طول شاخساره (97/0 سانتی­متر) و (94/0 سانتی­متر) بترتیب با اعمال 2 میلی­گرم در لیتر BAP بهمراه 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA  و 1 میلی­گرم در لیتر BAP در ترکیب با 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA حاصل گردید (جدول3). در حالی­که کاربرد سطوح پایین سیتوکینین (بویژه سطح 5/0 هورمون BAP) بهمراه برخی سطوح هورمون NAA به­طور مشترک، شاخساره­های کوتاه­تری را در این گونه تولید نمود.

با توجه به معنی­دار بودن میانگین طول شاخساره­های تولید شده از ریزنمونه­های مختلف تحت تیمار هورمونی BAP، نتایج مقایسه میانگین این صفت نشان داد که بیشترین میانگین طول شاخساره (8/0 سانتی­متر) در تیمار 2 میلی­گرم در لیتر BAP با کاربرد ریزنمونه­ی برگ کامل بدست آمد (شکل4). همچنین این نمودار نشان می­دهد که با افزایش غلظت هورمون BAP برای هر یک از ریزنمونه­های برگ کامل و قسمت تحتانی برگ روند افزایش طول معنی­دار شاخساره­های باززا شده مشاهده می­گردد.

در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN، مقایسه میانگین اثر متقابل هورمون­ها مبین تولید طویل­ترین شاخساره­ها با متوسط طول 74/0 سانتی­متر در نتیجه­ی کاربرد 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN بهمراه 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بود که با نتایج حاصله، از اعمال2 میلی­گرم در لیتر KIN بهمراه 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA بلحاظ تولید شاخساره­های طویل (با متوسط 71/0 سانتی­متر) تفاوت معنی­نداری نداشت (جدول3).

 

شکل4 - مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون BAP بر طول شاخساره­های باززا شده درکشت درون شیشه­ای گیاه H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

با این حال، ترکیب تیماری 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN بهمراه 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA، علاوه بر تاثیرگذاری مثبت در افزایش طول، از راندمان بالایی در حصول بیشترین تعداد شاخساره­ نیز برخوردار بود (جدول3). در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه با سطوح مختلف هورمون NAA نیز مشاهده شد که ریزنمونه­ی برگ کامل در محیط حاوی 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA توانست در تولید شاخساره­های طویل موفق عمل کند (شکل5).

 

 

شکل5 - مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون NAA بر طول شاخساره باززاشده­ در کشت درون شیشه­ای گیاه H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

این در حالی است که مقایسه میانگین آثار متقابل غلظت­های مختلف هورمون KIN با نوع ریزنمونه حاکی از آن بود که ریزنمونه­ی تحتانی برگ در بالاترین سطح هورمون KIN (2 میلی­گرم در لیتر) توانست شاخساره­های طویل­تر تولید نماید. روند رشد طولی شاخساره­ی هاورتیا تحت تأثیر مصرف هورمون KIN نشان می­دهدکه با افزایش غلظت هورمون KIN در ریزنمونه تحتانی کشت شده، طول شاخساره گیاه هاورتیا بیشتر شده است (جدول4).

عرض شاخساره: بر اساس نتایج مقایسه میانگین، بیشترین میانگین عرض شاخساره در شرایط کاربرد سیتوکینین BAP، با اعمال تیمار هورمونی 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بهمراه 1 میلی­گرم در لیتر BAP (64/0 سانتی­متر) حاصل گردید (جدول2). همچنین کمترین عرض شاخساره­ی گیاهان باززا شده ( 31/0 سانتی­متر) نیز در محیط کشت حاوی 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA همراه با کمترین غلظت هورمون BAP (5/0 میلی­گرم در لیتر) حاصل شد. این نتیجه، با اعمال تیمارهای 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر BAP به­تنهایی نیز مشاهده شد (جدول 2). مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون NAA بر صفت عرض شاخساره حاکی از آن بود که هر دو ریزنمونه­ی برگ کامل و تحتانی برگ با دریافت 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA، عریض­ترین شاخساره­ها (بترتیب 53/0 و 57/0 سانتی­متر) را تولید نمودند (شکل 6).

شکل6 - مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون NAA بر عرض شاخساره­های باززا شده درکشت درون شیشه­ای گیاه H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

اما در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN، نتایج مقایسه میانگین صفت عرض شاخساره­ی تولید شده در پی برهمکنش سه­جانبه­ی معنی­دار تیمارهای هورمونی و نوع ریزنمونه نشان داد که ریزنمونه­­های تحتاتی برگ در سطوح بالای KIN (1 و 2 میلی گرم در لیتر) بترتیب بهمراه سطوح متوسط (1/0 میلی­گرم در لیتر) و پایین (01/0 میلی­گرم در لیتر) هورمون NAA موفق به تولید شاخساره­های عریض شدند، در حالی­که ریزنمونه­های برگ کامل، عریض­ترین شاخساره­ها را در محیط­های حاوی سطوح بالای KIN (1 و 2 میلی­گرم در لیتر) بترتیب بهمراه سطوح متوسط (1/0 میلی­گرم در لیتر) و بالای (5/0 میلی­گرم در لیتر) هورمون NAA تولید نمودند (شکل7).

 

 

شکل7 - مقایسه میانگین اثر متقابل ترکیبات هورمونی KIN ،NAA  و نوع ریزنمونه بر عرض شاخساره­های باززا شده در کشت درون شیشه­ای گیاه H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

تعداد برگ:  نتایج تجزیه واریانس صفت تعداد برگ­ در شاخساره­های باززا شده­ در شرایط کاربرد سیتوکینین BAP، حاکی از تاثیرپذیری معنی­دار (در سطح احتمال یک درصد) این صفت از آثار ساده­ی هر یک از دو هورمون BAP و NAA و نیز برهمکنش آنها بود (جدول1).  درحالی­که تجزیه واریانس داده­ها در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN، نشان داد که آثار ساده و متقابل دو جانبه­ی کلیه­ی تیمارهای مورد بررسی (هورمون­های KIN، NAA و نوع ریزنمونه) تأثیر بسیار معنی­داری (در سطح احتمال یک درصد) بر تعداد برگ تولید شده­ی بوته­های هاورتیا در شرایط محیط کشت داشت (جدول2). صرفنظر از نوع سیتوکینین، یافته­های مقایسه میانگین برهمکنش هورمون­ها (اکسین×سیتوکینین) نشان داد که شاخساره­های باززا شده تحت تیمارهای هورمونی 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 2 میلی­گرم در لیتر سیتوکینین ( BAP یا KIN) از نظر متوسط تعداد برگ تولید شده در گروه برتر آماری قرار گرفتند (جدول3) علاوه بر این، درشرایط کاربرد سیتوکینین KIN نیز با اعمال 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بهمراه 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN، بیشترین تعداد برگ در شاخساره­ها ثبت گردید. در این راستا، مقایسه میانگین اثر متقابل هورمون NAA با نوع ریزنمونه نشان داد که ریزنمونه­ی برگ کامل تحت تیمار هورمونی 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA با میانگین تولید 23/2 عدد برگ درشاخساره، نسبت به سایر تیمارها موفق­تر عمل نمود (شکل 8).

 

شکل 8 - مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه و هورمون NAA بر تعداد برگ­های تولید شده از شاخساره­های باززاشده­ در کشت درون شیشه­ای گیاه H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

این موفقیت در تولید بالاترین تعداد برگ در شاخساره­های باززا شده از ریز نمونه­ی برگ کامل با در نظر گرفتن سطوح مختلف مصرف هورمون KIN، مشترکاً در تیمارهای هورمونی 5/0 و 2 میلی­گرم در لیتر KIN حاصل گردید (جدول4). روند افزایش تعداد برگ­های تولید شده در شاخساره­های باززا شده از ریزنمونه­ی تحتانی برگ نیز در غلظت­های مختلف هورمون KIN نشان داد که با افزایش غلظت این هورمون، تعداد برگ­های تولید شده از این ریزنمونه بطور معنی­داری افزایش یافت (جدول4). با این حال این افزایش در رتبه­ی دوم نسبت به تعداد برگ­های تولید شده توسط ریزنمونه­ی برگ کامل قرار داشت.

طول برگ:  با توجه به معنی­دار بودن (در سطح یک درصد) اثر متقابل 3 جانبه­ی هورمون­های NAA و BAP با نوع ریزنمونه، برای صفت طول برگ­های باززا شده (جدول 1)، نتایج مقایسه میانگین این صفت نشان داد که کاربرد ترکیب هورمونی 01/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 2 میلی­گرم در لیتر BAP بیشترین طول برگ را در شاخساره­های تولید شده از ریزنمونه­ی تحتانی برگ (61/0 سانتی­متر) تولید نمود (شکل 9). علاوه بر این ترکیب، مشاهده گردید که مصرف 2 و 1 میلی­گرم در لیتر BAP در حضور 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA، در محیط کشت ریزنمونه­ی تحتانی برگ و کاربرد 2 میلی­گرم در لیتر BAP در محیط کشت ریز نمونه­ی برگ کامل، شاخساره­هایی با برگ­های طویل تولید می­نماید (شکل9).  

با عنایت به معنی­دار شدن اثر متقابل دو جانبه­ی هورمون­های KIN و NAA نیز در سطح یک درصد (جدول2) مقایسه میانگین برهمکنش این دو هورمون بر رشد طولی برگ نشان داد که طویل­ترین برگ­ها در بالاترین سطح هورمون KIN (2 میلی­گرم در لیتر) بهمراه سطوح مختلف هورمون NAA تولید گردیدند. در مقایسه­ی نتایج بدست آمده برای صفات تعداد و طول برگ، مشاهده شدکه در بین ترکیبات تیماری ذکر شده، اعمال 2 میلی­گرم در لیتر KIN یا BAP بهمراه 01/0 میلی گرم ­NAA، صرفنظر از نوع ریزنمونه، در تولید بیشترین تعداد و میانگین طول برگ در گیاه هاورتیا موفق عمل نموده است (جدول 3).

 

شکل9 - مقایسه میانگین اثر متقابل ترکیبات هورمونی BAP ،  NAA و نوع ریزنمونه بر طول برگ­های تولید شده از شاخساره­های باززا شده در کشت درون شیشه­ای گیاه  H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

پهنای برگ: صفت پهنای برگ بطور معنی­داری از برهمکنش دو جانبه­ی تیمار NAA با هر یک از هورمون­های KIN و BAP تأثیر پذیرفت (جداول 1 و 2). مقایسه میانگین داده­ها برای این صفت نشان داد که عریض­ترین برگ­ها (48/0و 49/0 سانتی­متر) با کاربرد بالاترین غلظت هریک از هورمون­های سیتوکینینی BAP و KIN (2 میلی­گرم در لیتر) در شرایط عدم حضور NAA تولید گردیدند (جدول 3). این برتری در شرایط مصرف سیتوکینین BAP در ترکیب با سطوح پایین مصرف NAA (01/0 و 1/0 میلی­گرم در لیتر) نیز حفظ گردید (جدول 3).

اثر  نوع محیط کشت و هورمون NAA بر ریشه­زایی گیاه هاورتیا: در پژوهش حاضر، شاخساره­های باززا شده­ی هاورتیا با اندازه تقریبی2 سانتی­متر به محیط­­های کشت‌ ریشه­زایی حاوی اکسین NAA انتقال یافتند و نتایج نشان داد که تقریباً تمامی شاخساره­ها یک ماه پس از انتقال به محیط‌ها، ریشه­دار شدند (شکل10).

 

 

شکل10 - ریشه­زایی شاخساره­های H. attenuatae کشت شده در محیط  MS½  تیمار شده با  5/1 میلی­گرم در لیتر هورمون NAA  (a) و شاخساره­های رشدیافته در محیط  MSتیمار شده با 1 میلی گرم در لیتر هورمون NAA (b)

 

 

نتایج جدول تجزیه واریانس صفات تعداد و طول ریشه­ی شاخساره­های هاورتیای کشت شده در محیط­های مختلف حاوی غلظت­های متفاوت هورمون NAA نشان داد که، علاوه بر معنی­داری اثر ساده­ی هورمون NAA، اثر متقابل سطوح هورمونی و نوع محیط کشت برای هر دو صفت (تعداد و طول ریشه­) مورد بررسی در بخش ریشه­زایی، بترتیب در سطوح 1 و 5 درصد، معنی­دار بود (جدول 5).

 

 

جدول5 - تجزیه واریانس تاثیر غلظت­های مختلف هورمون NAA تیمار شده در محیط­های کشت MS  و MS½  بر ریشه­زایی گیاه هاورتیا H. attenuatae

 

 

میانگین مربعات

منابع تغییرات

درجه آزادی

تعداد ریشه

طول ریشه

NAA

3

52/2**

43/0*

محیط کشت

1

16/0ns

06/0ns

محیط کشت×NAA

3

51/1**

29/0*

خطای آزمایش

16

17/0

21/0

ضریب تغییرات (%)

 

34/13

97/18

* و ** بترتیب معنی داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد و ns عدم معنی داری را نشان می­دهد.
           

 

 

نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل دوجانبه­ی تیمار هورمونی و نوع محیط کشت در صفات مورد بررسی نشان داد که بیشترین تعداد (33/4 عدد) و طویل­ترین ریشه­ها (16/2 سانتی­متر) در شاخساره­های رشدیافته در محیط کشت MS½  تیمار شده با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA ثبت گردید (شکل11).

 

 

شکل11- مقایسه میانگین اثر متقابل هورمون NAA با نوع محیط کشت بر تعداد (a) و طول ریشه­ی (b) تولید شده از شاخساره­های باززا شده در کشت درون شیشه­ای گیاه  H.attenuatae

مقایسات میانگین در سطح احتمال 5 درصد و به­روش حداقل تفاوت معنی­دار انجام شد. وجود حداقل یک حرف آماری مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی دار است.

 

 

مرحله سازگاری: در پژوهش حاضر، انتقال شاخساره‌های باززا شده­ی H. attenuatae و دارای حداقل 4 ریشه به طول بیش از دو و نیم سانتی متر به محیط گلخانه نشان داد که به­طور متوسط، 90 درصد گیاهچه‌های منتقل شده به خاک توانستند با شرایط گلخانه سازگار شوند و رشد مطلوبی را از خود نشان دهند (شکل12).  گیاهچه‌های کشت بافتی در صورتی که در شرایط درون شیشه‌ای بخوبی رشد کرده باشند و شرایط مناسبی برای ادامه فتوسنتز و رشد در شرایط طبیعی داشته باشند، می‌توانند در گلخانه با راندمان بالایی سازگار شده و رشد کنند.

شکل12- نمونه ای از گیاهچه‌‌های H. attenuatae منتقل شده به خاک در گلخانه

 

بحث و نتیجه گیری

برنامه­ی هدفمند و اجرای پژوهش­ها در زمینه­ی تکثیر و پرورش گل­ها و گیاهان زینتی، می­تواند افزایش تجارت آنها را در بازارهای بین المللی و نرخ رشد اقتصادی بالایی را در این حوزه به­همراه داشته باشد.

گونه های مختلف جنس هاورتیا، از جمله ساکولنت­های زینتی محبوبی هستند که بدلیل تنوع مورفولوژیکی بالا و تناسب نیازهای رشدی آنها با سبک زندگی فعلی و توسعه­ی آپارتمان نشینی، تقاضای رو به رشدی را در بازارهای گل جهانی داشته­اند (9). در این بین، گونه­ی H. attenuatae (هاورتیای گورخری) با برخورداری از زیبایی خاص برگ­ها، توجه­ی ویژه­ی علاقمندان و گردآورندگان ساکولنت­ها را به خود جلب کرده است و تکثیر و تولید آن علاوه بر بازارهای جهانی، در بازار گل و گیاه داخلی نیز به­لحاظ اقتصادی ارزشمند است. با این حال نظر بوجود برخی مشکلات در تکثیر جنسی و غیر جنسی، نظیر خودناسازگاری، تولید کم بذر و درصد ریشه­زایی پایین قلمه­های برگی، ریزازدیادی این گیاه در شرایط درون شیشه­ای روش جایگزین مناسبی جهت ازدیاد این گونه است.

در این راستا، پژوهش حاضر راهکاری جهت بهبود باززایی مستقیم گونه­ی H. attenuatae با استفاده از ریزنمونه­های برگی در محیط MS تغییر یافته با کاربرد دو نوع سیتوکینین‌ BAP و KIN در ترکیب با اکسین NAA را ارائه می‌کند، چرا که هورمون‌های BAP و KIN و نیز هورمون NAA، به­ترتیب از معمول‌ترین و پرمصرف‌ترین سیتوکنین‌ها و اکسین‌های مصنوعی در باززایی مستقیم اغلب گیاهان و نیز ساکولنت‌های تک لپه­ای هستند و مصرف نسبت صحیح این هورمون‌ها (نسبت بالای سیتوکنین به اکسین) باززایی مستقیم مناسبی را در ساکولنت‌ها در پی داشته است (20 و 30). در ابتدا و پیش از اجرا و اعمال تیمارهای اصلی، با توجه به کسب نتایج مثبت مبنی بر رشد و نمو بهتر بوته­های هاورتیا در نتیجه­ی کاربرد Fe-EDDHA بجای Fe-EDTA در محیط پایه MS، این جایگزینی در تمامی واحدهای آزمایشی اعمال گردید. سایر محققین نیز گزارش نمودند که فراهمی و تامین عنصر آهن مورد نیاز در محیط کشت بدلیل پایداری بیشتر Fe-EDDHA در برابر تخریب نوری، بهبود خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک شاخساره­های باززا شده را در مطالعات مختلف در پی داشته است (3، 5، 11 و 15).

بررسی وضعیت باززایی شاخساره‌ها از ریزنمونه­های برگی نشان داد که با گذشت 8 هفته از آغاز هر دو آزمایش، علایم قابل رویت باززایی مشاهده گردید. اگرچه در شرایط کاربرد BAP، ریزنمونه­های برگی از تفاوت معنی­داری در قابلیت باززایی شاخساره­ برخوردار نبودند، ارزیابی برهمکنش نوع ریزنمونه و غلظت هورمون KIN، نشان داد که بیشترین تعداد شاخساره­ی باززا شده با کاربرد ریزنمونه تحتانی برگ در غلظت 1 میلی­گرم در لیتر KIN و غلظت­های کمتر NAA تولید گردید. بنظر می­رسد نسبت بالای سیتوکنین به اکسین عامل اصلی تقسیم سلولی، تشکیل و پرآوری شاخساره­ها باشد. در پژوهش چن و همکاران (10) نیز بیشترین تولید شاخساره (01/81 درصد) با کاربرد ریزنمونه­ی برگ گیاه هاورتیا در محیط کشت حاوی 1 میلی­گرم در لیتر BAP و 04/0 میلی­گرم در لیتر NAA بدست آمد. همراستا با پژوهش حاضر، محیط­های MS حاوی هر یک از دو سیتوکنین BAP و KIN در ترکیب با NAA، محیط­های مناسبی جهت باززایی شاخساره در گیاه الوئه ورا معرفی گردیدند (4 و 25). یانگ و همکاران (30) نیز نرخ بالای باززایی شاخساره­ از ریزنمونه­ی گل­آذین گونه­ی Haworthia arachnoidea var. setata  را در محیط MS حاوی ترکیب هورمونی 1 میلی­گرم در لیتر KIN و 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA گزارش نمودند. بنابراین، تنظیم کننده­های رشدی سیتوکینینی در تعادل با اکسین­ها، بر تمایزیابی سلول­های گیاهی از ریزنمونه­های مختلف تاثیرگذارند، نظر به اهمیت سیتوکینین­ها در تشکیل و تکثیر شاخساره­ها، گزینش نوع و غلظت سیتوکینین مورد استفاده در ریزازدیادی گیاهان مختلف با توجه به کارایی آنها در تحقق این هدف صورت می­گیرد (2 و 6). نتایج پژوهش­های پیشین در هاورتیاها نیز نشان داد که پاسخ باززایی در این گونه­ی گیاهی، با توجه به کاربرد سیتوکینین­های مختلف، متفاوت بود (21 و 27). در پژوهش حاضر نیز کاربرد BAP در ترکیب با NAA نسبت به ترکیب KIN و NAA  توانست در مجموع تعداد شاخساره (باززا شده از ریز نمونه بخش تحتانی برگ) بیشتری را در هاورتیا تولید نماید (t(70) = 2.28; p = 0.0255). در این راستا، اثر مثبت کاربرد BAP بر شاخه­زایی هاورتیا (28) و آلوئه‌ورا (12) در تحقیقات گذشته نیز گزارش شده بود. در حالی­که در پژوهش دیگری، طی ارزیابی و مقایسه­ تاثیر کاربرد سیتوکینین­های BAP و KIN بر باززایی 5 گونه­ی مختلف هاورتیا از ریزنمونه­های برگی، بر تاثیر بیشتر هورمون KIN در برخی صفات تاکید شده است(28).

در پژوهش حاضر، اگر چه تاثیرگذاری مثبت غلظت‌های بالای هر دو سیتوکینین BAP و KIN در ایجاد شاخساره‌های طویل‌ از ریزنمونه­های برگی گونه­ی H. attenuatae مشاهده شد. با این حال، در شرایط استفاده از سیتوکینین KIN، ترکیب تیماری 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN بهمراه 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA توانست تعداد بیشتری از شاخساره‌های طویل را باززا نماید. در پژوهش خانام و همکاران (16)، نیز حداکثر طول شاخساره (5/2 سانتی­متر) در گیاه آلوئه ورا با کاربرد 4 میلی­گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی­گرم در لیتر NAA به­دست آمد. در حالی­که، دویدی و همکاران (13) کاربرد 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP  را مناسب­ترین تیمار برای تولید شاخساره­های طویل در گیاه آلوئه­ورا معرفی نمودند. به­این ترتیب، گزینش غلظت مناسب سیتوکینین­ها در حصول بوته­های دارای مورفولوژی مناسب حائز اهمیت است به­طوری­که اختلالاتی نظیر عدم رشد ریشه و کندی رشد شاخساره­ها بدلیل افزایش تجمع متابولیت­های سمی در تیمار غلظت­های بالای سیتوکینین­ها در شرایط کشت بافت گیاهی گزارش شده است (7 و 8). در این راستا، روگرز (28) در باززایی گونه­های مختلف هاورتیا گزارش نمود که کاربرد غلظت­های تا 2 میلی­گرم در لیتر از سیتوکینین­ها (BAP و KIN)  شاخساره­هایی با ارتفاع مناسب تولید نمود، در حالی­که اعمال غلظت­های بالاتر این هورمون­ها، کاهش ارتفاع شاخساره­ها را در پی داشت.

نتایج بررسی عرض شاخساره‌های باززاشده نیز نشان داد که غلظت‌‌های بالای هر دو سیتوکنین بر عریض‌تر شدن شاخساره‌های باززا شده­ در گونه­ی H. attenuatae موثرتر می­باشد. همچنین در هر دو آزمایش، ریزنمونه برگ کامل مناسب‌تر بود. باتوجه به این نکته مهم که تناسب طول و عرض شاخساره در مورفولوژی و بازارپسندی بوته­های هاورتیا اهمیت زیادی دارد، نتایج حاصله نشان داد که در شرایط کاربرد سیتوکینین BAP اگرچه کاربرد سطوح متوسط هر دو تیمار هورمونی (به­ترتیب 1 و 1/0 میلی­گرم در لیتر BAP و NAA) به­طور هماهنگ هر دو صفت طول و عرض را در شاخساره­های باززا شده­ی رقم هاورتیای مورد بررسی، ارتقا بخشید (جدول3)، این هماهنگی بین طول و عرض شاخساره در شرایط کاربرد سیتوکینین KIN، در هیچ یک از ترکیبات تیماری به­طور معنی­داری مشاهده نگردید (جدول3 و شکل7).

 از دیگر خصوصیات مهم برای مناسب بودن شاخساره‌های باززا شده، تعداد برگ تولید شده در هر شاخساره است. در این راستا، بررسی این صفت در هر دو آزمایش مبین تاثیر مثبت کاربرد سطوح بالای سیتوکنین‌ها در تولید تعداد بالای برگ در شاخساره­های باززا شده بود. شاخساره­های باززا شده از ریزنمونه­ی برگ کامل از نظر تولید تعداد برگ بیشتر، موفق­تر عمل نمودند.  در پژوهش چمنی و همکاران (1) در گیاه لاله، با کاربرد 3/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP، بیشترین تعداد برگ (17عدد) و نیز بالاترین میانگین طول برگ (4 سانتی­متر) گزارش گردید. در پژوهش حاضر نیز، طویل‌ترین برگ‌ها با اعمال غلظت­های متوسط و بالای هورمون BAP، بهمراه سطوح پایین اکسین NAA تولید گردیدند. ضمن اینکه مشخص شد که بالاترین سطح مصرف سیتوکینین KIN بهمراه سطوح پایین مصرف NAA نیز می­تواند در رشد طولی برگ­ها موفق عمل نماید.

در مجموع، از آنجایی‌که اندازه و نوع ریزنمونه تاثیر زیادی در نتایج باززایی گیاهان کشت بافتی دارد، یافته­های پژوهش حاضر نشان داد که اگرچه باززایی مستقیم از هر دو ریزنمونه­ی برگی H. attenuatae می­تواند در تولید گیاهچه‌هایی یکنواخت در مدت زمانی کوتاه موفق عمل نماید، ولیکن بنظر می‌رسد استفاده از ریزنمونه‌های برگ کامل نتایج بهتری را بهمراه داشته باشد. همچنین کاربرد دو نوع سیتوکینین در ریزازدیادی این گیاه نشان داد که اعمال غلظت بالاتر BAP یا KIN در شرایط عدم مصرف یا مصرف سطوح پایین اکسین NAA، در باززایی شاخساره‌هایی با برگ­های طویل، عریض و با تعداد بیشتر، کارآمدتر از سایر سطوح بود.

در مرحله­ی ریشه­زایی، استفاده از سطوح 5/0 و 5/1 میلی­گرم در لیتر هورمون NAA در محیط MS½ توانست تقریبا ریشه هایی با تعداد و طول دو برابر شاهد تولید نماید. کاربرد اکسین­های مختلف بویژه NAA، IBA و IAA در شرایط درون شیشه­ای، با هدف ریشه­زایی گیاهان باززا شده مرسوم است (29). با این حال تعیین غلظت­های مناسب این هورمون­ها نیز حائز اهمیت است. پلا و همکاران (26) تیمار 1 میلی­گرم در لیتر هورمون NAA را جهت ریشه­زایی شاخساره­های کاکتوس اچینوسرئوس توصیه کردند. سایر محققین نیز کاربرد اکسین IBA را در ریشه­زایی گونه های دیگر گیاه هاورتیا موفقیت آمیز گزارش نمودند (10). علاوه بر تیمار هورمونی، فادل و همکاران (14) اظهار داشتند که کاهش غلظت محیط پایه و بدنبال آن ایجاد تغییرات جزئی در غلظت برخی عناصر از جمله عناصر کمیاب، تاثیر قابل توجهی بر اندام‌زایی گیاهان در شرایط آزمایشگاهی داشته که این تاثیر، در ریشه­زایی سایر گونه­های بررسی شده­ی هاورتیا مطلوب بود (17).

یکی از مراحل مهم کشت بافت گیاهان، استقرار گیاهچه‌های کشت بافتی در بسترهای کشت گلدانی است. راندمان بالای سازگاری گیاهچه‌های H. attenuatae با شرایط گلخانه مبین رشد مطلوب اندام­های فتوسنتزی و ریشه­ای این گیاهچه­ها در شرایط درون شیشه‌ای و کسب بنیه­ی گیاهچه­ای مطلوب جهت استقرار و ادامه­ی رشد در شرایط طبیعی (گلدان) بود.

 در نهایت می­توان اظهار داشت که یافته­های پژوهش حاضر علاوه بر تاثیر مثبت در گسترش تحقیقات مربوط به فیزیولوژی، مهندسی ژنتیک و زیست شناسی مولکولی جنس Haworthia، می­تواند در بهینه‌سازی ریزازدیادی تجاری این گونه­ی هاورتیا مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله از دانشگاه صنعتی شاهرود و شرکت زیست فناور سپنتا ناروان بخاطر حمایت هایشان در اجرای این پژوهش تشکر و قدردانی می نمایند.

1- چمنی، ا.، قمری، م.، محب الدینی، م.، قنبری، ع.، و حیدری، ح.، 1396. اثر تنظیم کننده­های رشد گیاهی بر کالوس­زایی و باززایی لاله (Fritillaria imperalis L).  نشریه علوم باغبانی دانشگاه فردوسی مشهد، 31، صفحات 469- 482.
2- کاویانی، ب.، و غفاری ایسی­زاد، س.، 1394. اثر غلظت های مختلف نفتالن استیک اسید و کینتین روی ریزازدیادی گیاه زینتی لیسیانتوس (Eustoma grandiflorum). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 28، صفحات 1088-1096.
3- مرادیان، م.، باقری، ع.، مرعشی، ح.، نعمتی، ح.، و شریفی، الف.، 1398. بررسی اثر آهن، نوع محیط کشت و ترکیب هورمونی محیط کشت بر باززایی دوگونه رز Rosa canina و Rosa beggeriana در شرایط این ویترو. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران).32، صفحات 218-230.
 
4- Ahmed, S., Kabir, A. H., Ahmed, M. B., Razvy, M. A., and Ganesan, S., 2007. Development of rapid micropropagation method of Aloe vera L. Seed Science journal. 24: 121-128.
5- Antonopoulos, C., Dimassi, K., Therios, I., Chatzissavvidis, C. and Papadakis, I., 2007. The effect of Fe–EDDHA and of ascorbic acid on in vitro rooting of the peach rootstock GF-677 explants. Acta Physiologiae Plantarum, 29: 559–561.
6- Aziz, A. N., Tan, B.C., Othman, R.Y., and Khalid, N., 2018. Efficient micropropagation protocol and genome size estimation of an important cover crop, Mucuna bracteata DC. ex Kurz. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 132: 267- 278.
7- Bairu, M. W., Aremu, A. O., and Van Staden, J., 2010. Somaclonal variation in plants: causes and detection methods. Plant Growth Regulation, 63: 147–173.
8- Baroja-Fernández, E., Aguirreolea, J., Martínková, H., Hanus, J., and Strnad, M., 2002. Aromatic cytokinins in micropropagated potato plants. Plant Physiology and Biochemistry, 40: 217–224.
9- Bayer, B., 1999. Haworthia revisited a revision of the genus. National Botanic Gardens of South Africa, Umdaus Press, PP: 130.
10- Chen, Y .M., Huang, J .Z., Hou, T. W., and Pan, I. C., 2019. Effects of light intensity and plant growth regulators on callus proliferation and shoot regeneration in the ornamental succulent Haworthia, Botanical studies, 60:10.
11- Christensen, B., Sriskandarajah, S., Serek, M., and Muller, R., 2008. In vitro culture of Hibiscus rosasinensis L.: Influence of iron, calcium and BAP on establishment and multiplication. Plant Cell Tissue Organ Culture, 93: 151–161.
12- Debiasi, C., Silva, C. G., and Pescador, R., 2007. Micropropagation of Aloe vera L. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 9: 36-43.
13- Dwivedi, N. K., Indiradevi, A., Asha, K. I., Asokan-Nair, R., and Suma, A., 2014. A protocol for micro propagation of Aloe vera L. (Indian Aloe) a miracle plant.  Research in Biotechnology. 5: 1-5.
14- Fadel, D., Kintzios, S., Economou, A. S., Moschopoulou, G., and Constantinidou, H. A., 2010. Effect of different strength of medium on organogenesis, phenolic accumulation and antioxidant activity of spearmint (Mentha spicata l.). The Open Horticulture Journal, 3: 31-35.
15- Gomez, M., Pellico, D., Ramırez-Lopez, P., Mancheno, M. J., Romano, S., delaTorre, M. C., and Sierra M. A., 2005. Understanding of the mode of action of FeIII-EDDHA as iron chlorosis corrector based on its photochemical and redox behavior. Chemistry a European Journal. 11: 5997–6005.
16- Khanam, N., Khanam, M., and Sarma, G. K., 2014. Rapid in vitro propagation of Aloe vera L. with some growth regulators using lateral shoots as explant. Journal of Pharmaceutical Sciences, 3: 2278-4357.
17- Kim, Y. H., Kim, H. H., Lee, G. Y., Lee, J. H., Jung, J. H., and Lee, S. D., 2018. Effect of growth regulators on In vitro mass propagation of Haworthia maughani. Journal of Plant Biotechnology. 45:369-374. 
18- Kitamura, Y., Kubo, K., Rahman, L., and Ikenaga, T., 2002. Reproduction of Sedum drymarioides, an endangered rare species, by micropropagation. Plant Biotechnology, 19:303–309.
 19- Kumari, A., and Naseem, M. D., 2016. An efficient protocol for micro propagation of a medicinal plant Aloe vera L. Through organ culture. Journal of Indian botany Society, 94: 118–125.
20- Liu, B .L., Fang, H. Z., Meng, C .R., Chen, M., Chai, Q. D., Zhang, K., and Liu, S. J., 2017. Establishment of a rapid and efficient micropropagation system for succulent plant Haworthia turgida. HortScience, 52, PP:1278–1282.
21- Lizumi, M., and Amaki, W., 2011. Miropropagation of Haworthia cymbioformis through Thin-cell-layer tissue culture. Combined Proceedings International Plant Propagators. 51: 288-291.
22- Luria, G., Wiess, D., Ziv, O., and Borochov, A., 2004. Effect of planting depth and density, leaf removal, cytokinin and gibberellic acid treatment on flowering and rhizome production in Zantedeschia aethiopica. IX international Symposium on Flower Bulbs, PP: 725-730.
23- Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: 473-497.
24- Mycock, D. J., Wesley-Smith, J., and Berjack, P., 1995. Cryopreservation of somatic embryos of 4 species with and without cryoprotectant pretreatment, Annual Botany, 75: 331-356.
25- Nayankantha, N. M. C., Singh, B. R., and kumar, A., 2010. “Improved culture medium for micropropagation of Aloe vera L. Tropical Agricultural Research and Extension, 13: 87-93.
26- Pelah, D., Kaushik, R., Mizrahi, Y., and Sitrit, Y., 2002. Organogenesis in the vine cactus Selenicereus megalanthus using thidiazuron. Plant Cell Tissue Organ Cultue. 71: 81–84.
27- Richwine, A. M., Tipton, J. L., and Thompson, G. A., 1995. Establishment of Aloe, Gasteria, and Haworthia Shoot Cultures from Inflorescence Explants. Hortscience, 30:1443–1444.
28- Rogers, S. M. D., 1993. Optimization of plant regeneration and rooting from leaf explants of five rare Haworthia.  Scientia Horticulturae, 56:157-161.
29- Sivanesan, I., Song, J. Y., Hwang, S. J., and Jeong, B. R., 2011. Micropropagation of Cotoneaster wilsonii Nakai -A rare endemic ornamental plant. Plant Cell Tissue Organ Cult, 105: 55–63.
30- Yong, X. J., Mai, Y. L., Lin, S. H., and Xia, S. Y., 2007. Tissue culture and rapid propagation of Haworthia arachnoidea var. setata. Journal of Tianjin Agricultural Sciences. 1: 12-13.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 2
Spring 2024
Pages 168-184

  • Receive Date 04 January 2022
  • Revise Date 10 March 2022
  • Accept Date 15 April 2022