تاثیر شرایط مختلف استخراج با امواج فراصوت بر خواص ضدرادیکالی و ضدمیکروبی عصاره الکلی گیاه کبر(Capparis spinosa L.)

کلکلی, محمدانور; سرحدی, حمید; شهدادی, فاطمه

doi:10.22034/jpr.2022.2188

تاثیر شرایط مختلف استخراج با امواج فراصوت بر خواص ضدرادیکالی و ضدمیکروبی عصاره الکلی گیاه کبر(Capparis spinosa L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

محمدانور کلکلی ¹

حمید سرحدی ¹

فاطمه شهدادی ²

¹ گروه علوم و صنایع غذایی، واحد بم، دانشگاه آزاد اسلامی، بم، ایران

² گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه جیرفت، جیرفت، ایران

10.22034/jpr.2022.2188

چکیده

برای استخراج مواد موثره گیاهی، روش‌های مختلفی از جمله سوکسله و غرقابی و یا فناوری‌های جدیدی نظیر مایکروویو و یا امواج فراصوت مورد استفاده قرار می‌گیرند. هدف از این مطالعه، بررسی کارایی استفاده از امواج فراصوت در استخراج ترکیبات فنلی، ضد میکروبی و ضدرادیکالی برگ، ریشه و میوه گیاه کبر می‌باشد. بهینه‌سازی به روش سطح پاسخ با استفاده از فاکتور زمان در سه سطح (10، 25 و 40 دقیقه) و شدت صوت نیز در سه سطح (40، 70 و 100 درصد) با حلال الکلی (اتانول 76 درصد) در نظر گرفته‌شد. از نتایج آزمون‌های انجام‌شده با روش آماری سطح پاسخ، شدت صوت به عنوان اثربخش‌ترین فاکتور استخراج بدست آمد. شرایط بهینه استخراج ترکیبات آنتی‌اکسیدانی و ضد میکروبی با حمام فراصوت، زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بود. در این شرایط میزان ترکیبات فنلی کل برای برگ، ریشه و میوه به‌ترتیب 47/25، 24/17 و 63/23 میلی‌گرم بر گرم، میزان بهینه IC50 به‌ترتیب 13/9، 20/40 و 30/45 میکروگرم بر میلی‌گرم، میزان بهینه MIC باکتری Bacillus cereus به ترتیب 07/1، 15/2 و 02/8 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و میزان بهینه MBC باکتری Bacillus cereus عصاره‌های برگ و ریشه به‌ترتیب 41/1 و 62/8 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و MBC Bacillus cereus عصاره میوه گیاه 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بدست آمد. بطور کلی مشخص شد که عصاره‌های الکلی استخراج شده با روش فراصوت دارای ترکیبات فنولی قابل توجهی بودند و با افزایش فاکتورهای زمان و شدت صوت، استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ، ریشه و میوه گیاه افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها

گیاه کبر

عصاره الکلی

خواص آنتی‌اکسیدانی

خواص ضد میکروبی

امواج فراصوت

موضوعات

بیوشیمی

عنوان مقاله English

Effect of different extraction conditions with ultrasound on antiradical and antimicrobial properties of caper (Capparis spinosa) alcoholic extract

نویسندگان English

Mohammad Anvar Kalkali ¹

Hamid Sarhadi ¹

fatemeh shahdadi ²

¹ Department of Food Science & Technology, Bam Branch, Islamic Azad University, Bam, Iran

² Department of Food Science &amp; Technology, Faculty of Agriculture, University of Jiroft, Jiroft, Iran

چکیده English

To extract active ingredients of herbal, several methods including soxhlet and maceration or new technologies such as microwave and ultrasound are being used. The aim of this study was to evaluate the efficiency of ultrasound in extraction of phenolic, antimicrobial and antradical compounds of leaf, root and fruit of Capparis spinosa L. Optimization by response surface method was considered using time factor (10, 25 and 40 minutes) and sound intensity (40, 70 and 100%) with alcoholic solvent (ethanol 76%) was considered. The results showed ultrasound power was more effective factor than time. By increasing of ultrasound power and the time of extraction yield increased. The optimum conditions for alcoholic extraction of antioxidant and antimicrobial compounds were extraction time of 36 min and ultrasound power of 91 percent. In these condition, total phenolic content was obtained 25.47, 17.24 and 23.63 mg/g in leaf, root and fruit, respectively and IC50 was 9.13, 40.20 and 45.30 µg/mg in leaf, root and fruit, respectively. The minimum inhibitory concentration for Bacillus cereus was obtained 1.07, 2.15 and 8.02 mg/ml in leaf, root and fruit, respectively and minimum bactericidal concentration was 1.41 and 8.62 mg/ml in leaf and root. Minimum bactericidal concentration for Bacillus cereus was obtained 12.5 mg/ml in fruit. In general, it was found that alcoholic extracts obtained by ultrasound method had significant phenolic compounds and with increasing time factors and sound intensity, the extraction of antimicrobial compounds from leaves, roots and fruits of plants increased.

کلیدواژه‌ها English

Alcoholic extracts

Antiradical properties

Antimicrobial activity

Capparis spinosa

Ultrasound

تاثیر شرایط مختلف استخراج با امواج فراصوت بر خواص ضدرادیکالی و ضدمیکروبی عصاره الکلی گیاه کبر(Capparis spinosa L.)

محمدانور کلکلی¹، حمید سرحدی¹ و فاطمه شهدادی2^*

¹ ایران، بم، دانشگاه آزاداسلامی، واحد بم، گروه علوم و صنایع غذایی

2 ایران، جیرفت، دانشگاه جیرفت، دانشکده کشاورزی، گروه علوم و صنایع غذایی

تاریخ دریافت: 17/10/1400 تاریخ پذیرش: 24/04/1401

چکیده

برای استخراج مواد موثره گیاهی، روشهای مختلفی از جمله سوکسله و غرقابی و یا فناوریهای جدیدی نظیر مایکروویو و یا امواج فراصوت مورد استفاده قرار می‌گیرند. هدف از این مطالعه، بررسی کارایی استفاده از امواج فراصوت در استخراج ترکیبات فنلی، ضد میکروبی و ضدرادیکالی برگ، ریشه و میوه گیاه کبر میباشد. بهینهسازی به روش سطح پاسخ با استفاده از فاکتور زمان در سه سطح (10، 25 و 40 دقیقه) و شدت صوت نیز در سه سطح (40، 70 و 100 درصد) با حلال الکلی (اتانول 76 درصد) در نظر گرفتهشد. از نتایج آزمونهای انجامشده با روش آماری سطح پاسخ، شدت صوت به عنوان اثربخشترین فاکتور استخراج بدست آمد. شرایط بهینه استخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی با حمام فراصوت، زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بود. در این شرایط میزان ترکیبات فنلی کل برای برگ، ریشه و میوه بهترتیب 47/25، 24/17 و 63/23 میلیگرم بر گرم، میزان بهینه IC₅₀ بهترتیب 13/9، 20/40 و 30/45 میکروگرم بر میلی‌گرم، میزان بهینه MIC باکتری Bacillus cereus به ترتیب 07/1، 15/2 و 02/8 میلیگرم بر میلیلیتر و میزان بهینه MBC باکتری Bacillus cereus عصارههای برگ و ریشه بهترتیب 41/1 و 62/8 میلیگرم بر میلیلیتر و MBC باکتری Bacillus cereus عصاره میوه گیاه 5/12 میلیگرم بر میلیلیتر بدست آمد. بطور کلی مشخص شد که عصارههای الکلی استخراج شده با روش فراصوت دارای ترکیبات فنولی قابل توجهی بودند و با افزایش فاکتورهای زمان و شدت صوت، استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ، ریشه و میوه گیاه افزایش یافت.

واژه های کلیدی: گیاه کبر، عصاره الکلی، خواص آنتی‌اکسیدانی، خواص ضد میکروبی، امواج فراصوت

* نویسنده مسئول، تلفن: 09133495201 ، پست الکترونیکی: fatemeh.shahdadi@gmail.com

مقدمه

امواج صوتی، امواج فشاری هستند که در یک فرکانس خاص نوسان دارند نظیر امواجی که از طریق یک رسانه منتشر می‌شوند. فراصوت (اولتراسوند) به امواج صوتی اشاره دارد که در فرکانسی فراتر از حدود مجاز شنوایی انسان نوسان دارند. فرکانس فراصوتی که برای انجام فرآوری و واکنشهای شیمیایی استفاده شده است معمولا محدودهای بین 16 و 3000 کیلوهرتز را پوشش می‌دهد (23).

استخراج به کمک امواج فراصوت از جمله مهمترین روش‌های جداسازی ترکیبات ارزشمند از منابع گیاهی محسوب می‌شود که در مقیاس‌های بزرگ و کوچک قابل اجرا می‌باشد. سامانه‌های آشکارساز و حمام دو روش رایج استفاده از امواج فراصوت هستند. در حمام فراصوت به منظور پراکندگی مواد جامد در حلال، فراصوت اندازه ذرات را به طور چشمگیری کاهش می‌دهد و باعث افزایش قابلیت انحلال پذیری آنها می‌شود. حمام فراصوت می‌تواند برای طیف گسترده‌ای از نمونه‌ها استفاده شود و قابلیت تکرارپذیری بالایی دارد (1). روش حمام فراصوت به منظور استخراج از نمونه‌های خشک شده و پودر شده در مقیاس بزرگ و صنعتی روشی کارآمد می‌باشد (35).

گیاه کبر با نام علمی Capparis spinosa L. از راسته میخک‌سانان و از خانواده کور یا علف مار است. کاپاریس شامل 250 گونه است که اغلب آنها وحشی هستند و در زمین‌های خشک و نیمه‌خشک نواحی گرمسیری و نیمه‌گرمسیری پراکنده شده‌اند (20). کبر یک گیاه بوته‌ای چندساله مقاوم به خشکی معمولا با سازگاری قابل توجه به محیط‌های سخت می‌باشد (17). کبر دارای خواص ضددیابت و کاهنده لیپیدهای خون می‌باشد (26). مطالعات متعدد نشان داده‌اند که استفاده از قسمت‌های مختلف گیاه از جمله ریشه، میوه، برگ و بذر به طور معنی‌داری باعث کاهش سطح گلوکز خون، کاهش سطح تری گلیسرید و کلسترول سرم، افزایش سطح HDL و کاهش سطح LDL سرم شدهاست (18 ، 36).

در مطالعات متعدد ترکیبات فنولی و آنتیاکسیدانی زیادی برای این گیاه گزارش شده است. نجفی و اسماعیلزاده (1395) اسـتخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی گیاه کبر از استان سیستان و بلوچستان را با استفاده از حلالهای مختلف و مایکروویو بهینهسازی کردند. شـرایط استخراج شامل حلال، زمان، دما و توان دستگاه بود. نتایج نشان داد عصاره اتـانولی بـا شرایط توان 300 وات، زمان 15 دقیقـه و درجـه حـرارت 85 درجـه سـانتیگـراد یـک تیمـار بهینـه بـرای اسـتخراج ترکیبـات آنتیاکسیدانی عصاره بود (11). صفری و همکاران (1399) مطالعهای با هدف بررسی تنوع فیتوشیمیایی و آنتی اکسیدانی میوه برخی گونههای کبر در استان آذربایجان غربی انجام دادند. عصارهگیری ازمیوهها با استفاده از حلال متانول و روش فراصوت انجام گرفت. نتایج ارزیابی فیتوشیمیایی نشان داد که میانگین فعالیت آنتیاکسیدانی به روش DPPH بین 63/41 تا 20/66 درصد بود. مقدار فنول کل به ترتیب بین 96/4 تا 52/12 میلی گرم معادل گالیک اسید بر گرم وزن تر میوه بود (6). جلالی نیا و همکاران (1400) میزان فنل کل،فلاونوئیدها و فعالیت آنتی اکسیدانی گل، میوه و برگ سه جمعیت ازگیاه کبر درتهران ، زابل و گرگان را که شرایط اقلیمی کاملا متفاوتی دارند بررسی نمودند. نتایج این بررسی نشان دادکه میزان فنل هاو فلاونوئیدها و فعالیت آنتی اکسیدانی در گل ها بیشتر از برگ و در برگ ها بیشتر از میوه است. همچنین به نظر میرسد میزان ترکیبات شیمیایی وفعالیت آنتی اکسیدانی جمعیت های مختلف گیاه کبر با دو عامل اقلیمی دما و رطوبت همبستگی دارد (2). نوشاد و همکاران (1401) در پژوهشی، ترکیبات فنولی، فعالیت آنتی اکسیدانی و ضدمیکروبی عصاره اتانولی میوه گیاه کبر را بررسی نمودند و گزارش کردند که فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره اتانولی میوه گیاه کبر بر پایه مهار رادیکال‌های آزاد DPPH و ABTS به ترتیب 73/52 و 62/58 درصد بود. در بررسی اثرات اثر مشخص شد که باکتری‌های گرم مثبت حساسیت بالاتری نسبت به انواع گرم منفی در برابر عصاره نشان دادند (12).

یکی از اثرات مهم عصارههای گیاهی که امروزه بسیار مورد توجه قرار گرفتهاست، اثرات ضدمیکروبی آنها میباشند. در پژوهش حاضر تاثیر ضدمیکروبی عصارههای مختلف گیاه کبر نیز مورد بررسی قرار گرفت. دوباکتری مهم پاتوژن که باعث ایجاد بیماری میشوند Bacillus cereus و Pseudomonas aeruginosa میباشند. Bacillus cereus یکی از انواع باکتریهای میلهای شکل، گرم مثبت و هاگ‌دار است. هاگ این باکتری به صورت گسترده‌ای در طبیعت، آب و خاک پراکنده شده به طوری که می‌توان آن را از مواد غذایی گوناگون جدا نمود. این باکتری از مهم ترین باکتریهای عامل مسمومیت غذایی در انسان میباشد (28).Pseudomonas aeruginosa یک باکتریِِِ میلهای گرم منفی است که در خاک، آب و دیگر محیطهای نمناک یافت می‌شود. این باکتری بیشتر از راه میوه‌ها، گیاهان و سبزی‌ها، عیادت کنندگان و بیمارانی که از دیگر بخش‌ها منتقل می‌شوند وارد محیط بیمارستان می‌شود. گسترش وانتشار از بیماری به بیمار دیگر بوسیله دست‌های پرسنل بیمارستان، همچنین تماس مستقیم بیمار با منابع آلوده مانند خوردن آب و خوراک آلوده رخ می‌دهد (33).

با بررسی مطالعات انجام گرفته بر روی این گیاه و با توجه به اینکه واریته‌های گیاه کبر در کشور ما و شرایط آب و هوایی سخت رشد می‌‌کنند و دارای خواص غذایی و دارویی فراوانی میباشند و نظر به اینکه تاکنون پژوهشی در مورد این گیاه در استان کرمان انجام نشدهاست، هدف این پژوهش بررسی میزان ترکیبات فنولی، فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی عصاره الکلی (اتانولی) برگ، میوه و ریشه گیاه کبر استخراج شده به روش فراصوت تحت تاثیر شدتهای صوت و زمانهای متفاوت بود.

مواد و روشها

مواد مورد استفاده در این پژوهش شامل اتانول 76 درجه، معرف فولین سیوکالتو، اسید گالیک، اسید سولفوریک و دی متیل سولفوکسید (مرک آلمان)، معرف 2و2 دی فنیل پیکریل هیدرازیل (سیگما آمریکا)، محیط های کشت نوترینت آگار، محیط کشت مولر هینتون آگار، محیط کشت مولر هینتون براث (مرک آلمان) بودند.

شناسایی و آمادهسازی گیاه: گیاه کبر در اسفندماه سال 1397 از مزرعه تحقیقات گیاهان دارویی شهرستان عنبرآباد در استان کرمان جمعآوری و با همکاری هرباریوم و آزمایشگاه سیستماتیک گیاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد جیرفت مورد شناسایی قرار گرفت. ریشه، برگ و میوه گیاه به ترتیب در ماههای اسفند، اردیبهشت و مرداد ماه جمعآوری و در دمای اتاق و دور از نور خورشید به طور کامل خشک گردید و به منظور آمادهسازی بخشهای مختلف گیاه جهت استخراج عصاره توسط آسیاب آزمایشگاهی پودر و از الکی با مش 40 عبور دادهشد.

تصویر 1- گیاه کبر

فرایند استخراج با حمام فراصوت: جهت تهیه عصاره از ریشه، برگ و میوه گیاه از روش استخراج با حمام فراصوت استفاده گردید. حلال مورد استفاده جهت عصارهگیری اتانول 76 درصد بود. برای استخراج عصاره الکلی به روش فراصوت، 50 گرم از نمونههای پودر شده گیاهی با 200 میلیلیتر حلال اتانول به نسبت 1:4 حجمی/وزنی مخلوط گردید و ظروف حاوی حلال و نمونهها در حمام فراصوت با فرکانس 35 کیلوهرتز قرار داده شد. سطوح تیماری روش فراصوت شامل سه سطح زمان (10، 25 و 40 دقیقه) و سه سطح شدت صوت (40، 70 و 100 درصد) در نظر گرفته شد. پس از اتمام تیمار فراصوت، عصاره استخراج شده با 7800 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ و سپس قسمت شفاف بالای مخلوط جدا و از صافی 45/0 میکرون عبور داده شد. جداسازی حلال و تغلیظ عصاره توسط تبخیر کننده چرخشی تحت خلاء در دمای 40 درجه سانتیگراد و 200 دور در دقیقه انجام شد. به منظور حذف باقیمانده حلال، عصاره تغلیظ شده بر روی پلیت پخش و درون آون خلاء با دمای 40 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا عصاره به طور کامل خشک گردد (8).

اندازهگیری ترکیبات فنولی: جهت انجام آزمون، 100 میکرولیتر از محلول عصاره به لوله آزمایش منتقل و 500 میکرولیتر معرف فولین سیوکالتیو و یک میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. پس از گذشت 1 دقیقه، 5/1 میلیلیتر محلول کربنات سدیم 20 درصد اضافه و توسط شیکر لوله به طور مناسب همگن شد. محتویات لوله آزمایش به مدت 2 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شد و سپس مقدار جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر قرائت گردید (20).

مقدار کل ترکیبات فنولی از معادله خط رسم شده بر مبنای اسید گالیک و به صورت میلی گرم در گرم عصاره بیان شد (معادله 1):

معادله (1)Y=0.0039X+0.0315 R²=0.996

تعیین فعالیت آنتیرادیکالی: تعیین فعالیت آنتیرادیکالی از طریق آزمون DPPH و با استفاده از معرف 2و2-دی فنیل -1- پیکریل هیدرازیل (2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)) انجام گردید. ابتدا رقتهای 1000-100 میکرولیتر بر لیتر از عصارههای بخشهای مختلف گیاه تهیه شد. سپس به سه میلیلیتر از نمونهها،1000 میکرولیتر محلول DPPH(100 میکرومولار در متانول)، اضافه گردید و به مدت 30 ثانیه عمل همزدن انجام شد. محلولهای بدست آمده در دمای اتاق در مکان تاریک به مدت 30 دقیقه نگهداری و جذب آنها در طول موج 517 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد (نمونه کنترل حاوی 3 میلیلیتر متانول و 1000 میکرولیتر محلول DPPH بود) (32). فعالیت آنتیرادیکالی با استفاده از رابطه زیر محاسبه گردید (معادله 2):

Absorbance of control – Absorbance of sample	DPPH Scavenging = % معادله (2)
Absorbance of control

نتایج به صورت IC₅₀ گزارش شد. IC₅₀، غلظتی از عصاره است که میزان رادیکالهای آزاد DPPH را به نصف کاهش دهد. این شاخص با استفاده از معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد غلظت عصاره بر حسب درصد به دام اندازی رادیکال آزاد به دست آمد (معادله 3).

معادله (3) y = 1.3534 x + 0.58

که در این معادله y درصد حذف رادیکال آزاد و x غلظت بر حسب میکروگرم بر میلیگرم میباشد.

آزمونهای بررسی فعالیت ضد میکروبی

1-تهیه غلظت مادر از عصاره الکلی: غلظت مادر 200 میلیگرم بر میلی لیتر از پودر عصاره خشک شده الکلی با استفاده از دیمتیلسولفوکساید 5% آماده گردید و با عبور از فیلتر میکروبی با قطر منافذ 45/0 میکرون استریل شد (10).

2-تهیه سوسپانسیون باکتریایی نیم مک فارلند: محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه با آن مقایسه میشود. این محیط حاوی۱۰^۸ × 5/1 باکتری است. برای تهیه کدورت نیم مک فارلند 5/0 میلی لیتر کلرید باریم 48/0 مولار در 5/99 میلیلیتر اسید سولفوریک 36/0نرمال مخلوط گردید (25).

آمپول های لیوفیلیزه 1015 Bacillus cereus PTCC و Pseudomonas aeruginosa PTCC 1430 از مرکز منطقهای کلکسیونهای قارچها و باکتریهای صنعتی ایران خریداری و مطابق دستورالعمل ارسالی به شرح ذیل عمل احیاء سویه ها انجام گردید:

آمپول لیوفیلیزه باکتریها در شرایط استریل باز شد و حدود 5/0 میلی لیتر از محلول رینگر استریل به ماده خشک درون آن اضافه و با دقت جهت تهیه یک سوسپانسیون یکنواخت مخلوط گردید. کل سوسپانسیون تهیه شده باکتری هایBacillus cereus و Pseudomonas aeruginosa در سطح شیبدار محیط کشت لولهای نوترینت آگار تلقیح و سپس لولهها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد جهت رشد باکتریایی گرمخانهگذاری گردید. به میزانی از باکتریهای رشدیافته درون لولهها به محلول رینگر استریل اضافه شد که کدروتی معادل محلول استاندارد نیم مک فارلند و با جذبی معادل 13/0-08/0 در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر حاصل شد (21).

3-تعیین حداقل غلظت ممانعتکننده از رشد (Minimum Inhibitory Concentration): جهت تعیین حداقل غلظت ممانعتکننده از رشد به روش رقیقسازی میکرو (Microdilution) از غلظت مادر 200 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره های الکلی برگ، ریشه و میوه گیاه جهت تهیه غلظتهای سریالی به ترتیب ذیل استفاده گردید. در میکروپلیتهای 96 خانه، نخست درون چاهک های 12 عددی هر ردیف، میزان 95 میکرولیتر محیط کشت مولر هینتون براث استریل با غلظت مضاعف اضافه شد. سپس 100 میکرولیتر از غلظت مادر 200 میلیگرم بر میلیلیتر عصارههای الکلی به چاهک اول منتقل و غلظت 100 میلیگرم بر میلیلیتر از عصارهها تهیه گردید. در ادامه 100 میکرولیتر از چاهک اول به چاهک دوم منتقل و غلظت 50 میلیگرم بر میلیلیتر از عصارهها تهیه شد. این ترتیب برای همه چاهکها به جز چاهک شماره 12 که به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شده است، ادامه یافت. چاهک شماره 11 به عنوان شاهد و کنترل منفی در نظر گرفته شد. در ادامه 5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی معادل کدورت استاندارد نیم مک فارلند حاوی (cfu/ml) 10⁸×5/1 به هر یک از چاهکها به جز چاهک شماره 11 اضافه گردید. سپس میکروپلیت به مدت 7 ثانیه در شیکر الایزا تکان داده شد و میزان کدورت اولیه چاهک ها در طول موج 625 نانومتر قرائت گردید. در ادامه میکروپلیت در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شد و پس از گذشت این زمان میزان جذب یا کدورت چاهکها مجددا توسط دستگاه الایزا قرائت و مقایسه گردید. کمترین غلظت عصاره که سبب ممانعت از رشد باکتری گردیده بود به عنوان حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) در نظر گرفته شد (29).

4-تعیین حداقل غلظت باکتریکشی (Minimum Bactericidal Concentration): حداقل غلظت باکتریکشی با توجه به مقادیر MIC برای هر عصاره تعیین گردید به طوری که میزان 5 میکرولیتر از چاهکهایی که رشد باکتری در آنها متوقف شده است به پلیت های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار تلقیح و به طور یکنواخت پخش گردید و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. پایینترین غلظت عصاره که در آن 9/99 درصد باکتریها رشد نکرده (فاقد رشد باکتری) بودند به عنوان MBC در نظر گرفته شد (7).

روش آماری: به منظور بررسی اثر متغیرهای ثابت مطالعه (زمان و شدت صوت) بر روی مقدار ترکیبات فنولی، قدرت گیرندگی رادیکال آزاد و همچنین بهینه‌سازی فرآیند استخراج و در نهایت خصوصیات ضد میکروبی عصاره از روش سطح پاسخ (RSM) استفاده شد و نرم افزار مورد استفاده Design Expert نسخه 11 بود. مقایسات میانگینها بوسیله آزمون دانکن و در سطح α=0.01 به وسیله نرم افزار SAS 9.4 صورت گرفت.

نتایج

بررسی نتایج بدست آمده و مقایسه بین مدلهای رگرسیونی حاکی از آن بود که در این مطالعه مدل Quadratic ، دارای اختلاف معنیدار با سایر مدل‌ها بوده و همچنین Lack of Fit برای آن معنی‌دار نشد. در نتیجه مدل Quadratic برای بررسی روند تغییرات پارامترهای اندازه گیری شده در این مطالعه انتخاب شد.

پس از انتخاب بهترین مدل در سطح آماری مورد نظر (99% یا 95%)، جهت بررسی پارامترهای اثرگذار در مطالعه با توجه به جدول Anova، پارامتری که آزمون F برای آن معنی‌دار نباشد (P>0.01) از مدل حذف می‌شود و سایر پارامترها که دارای اختلاف معنی‌دار در سطح (99%) هستند در مدل نگهداشته میشوند. لازم به ذکر است در صورتی که پارامتر خطی یک متغیر در یک مدل، اثر معنیداری نداشتهباشد ولی اثر متقابل آن با یکی از متغیرهای دیگر که آن متغیر دارای اثر معنی‌داری در مدل بوده، دارای اثر معنی‌دار باشد آن پارامتر در مدل نگهداشته می‌شود و سپس در معادله کلی با استفاده از ضرایب داده شده برای هر پارامتر حاصل می‌گردد. نهایتا در میان پارامترهای مختلف، پارامتری که بیشترین مجموع مربعات را داشتهباشد به عنوان اثرگذارترین پارامتر و برعکس انتخاب می‌شود.

میزان ترکیبات فنولی کل عصارههای اتانولی برگ، ریشه و میوه گیاه: بر اساس طرح RSM، مدل Box-Behnken جهت کسب حداکثر اطلاعات با انجام کمترین میزان آزمایشات و بررسی 2 متغیر (زمان و شدت صوت) در 3 سطح، 13 عصاره از هر قسمت برگ، ریشه و میوه گیاه کبر استخراج و میزان ترکیبات فنولی کل با استفاده از نمودار استاندارد رسم شده بر حسب میلیگرم بر گرم اسید گالیک محاسبه گردید (جدول 1).

جدول 1- تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ و مقادیر ترکیبات فنولی کل (TPC) عصارههای گیاه

ترکیبات فنولی کل (میلیگرم/گرم معادل گالیک اسید)			شرایط استخراج عصاره	تیمار
میوه	ریشه	برگ	شرایط استخراج عصاره	تیمار
^d5/1±82/12	^e1/1±58/6	^e*2/1±22/13	شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه	1
^d5/1±02/12	^e3/1±25/6	^e1/1±48/12	شدت صوت 40 درصد و زمان 25 دقیقه	2
^c5/1±10/15	^e0/1±10/7	^d5/1±32/15	شدت صوت 49 درصد و زمان 36 دقیقه	3
^c7/1±48/16	^de3/1±24/8	^cd1/1±45/16	شدت صوت 70 درصد و زمان 10 دقیقه	4
^b3/1±30/19	^cd5/1±46/10	^c1/2±28/18	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	5
^b5/1±36/19	^cd2/1±52/10	^c5/1±22/18	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	6
^b2/1±32/19	^cd1/1±40/10	^c5/1±25/18	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	7
^b2/1±29/19	^cd5/1±44/10	^c4/1±27/18	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	8
^b2/1±34/19	^cd4/1±48/10	^c5/1±20/18	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	9
^ab5/1±14/21	^c4/1±34/12	^b0/2±18/21	شدت صوت 70 درصد و زمان 40 دقیقه	10
^ab1/1±16/22	^ab1/1±22/15	^b4/1±14/22	شدت صوت 91 درصد و زمان 14 دقیقه	11
^a0/1±10/24	^a5/1±35/18	^a1/1±20/26	شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه	12
^a5/1±22/23	^a3/1±12/17	^a6/1±/25	شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه	13

*در هر ستون اعداد با حروف غیرمشابه از لحاظ آماری تفاوت معنیدار دارند (p<0.05).

شکل 1- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان ترکیبات فنولی کل عصاره برگ گیاه

شکل 2- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان ترکیبات فنولی کل عصاره ریشه گیاه

شکل 3- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان ترکیبات فنولی کل میوه گیاه

نتایج نشان میدهد بین عصارههای الکلی برگ و ریشه گیاه کبر، عصاره های الکلی ریشه با عصاره های الکلی برگ و میوه و همچنین عصارههای میوه و ریشه اختلاف معنیداری در سطح 99% (P<0.01) مشاهده گردید. در روش RSM مرحله‌ای به نام Verification وجود دارد، در این مرحله میتوان میزان استخراج ترکیبات فنولی کل از برگ، ریشه و میوه گیاه با استفاده از حلال اتانول را در مرحله آزمایش با مقدار پیشگویی شده توسط مدل به طریق آماری مقایسه نمود. در این بررسی پس از انجام این مرحله، مقادیر مشاهده شده (Y₀) با مقادیر پیش‌بینی‌شده (Y) مقایسه گردیدند. نتایج، بیانگر همبستگی بسیار خوب بین نتایج بدست آمده با روش تجربی و مقادیر پیش‌بینی‌شده با روش آماری هستند و ضریب تبیین بالای بین مقادیر واقعی و پیشبینی شده را نشان میدهند. با توجه به نمودارهای Surface (شکلهای 1، 2 و 3) با افزایش زمان و شدت صوت، میزان استخراج ترکیبات فنولی از برگ، ریشه و میوه گیاه با استفاده از حلال اتانول افزایش مییابد. با توجه به پارامترهای معنیدار در فرآیند استخراج ترکیبات فنولی کل از برگ، ریشه و میوه گیاه، معادلات کلی را میتوان بصورت زیر گزارش کرد:

معادله 1: معادله کلی میزان استخراج ترکیبات فنولی کل از برگ گیاه

Y=16.753 + 1.4862 A + 4.677 B + 1.63269 C + 0.504125 B²

معادله 2: معادله کلی میزان استخراج ترکیبات فنولی کل از ریشه گیاه

Y=9.895 + 1.12114 A+ 4.27744 B + 0.888462 C + 0.590312 B²

معادله 3: معادله کلی میزان استخراج ترکیبات فنولی کل از میوه گیاه

Y=14.5031 + 1.24586 A + 3.62534 B + 4.23923 C

که Y: میزان ترکیبات فنولی کل استخراجی بر حسب میلیگرم بر گرم، A: زمان بر حسب دقیقه، B: شدت صوت بر حسب درصد و C: اثر حلال می باشد.

با توجه به معادلههای 1، 2 و3 و مقادیر مجموع مربعات برای هر پارامتر موثر در استخراج، شدت صوت (B) بعنوان موثرترین فاکتور استخراج ترکیبات فنولی کل از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر انتخاب گردید.

شرایط بهینه استخراج ترکیبات فنولی کل از برگ گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت به میزان 47/25 میلیگرم بر گرم، شرایط بهینه استخراج ترکیبات فنولی کل از ریشه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت به میزان 24/17 میلیگرم بر گرم و شرایط بهینه استخراج ترکیبات فنولی کل از میوه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت به میزان 63/23 میلیگرم بر گرم مشاهده گردید. نتایج بهینه سازی حاکی از آن است که در شرایط استخراج (دما، شدت صوت و حلال) یکسان، میزان ترکیبات فنولی کل استخراجی از برگ گیاه کبر با میزان 47/25 میلیگرم بر گرم بیشتر از قسمت های ریشه و میوه گیاه است.

میزان IC₅₀ عصارههای برگ، ریشه و میوه گیاه

جدول 2- تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ و مقادیر IC₅₀ عصارههای گیاه

IC₅₀ (μg/mg)			شرایط استخراج عصاره	تیمار
میوه	ریشه	برگ	شرایط استخراج عصاره	تیمار
^b9/3±92/87	^a1/5±12/78	^ab^*5/1±75/18	شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه	1
^a4/4±74/90	^a2/4±28/79	^a3/2±47/19	شدت صوت 40 درصد و زمان 25 دقیقه	2
^bc2/4±22/85	^b7/3±00/75	^bc3/1±04/17	شدت صوت 49 درصد و زمان 36 دقیقه	3
^d5/3±52/81	^c6/3±36/70	^c6/1±31/16	شدت صوت 70 درصد و زمان 10 دقیقه	4
^e1/4±78/67	^de9/2±23/63	^d4/2±43/14	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	5
^fg5/2±50/62	^e4/4±83/61	^d4/1±47/14	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	6
^ef4/3±41/65	^d6/3±32/64	^d1/1±44/14	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	7
^e6/2±61/68	^de9/4±93/63	^d3/1±43/14	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	8
^g2/4±21/63	^de5/3±50/62	^d7/1±48/14	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	9
^h3/3±35/54	^f3/3±26/56	^e5/1±72/11	شدت صوت 70 درصد و زمان 40 دقیقه	10
ⁱ6/3±62/51	^g8/2±87/46	^e2/2±03/11	شدت صوت 91 درصد و زمان 14 دقیقه	11
^j8/2±87/46	ⁱ5/3±50/37	^f8/1±04/9	شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه	12
^j1/3±67/47	^h1/2±19/40	^f4/1±43/9	شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه	13

*در هر ستون اعداد با حروف غیرمشابه از لحاظ آماری تفاوت معنیدار دارند (p<0.05).

شکل 4- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان IC₅₀ عصاره برگ گیاه

شکل 5- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان IC₅₀ عصاره ریشه گیاه

شکل 6- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان IC₅₀ عصاره میوه گیاه

میزان IC₅₀ عصارههای برگ، ریشه و میوه گیاه کبر با حلال اتانول به روش فراصوت به ترتیب 29/3±25/14، 36/13±49/61 و 16/15±19/67 میکروگرم بر میلیگرم بودند. نتایج حاصل از مقایسه میزان IC₅₀ عصارههای استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر در مرحله آزمایش با مقدار پیشگویی شده توسط مدل بطریق آماری بیانگر همبستگی بسیار خوب بین نتایج بدست آمده با روش تجربی و مقادیر پیش‌بینی‌شده با روش آماری هستند. با توجه به نمودارهای Surface (شکلهای 4، 5 و 6) با افزایش زمان و شدت صوت، میزان IC₅₀ عصارههای استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر با حلال اتانول کاهش مییابد. با توجه به پارامترهای معنیدار در فرآیند استخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی از برگ، ریشه و میوه گیاه، معادلات کلی را میتوان بصورت زیر گزارش کرد:

معادله 4: معادله کلی تعیین میزان IC₅₀ عصاره استخراجی از برگ گیاه

Y=17.9085 – 1.94444 A – 5.87362 B – 3.65385 C + 0.719286 AC + 2.06586 BC

معادله 5: معادله کلی تعیین میزان IC₅₀ عصاره استخراجی از ریشه گیاه

Y=66.1742 – 4.15504 A – 14.9191 B – 4.68269 C

معادله 6: معادله کلی تعیین میزان IC₅₀ عصاره استخراجی از میوه گیاه

Y=65/8277 - 4/55282 A - 13/3569 B – 3/6295 BC

که Y: میزان IC₅₀ عصاره استخراجی بر حسب میکروگرم بر میلیگرم، A: زمان بر حسب دقیقه، B: شدت صوت بر حسب درصد و C: اثر حلال می باشد.

با توجه به معادلههای 4، 5 و 6 و مقادیر مجموع مربعات برای هر پارامتر موثر در استخراج، شدت صوت (B) به عنوان موثرترین فاکتور استخراج ترکیبات آنتی اکسیدانی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر انتخاب گردید.

شرایط بهینه IC₅₀ عصاره های استخراجی از برگ گیاه به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت بمیزان 13/9 میکروگرم بر میلیگرم، شرایط بهینه IC₅₀ عصارههای استخراجی از ریشه گیاه به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت بمیزان 20/40 میکروگرم بر میلیگرم و شرایط بهینه IC₅₀ عصاره های استخراجی از میوه گیاه به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد حمام فراصوت بمیزان 30/45 میکروگرم بر میلیگرم مشاهده گردیدند.

حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصارههای استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر

جدول 3- تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ و مقادیر حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصارهها

حداقل غلظت بازدارندگی (میلیگرم/میلیلیتر)			شرایط استخراج عصاره	تیمار
میوه	ریشه	برگ	شرایط استخراج عصاره	تیمار
50	5/12	25/6	شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه	1
50	5/12	25/6	شدت صوت 40 درصد و زمان 25 دقیقه	2
25	5/12	25/6	شدت صوت 49 درصد و زمان 36 دقیقه	3
25	5/12	25/6	شدت صوت 70 درصد و زمان 10 دقیقه	4
5/12	25/6	12/3	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	5
5/12	25/6	12/3	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	6
5/12	25/6	12/3	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	7
5/12	25/6	12/3	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	8
5/12	25/6	12/3	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	9
5/12	12/3	56/1	شدت صوت 70 درصد و زمان 40 دقیقه	10
25/6	12/3	56/1	شدت صوت 91 درصد و زمان 14 دقیقه	11
25/6	12/3	56/1	شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه	12
25/6	12/3	56/1	شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه	13

شکل 7- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره برگ گیاه

شکل 8- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره ریشه گیاه

شکل 9- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره میوه گیاه

نتایج حاصل از مقایسه میزان MIC عصاره های استخراجی از برگ و میوه گیاه کبر با حلال اتانول بر باکتری Bacillus cereus در مرحله آزمایش با مقدار پیشگویی شده توسط مدل بطریق آماری بیانگر همبستگی بسیار خوب بین نتایج بدست آمده با روش تجربی و مقادیر پیش‌بینی‌شده با روش آماری هستند. با توجه به نمودارهای Surface (شکلهای 7، 8 و 9) با افزایش زمان و شدت صوت، میزان MIC عصارههای الکلی برگ، ریشه و میوه گیاه کبر دربرابر باکتری Bacillus cereus کاهش مییابد. عصارههای الکلی استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر در شدتهای صوت بالا (91 و 100 درصد) قابلیت مهار رشد باکتری Bacillus cereus را در غلظت های پایین بترتیب 56/1، 12/3 و 25/6 میلیگرم بر میلیلیتر از خود نشان داده اند که بیانگر حساسیت زیاد باکتری Bacillus cereus به این عصارههای استخراجی میباشد. در شدت صوت پایین (40 درصد) عصارههای الکلی برگ گیاه، کمترین MIC (25/6 میلیگرم بر میلیلیتر) را نسبت به عصارههای الکلی ریشه و میوه بترتیب 5/12 و 50 میلیگرم بر میلیلیتر نشان دادهاند.

با توجه به پارامترهای معنی دار در فرآیند استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ، ریشه و میوه گیاه، معادلات کلی را میتوان بصورت زیر گزارش کرد:

معادله 7: معادله کلی تعیین میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره استخراجی از برگ گیاه

Y=4.685 – 2.02487 A – 4.88848 B – 2.765 C + 1.5625 AB + 1.19579 AC +2.8869 BC+ 2.14875 B²

معادله 8: معادله کلی تعیین میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره استخراجی از ریشه گیاه با حلال اتانول

Y=18.0281 – 4.14365 A – 10.0036 B – 10.8181 C + 6.00048 BC

معادله 9: معادله کلی تعیین میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد Bacillus cereus عصاره استخراجی از میوه گیاه با حلال اتانول

Y=18.75 – 8.00206 A – 23.3197 B – 9.375 C + 9.375 AB + 2.66735 AC + 7.77324 BC + 4.10156 A² + 11.1328 B²

که Y: میزان MIC عصاره استخراجی بر حسب میلیگرم بر میلی لیتر، A: زمان بر حسب دقیقه، B: شدت صوت بر حسب درصد و C: اثر حلال می باشد.

با توجه به معادله های 7، 8 و 9 و مقادیر مجموع مربعات برای هر پارامتر موثر در استخراج، شدت صوت (B) بعنوان موثرترین فاکتور استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر انتخاب گردید.

شرایط بهینه حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری Bacillus cereus عصاره های استخراجی از برگ گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 07/1 میلیگرم بر میلیلیتر، شرایط بهینه حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری Bacillus cereus عصارههای استخراجی از ریشه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 15/2 میلیگرم بر میلیلیتر و شرایط بهینه حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری Bacillus cereus عصارههای استخراجی از میوه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 02/8 میلیگرم بر میلیلیتر مشاهده گردید.

حداقل غلظت بازدارندگی از رشد Pseudomonas aeruginosa عصارههای برگ، ریشه و میوه گیاه کبر

جدول 4- تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ و مقادیر حداقل غلظت بازدارندگی رشد Pseudomonas aeruginosa عصاره های گیاه

حداقل غلظت بازدارندگی (میلیگرم/میلیلیتر)			شرایط استخراج عصاره	تیمار
میوه	ریشه	برگ	شرایط استخراج عصاره	تیمار
100<	100	100	شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه	1
100<	100	100	شدت صوت 40 درصد و زمان 25 دقیقه	2
100<	50	50	شدت صوت 49 درصد و زمان 36 دقیقه	3
100<	50	50	شدت صوت 70 درصد و زمان 10 دقیقه	4
100	25	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	5
100	25	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	6
100	25	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	7
100	25	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	8
100	25	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	9
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 40 دقیقه	10
50	25	5/12	شدت صوت 91 درصد و زمان 14 دقیقه	11
25	5/12	25/6	شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه	12
25	5/12	25/6	شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه	13

میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد عصارههای الکلی برگ گیاه کبر در برابر باکتری Pseudomonas aeruginosa بسته به شدت صوت و زمان استخراج از 25/6-100 میلیگرم بر میلیلیتر، عصاره های الکلی ریشه گیاه کبر از 5/12-100 میلیگرم بر میلی لیتر و عصاره های الکلی میوه گیاه کبر از 25-بیشتر از 100 میلی گرم بر میلی لیتر متغیر بود. در شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه، عصاره الکلی برگ میزان MIC کمتری را نسبت به عصاره ریشه و میوه دارا می باشد. در شدت صوت پایین 40 درصد و زمان 25 دقیقه، عصاره برگ و ریشه میزان MIC یکسان 100 میلیگرم بر میلیلیتر را در برابر باکتری Pseudomonas aeruginosa از خود نشان داد در حالیکه عصاره الکلی میوه هیچ بازدارندگی رشدی را در برابر باکتری Pseudomonas aeruginosa از خود نشان نداد. از مقایسه مقادیر حداقل غلظت بازدارندگی رشد عصارههای استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه در شدت های صوت پایین 40 و 49 درصد میتوان چنین نتیجه گرفت که باکتری Pseudomonas aeruginosa مقاومت زیادی را از خود نشان داد. در مجموع عصاره میوه نسبت به عصارههای برگ و ریشه حداقل غلظت بازدارندگی رشد بیشتری داشتتند.

حداقل غلظت باکتریکشی (MBC) Bacillus cereus عصارههای برگ، ریشه و میوه گیاه کبر

جدول 5- تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ و مقادیر حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره های گیاه

حداقل غلظت باکتریکشی (میلیگرم/میلیلیتر)			شرایط استخراج عصاره	تیمار
میوه	ریشه	برگ	شرایط استخراج عصاره	تیمار
100<	50	25	شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه	1
100<	50	25	شدت صوت 40 درصد و زمان 25 دقیقه	2
100	50	25	شدت صوت 49 درصد و زمان 36 دقیقه	3
100	50	25	شدت صوت 70 درصد و زمان 10 دقیقه	4
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	5
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	6
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	7
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	8
50	25	5/12	شدت صوت 70 درصد و زمان 25 دقیقه	9
50	5/12	25/6	شدت صوت 70 درصد و زمان 40 دقیقه	10
50	5/12	25/6	شدت صوت 91 درصد و زمان 14 دقیقه	11
25	5/12	12/3	شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه	12
25	5/12	12/3	شدت صوت 91 درصد و زمان 36 دقیقه	13

شکل 10- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره برگ گیاه

شکل 11- نمایش نمودار سه بعدی، اثر همزمان دو متغیر زمان و شدت صوت بر میزان حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره ریشه گیاه

نتایج حاصل از مقایسه میزان MBC عصارههای استخراجی از برگ گیاه کبر با حلال اتانول بر باکتری Bacillus cereus در مرحله آزمایش با مقدار پیشگوییشده توسط مدل بطریق آماری بیانگر همبستگی نسبتا خوب بین نتایج بدست آمده با روش تجربی و مقادیر پیش‌بینی‌شده با روش آماری هستند. با توجه به نمودارهای Surface (شکلهای 10 و 11) با افزایش زمان و شدت صوت، میزان MBC عصارههای برگ و ریشه گیاه کبر در برابر باکتری Bacillus cereus کاهش یافت. عصارههای استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر در شدت صوت بالای 91 درصد و زمان 36 دقیقه و نیز شدت صوت 100 درصد و زمان 25 دقیقه قابلیت باکتریکشی 9/99 درصد از باکتری Bacillus cereus را بترتیب در غلظت 12/3، 5/12 و 25 میلیگرم بر میلیلیتر از خود نشان داد که بیانگر فعالیت ضد میکروبی بالای عصارههای استخراجی از برگ گیاه نسبت به عصارههای ریشه و میوه میباشد. این موضوع در مورد عصارههای الکلی استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه کبر در شدت صوت پایین 40 درصد و زمان 25 دقیقه و نیز شدت صوت 49 درصد و زمان 14 دقیقه بترتیب با غلظت 25، 50 و بیشتر از 100 میلیگرم بر میلیلیتر نیز صدق میکند و تاثیر ترکیبات فنولی از جمله روتین موجود در برگ گیاه را در فعالیت آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی نسبت به اندام های ریشه و میوه گیاه نشان میدهد.

با توجه به پارامترهای معنی دار در فرآیند استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ و ریشه گیاه، معادلات کلی را میتوان بصورت زیر گزارش کرد:

معادله 10: معادله کلی تعیین میزان حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره استخراجی از برگ گیاه

Y=20.9131 – 5.55809 A – 13.4184 B – 6.97154 C + 4.4718 BC

معادله 11: معادله کلی تعیین میزان حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره استخراجی از ریشه گیاه

Y=44.2308 – 8.38119 A – 22.4437 B – 15.3846 C

که Y: میزان MBC عصاره استخراجی بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر، A: زمان بر حسب دقیقه، B: شدت صوت بر حسب درصد و C: اثر حلال می باشد.

با توجه به معادله های 10 و 11 مقادیر مجموع مربعات برای هر پارامتر موثر در استخراج، شدت صوت (B) بعنوان موثرترین فاکتور استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ و ریشه گیاه کبر انتخاب گردید.

شرایط بهینه حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصارههای استخراجی از برگ گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 41/1 میلیگرم بر میلیلیتر و شرایط بهینه حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصارههای استخراجی از ریشه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 62/8 میلیگرم بر میلیلیتر مشاهده گردید. حداقل غلظت باکتریکشی Bacillus cereus عصاره استخراجی از میوه گیاه با حلال اتانول به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بمیزان 25 میلی گرم بر میلیلیتر حاصل گردید.

بحث و نتیجهگیری

با توجه به نتایج از این مطالعه مشخص شد که عصارههای اتانولی برگ، ریشه و میوه گیاه کبر دارای ترکیبات فنولی قابل توجهی بودند و با افزایش زمان و شدت صوت، میزان استخراج ترکیبات فنولی از برگ، ریشه و میوه گیاه افزایش یافت.Gu و همکاران (2007) در استخراج کاتکینها و کافئین از چای به روش فراصوت بیان کردند که یک روند افزایشی در میزان استخراج با افزایش زمان وجود دارد. فاکتور زمان مدت انتقال جرم را افزایش میدهد. شدت صوت نیز با محتوای انرژی بالای امواج باعث ایجاد نیروی برشی و شکستن و متلاشیکردن دیوارههای سلولی و افزایش احتمال رهایش محتویات گیاه به محیط استخراج و بهبود انتقال جرم میگردد (19). علاوه بر این فراصوت سبب کاهش اندازه ذرات و افزایش سطح تماس گردیده و در نتیجه انتشار حلال در بافت را افزایش میدهد (24).

راشدی و همکاران (1393) در مطالعهای، میزان ترکیبات فنولی عصارههای متانولی استخراجی از برگ، ساقه و میوه گیاه علف مار (Capparis spinosa L) استان خوزستان را بترتیب 73/28، 40/14 و 14/8 میلیگرم بر گرم گزارش نمودند. آنها میزان ترکیبات فنولی برگ گیاه را بیشتر از اندامهای دیگر گیاه گزارش کردند که با مطالعه حاضر مطابقت دارد (4). در مطالعهای، Bhoyar و همکاران (2011) ، میزان ترکیبات فنولی تام برگ گیاه کبر منطقه ترانس هیمالیا را بین 42/21 تا 62/27 میلی گرم بر گرم گزارش کردند که با میزان بهینه مطالعه حاضر مطابقت دارد (16).

محبوبی و محبوبی (2014) میزان ترکیبات فنولی کل استخراجی از میوه و ریشه گیاه کبر با حلال اتانول 70 درصد را بترتیب 7/31 و 4/22 میکروگرم بر گرم و ترکیبات فنولی کل عصاره اتانولی میوه را بیشتر از ریشه گیاه گزارش کردند (25) که میزان بهینه ترکیبات فنولی کل استخراجی از میوه و ریشه گیاه کبر در مطالعه حاضر کمتر از این میزان بوده اما میزان ترکیبات فنولی کل بیشتر عصاره الکلی میوه نسبت به ریشه گیاه با مطالعه حاضر مطابقت دارد. در پژوهش الازاوی و همکاران (2018) میزان ترکیبات فنولی عصارههای متانولی برگ با غلظتهای 8، 10 و 12 میلیگرم بر لیتر برابر با 62/21، 81/24 و 54/29 میلیگرم بر گرم بود (14). نوشاد و همکاران (1401) میزان ترکیبات فنولی عصاره اتانولی استخراج شده با حلال متانول و روش غوطه وری میوه کبر را 40/28 میلیگرم بر گرم گزارش نمودند (12) که با توجه به زمان زیادی که برای استخراج این ترکیبات در مطالعه ایشان بکار رفتهاست در مقایسه با مطالعه حاضر فقط سه واحد اختلاف مشاهده میشود. تفاوت در میزان ترکیبات فنولی کل میتواند ناشی از تفاوت در شرایط محیطی محل رویش گیاه و شرایط استخراج باشد (15). شرایط استخراج شامل روش استخراج (سنتی غوطهور در حلال، مایکروویو، فراصوت، حلال فوق بحرانی و غیره)، دما، نوع حلال، میزان همزدن و زمان میباشند که تغییر در هر کدام از این فاکتورها مقایسهکردن نتایج مطالعات مختلف را دشوار می کند (19).

دهقان تنها و همکاران (1398) در مطالعه ای به بهینهسازی شرایط استخراج ترکیبات فنولی فلفل قرمز با استفاده از حلال متانول به روش سطح پاسخ پرداختند و بیشترین میزان ترکیبات فنولی فلفل قرمز را 6/49 میلیگرم در صد گرم فلفل در دمای 49 درجه سانتیگراد، زمان 39 دقیقه و شدت صوت 8/89 درصد حمام فراصوت گزارش و فاکتور شدت صوت را تاثیرگذارترین پارامتر در استخراج بیان کردند (3) که تقریبا با شرایط بهینه 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد و معرفی شدت صوت بعنوان موثرترین فاکتور در استخراج ترکیبات فنولی کل در مطالعه حاضر مطابقت دارد.

شاخص IC₅₀ به غلظتی از عصاره اختصاص دارد که توانایی مهار 50 درصد از رادیکالهای آزاد DPPH را داشته باشد. بدیهی است عصارههایی که در غلظتهای پایینتر توانایی مهار 50 درصد از رادیکالهای آزاد DPPH را داشته باشند دارای فعالیت آنتی اکسیدانی بیشتری هستند. در شرایط بهینه، کارایی عصاره اتانولی برگ گیاه کبر در جمع آوری رادیکالهای DPPH خیلی بیشتر از عصارههای اتانولی ریشه و میوه بود که با میزان ترکیبات فنولی موجود در برگ گیاه رابطه مستقیم دارد. با توجه به اینکه میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در برگ گیاه بیشتر از اندامهای دیگر است و نظر به اینکه ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی از عوامل اصلی آنتیاکسیدان هستند از اینرو بالا بودن فعالیت آنتیاکسیدانی در برگ را میتوان به بالا بودن میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی نسبت داد. از جمله ترکیبات آنتیاکسیدان برگ گیاه کبر میتوان به روتین اشاره کرد (25). نتایج پژوهش هدایتی و همکاران (1401) نشان داد بین میزان ترکیبات فنولی و ظرفیت آنتیاکسیدانی ریشه‌های موئین بذرالبنج (Hyoscyamus reticulatus) رابطه مستقیمی وجود دارد (13). همچنین صادقی و زارعی (1399) نشان دادند که عصاره هگزانی گل گیاه خاکشیر و برگ گیاه شاه‌تره حاوی مقدار بالایی از ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی بودند و بهمین دلیل قدرت مهار رادیکال آزاد بیشتری داشتند (5).

راشدی و همکاران (1393) در مطالعهای ، میزان IC₅₀ عصارههای متانولی برگ، ساقه و میوه گیاه را بترتیب 83/4، 86/6 و 11/6 میکروگرم بر میلیگرم و میزان IC₅₀ برگ گیاه کبر منطقه خوزستان را کمتر از اندامهای دیگر این گیاه گزارش کردند (4) که با مطالعه حاضر مطابقت دارد.Rajhi و همکاران (2021) فعالیت آنتیاکسیدانی عصاره اتانولی برگ گیاه کبر را بر حسب حذف رادیکالهای آزاد DPPH ، 6/84 درصد گزارش کردند (31). Aliyazicioglu و همکاران (2013) در مطالعهای به بررسی ترکیبات فنولیک، فعالیت آنتیاکسیدانی و آنالیز مواد معدنی گیاه Capparis spinosa L. پرداختند. مطالعه بر روی فعالیت آنتیاکسیدانی گیاه نشان داد که میانگین ترکیبات گیاه دارای غلظت بازدارندهای معادل 32/0 میلی گرم بر میلیلیتر میباشند (15) که در مقایسه با نتایج مطالعه حاضر فعالیت آنتیاکسیدانی کمتری را نشان میدهد و میتواند ناشی از تفاوت در شرایط محیطی محل رویش گیاه باشد.

محبوبی و محبوبی (2014) در مطالعه ای، میزان IC₅₀ عصاره های اتانولی ریشه و میوه گیاه کبر را بترتیب 88 و 560 میکروگرم بر میلیلیتر و فعالیت آنتیاکسیدانی عصاره اتانولی ریشه را بیشتر از میوه گزارش کردند (25) که در مقایسه با مطالعه حاضر فعالیت آنتی اکسیدانی کمتری دارند اما میزان IC₅₀ کمتر عصاره اتانولی ریشه نسبت به عصاره اتانولی میوه با مطالعه حاضر مطابقت دارد.

شرایط بهینه حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری Bacillus cereus عصاره های استخراجی از برگ، ریشه و میوه گیاه به روش فراصوت در زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد بترتیب میزان 07/1 ، 15/2 و 02/8 میلی گرم بر میلیلیتر بود. محبوبی و محبوبی (2014) در مطالعهای، میزان حداقل غلظت بازدارندگی رشد عصارههای اتانولی ریشه و میوه گیاه کبر در برابر باکتری Bacillus cereus را بترتیب 2/3 و 4/6 میلیگرم بر میلی لیتر گزارش کردند که در مقایسه با میزان بهینه مطالعه حاضر عصارههای اتانولی ریشه میزان MIC بیشتر و عصارههای اتانولی میوه میزان MIC کمتری دارند (25) اما میزان MIC کمتر عصاره الکلی ریشه نسبت به میوه با مطالعه حاضر مطابقت دارد. Kalpana و Prakash(2015)، عصارههای اتانولی برگ و میوه های گیاه Capparis sepiaria L. را بمنظور بررسی فعالیت ضد میکروبی در برابر شش باکتری Bacillus subtilis ، Escherichia coli، Enterococcus faecalis، Klebsiella pneumoniae، Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus مورد بررسی قرار دادند و بطور مقایسهای، عصاره های اتانولی میوه را دارای فعالیت ضد میکروبی بیشتری نسبت به عصارههای اتانولی برگ گیاه گزارش کردند (22) که در شرایط بهینه مطالعه حاضر، فعالیت ضد میکروبی عصارههای الکلی برگ بیشتر از میوه میباشد.

نتایج پژوهش حاضر نشان که باکتری Pseudomonas aeruginosa در برابر عصاره میوه مقاومت زیادی را از خود نشان داد. در مجموع عصارههای میوه نسبت به عصارههای الکلی برگ و ریشه حداقل غلظت بازدارندگی رشد بیشتری داشتتند. محبوبی امین (1393) در مطالعهای، MIC عصاره تام متانولی حاصل از بخشهای هوایی گیاه Capparis cartilaginea را در برابر Pseudomonas aeruginosa 25/31 میلیگرم بر لیتر گزارش کرد (9) که در مقایسه با میزان MIC مطالعه حاضر دارای حداقل غلظت بازدارندگی رشد کمتری دربرابر باکتری Pseudomonas aeruginosa بود.

رحیمی فرد و همکاران (2015) در مطالعه ای، حداقل غلظت بازدارندگی رشد عصاره تام متانولی حاصل از بخش هوایی گیاه Capparis cartilaginea در برابر باکتری Pseudomonas aeruginosa را 25/31 میکروگرم بر میلیلیتر گزارش کردند (30) که در مقایسه با میزان MIC مطالعه حاضر کمتر بود. آنها همچنین عصاره تام متانولی حاصل از بخشهای هوایی گیاه Capparis mucronifolia را با MIC بیشتر از 1000میلیگرم بر میلیلیتر فاقد قابلیت مهار باکتری Pseudomonas aeruginosa گزارش کردند.

الازاوی و همکاران (2018) در بررسی فعالیت ضد باکتریایی عصاره متانولی برگ گیاه کبر در برابر سویه‌های بیماری‌زا مانند Staphylococcus aureus، Klebsiella pneumoniae،Escherichia coli و Pseudomonas aeruginosa نشان دادند که عصاره متانولی در برابر بیشتر گونههای مورد مطالعه در غلظت 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اثر مهاری داشت در حالی که Pseudomonas aeruginosa در برابر عصاره مقاومت نشان داد (14).

محبوبی و محبوبی (2014) در مطالعهای، میزان حداقل غلظت باکتریکشی عصارههای اتانولی ریشه و میوه گیاه کبر در برابر باکتری Bacillus cereus را بترتیب 8/12 و 2/51 میلیگرم بر میلی لیتر گزارش کردند که نسبت بمیزان بهینه MBC عصاره الکلی ریشه و کمترین میزان حداقل غلظت باکتریکشی عصاره الکلی میوه گیاه در مطالعه حاضر بیشتر بود و از اینرو عصارههای ضعیفتری میباشند (25).

پلیفنولها بدلیل فعالیت بیولوژیکی بالای خود که توسط ترکیب منحصربفرد آنها تعیین میشود، شناخته شدهاند. گزارش شده که فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی عصارههای گیاه کبر ناشی از ترکیبات فنولی شامل فنولهای ساده، اسیدهای فنولی، آنتوسیانینها، مشتقات هیدروکسی سینامیک اسید، فلاوونوئیدها و غیره میباشد (34). با توجه به این مطلب میتوان نتیجه گرفت که عصاره الکلی برگ کبر با دارا بودن ترکیبات فنولی بیشتر، فعالیت آنتیرادیکالی و ضدمیکروبی بالاتری نسبت به عصارههای ریشه و میوه نشان داد (13).

بطور کلی، با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه مشخص شد بهترین مدل تجزیه و تحلیل آماری Quadratic بود که با ضریب تبیین بالایی دادهها را مورد برازش قرارداد. در بررسی نتایج آزمونهای انجام شده با روش آماری سطح پاسخ، شدت صوت به عنوان تاثیر گذارترین فاکتور انتخاب شد و با افزایش فاکتورهای زمان و شدت صوت، استخراج ترکیبات ضد میکروبی از برگ، ریشه و میوه گیاه افزایش یافت. شرایط بهینه استخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی و ضد میکروبی با حمام فراصوت، زمان 36 دقیقه و شدت صوت 91 درصد انتخاب گردید. میزان ترکیبات فنولی کل عصارههای الکلی برگ و میوه گیاه کبر به روش استخراج فراصوت بترتیب با میزان 72/18 و 74/18 میلیگرم بر گرم تقریبا معادل یکدیگر و بیشتر از عصارههای ریشه گیاه با میزان 04/11 میلیگرم بر گرم بودند. عصاره برگ گیاه کبر دارای بیشترین ترکیبات فنولی و قابلیت حذف رادیکالهای آزاد بود.

تشکر و قدردانی

این مقاله بر گرفته از پایاننامه کارشناسی ارشد محمدانور کلکلی با کد 973456 میباشد. بدین وسیله از حمایت مالی دانشگاه آزاد اسلامی واحد بم و همکاری آزمایشگاه این دانشگاه سپاسگزاری میشود.

1- ابونجمی، م.، قربانی، م. و قربانی جاوید، م. 1394. امواج فراصوتی روشی نوین در استخراج ترکیب‌های گیاهی. نشریه علمی ترویجی صوت و ارتعاش، 4(8): 99-85.

2- جلالی نیا، ا.ع.، دهقانی، م. و اسمعیل زاده بهابادی، ص.1400. بررسی رابطه شرایط اقلیمی با میزان ترکیبات فیتوشیمیایی و خواص آنتیاکسیدانی گیاه کبر (.Capparis spinosa L) در زابل، گرگان و تهران، کنفرانس ملی رویین تن سازی سیستان، زابل.

3- دهقان تنها، ر.، مهدیان، ا.، امینی فرد، م.ح.، بیات، ح. و گاراژیان، ر. 1398. بهینهسازی شرایط استخراج ترکیبات فنلی فلفل قرمز با استفاده از امواج فراصوت به روش سطح پاسخ. نشریه نوآوری در علوم و فناوری غذایی، 11(1): 95-85.

4- راشدی، ه.، امیری، ح. و قارزی، ا. 1393. بررسی فیتوشیمیایی و خواص آنتیاکسیدانی گیاه علف مار استان خوزستان. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی قزوین، 18(6): 17-11.

5-صادقی، م. و زارعی، م.ع. 1399. ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی و تعیین میزان فنل و فلاونوئید عصاره هگزانی اندام‌های هوایی گیاهان خاکشیر (Descurainia sophia) و شاه‌تره (Fumaria vaillantii). مجله پژوهشهای گیاهی، 33(2): 373-365.

6- صفری منگودی، س.، علیرضالو، ا.، نیکزاد، ب. و بهادری، م.ب. 1399. بررسی تنوع فیتوشیمیایی و آنتیاکسیدانی برخی نوتیپهای کبر (Capparis spinosa) در استان آذربایجان غربی. اولین همایش ملی چالش های فراروی تکمیل زنجیره‌ی ارزش گیاهان دارویی و معطر،ارومیه.

7- علیزاده بهبهانی، ب.، شهیدی، ف.، طباطبایی یزدی، ف.، مرتضوی، س.ع. و محبی، م. 1395. اثر ضد میکروبی و برهمکنش عصاره های آبی و اتانولی بارهنگ کبیر بر استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا اینوکوا، اشرشیاکلی و سودوموناس آئروژینوزا در شرایط برون تنی. فصلنامه بیماری های عفونی و گرمسیری وابسته به انجمن متخصصین بیماری های عفونی و گرمسیری، 21(75): 8-1.

8- قربانی، م.، ابونجمی، م.، قربانی جاوید، م. و عرب حسینی، ا. 1396. تاثیر شرایط عصاره‌گیری با امواج فراصوت بر عملکرد و خواص آنتی‌اکسیدانی عصاره گیاه رازیانه. مجله علوم و صنایع غذایی، 14(67): 73-63.

9- محبوبی امین، م. 1393. بررسی اثر ضد میکروبی عصاره تام و فراکسیون های اتردوپترولی، کلروفرمی، اتیل استاتی، متانولی و آبی حاصل از بخش هوایی Capparis cartilaginea decne علیه 6 سوش باکتریایی. پایان نامه دکترای داروسازی، دانشکده داروسازی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم دارویی.

10- مهربان، ا. 1393. بررسی اثر ضد میکروبی عصاره های آبی، اتانولی و هیدروالکلی گیاه Salvia chorassanica بر برخی از میکروارگانیسمهای بیماریزا با منشا غذایی در شرایط آزمایشگاهی. پایان نامه کارشناسی ارشد علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

11- نجفی، ش. و اسمعیل زاده بهابادی، ص. 1395. بررسی فیتوشیمیایی، آنتی اکسیدانی و بهینه سازی استخراج مواد موثره میوه گیاهCapparis spinosa L. در منطقه سیستان. اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، 4(3): 45-36.

12-نوشاد، م.، علیزاده بهبهانی، ب. و رحمتی جنیدآباد، م. 1401. عصاره اتانولی کور (Capparis spinosa) فنل، فلاونوئید، پتانسیل آنتی‌اکسیدانی و فعالیت ضدباکتریایی آن بر انتروباکتر آئروژنز، اشرشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز. مجله علوم و صنایع غذایی ایران، 19(124): 216-207.

13-هدایتی، ا.، حسینی، ب.، ملکی، ر. و پالازون، خ. 1401. تاثیر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید (SiO₂ NPs) بر میزان ترکیبات پلی فنولی و ظرفیت آنتی اکسیدانی ریشه‌های موئین بذرالبنج مشبک و کوتاه. مجله پژوهشهای گیاهی،35(1): 98-84.

14- Al-Azawi, A., Ghaima, K. And Salih, H. 2018. Phytochemical, antibacterial and antioxidant activities of Capparis spinosa L. Cultivated in Iraq. Bioscience Research, 15 (3): 2611-2618

15-Aliyazicioglu, R., Eyupoglu, O.E., Sahin, H., Yildiz, O. and Baltas N. 2013. Phenolic components, antioxidant activity, and mineral analysis of Capparis spinosa L. African Journal of Biotechnology, 12(47): 6643-6649.

16- Bhoyar, M.S., Mishra, G.P., Naik, P.K. and Srivastava, R.B. 2011. Estimation of Antioxidant Activity and Total Phenolics Among Natural Populations of Caper (Capparis spinosa) Leaves Collected from Cold Arid Desert of Trans-Himalayas. Australian Journal of Crop Science, 5(7): 912-919.

17-Chedraoui, S., Abi-Rizk, A., El-Beyrouthy, M., Chalak, L., Ouaini, N. and Rajjou, L. 2017. Capparis spinosa L. in a systematic review: A xerophilous species of multi values and promising potentialities for agrosystems under the threat of global warming. Frontiers in Plant Science, 8: 18-35.

18-Eddouks, M., Maghrani, M., Lemhadri, A., Ouahidi, M.L. and Jouad, H. 2002. Ethnopharmacological survey of medicinal plants used for the treatment of diabetes mellitus, hypertension and cardiac diseases in the south-east region of Morocco (Tafilalet). Journal of Ethnopharmacology, 82(2-3): 97-103.

19-Gu, X., Cai, J., Zhang, Z. and Su, Q. 2007. Dynamic Ultrasound‐Assisted Extraction of Catechins and Caffeine in Some Tea Samples. Journal of Environmental Analytical Chemistry, 97(5‐6): 321-330.

20-Jiménez-López, J., Ruiz-Medina, A., Ortega-Barrales, P. and Llorent-Martínez, E. 2018. Phytochemical profile and antioxidant activity of caper berries (Capparis spinosa L.): Evaluation of the influence of the fermentation process. Food chemistry, 250: 54-59.

21-Jokar, M., Rahmani, R.A., Ibrahimi, N.A., Abdullah, L.C. and Tan, C.P. 2012. Melt production and antimicrobial efficiency of low-density polyethylene (LDPE)-silver nanocomposite film. Food and Bioprocess Technology, 5(2): 719-728.

22-Kalpana, B. and Prakash, M. 2015. Antibacterial Activity of Capparis sepiaria L. (Capparidaceae) Leaves and Fruits. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 4(1): 1007-1012.

23-Leong, T.S.H., Manickam, S., Martin, G.J., Li, W. nd Ashokkumar, M. 2018. Ultrasonic Production of Nano-emulsions for Bioactive Delivery in Drug and Food Applications. Springer. 2018; pages: 55-61.

24-Li, J.W., Ding, S.D. and Ding, X.L. 2007. Optimization of the ultrasonically assisted extraction of polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. jinsixiaozao. Journal of Food Engineering, 80(1): 176-183.

25-Mahboubi, M. and Mahboubi, A. 2014. Antimicrobial activity of Capparis spinosa as its usages in traditional medicine. Herba Polonica Journal, 60(1): 39-48.

26-Mollica, A. 2017. Anti-diabetic and anti-hyperlipidemic properties of Capparis spinosa L.: In vivo and in vitro evaluation of its nutraceutical potential. Journal of Functional Foods, 35: 32-42.

27-Moufid, A., Farid, O. and Eddouks, M. 2015. Pharmacological Properties of Capparis spinosa Linn. International Journal of Diabetes and Vascular Disease Research:, 3(5): 99-104.

28- Ombui, J., Gitahi, N. and Gicheru, M. 2008. Direct detection of Bacillus cereus enterotoxin genes in food by multiplex Polymerase Chain Reaction. International Journal of Integrative Biology, 2(3): 77-83

29-Ozturk, S. and Ercisli, S. 2007. Antibacterial activity and chemical constitutions of Ziziphora clinopodioides. Food control, 18(5): 535-540.

30-Rahimifard, N., Shojaii, A., Mahbobi, M., Hafezan, G., Bagheri, F. and Asgarpanah, J. 2015. Evaluation of Antibacterial Activity and Flavonoid Content of Two Capparis Species from Iran. Journal of Medicinal Plants, 3(55): 89-94.

31- Rajhi, I., Hernandez Ramos, F., Abderrabba, M., Ben Dhia,M.T., Ayadi, S. and Labidi, J. 2021.Antioxidant,Antifungal and Phytochemical Investigations of Capparis spinosa L. Agriculture, 11: 1-16.

32-Sharififar, F., Moshafi, M., Mansouri, S., Khodashenas, M. and Khoshnoodi, M. 2007. In vitro evaluation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and methanol extract of endemic Zataria multiflora Boiss. Food control, 18(7): 800-805.

33- Slekovec, C., Plantin, J., Cholley, P., Thouverez, M., Talon, D., Bertrand, X. and Hocque, D. 2017. Tracking down antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates in a wastewater network. PLoS One, 7(12):49-57.

34- Tlili, N., Khaldi, A., Triki, S. and Munné-Bosch, S. 2010. Phenolic compounds and vitamin antioxidants of caper (Capparis spinosa). Plant Foods for Human Nutrition, 65(2):260–265.

35-Wu, Y., Cui, S.W., Tang, J. and Gu, X. 2007. Optimization of extraction process of crude polysaccharides from boat-fruited sterculia seeds by response surface methodology. Food chemistry, 105(4): 1599-1605.‏

36-Yang, T., Liu, Y., Wang, C. and Wang, Z. 2008. Advances on investigation of chemical constituents, pharmacological activities and clinical applications of Capparis spinosa. China Journal of Chinese Materia Medica, 33(21): 2453-2458.