اثر  EDTAبر برخی خصوصیات فیزیولوژیکی سلمک اورشلیمی

(Chenopodium botrys L.) تحت تنش کادمیوم

زهره شیرخانی

ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 1/11/1400            تاریخ پذیرش: 13/12/1400

چکیده

کادمیوم یکی از آلاینده­های اصلی خاک است. کاربرد EDTA در خاک یک استراتژی برای افزایش گیاه­پالایی فلزات سنگین است، اما چنین کلات­کننده­هایی معمولا باعث سمیت گیاهی و عوارض جانبی می‌شوند. بنابراین، هدف مطالعه حاضر بررسی اثرات کاربرد EDTA بر ویژگی‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سلمک اورشلیمی تحت سطوح تیماری مختلف کادمیوم در خاک بود. دراین پژوهش، اثر EDTA (صفر، 3، 6 و 12 میلی­مول در کیلوگرم) بر مقدار کادمیوم جذب شده توسط بافت­های گیاهی، محتوای نسبی آب برگ، شاخص پایداری غشا، محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی، محتوای کربوهیدرات­های محلول، محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و الگوی پروتئین بذر سلمک اورشلیمی تحت تنش کادمیوم (صفر، 75، 150 و 225 میلی­گرم در کیلوگرم) بررسی شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که افزودن EDTA به خاک، غلظت کادمیوم اندام­های هوایی و ریشه سلمک اورشلیمی تحت تیمار کادمیوم را افزایش داد. کاربرد EDTA باعث کاهش محتوای نسبی آب برگ، شاخص پایداری غشا و افزایش محتوای رنگیزه­‌های فتوسنتزی و کربوهیدرات‌های محلول شد. همچنین تغییرات در الگوی پروتئین بذر، افزایش محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در گیاهان تیمار شده با کادمیوم و EDTA مشاهده شد که نشان می­دهد این تیمار در کاهش تنش اکسیداتیو در سلمک اورشلیمی تحت تیمار Cd مفید بوده است. بر اساس نتایج، سلمک اورشلیمی گیاهی مناسب برای گیاه­پالایی خاک­های آلوده به کادمیوم است. علاوه­بر­این، EDTA می­تواند نقش مهمی در حذف این فلز از طریق انتقال آن از خاک به گیاه داشته باشد.

واژه های کلیدی: تنش اکسیداتیو، تنش فلزات سنگین، عامل کلات­کننده، گیاه­پالایی

* نویسنده مسئول، تلفن: ۳-۸۸۳۲۹۲۲۰-۲۱، پست الکترونیکی:z.shirkhani@khu.ac.ir

مقدمه

آلودگی فلزات سنگین ناشی از فعالیت­های مختلف انسانی به دلیل سمیت، عدم تجزیه و تجمع زیستی، خطر زیادی را بر محیط­زیست و سلامت انسان تحمیل می­کند (32). کادمیوم (Cd)، به­عنوان یک فلز سنگین شناخته شده، در بافت­های موجودات زنده انباشته می­شود و حتی در غلظت­های کم اثرات سمی دارد (51). انواع مختلفی از روش­های شیمیایی، فیزیکی و زیستی همانند گیاه­پالایی برای پاکسازی خاک­های آلوده وجود دارد (29). گیاه­پالایی به­معنای استفاده از گیاهان برای حذف آلاینده­های مختلف از مکان­های آلوده، به­عنوان یک فناوری مقرون به­صرفه در نظر گرفته می­شود که می­تواند برای حذف برخی از فلزات سنگین به­کار رود (48). در گیاه­پالایی خاک­های آلوده به فلزات سنگین، از گیاهان انباشته کننده استفاده می­شود. چنین گیاهانی می­توانند فلزات را چندین برابر بیشتر از گونه­های دیگر انباشته کنند (50).

با توجه به محدودیت­های گیاه­پالایی، اخیراً، چندین استراتژی مانند تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی (2، 39و53)، عوامل کلات­کننده (27و40)، بیوپلیمرها (41) و ترکیبات آلی (4) برای جذب غلظت‌های بسیار بیشتر فلزات سنگین توسعه یافته‌اند. یکی از روش­های متداول برای افزایش کارایی گیاه­پالایی استفاده از کلات­کننده­های مصنوعی مانند اتیلن­دی­آمین­تترا­استیک­اسید (EDTA) است (27). مولکول EDTA یک لیگاند شش دندانه­ای است و شش مکان بالقوه برای پیوند با یون­های فلزی دارد که شامل چهار گروه کربوکسیل و دو گروه آمین می­باشد. علاوه­بر­این خصوصیت آنیونی EDTA بر تثبیت و تحکیم کمپلکس کمک می­کند. به­خصوص چهار اکسیژن کربوکسیلات می­توانند جاذبه الکترواستاتیکی قوی با کاتیون فلزات ایجاد کنند (15).

عوامل کلات­کننده میل ترکیبی زیادی با کاتیون­های فلزی مختلف داشته و به آسانی به­صورت یک کمپلکس کلات- فلز از ریشه­های گیاه به سمت اندام­های هوایی جابجا می­گردند. بنابراین عوامل کلات­کننده به­طور همزمان جذب و جابجایی فلزات سنگین را افزایش می­دهند و از طرف دیگر، به­واسطه­ی تشکیل کمپلکس با یون­های فلزی قادر به کاهش سمیت کاتیون­های فلزی آزاد در گیاه نیز می­باشند (46).

در مطالعه­ای که به منظور بررسی اثر EDTA و کادمیوم بر دو گونه Brasica carinata و B. juncea انجام گرفت مشخص شد که کاربرد EDTA سبب افزایش معنی­دار ارتفاع، وزن تر و خشک اندام هوایی، طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه و تجمع فلزات سنگین در هر دو گونه شد (20). در پژوهش دیگر اثرات کادمیوم، کروم، مس، نیکل و سرب به صورت جداگانه و با استفاده همزمان از EDTA در محلول غذایی هوگلند بر اطلسی بررسی شد. نتایج نشان‌دهنده جذب بیشتر کادمیوم، کروم، نیکل و سرب در قسمت‌های هوایی، و مس در ریشه‌ها بود که با به­کارگیری EDTA این میزان افزایش یافت. این جذب با تغییراتی در شاخص‌های بیوشیمیایی از جمله افزایش مالون­دی­آلدهید (MDA)، محتوایH₂O₂   و نشت الکترولیت همراه بود (23). محمدی و همکاران (2021)(31) نشان دادند که استفاده از EDTA اثرات سمی جیوه را با تغییر در ترکیبات فنلی، کلات شدن با جیوه و کده­بندی مناسب آن بهبود می­بخشد. نتایج مطالعات بر روی گندم و کاه­و­کلش نشان داد که کاربرد EDTA حلالیت سرب و کادمیوم را در محلول خاک افزایش داده و منجر به افزایش جذب سرب در کاه­و­کلش و دانه گندم و کادمیوم در کاه­و­کلش گردید (7).

برای این مطالعه سلمک اورشلیمی انتخاب شد. این گونه گیاهی مقاوم به تنش­های محیطی و دارای سیستم ریشه­ای گسترده و زیست­توده مناسب است. سلمک اورشلیمی گیاهی یکساله متعلق به تیره اسفناج (Chenopodiaceae) است. این گونه به ارتفاع 40 سانتی­متر، افراشته، پوشیده از کرک­های غده­ای معطر است. پراکندگی این گونه در ایران شمال، شمال­غرب، غرب، مرکز، شمال­شرق و جنوب شرق کشور است (1). در مطالعات قبلی نشان داده شده است که این گونه می­تواند به­عنوان گیاه انباشته کننده کادمیوم مورد استفاده قرار گیرد (28). همچنین به خوبی ثابت شده است که EDTA انتقال فلزات سنگین را در ریشه و ساقه گیاهان افزایش می­دهد (40)، اما هیچ مدرکی وجود ندارد که آیا استفاده از این عامل کلات­کننده می­تواند برای سلمک اورشلیمی عوارض جانبی به همراه داشته باشد یا خیر، از این رو در این مطالعه اثر کادمیوم و EDTA بر خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سلمک اورشلیمی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

انتخاب بذر و آماده کردن محیط کشت: بذرهای Chenopodium botrys L. (سلمک اورشلیمی، درمنه ترکی) در سینی­های مخصوص کشت حاوی کوکوپیت و پرلیت کاشته شدند. بعد از جوانه­زنی دانه­رست­های سالم در مرحله3-2 برگ حقیقی به گلدان­هایی با ارتفاع 21 سانتی­متر و قطر 20 سانتی­متر حاوی 4 کیلوگرم خاک منتقل شدند. تراکم کشت برای هر گلدان یک بوته در نظر گرفته شد. گلدان­ها در گلخانه­ی تحقیقاتی با میانگین دمای 5±25 درجه­ی سانتیگراد، شدت نور 85 میلی­مول بر متر مربع در ثانیه و رطوبت نسبی 65 درصد قرار گرفتند.

مشخصات اولیه خاک: قبل از انتقال نمونه­ها به خاک، خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک تعیین و اندازه­گیری شد (43). مشخصات خاک در جدول 1 ارائه شده است.

جدول 1- برخی از خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک مورد آزمایش

تیمار کادمیوم و EDTA: در این آزمایش خاک خشک به­طور دستی با کلرید­کادمیوم (Merck, Germany) آلوده گردید. برای این منظور کلرید­کادمیوم به صورت پودر با خاک مخلوط شده و از یک الک با قطر 2 میلی­متر عبور داده شد و برای مدت دو هفته در شرایط گلخانه به­منظور متعادل­سازی نگهداری گردید. در این مطالعه از 4 سطح کلرید­کادمیوم (صفر، 75، 150 و 225 میلی­گرم در کیلوگرم) استفاده شد (40). برای بررسی میزان آب­شوئی کادمیوم، از گلدان­های حاوی خاک و فاقد گیاه استفاده شد. با توجه به ناچیز بودن مقدار آب­شویی و عدم اختلاف معنی­دار با گروه­های تیماری نتایج در آنالیزهای آماری اعمال نگردید.

به منظور بررسی اثر عامل کلات­کننده مصنوعی بر گیاه­پالایی چهار غلظت EDTA (صفر، 3، 6 و 12 میلی­مول در کیلوگرم) به خاک گلدان­ها با چهار سطح کادمیوم (صفر، 75، 150 و 225 میلی­گرم در کیلوگرم) اضافه شد (40).

سنجش کادمیوم کل خاک: به منظور سنجش کادمیوم، نمونه‌های خاک (3 گرم) به مدت 16 ساعت در ظروف شیشه­ای و در دمای آزمایشگاه با مخلوطی از اسیدهیدروکلریک ( 37 درصد) و اسیدنیتریک (70 درصد)، به ترتیب به میزان 21 و 7 میلی­لیتر، قرار گرفتند. پس از آن، نمونه­ها در دمای 130 درجه سانتی­گراد به مدت 2 ساعت زیر هود هضم شدند. سپس سوسپانسیون تهیه شده، فیلتر و با اسیدنیتریک (5/0 مولار) رقیق و به حجم 100 میلی­لیتر رسانده شد. نمونه­ها تا زمان آنالیز کادمیوم در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری گردید. غلظت کادمیوم کل با استفاده از دستگاه جذب اتمی (Varian Spectra AA220FS) قرائت شد (34).

سنجش کادمیوم در بافت­های گیاهی: بافت­های گیاهی به دقت با آب شهری و آب دیونیزه شسته و در دمای 70 درجه توسط آون خشک گردیدند. به­منظور تعیین غلظت کادمیوم بافت گیاهی، به پودر خشک ریشه و اندام­های هوایی اسید­نیتریک غلیظ افزوده شد. نمونه­ها به مدت یک ساعت در دمای 120 درجه سانتی­گراد در حمام آب گرم قرار گرفتند. سپس آب­اکسیژنه 20 درصد به آن­ها افزوده شد، نمونه­ها پس از سرد شدن، صاف و با آب مقطر به حجم 50 میلی­لیتر رسانده شدند. غلظت کادمیوم توسط دستگاه جذب اتمی اندازه­گیری گردید (44).

محاسبه فاکتورهای تجمع زیستی (BCF) و انتقال (TF): فاکتور­های تجمع زیستی (Bioconcentration Factor) و انتقال (Translocation factor) برای تعیین بازده گیاه­پالایی کادمیوم محاسبه گردیدند. فاکتور تجمع زیستی عبارتست از غلظت فلزات سنگین در ریشه (میلی­گرم در کیلوگرم) نسبت به غلظت فلزات سنگین در خاک (میلی­گرم در کیلوگرم). فاکتور انتقال نسبت غلظت فلز در اندام هوایی (میلی­گرم در کیلوگرم) به غلظت فلز در ریشه (میلی­گرم در کیلوگرم) می­باشد (52).

تعیین شاخص پایداری غشا سلول (MSI): کادمیوم با تغییر در ترکیبات لیپیدی عمکلرد غشا را دستخوش تغییر می­کند. به منظور بررسی اثر کادمیوم بر غشا، شاخص پایداری غشا بر اساس میزان هدایت الکتریکی حاصل از نشت یون­ها از سلول­های برگ به درون آب دیونیزه اندازه­گیری شد. 1/0 گرم برگ تازه در 10 میلی­لیتر آب دیونیزه غوطه­ور گردید، سپس در حمام آب گرم در دمای 40 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه قرار داده شد و پس از طی این زمان هدایت الکتریکی نمونه­ها به کمک ­ECمتر اندازه­گیری شد. گروه دوم از نمونه­ها در حمام آب گرم به مدت 30 دقیقه و در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شده و پس از رسیدن به دمای اتاق، هدایت الکتریکی آن­ها اندازه­گیری شد. در نهایت اعداد حاصله در فرمول زیر جایگذاری و شاخص پایداری غشا سلول محاسبه گردید (37).

MSI (Membrane stability index) = (1- EC1/EC2)100

EC1: هدایت الکتریکی نمونه­های آزمایشی در زمان 10 دقیقه

EC2: هدایت الکتریکی نمونه­های آزمایشی در زمان 30 دقیقه

سنجش محتوای نسبی آب بافت (RWC): کاهش محتوای نسبی آب بافت سبب کاهش پایداری غشا می­گردد. بدین منظور از آخرین برگ نمو یافته همه گروه­های تیماری و شاهد برای سنجش محتوای نسبی آب بافت نمونه­برداری صورت گرفت. وزن تر نمونه­ها بلافاصله اندازه­گیری و سپس تمامی نمونه­ها در آب مقطر به مدت 24 ساعت در یخچال و در دمای چهار درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از 24 ساعت، وزن اشباعی برگ­ها اندازه­گیری و برگ­ها مجدداً به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتی­گراد در آون قرار داده شدند. وزن خشک هر نمونه اندازه­گیری شد. با قرار دادن اعداد حاصل از توزین در فرمول زیر، مقدار نسبی آب بافت محاسبه گردید (7).

RWC (Relative water content) = ((Wf-Wd) / (Wt-Wd)) × 100

Wf: وزن تازه

Wd: ورن خشک

Wt: وزن اشباع

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی: به منظور سنجش محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی از استون 80 درصد استفاده شد. سنجش در مرحله زایشی گیاه انجام شد. میزان جذب در طول موج­های 8/646، 2/663 و 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدلII Biowave انگلستان) ثبت گردید. میزان کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در هر یک از نمونه­ها با استفاده از فرمول­های زیر بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید (27):

C_a =25/12A_2/663-79/2A_8/646

C_b = 50/21A_8/646-10/5A_2/663

Tchl = C_a+C_b

C_x+c= (1000A₄₇₀-82/1C_a-02/852C_b)/198

C_a: غلظت کلروفیل a

C_b: غلظت کلروفیل b

Tchl: کلروفیل کل

 :C_x+cغلظت کاروتنوئیدها

سنجش کربوهیدرات­های محلول: سنجش قند­های محلول با استفاده از روش فنل- اسیدسولفوریک انجام گرفت. 1/0 گرم از برگ خشک در 10 میلی­لیتر اتانول 70 درصد ریخته شد و پس از یک هفته، 5/0 میلی­لیتر از بخش رویی محلول با آب مقطر به حجم 2 میلی­لیتر رسانده شد. سپس 1 میلی­لیتر فنل 5 درصد اضافه و مخلوط خوب بهم زده شد و در ادامه به آن 5 میلی­لیتر اسید­سولفوریک غلیظ اضافه گردید. حدود نیم ساعت پس از خنک شدن کامل محلول، جذب آن توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانده شد. برای اندازه­گیری مقدار قند از منحنی استاندارد تهیه شده از گلوکز استفاده گردید (24).

استخراج عصاره پروتئینی: جهت استخراج عصاره پروتئینی از برگ تر گیاه و بافر فسفات (6 pH) استفاده شد. نمونه برگ تا مرحله همگن­سازی سائیده شد. بعد از 10 دقیقه با دستگاه سانتریفیوژ (Sigma, 1-16 k; Germany) با سرعت 13000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ و محلول رویی برداشته شد.

سنجش محتوای پروتئین کل: سنجش کمی پروتئین­ها با استفاده از روش برادفورد انجام گرفت. پنج میلی­لیتر معرف برادفورد به 1/0 میلی­لیتر عصاره پروتئینی در لوله آزمایش اضافه شد و مخلوط به سرعت ورتکس گردید. جذب نمونه­ها پس­از 25 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول­موج 595 نانومتر خوانده­شد. محتوای پروتئین کل بر اساس میلی­گرم بر گرم وزن ‌تر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) گزارش گردید (9).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز (POX) در برگ­ها با استفاده از گایاکول به­عنوان سوبسترا تخمین زده شد. مخلوط واکنش حاوی 05/0 میلی‌لیتر عصاره آنزیمی، 95/0 میلی‌لیتر بافر استات (1/0 مولار، 6/4pH )، 1 میلی­لیتر آب­اکسیژنه (16 میلی­مولار) و 1 میلی‌لیتر محلول گایاکول (15 میلی­مولار) تهیه شد. جذب نوری محلول در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری گردید (26). در نهایت فعالیت آنزیم برحسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین در گرم وزن تر نمونه محاسبه گردید.

فعالیت آنزیم پلی­فنل­اکسیداز: فعالیت آنزیم پلی­فنل­اکسیداز (PPO) با تغییرجذب در طول موج 430 نانومتر اندازه­گیری شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 200 میلی­مولار (8/6 pH)، پیروگالول 10 میلی­مولار و عصاره آنزیمی بود (35). فعالیت آنزیم برحسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین در گرم وزن تر نمونه محاسبه گردید.

مطالعه پروتئین­‌های بذر به روش الکتروفورز: الکتروفورز پروتئین­های بذر روی ژل پلی­اکریل­آمید (12 درصد) در حضور دودسیل سولفات انجام گرفت. برای استخراج پروتئین بذر از بافر فسفات­سدیم (7 pH) به نسبت 5 :1 (W/V) استفاده شد. عصاره پروتئینی استخراج شده با بافر نمونه به نسبت 1 به 3 مخلوط گردید و در حمام آب گرم به مدت 5 دقیقه حرارت داده شد. پس از اتمام الکتروفورز، رنگ­آمیزی ژل با رنگ کوماسی­برلیانت­بلو  R₂₅₀صورت گرفت. برای انجام الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز کمپانیBio- Rad  (USA) استفاده شد الکتروفورز با ولتاژ ثابت 110 ولت انجام گرفت. پس از چند مرحله رنگ­بری ژل، با استفاده از اسکنر از آن عکس تهیه و تغییرات باندها مورد مطالعه و مقایسه گردید (17).

بررسی­های آماری: در این مطالعه، تمام محاسبات آماری با حداقل3 تکرار با استفاده از نرم‌افزار SAS (version 9.1) توسط آزمون مقایسه‌ای دانکن به صورت آزمایش فاکتوریل و در قالب طرح پایه کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج

اثر EDTA بر جذب و انتقال کادمیوم: افزودنEDTA  (3، 6 و 12 میلی­مول در کیلوگرم) به­عنوان یک کلات­کننده، باعث کاهش معنی­دار (01/0P ≤) غلظت کادمیوم کل باقیمانده در خاک شد (شکل1 a). در مقابل، استفاده از EDTA به­طور معنی­داری باعث افزایش غلظت کادمیوم در ریشه (در غلظت 225 میلی­گرم بر کیلوگرم کادمیوم) و اندام­های هوایی گیاهان تحت تیمار با کادمیوم گردید (01/0P ≤). با افزایش غلظتEDTA ، تجمع کادمیوم در ریشه و اندام­های هوایی افزایش یافت. با کاربرد 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA (12-EDTA) در تیمار 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم، مقدار جذب کادمیوم در ریشه و اندام هوایی به 18/71 و 68/81 میلی­گرم در کیلوگرم وزن خشک رسید که این مقدار در گروه شاهد (تیمار 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم) به ترتیب 27/70 و 02/63 میلی­گرم در کیلوگرم وزن خشک بود (شکل 1 b و c). با توجه به تجزیه و تحلیل داده­ها، BCF و TF در گروه­های تحت تیمار با EDTA افزایش یافت (شکل 1 d و e). تیمار 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA بالاترین میزان BCF (34/1) و TF (33/1) را در میان تمام تیمار­ها دارا بود. در فاکتور تجمع و انتقال بین سطوح مختلف EDTA اختلاف آماری معنی­دار وجود ندارد.

شکل 1- اثرEDTA  بر جذب و انتقال کادمیوم در سلمک اورشلیمی. (a) غلظت کادمیوم کل باقیمانده در خاک؛ (b) غلظت کادمیوم در ریشه؛ (c) غلظت کادمیوم در اندام­های هوایی؛ (d) فاکتور تجمع و (e) فاکتور انتقال. هر ستون معرف میانگین 3 تکرار است. حروف متفاوت نمایانگر گروه­های با تفاوت آماری معنی­دار است. # نشان­دهنده­ی مقادیر کمتر از 2/0 میلی­گرم در کیلوگرم است.

اثر EDTA بر محتوای نسبی آب بافت و شاخص پایداری غشاء: تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از آزمون مقایسه­ای دانکن نشان داد که اثر EDTA بر سنجش محتوای نسبی آب بافت و شاخص پایداری غشاء در گیاهان تحت تیمار­های مختلف کادمیوم معنی­دار است (01/0P ≤). بالاترین میزان افزایش محتوای نسبی آب بافت و شاخص پایداری غشاء (به ترتیب 88 و 33/89 درصد) در گروه شاهد و کمترین میزان (به ترتیب 00/58 و 66/51 درصد) در گروه تیماری 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مولار EDTA مشاهده شد (شکل 2 a و b).

شکل 2- اثر EDTA بر محتوای نسبی آب بافت و شاخص پایداری غشا در سلمک اورشلیمی تحت تیمار کادمیوم. (a) محتوای نسبی آب بافت (درصد) و (b) شاخص پایداری غشا (درصد). هر ستون معرف میانگین 3 تکرار است. حروف متفاوت نمایانگر گروه­های با تفاوت آماری معنی­دار است.

اثر EDTA بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی: بررسی­های آماری نشان داد که تحت تیمار EDTA افزایش در محتوای کلروفیل a و کلروفیل کل در سطح احتمال (01/0P ≤) و افزایش در محتوای کلروفیل b در سطح احتمال (05/0P ≤) معنی­دار می­باشد. EDTA بر محتوای کاروتنوئید­ها بی­اثر بود. محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در تیمار 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA به ترتیب 33/18، 88/6 و 21/25 میلی­گرم در گرم وزن تر رسید که این مقدار در نمونه­های شاهد (تیمار 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم) به ترتیب 87/14، 31/6 و 17/21 میلی­گرم در گرم وزن تر بود (شکل 3 a-d).

اثر EDTA بر محتوای کربوهیدرات­های محلول: آنالیز داده­های به­دست آمده از سنجش محتوای کربوهیدرات­های محلول سلمک اورشلیمی نشان داد که اثر EDTA در حضور کادمیوم بر افزایش محتوای کربوهیدرات­های محلول در سطح احتمال (01/0P ≤) معنی­دار بوده است. افزایش محتوای کربوهیدرات­های محلول در نمونه تحت تیمار 75 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA، 51/43 درصد بود (شکل 3 e).

اثر EDTA بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیمی: نتایج آنالیزهای آماری نشان داد که  اثر EDTA بر محتوای پروتئین کل، فعالیت آنزیم پراکسیداز و پلی­فنل­اکسیداز در حضور کادمیوم معنی­دار بود (01/0P ≤). محتوای پروتئین کل در برگ سلمک اورشلیمی که تحت تیمار با 75 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA بود 74/1 بار نسبت به گروه شاهد (تحت تیمار با 75 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم) افزایش یافت. اختلاف آماری معنی­دار بین محتوای پروتئین کل در سطوح مختلف EDTA وجود نداشت. کمترین مقدار پروتئین کل در تیمار صفر کادمیوم (76/0 میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ) و بیشترین مقدار آن در تیمار 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA (20/5 میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ) مشاهده شد (شکل 4 a).

شکل 3- اثر EDTA بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی و محتوای کربوهیدرات­های محلول در سلمک اورشلیمی تحت تیمار کادمیوم. (a) محتوای کلروفیل a؛ (b) محتوای کلروفیل b؛ (c) محتوای کلروفیل کل؛ (d) محتوای کاروتنوئید و (e) محتوای کربوهیدرات­های محلول. هر ستون معرف میانگین 3 تکرار است. حروف متفاوت نمایانگر گروه­های با تفاوت آماری معنی­دار است.

فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و پلی­فنل­اکسیداز در همه­ی گروههای تحت تیمار کادمیوم و EDTA افزایش معنی­دار یافت. بالاترین مقدار فعالیت آنزیم­های پراکسیداز (053/0 واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین) و پلی­فنل­اکسیداز (058/0 واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین) به ترتیب در گروه­های 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA و 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 6 میلی­مول در کیلوگرم EDTA مشاهده شد. کمترین مقدار فعالیت آنزیم­های پراکسیداز (005/0 واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین) و پلی­فنل­اکسیداز (01/0 واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین) در گروه تیماری فاقد کادمیوم و EDTA گزارش شد (شکل 4 b و c).

اثر EDTA بر الگوی پروتئین بذر: بررسی الگوی پروتئینی بذر سلمک اورشلیمی تغییر در میزان پروتئین بذر در نمونه­های تیمار شده با کادمیوم و EDTA نسبت به گروه­های شاهد را نشان داد. نتایج نشان داد که تراکم و غلظت باند­های پروتئینی در نمونه­های تیماری شده با کادمیوم بیشتر از نمونه شاهد بود. افزایش در میزان پروتئین بذر در گروههای تحت تیمار کادمیوم و EDTA نسبت به گروه­های تیماری با کادمیوم مشاهده شد. این افرایش به صورت افزایش در تراکم، غلظت و همچنین تعداد باند بود (شکل 5).

شکل 4- اثر EDTA بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیمی در سلمک اورشلیمی تحت تیمار کادمیوم. (a) محتوای پروتئین کل؛ (b) فعالیت آنریم پراکسیداز و (c) فعالیت آنریم پلی­فنل­اکسیداز. هر ستون معرف میانگین 3 تکرار است. حروف متفاوت نمایانگر گروه­های با تفاوت آماری معنی­دار است.

شکل 5- مقایسه نیمرخ الکتروفورزی پروتئین­های بذر سلمک اورشلیمی در گروه­های تحت تیمار کادمیوم و EDTA. M: مارکر پروتئینی؛ 1، 0-Cd + 0-EDTA؛ 2، 0-Cd + 3-EDTA؛ 3، 0-Cd + 6-EDTA؛  4، 0-Cd + 12-EDTA؛ 5، 75-Cd + 0-EDTA؛ 6، 75-Cd + 3-EDTA؛ 7، 75-Cd + 6-EDTA؛ 8، 75-Cd + 12-EDTA؛ 9، 150-Cd + 0-EDTA ؛ 10، 150-Cd + 3-EDTA؛ 11، 150-Cd + 6-EDTA؛ 12، 150-Cd + 12-EDTA؛ 13، 225-Cd + 0-EDTA؛ 14، 225-Cd + 3-EDTA؛ 15 ، 225-Cd + 6-EDTA؛16 ، 225-Cd + 12-EDTA.

بحث و نتیجه گیری

وجود سطوح بالای فلزات سنگین در محیط­زیست به دلیل سمیت بالا و تمایل به انباشته­سازی در محیط­زیست و پایداری در اکوسیستم یک تهدید بالقوه برای سلامت انسان و اکوسیستم­ها است (45). جهت ارزیابی توان گیاه­پالایی و بهبود توان گیاه­پالایی سلمک اورشلیمی از سطوح مختلف کادمیوم به صورت تیمار خاک همراه با EDTA به­عنوان یک کلات کننده مصنوعی استفاده شد. EDTA یک کلات­کننده شش دندانه است که توانایی اتصال به یون­های فلزی را از طریق گروه­های کربوکسیل و آمین دارد (18).

در تحقیق حاضر غلظت کادمیوم در حضور EDTA در بافت­های گیاهی افزایش پیدا کرد؛ این نتیجه در مطالعه بر روی Helianthus annuus نیز مشاهده شده است. در این مطالعه مشخص گردید که EDTA سبب افزایش حلالیت فلز در خاک و به دنبال آن افزایش غلظت در بافت­های H. annus شده است (47). مهم­ترین دلیل در افزایش جذب کادمیوم می­تواند مربوط به اثر افزایشی EDTA بر روی حلالیت کادمیوم باشد (21). در واقع وجود پیوندهای آلی- فلزی در ترکیبات کلات و فلزات سبب می­شود فلزات کمتر در معرض کلوئیدها، هیدروکسیدها و اکسیدها قرار گرفته و مانع از رسوب و تثبیت آن­ها در خاک شوند. از طرفی کلات­ها توسط ریشه­ی گیاهان قابل جذب بوده و می­توانند فلزات را از فاز جامد و غیر­محلول به فازهای تبادلی انتقال داده و در نهایت میزان جذب توسط گیاهان را افزایش دهند (10). همچنین مشخص شده که کمپلکس­های کلات- فلز می­توانند از طریق شکاف‌های اندودرمی ریشه و نوار کاسپاری وارد ریشه شده، به سرعت به اندام­های هوایی منتقل گردند (6). مطالعات نشان داده است که EDTA تشکیل کمپلکس فلزی می­دهد که باعث افزایش و تسهیل تحرک فلز در گیاه می‌شود، در نتیجه افزایش انتقال فلز از ریشه به اندام­های هوایی امکان­پذیر می­گردد (30و48). نتایج مشابه در گیاهان دیگر برای فلزات سنگین از جمله کادمیوم گزارش شده است (11و12). در این مطالعات محققین به این نتیجه رسیدند که گیاه­پالایی به کمک مواد شیمیایی یکی از روش‌های سودمند، مؤثر و پایدار برای زیست­پالایی است. بر اساس نتایج پژوهش حاضر و نتایج مطالعات قبلی می­توان نتیجه­گیری کرد که EDTA یک کلات­کننده غیر­سمی است که می‌تواند با افزایش حلالیت و دسترس­پذیری فلزات در خاک توانایی زیست­پالایی گیاهان را افزایش دهد.

در این مطالعه نشان داده شد که EDTA سبب کاهش محتوای نسبی آب بافت و شاخص پایداری غشا سلمک اورشلیمی در حضور کادمیوم می­شود. تجمع پرولین و آمینواسیدهای آزاد در پاسخ به تنش کادمیوم، دلیل مناسبی برای کاهش در میزان نسبی آب بافت و به­وجود آوردن خشکی فیزیولوژیک در گیاه است (6). تحقیقات نشان داده که EDTA سبب سیال شدن و خروج اجزا لیپیدی غشا و در نتیجه از بین رفتن پایداری غشا، کاهش محتوای آب و لیز سلول می­گردد (38). در مطالعه اثر سرب و EDTA بر روی H. annus مشخص شد که سرب یا EDTA به تنهایی اثر کاهشی و به­کارگیری هر دو با یکدیگر در برخی غلظت­ها و ارقام اثر افزایشی بر محتوای آب بافت دارد که در تطابق با پژوهش حاضر نمی­باشد (33).

انواع مختلفی از رنگیزه­ها مانند کلروفیل، گزانتوفیل، کاروتنوئیدها و غیره در گیاهان وجود دارد. کلروفیل­ها فراوان­ترین و مهم­ترین رنگیزه­ها در گیاهان عالی هستند. در این تحقیق کاهش در مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی و در نتیجه کربوهیدرات­های محلول در اثر تیمار کادمیوم مشاهده شد. در اثر کاربرد EDTA، محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی و کربوهیدرات­های محلول تحت شرایط تنش در سلمک اورشلیمی افزایش یافت. در مطالعات قبلی اثر افزایشی EDTA بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی گیاهان تحت تیمار فلزات سنگین گزارش شده است (19، 22 و 23) که در راستای مطالعه حاضر است. کمپلکس فلز-کلات­کننده قادر به نفوذ در غشاهای گیاه نیست، از این رو کلات­کننده­ها تحرک فلز و سپس سمیت آن را کاهش می‍دهند (36).

هنگامی­که فلزات سنگین جذب می­شوند، گیاه از مکانیسم­های دفاعی مختلف که بتواند با سمیت فلزات مواجه شود استفاده می­کند. تحریک فرآیندهای کنترل­کننده اثرات سمی ROS (آنزیم­های آنتی­اکسیدانی) و تولید پروتئین­های تنشی از جمله این مکانیسم­ها می­باشد. این مکانیسم­ها به گیاهان کمک می­کند تا آسیب­های ناشی از تنش اکسیداتیو را کاهش دهند و سلول­ها حالت احیا خود را حفظ کنند (39). مشخص شده است که پروتئین­ها به­طور مستقیم در پاسخ­های گیاه به تنش­ها شرکت می­کنند و سازگاری گیاه با تنش فلزات سنگین همراه با تغییرات پروتئوم است (42). فعال شدن آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، یک استراتژی دفاعی طبیعی برای کنترل محتوایROS  با توجه به نیازهای متابولیکی سلول­ها در یک زمان خاص است. فعال­سازی این آنزیم­ها تحت تنش فلزات سنگین به خوبی شناخته شده و در گیاهان مختلف گزارش شده است. در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی با توجه به غلظت کادمیوم، اندام مورد استفاده و سن گیاه کاهش یا افزایش مشاهده شده است (13 و 16). تغییر در الگوی پروتئین بذر، افزایش محتوای پروتئین و افزایش فعالیت آنزیمی تحت تیمار کادمیوم و EDTA نسبت به گروه شاهد نشان می­دهد که آسیب­های ناشی از تنش کادمیوم با استفاده از EDTA کاهش یافته است. افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی بعد از افزودن EDTA به خاک آلوده نسبت به گروه شاهد در مطالعات قبلی گزارش شده است (12و14). همچنین تغییرات در الگوهای پروتئینی (SDS-PAGE) و افزایش تراکم باندها و تشکیل باندهای جدید در گیاهانی که تحت تأثیر آلودگی­های محیط­زیست قرار دارند نشان داده شده است (3).

نتیجه­گیری کلی: نتایج نشان داد که سلمک اورشلیمی دارای پتانسیل گیاه­پالایی خاک­های آلوده به کادمیوم است. این مطالعه همچنین نشان داد که EDTA می­تواند به­عنوان استراتژی خوبی برای افزایش گیاه­پالایی کادمیوم در خاک­های آلوده در نظر گرفته شود. غلظت کادمیوم در بافت گیاهی در معرض 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم و 12 میلی­مول در کیلوگرم EDTA، تقریباً 29/1 برابر بیشتر از گروه تیمار شده با 225 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیوم بود. نتایج نشان داد که افزودن EDTA به خاک آلوده می‌تواند با تأثیر بر محتوای پروتئین و فعالیت آنزیمی، آسیب­های ناشی از تنش کادمیوم را در سلمک اورشلیمی کاهش دهد.

سپاسگزاری

نویسنده این مقاله بر خود لازم می­داند از آقای دکتر عبدالکریم چهرگانی­راد و آزمایشگاه زیست­شناسی سلولی دانشگاه بوعلی­سینا همدان بابت حمایت­های صورت گرفته در انجام این پژوهش قدردانی نماید.