بررسی بیش بیانی ژن pmt بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک تحت تأثیر غلظت بهینه عصاره مخمر

شهلا شامه¹، بهمن حسینی^1* و خاویر پالازون²

1. ^1. ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

² اسپانیا، دانشگاه بارسلونا، دانشکده داروسازی، گروه فیزیولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 24/01/1400          تاریخ پذیرش: 06/07/1400

چکیده

مهندسی ژنتیک و محرک­ها از راهکارهای مفید جهت بهینه سازی تولید متابولیت­های ثانویه در سطح انبوه هستند. در این مطالعه، ریشه­های موئین از تلقیح ریزنمونه­های کوتیلدون گیاه بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) با سویه­های A4 از Agrobacterium rhizogenes و C58C1 (pRiA4-pBMI) از Agrobacterium tumefaciens حاوی ژن pmt تولید شدند. سپس تأثیر ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی­گرم بر لیتر بعد از 48 ساعت) بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشه­های موئین حاصل از دو سویه مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج بررسی تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر نشان داد که در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1، وزن تر (85/2 برابر) و خشک (27/2 برابر)، فنول (74/1 برابر)، فلاونوئید (76/1 برابر) و آلکاوئید کل (77/1 برابر) بیشتر از ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 شد. بیشترین ظرفیت آنتی­اکسیدانی به دو روش IC₅₀ (62/1 میکروگرم بر میلی­لیتر) و FRAP (77/14 میلی­مول آهن II بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 مشاهده شد. میزان فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 به ترتیب 45/2، 30/1، 82/1 و 18/2 برابر بیشتر از ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 به دست آمد. همچنین بیشترین میزان تولید هیوسیامین (37/1 برابر) و اسکوپولامین (34/1 برابر) در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 حاصل شد. نتایج مشخص کرد که ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر می­تواند به­عنوان یک راهکار مناسب جهت افزایش تولید ترکیبات فیتوشیمیایی، ظرفیت آنتی­اکسیدانی، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و تروپان آلکالوئیدها در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک استفاده شود.

واژه های کلیدی: آلکالوئیدکل، بیش بیانی، تروپان آلکالوئیدها، عصاره مخمر، مهندسی ژنتیک

* نویسنده مسئول، تلفن:  04432779558 ، پست الکترونیکی: pbhosseini@yahoo.com

مقدمه

رویکرد روز افزون مصرف داروهایی با منشأ گیاهی توسط مردم جهان، سبب افزایش تقاضا در زمینه مواد مؤثره گیاهان دارویی به­عنوان تولیدات قابل مصرف در صنایع آرایشی-بهداشتی و دارویی شده است (52). بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) یکی از گیاهان تیره بادمجانیان (Solanaceae) است که بومی مناطق خشک و نیمه خشک مصر، جنوب غرب آسیا، ایران و ترکیه است (12). تمام پیکر گیاه، حاوی آلکالوئید است که مهمترین آن­ها را هیوسیامین، اسکوپولامین و آتروپین تشکیل می‌دهند (1). از کاربردهای تروپان آلکالوئیدها در پزشکی می‌توان به مواردی مانند آرام نمودن علایم بیماری پارکینسون، گشادکردن مردمک چشم و افزایش ضربان قلب، خنثی­کردن سستی ماهیچه‌های صاف ناشی از ترکیبات فسفره آلی و کاهش ترشح عرق و اسید معده اشاره نمود (8). ارزش تجاری اسکوپولامین به دلیل عملکرد متفاوت در سیستم عصبی و فعالیت فیزیولوژیکی بالاتر نسبت به هیوسیامین بیشتر می­باشد (33). در سال­های اخیر، تولید متابولیت­های ثانویه از طریق کشت بافت گیاهی بسیار مورد توجه قرار گرفته است، زیرا مواردی وجود دارد که میزان متابولیت­های موجود در کشت سلول­های گیاهی خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه کامل است و یا حتی سلول­های کشت شده، متابولیت­هایی تولید می­کنند که در گیاه اولیه تولید نمی­شوند (54). با توجه به اهمیت و نیاز به افزایش تولید ترکیبات با ارزش در گیاهان دارویی به دلایل کاربرد در صنایع دارویی و غذایی، به نظر می­رسد که روش­های زیست فنآوری مانند کشت سلول و اندام می‍توانند در به ثمر رسیدن این اهداف مفید باشند (57). در حال حاضر استفاده از روش­های نوین مهندسی ژنتیک، از جمله پرکاربردترین فنونی به شمار می­روند که در شناسایی مسیرهای بیوشیمیایی و ژن­های دخیل در این مسیرها، افزایش بیان ژن­ها، دستورزی آن­ها و انتقال آن­ها از موجودی به موجود دیگر مورد استفاده قرار می­گیرند (29). مهندسی متابولیت به­عنوان راهکار نهایی برای تغییر در تولید متابولیت­های ثانویه با استفاده از دو سیستم کلی افزایش و کاهش بیان ژن­های بیوسنتز کننده است (59). به طور کلی می­توان گفت که تغییر بیان ژن­های کلیدی درگیر در تولید یک یا دسته­ای از متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی، از مهمترین راهبرد­های مورد استفاده در بالابردن تولید متابولیت­ها در گیاهان دارویی محسوب می­شوند (9). تراریختی به واسطه­ی آگروباکتریوم این مزیت را داراست که با قرار دادن هر ژن خارجی مورد علاقه در یک ناقل دوگانه (Binary vector)، بتوان آن را به کلون­های ریشه موئین تراریخت انتقال داد (19). ریشه موئین نوعی بیماری گیاهی است که توسط باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز ایجاد می­گردد (38). کشت ریشه موئین به علت رشد سریع، زمان دو برابرشدن کوتاه، سهولت نگهداری و توانایی سنتز گسترده‌ای از ترکیبات شیمیایی، مزیت‌های بیشتری را به­عنوان یک منبع پیوسته برای تولید متابولیت‌های ثانویه ارزشمند ایجاد می‌نماید (19 و 13). اگرچه روش­های مختلف برای انتقال ژن وجود دارد اما استفاده از
A. tumefaciens به دلایل متعدد از جمله: بازدهی بیشتر با هزینه­ی کمتر، امکان انتقال قطعات بزرگ DNA و انتقال تعداد کپی DNA کم نسبت به سایر روش­ها ارجحیت دارد (62 و 51)

اخیراً، رویکردهای متعددی مثل استفاده از محرک­های زیستی و غیر زیستی و تحریک مسیر بیوسنتزی برای افزایش تولید متابولیت­ها در کشت ریشه­های موئین به­کار گرفته شده است (41). محرک­ها با القاء سیستم دفاعی گیاه منجر به افزایش بیوسنتز و انباشت متابولیت­های ثانویه می­شوند (64). عصاره مخمر ( به­عنوان محرک زیستی)، ترکیبی از آمینو اسیدها، ویتامین­ها، مواد معدنی مختلف و سایر ترکیب­های تحریک کننده رشد و تولید متابولیت­های ثانویه می­باشد (50). تاکنون مطالعات زیادی مبنی بر بیش بیانی ژن­های کلیدی در مسیر بیوسنتزی مختلف و استفاده از محرک­ها به­عنوان راهکاری مهم به منظور بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت ریشه‌های موئین ارائه شده است. pmt به­عنوان ژن بالادست در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئید ها نقش دارد که افزایش تعداد رونوشت­های مربوط به آن می­تواند به­عنوان یکی از راهکارهای مؤثر جهت افزایش تولید تروپان آلکالوئیدها باشد (37). در تحقیقی با بررسی بیش بیانی ژن pmt به منظور افزایش تولید آلکالوئیدهای ارزشمند هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های موئینHyoscyamus muticus، محتوی هیوسیامین در ریشه­های تراریخت شده 3-2 برابر ریشه­های شاهد مشاهده گردید، اما محتوی اسکوپولامین مشابه ریشه­های شاهد بود (37). در تحقیقی که توسط Kang و همکاران (26) صورت گرفت، بررسی بیش بیانی ژن h6h در کشت ریشه­های موئین گیاه Scopolia parviflora  نشان داد که میزان تولید اسکوپولامین 3 برابر نسبت به ریشه‌های شاهد افزایش یافت. در تحقیق دیگر Yang و همکاران (60)، اثر بیش بیانی ژن pmt و h6h به منظور افزایش تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشه­های موئین تراریخته شده شابیزک (Atropa belladonna) مورد مطالعه قرار دادند، نتایج نشان داد که محتوی هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های تراریخت به ترتیب 11 و 5 برابر ریشه­های غیر تراریخت افزایش یافت.

در پژوهشی تیمار ریشه­های موئین خرفه
(Portulaca oleracea) با غلظت 500 میلی­گرم بر لیتر عصاره مخمر به مدت 48 ساعت، سطح تجمع نورآدرنالین را نسبت به ریشه­های شاهد 5 برابر افزایش داد (44). در تحقیقی که توسط رحیمی آشتیانی و همکاران (3) صورت گرفت، بررسی اثر غلظت­های مختلف عصاره مخمر در زمان­های مختلف بر کشت سوسپانسیون سلولی گیاه خار مریم (Silybum marianum) نشان داد که بیشترین میزان تولید سیلی مارین در تیمار با 6 میلی­گرم بر50 میلی­لیتر محیط کشت در مدت 72 ساعت حاصل شد که نسبت به شاهد 5 برابر افزایش نشان داد. تیمار عصاره مخمر در ریشه­های موئین چریش (Azadirachta indica)، تولید آزادیراکتین را نسبت به شاهد 6/1 برابر بهبود بخشید (48). کاربرد عصاره مخمر در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک (H. reticulatus) در غلظت­های مختلف و زمان­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت، بالاترین میزان تولید هیوسیامین (2 برابر) و اسکوپولامین (5/2 برابر بیشتر از شاهد) در غلظت­های 500 و 250 میلی­گرم بر لیتر عصاره مخمر در مدت زمان 48 ساعت تحریک زایی به دست آمد (35). Udomusk و همکاران (55) گزارش کردند میزان تولید ایزوفلاونوئید کل در ریشه­های موئین Pueraria candollei به وسیله عصاره مخمر در غلظت و زمان­های مختلف، 5/4 برابر بیشتر از ریشه­های موئین شاهد بود.

گزارشات بالا نشان می­دهند که بیش بیانی ژن­های کلیدی در مسیر بیوسنتزی و استفاده از محرک­ها از روش­های موثر بر ای بهبود تولید متابولیت­های ثانویه در کشت ریشه­های موئین است. در این مطالعه برای اولین بار ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک مورد ارزیابی قرار گرفت.

مواد و روشها

تهیه سویه­های باکتری: در این مطالعه از  Agrobacterium rhizogenesسویه  A4(به­عنوان کنترل) و Agrobacterium tumefaciens سویه (pRiA4-pBMI) C58C1 حامل ژن pmt جهت تولید ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک استفاده شد (شکل 2-الف). این دو سویه به ترتیب از بانک میکروبی مؤسسه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تهران و دانشگاه بارسلونا، اسپانیا تهیه شدند (36).

کشت بذر و تهیه ریز نمونه: ابتدا بذرهای گیاه بذرالبنج مشبک (تهیه شده از شرکت پاکان بذر اصفهان) با اسید سولفوریک 10 درصد به مدت 10 دقیقه خراشیده شدند. سپس بذرها با استفاده از اتانول 70 در‌صد به مدت 1 دقیقه و محلول هیپو‌کلریت سدیم 5/2 درصد کلر فعال به مدت 10 دقیقه ضد عفونی سطحی شدند. بذور ضدعفونی­شده جهت جوانه­زنی و تهیه ریزنمونه در محیط کشت MS (39)  فاقد تنظیم کننده‌های رشد گیاهی و دارای 7 گرم بر لیتر آگار کشت گردیدند. بذرها در دمای 24 درجه سانتی­گراد و شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

تلقیح ریز نمونه و ظهور ریشه موئین: پس از کشت شبانه، هر دو نوع سویه باکتری (A4 و C58C1) با غلظت بهینه (OD₆₀₀) بین 6/0 تا 8/0 جهت تلقیح در محیط کشت مایع Luria-Bertani (LB) حاوی ریفامپیسین (50 میلی­گرم بر لیتر، برای هر دو سویه باکتری) و کانامایسین (50 میلی­گرم بر لیتر، برای سویه C58C1) در شرایط تاریکی بر روی شیکر انکوباتور (120 دور در دقیقه در 25 درجه سانتیگراد) کشت شدند. پس از جدا کردن ریزنمونه­های کوتیلدونی (ریزنمونه) توسط اسکالپل، روش اولتراسونیکElmasonic) ،Singen ،  (Germanyبا فرکانس 120 هرتز و دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه جهت تلقیح بهتر ریزنمونه­ها با سویه­های A4 و C58C1 استفاده گردید (46). پس از 2 روز، ریزنمونه­ها به محیط کشت MS جامد حاوی سفوتاکسیم (200 میلی­گرم بر لیتر، برای هر دو سویه) و کانامایسین (100 میلی­گرم بر لیتر، برای سویه C58C1) منتقل شدند. پس ازگذشت یک هفته، برای افزایش رشد ریشه­های موئین در محیط کشت جامد، هر یک از ریزنمونه­های ریشه­دار به صورت تکی و لاین­های مجزا به محیط کشت MS جامد عاری از هورمون و حاوی سفوتاکسیم (100 میلی­گرم در لیتر، برای هر دو سویه) و کانامایسین (100 میلی­گرم بر لیتر، برای سویه C58C1) منتقل گردیدند. واکشت ریزنمونه­ها هر 2 هفته یکبار انجام شد. از میان 10 و 54 لاین ریشه موئین القاء شده به ترتیب توسط سویه­های A4 و C58C1، لاین­های 6 و 13 بعنوان لاین پر رشد جهت انجام مراحل بعدی آزمایش انتخاب شدند (شکل 2-پ).

آنالیز مولکولی ریشه­های مویین از طریق واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR): جهت اثبات حضور ژن rol B در ریشه­های موئین از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی ژن rol B  استفاده شد. DNA ژنومی ریشه‌های موئین حاصل از هر دو سویه به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج گردید (16). واکنش در 94 درجه و 35 چرخه (هر چرخه شامل 1 دقیقه در 94 درجه، 80 ثانیه در 60 درجه و 90 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و تکمیل بسط در 10 دقیقه در دمای 72 درجه) انجام شد. محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد و بوسیله دستگاه ژل داک عکسبرداری شد. تکثیر قطعات  bp780 ژن rol B با استفاده از آغازگر رفت F: 5´- TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3´ و برگشت R: 5´- TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3´ انجام شد.

تیمار ریشه­های موئین با غلظت بهینه عصاره مخمر: عصاره مخمر از شرکت لیوفیلکم Liofilchem)) تهیه شد. غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی­گرم بر لیتر) (35) جهت تیمار ریشه­های موئین هر دو سویه باکتری در محیط کشت MS مایع تهیه گردید. یک گرم از ریشه‌های موئین هر دو سویه باکتری به داخل ارلن مایرهای 250 میلی‌لیتری حاوی 10 میلی‌لیتر محیط کشت MS مایع در 3 تکرار، منتقل و داخل شیکر انکوباتور با 120 دور در دقیقه، دمای 25 درجه سانتی­گراد و در تاریکی نگه‌‌داری شدند (شکل 2-ت). پس از 21 روز، محیط کشت MS مایع حاوی غلظت بهینه عصاره مخمر به ارلن­ها اضافه گردید. پس از گذشت 48 ساعت از زمان تیمار، ریشه‌های موئین به محیط کشت MS مایع فاقد عصاره مخمر انتقال یافتند. پس از گذشت یک هفته، عمل برداشت ریشه‌های موئین صورت گرفت و بعد از شستشو با آب مقطر و حذف رطوبت اضافی ریشه‌ها توسط کاغذ صافی، وزن تر اندازه‌گیری شد. پس از خشک شدن ریشه­ها توسط فریز درایر (به مدت 48 ساعت) وزن خشک اندازه‌گیری و ثبت شدند.

عصاره گیری جهت اندازه­گیری صفات فیتوشیمیایی و ظرفیت آنتی اکسیدانی: یک گرم وزن تر از ریشه­های موئین سویه A4 و C58C1 داخل هاون توسط ازت مایع پودر شدند و سپس به پودرهای ریشه موئین 20 میلی­لیتر متانول 80 درصد اضافه شد. در نهایت عصاره گیری با استفاده از روش اولتراسونیک در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انجام شد (58).

اندازه­گیری فنول و فلاونوئید کل: اندازه­گیری فنول کل با استفاده از معرف فولین سیوکالتیو (Folin-Ciocalteu) به روش Slinkard و Singleton (47) اندازه­گیری شد. 180 میکرولیتر از عصاره متانولی (80 درصد) استخراج شده از ریشه­های موئین با 180 میکرولیتر آب مقطر و 1200 میکرولیتر فولین 10 درصد داخل لوله ِآزمایشی تمیز ریخته و در آخر به آن 960 میکرولیتر کربنات سدیم 7 درصد مقطر اضافه گردید. سپس لوله‌‌های شیشه‌‌ای به مدت 30 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق نگه­داری شد. میزان جذب در طول موج 760 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومترDynamica (HALODB-20) قرائت شد. منحنی استاندارد بر اساس اسید گالیک، ترسیم و نتایج به بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید بر گرم وزن تر گزارش شد. در مورد فلاونوئید کل، 150 میکرولیتر از عصاره متانولی (80 درصد) استخراج شده از ریشه­های موئین با 150 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد به مدت 5 الی 15 دقیقه در شرایط تاریکی قرار داده شد. سپس 300 میکرولیتر محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 1000 میکرولیتر استات پتاسیم 1 مولار اضافه نموده و جذب مخلوط در طول موج 380 نانومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد. میزان فلاونوئید کل عصاره­ها بر اساس میلی‌‌گرم کوئرستین بر گرم وزن تر گزارش شد (15).

اندازه­گیری آلکالوئید کل: سنجش آلکالوئید کل با استفاده از روش Ajanal و همکاران (6) با تغییرات جزئی اندازه­گیری شد. 1 گرم از ریشه­های موئین خشک شده پودر شدند و با 20 میلی­لیتر متانول (80 درصد) به مدت 24 ساعت عصاره گیری شد. عصاره به دست آمده توسط کاغذ صافی فیلتر شد و جهت تبخیر متانول و تغلیظ عصاره از دستگاه روتاری با دمای 45 درجه سانتیگراد در تاریکی استفاده شد. پس از آن ، عصاره غلیظ شده در 1 میلی­لیتر اسید کلریدریک (2N) حل و فیلتر شد. 1 میلی­لیتر از این عصاره به دکانتور منتقل و با 10 میلی­لیتر کلروفرم (pH=7 توسط NaoH=0.1 N) شسته شد. درنهایت 5 میلی­لیتر معرف سبز بروموکروزول  (Bromocresol green)، 5 میلی­لیتر بافر فسفات  (pH= 4.7) و 4 میلی­لیتر کلروفرم به محلول اضافه شد و به شدت تکان داده شد. جذب نمونه­ها در 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی استاندارد از غلظت­های آلکالوئید هیوسیامین (4/0، 6/0، 8/0، 1 و 2/1 میلی­لیتر) استفاده شد. میزان آلکالوئید کل بر اساس میکروگرم بر گرم وزن خشک گزارش شد.

اندازه‌‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی به روش مهار رادیکال آزاد DPPH : برای اندازه­گیری ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش DPPH، 2 میلی­لیتر از محلول DPPH به غلظت­های مختلف (200، 400 و 600 پی پی ام) عصاره ریشه­های موئین اضافه شد. محلول حاصل را تکان داده و در دمای آزمایشگاه به مدت 30 دقیقه نگهداری شدند. جذب نمونه­ها در 517 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. منحنی استاندارد بر اساس غلظت­های مختلف اسید آسکوربیک (10، 20، 30، 40 و 50 پی پی ام) رسم شد. با استفاده از فرمول زیر فعالیت آنتی­اکسیدانی تعیین گردید. جهت تهیه شاهد (Blank) نیز به روش بالا عمل و فقط به جای عصاره گیاهی، 50 میکرولیتر متانول 80 درصد اضافه شد (24).

RSA= [(Abs control – Abs sample)/Abs control] ×100

:Abs control میزان جذب بلنک، :Abs sample میزان جذب نمونه

اندازه‌‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی از طریق قدرت احیاء‌کنندگی آهن FRAP)): به منظور سنجش میزان ظرفیت آنتی­‌اکسیدانی ریشه‌های موئین به روش FRAP، 500 میکرولیتر از عصاره ریشه­های موئین و 3 میلی­لیتر معرف تازهFRAP  (بافر استات سدیم 300 میلی­مولار با اسیدیته 6/3، فریک- تری پریدیل- اس- تریازین (2,4,6-Tris(2-Pyridyl)-s-Triazine (TPTZ)) و فریک کلرید) با هم مخلوط شدند. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (دمای 37 درجه سانتیگراد) قرار گرفت و جذب آن در طول موج 593 نانومتر و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نسبت به شاهد خوانده شد. از سولفات آهن برای رسم منحنی استاندارد استفاده گردید و نتایج داده­ها بر اساس میلی­مول آهن II بر گرم وزن تر بیان شد (65).

عصاره‌ی گیاهی جهت سنجش فعالیت آنزیم‌ها: 5/0گرم از هر نمونه تازه (ریشه­های حاصل از هر دوسویه) در نیتروژن مایع پودر شدند و در 2 میلی­لیتر بافر استخراج حاوی 5/0درصد تری هیدروکلراید (Tris HCL) و 05/0 درصد پلی وینیل پیرولیدون (PVP)  در pH=8 حل شد. عصاره حاصل سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از جداسازی ، از مایع رویی برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان استفاده شد (49).

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD): سنجش فعالیـت آنـزیم سوپراکسـید دیسـموتاز بـا روش  Giannopolitisو Ries (18) و به کمک سنجش مهار احیای نوری (Photoreduction) نیتروبلوتترازولیوم (NBT) در طــول مــوج 560 نانومتر، انجام گرفت. برای هر نمونه ، 50 میکرولیتر عصاره به لوله­های حاوی 1 میلی­لیتر بافر واکنش (متشکل از 50 میلی مولار بافر فسفات (pH=7)، 13 میلی مولار ال-متیونین، 1/0 مولار EDTA، 75 میکرومولار NBT و 2 میکرومولار ریبوفلاوین) اضافه شد. پس از قرار گرفتن لوله­ها به مدت 15 دقیقه در معرض نور، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نمونه قرائت گردید. یـک واحد آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز، مقدار آنزیمی اسـت کـه موجب 50 درصـد ممانعـت از احیـای نوری NBT مـی­گـردد.

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): فعالیت آنزیم کاتالاز با روش Aebi (5) در 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. برای هر نمونه، 5 میکرولیتر عصاره (25 برابر رقیق شده) به لوله­های حاوی 5/2 میلی لیتر­بافر فسفات (50 میلی مولار در pH=7) و 20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (3 درصد) اضافه شد. یک واحد آنزیمی کاتالاز، مقدار آنزیمی است که 1 میلی‌مولار H2O2 را در یک دقیقه تجزیه می­کند.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX): فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با روش Nakano و Asada (40) در 290 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. برای هر نمونه، 100 میکرولیتر عصاره به لوله­های حاوی 2 میلی­لیتر بافر فسفات (50 میلی مولار در pH=7، 20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (5 درصد) و 10 میکرولیتر اسید اسکوربیک (50 میکرومول) اضافه شد. فعالیت آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان اسید اسکوربیک اکسید شده در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه تعیین شد

فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX): فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با روش Mac-Adam و همکاران (32) در 436 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. 100 میکرولیتر عصاره به لوله­های حاوی 3 میلی­لیتر بافر فسفات (1/0 مولار در pH=7)، 50 میکرولیتر گایاکول و 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن ( 3 درصد) اضافه شد. میزان فعالیت آنزیم بر حسب تغییرات واحد جذب در دقیقه به ازای هر گرم وزن تر محاسبه گردید.

عصاره گیری آلکالوئیدها: استخراج تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین موجود در ریشه‌های موئین حاصل از دو سویه باکتری به روش Kamada و همکاران (25) با اندکی تغییر انجام شد. بر اساس این روش، مقدار 5/0 گرم از ریشه‌های موئین خشک، پودر و کلروفرم، متانول و آمونیاک 25 درصد، به نسبت­های 15 :5 :1 به نمونه­های پودر شده اضافه و به مدت 10 دقیقه با اولتراسونیک عصاره گیری شدند. پس از عبور از صافی و دو مرتبه شستشوی کاغذ صافی با 1 میلی­لیتر کلروفرم، برای تبخیر فاز کلروفرمی از دستگاه تبخیر کننده دوار (روتاری اواپراتور) (Rotary evaporator) استفاده گردید. به عصاره­های باقی مانده و خشک شده، 5 میلی­لیتر کلروفرم و 2 میلی­لیتر اسید سولفوریک 1 نرمال اضافه و کاملا هم زده شدند. در مرحله بعد مخلوط به دست آمده داخل دکانتور ریخته شد که باعث تشکیل دو فاز شد. فاز کلروفرمی (فاز پایینی) جدا و دور ریخته شد و فاز آبی حاوی آلکالوئیدها به یک بشر منتقل شد و pH آن روی یخ و به وسیله ی آمونیاک 28 درصد تا 10 تنظیم گردید محلول قلیایی داخل دکانتور اضافه شد و آلکالوئیدها یک مرتبه توسط 2 میلی­لیتر و دو مرتبه توسط 1 میلی­لیتر کلروفرم استخراج شدند. فاز کلروفرمی به دست آمده پس از افزودن سولفات سدیم خشک به منظور حذف آب اضافی موجود، از صافی عبور داده شده و کاغذ صافی توسط 1 تا 2 میلی­لیتر کلروفرم شستشو داده شدند. در نهایت محلول صاف شده به وسیله روتاری اواپراتور در دمای 40 درجه سانتی­گراد تبخیر و ماده جامد به دست آمده که آلکالوئید کل نامیده می­شود در 1 میلی­لیتر متانول خالص حل شد.

آنالیز تروپان آلکالوئیدها به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC): به­منظور سنجش میزان تروپان آلکالوئیدها (هیوسیامین و اسکوپولامین) در عصاره های استخراجی از ریشه‌های موئین دو سویه باکتری، از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، مدل  Smartline(Knauer، آلمان) با آشکارساز  PDAمدل K-2800 با طول موج 215 نانومتر استفاده شد. ستون مورد استفاده C-18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) بود. سرعت جریان حلال 4/1 میلی­لیتر بر دقیقه بود و فاز متحرک شامل استونیتریل و بافر استات به نسبت­های 20:80 بود. مقدار عصاره استفاده شده برای هر تزریق 20 میکرولیتر و جمع آوری و پردازش داده ها توسط نرم افزارEZChrom Elite  انجام شد. میزان دو آلکالوئید هیوسیامین و اسکوپولامین بر اساس سطح زیر منحنی به دست آمده با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد.

آنالیز آماری داده­ها: برای مقایسه و تحلیل داده­ها از نرم

افزار SAS 9.4 و آزمون T-test جفت نشده استفاده گردید. نمودارها با استفاده از نرم افزاR  رسم شدند.

نتایج

تأیید حضور ژن rol B در ریشه­های موئین: نتایج آنالیز الکتروفورز ژل آگارز 1درصد محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای ریشه­های موئین تراریخت احتمالی، حضور قطعه با اندازه حدودی bp780 مربوط به ژن rol B را در ریشه­های موئین حاصل از تلقیح ریزنمونه­های کوتیلدونی با سویه A4 ازAgrobacterium  rhizogenes و سویه C58C1 از Agrobacterium tumefaciens تأیید نمود که هم­اندازه قطعه تکثیر شده در نمونه کنترل مثبت (هر دو سویه آگروباکتریوم مورد استفاده در تلقیح) بود. همچنین در DNA حاصل از ریشه‌‌های طبیعی گیاه بذرالبنج مشبک و محصول واکنش PCR بدون DNA الگو (به­عنوان کنترل منفی)، هیچ باند تکثیری مشاهده نگردید. به عبارت دیگر، حضور باند قوی در منطقه bp780 مؤید تکثیر قطعه مورد بررسی و حضور ژن rol B در ریشه­های موئین بود (شکل 1).

شکل 1- الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد محصول واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز جهت تأیید حضور ژن rol B در ریشه‌های تراریخت: L: DNA مارکر (1 kb ladder Fermentas)، A4: Agrobacterium rhizogenes به­عنوان کنترل مثبت، C58C1: Agrobacterium tumefaciens به­عنوان کنترل مثبت، WT: ریشه‌های  طبیعی بذرالبنج مشبک به­عنوان کنترل منفی، C: محصول واکنش PCR بدون DNA الگو، 1: ریشه‌های موئین القا شده با سویه A4،2 : ریشه‌های موئین القا شده با سویه C58C1

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم و غلظت بهینه عصاره مخمر بر رشد ریشه­های موئین: در ریزنمونه­های کوتیلدونی تلقیح شده با سویه A4 و C58C1 به ترتیب بعداز 4 و 2 هفته ریشه­های موئین از محل زخم ظاهر شدند (شکل 2-ب). نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان وزن تر و خشک ریشه‌های موئین نشان داد که وزن تر (09/0±02/2 گرم) و خشک (01/0±18/0گرم) ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 در مقایسه با ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 (وزن تر= 03/0±76/5 گرم، وزن خشک= 00/0±41/0گرم) از لحاظ آماری به طور معنی­داری در سطح احتمال یک درصد کمتر است (جدول 1).

شکل 2-الف- واکشت Agrobacterium rhizogenes سویه A4 (1) و Agrobacterium tumefaciens سویهC58C1  (2)، ب: ظهور ریشه­های موئین از ریز نمونه­های تلقیح یافته با آگروباکتریوم، پ: رشد ریشه­های موئین در محیط کشت جامد و ت: کشت ریشه­های موئین در محیط کشت مایع.

جدول 1- تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر صفات رشدی و فیتوشیمیایی ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک و آزمون T-test جفت نشده

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان فنول و فلاونوئید: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان فنول و فلاونوئید کل ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین فنول (05/0±32/7 میلی­گرم اسید گالیک بر گرم وزن تر) و فلاونوئید کل (05/0±84/1 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 بیشتر از میانگین فنول (05/0±20/4 میلی­گرم اسید گالیک بر گرم وزن تر) و فلاونوئید کل (02/0±04/1 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن تر) ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود. (جدول 1). طبق نتایج به دست آمده، میزان افزایش فنول و فلاونوئید کل در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 به­ترتیب 74/1 و 76/1 برابر نسبت به ریشه­های موئین کنترل افزایش یافت.

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان آلکالوئید کل: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان آلکاوئیدکل ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین آلکالوئیدکل (40/0±87/82 میکروگرم بر گرم وزن خشک: ) در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 77/1 برابر بیشتر از میانگین آلکالوئید کل (26/0±81/46 میکروگرم بر گرم وزن خشک) ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود. (جدول 1).

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش DPPH : نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان IC₅₀ ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین IC₅₀ (02/62±0/1 میکروگرم بر میلی­لیتر) در ریشه­های حاصل از سویه C58C1 کمتر از میانگین IC₅₀ (03/12±0/2 میکروگرم بر میلی­لیتر) ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 2). این موضوع نشان می­دهد که ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با ریشه­های حاصل از A4 فعالیت آنتی­اکسیدانی بیشتری از خود نشان می­دهد (جدول 2).

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش FRAP : نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش FRAP ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش FRAP (16/77±0/14 میلی­مول آهن II بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 بیشتر از میانگین ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP (11/71±0/11 میلی­مول آهن II بر گرم وزن تر) ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 2).

جدول 2- تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH و FRAP ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک و آزمون T-test جفت نشده

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین فعالیت آنزیم­های اکسیدانی SOD)، CAT، APX و (GPX در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 به­ترتیب 45/2، 30/1، 82/1 و 18/2 برابر بیشتر از میانگین آنزیم­های آنتی­اکسیدانی ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود (شکل3).

شکل 3- تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، الف: سوپراکسید دیسموتاز، ب: کاتالاز، ت: آسکوربات پراکسیداز، پ: گایاکول پراکسیداز

تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها: کروماتوگرام مربوط به استاندارد ترکیبات هیوسیامین و اسکوپولامین و همچنین کروماتوگرام­های مربوط به عصاره ریشه‌های موئین دو سویه A4 و C58C1 تیمار شده با غلظت بهینه عصاره مخمر در شکل 4 آورده آمده است. نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید هیوسیامین و اسکوپولامین ریشه‌های موئین نشان داد که میانگین تولید هیوسیامین (75/3±66/76 میکروگرم بر گرم وزن خشک) و اسکوپولامین (88/0±30/102 میکروگرم بر گرم وزن خشک) در ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 کمتر از میانگین تولید هیوسیامین (76/1±30/105 میکروگرم بر گرم وزن خشک) و اسکوپولامین (45/1±70/137 میکروگرم بر گرم وزن خشک) ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 بود (شکل5) که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنی­دار بود (شکل 5). طبق نتایج به دست آمده، میزان افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 به­ترتیب 37/1 و 34/1 برابر نسبت به ریشه­های موئین کنترل افزایش یافت.

بحث و نتیجه گیری

در این مطالعه، مقایسه دو سویه مختلف باکتری آگروباکتریوم (سویه A4 از A. rhizogenes و سویه C58C1 ازA. tumefaciens) بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی گرم بر لیتر) بعد از 48 ساعت به­عنوان محرک زیستی نشان داد که وزن تر و خشک ریشه­های موئین حاصل از سویهC58C1  نسبت به سویه A4 به­طور مؤثری در گیاه بذرالبنج مشبک تحت تأثیر عصاره مخمر قرار گرفت. اختلاف در مورفولوژی و میزان رشد ریشه­های مونین را می­توان به تنوع پلاسمیدهای وارد شده توسط سویه­های مختلف باکتری نسبت داد که به چگونگی تاثیر ژن­های rol مربوط می­شود. بیان این ژن­ها˓ سطح هورمون­های اکسین و سیتوکینین گیاه میزبان و نیز میزان حساسیت سلول­های گیاهی به سطح هورمون رشد را تغییر می­دهند (53).

شکل 4-الف- کروماتوگرام پیک­های استاندارد حاصل از دستگاه HPLC تروپان آلکالوئیدها،  ب: کروماتوگرام ریشه­های موئین القا شده با سویه A4 و پ: کروماتوگرام ریشه­های موئین القا شده با سویه C58C1

شکل 5- تأثیر سویه­های مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها، الف: هیوسیامین ب: اسکوپولامین

همچنین دلیل دیگر این تفاوت­ها، بیان متفاوت ژن­های
T-DNA ریشه­های تراریخته، تعداد کپی­های متعدد T-DNA وارد شده و اثرات محل ورود T-DNA به ژنوم گیاه می‍باشد (7).

در این مطالعه، مقایسه تأثیر سویه­های مختلف باکتری آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی گرم بر لیتر) بعد از 48 ساعت به­عنوان محرک زیستی نشان داد که  سویه C58C1 در ریشه­های موئین به طور مؤثری میزان تولید و تجمع ترکیبات فیتوشیمیایی به ویژه فنول و فلاونوئید کل، آلکالوئید کل، هیوسیامین و اسکوپولامین را نسبت به سویه A4 تحت تأثیر قرار داد. از دلایل افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در ریشه­های موئین ممکن است انتقال T-DNAی باکتری آگروباکتریوم و اختلال در مسیر بیوسنتز ترکیبات با ارزش باشد (4). به طور کلی تولید انبوه و سریع متابولیت­های ثانویه در مقیاس بالا با استفاده از روش­های شیمیایی مشکل و یا غیرممکن می­باشد (41). از راهبردهای متعددی برای بهبود تولید متابولیت­ها می­توان به کشت بافت گیاهی، استفاده از پیش سازها، کاربرد انواع محرک­ها و مهندسی ژنتیک اشاره کرد که راه حلی مناسب و ارزان برای تولید آسان و انبوه متابولیت­های ثانویه می‍باشد (59).

سه آنزیم مهم در مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها شامل هیوسیامین -6- بتا هیدروکسیلاز (H6H)، تروپینون ردوکتاز (TR-I) و پوترسین N- متیل ترانسفراز(PMT)  هستند (45). بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها مانند هیوسیامین و اسکوپولامین با تشکیل یون N- متیل پیرولینیوم از آمینواسیدهای اورنیتین وآرژنین آغاز می­شود. پوترسین N- متیل ترانسفراز (PMT) آنزیم دخیل در برداشت پوترسین از مخزن پلی آمین می‍باشد و -N متیلاسیون دی آمین را به شکل N- متیل پوترسین کاتالیز می­کند. این مرحله اولین مرحله مشترک در بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها و نیکوتین می­باشد و منجر به تولید یک ترکیب حدواسط دارای بارمثبت (N- متیل پیرولینیوم) می­گردد. سپس مسیر تروپان آلکالوئیدها از مسیر تولید نیکوتین جدا می­شود. آخرین مرحله در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها، توسط آنزیم هیوسیامین-6- بتا هیدروکسیلاز انجام می‌شود. در این مرحله، آنزیم هیوسیامین 6- بتا هیدروکسیلاز، هیدروکسیلاسیون هیوسیامین را به 6- بتا هیدروکسی هیوسیامین و نیز اپوکسیداسیون 6- بتا هیدروکسی هیوسیامین را به اسکوپولامین (هیوسین)، کاتالیز می‌کند (63). Kohnen-Johannsen  و  Kayser(28) نشان دادند که بیش بیانی ژن­های درگیر در فعال­سازی آنزیم­های کلیدی در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها منجر به تجمع تولید این ترکیبات می­شوند. علاوه بر این، استفاده از عصاره مخمر بعنوان محرک می­تواند فعالیت آنزیم پوترسین متیل ترانسفراز PMT)) و به دنبال آن ظرفیت سنتز تروپان آلکالوئیدها رو به دلیل محتوی یون کلسیم (Ca) تنظیم می‍کند (43). در این مطالعه از یک طرف، کاربرد Agrobacterium tumefaciens سویه C58C1 به­عنوان حامل ژن pmt و از طرف دیگر تیمار با عصاره مخمر، احتمالا در میزان فعالیت آنزیم­های کلیدی مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها مانند H6H و PMT مؤثر بوده و به طور مستقیم یا غیر مستقیم، بیان ژن­هایpmt  و h6h را تحت تأثیر  قرار داده و موجب افزایش تروپان آلکالوئیدها می­شوند. گزارشات مختلف نشان می­دهد میزان تجمع تروپان آلکالوئیدها با بیش بیانی ژن­هایpmt  و h6h در کشت ریشه­های­ موئین شابیزک (Atropa belladonna) بهبود یافت (60 و 31). همچنین مطالعات مختلف نشان می­دهند که عصاره مخمر نقش مؤثری در افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین در کشت ریشه موئین بذرالبنج مشبک
(H. reticulatus L.) (35)، اسکوپولامین در کشت ریشه موئین بنگ دانه (H. niger L.) (21)، سیلی مارین در کشت سوسپانسیون سلولی خار مریم (S. marianum) (3)، ایزوفلاونوئید کل در ریشه­های موئین(P. candollei)  (55) داشته است.

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تیمار با غلظت بهینه عصاره مخمر منجر به افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی به دو روش DPPH و FRAP در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با سویه A4 شد. ظرفیت آنتی­اکسیدانی با استفاده از روش DPPH یک روش ساده، سریع و حساس برای ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدان­ها جهت مهار رادیکال­های آزاد است (27). IC₅₀ غلظت لازم برای مهار 50 درصد رادیکال­های آزاد را نشان می­دهد (24). بین مقدار IC₅₀ و فعالیت آنتی­اکسیدانی رابطه­ی معکوسی وجود دارد (30). در روشFRAP ترکیبات آنتی­اکسیدانی با  Ferric tri-pyridyl-triazine complex (Fe (III)-TPTZ) واکنش می­دهند و موجب ایجاد رنگ آبی می­شوند (20). افزایش فعالیت آنتی­اکسیدانی بالا در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 با هر دو روش DPPH و FRAP را می­توان با افزایش تجمع متابولیت­های ثانویه از جمله فنول، فلاونوئید و آلکالوئیدکل توضیح داد (23). جامی و همکاران (2) گزارش کردند با افزایش تولید ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در گیاه نوروزک (Salvia leriifolia Benth.)، فعالیت آنتی اکسیدانی نیز با هر دو روش FRAP و DPPH افزایش یافت.

نتایج آنالیز داده­ها نشان داد که تیمار با غلظت بهینه عصاره مخمر منجر به افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با سویه A4 شد. در روابط گیاه-میکروب، دو سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی وجود دارد (17). آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز از جمله مهم ترین آنزیم­های آنتی­اکسیدانی هستند که مستقیماً با رادیکال­های اکساینده واکنش نمــوده و آن­ها را به فرآورده­های غیــر رادیـــکالی تـــبدیل می­نمایند (61). سوپراکسید دیسموتاز یکی از مهم­ترین آنزیم­های آنتی­اکسیدانی است که از اکسیده شدن غشای لیپیدها جلوگیری می­کند و در تبدیل سوپراکسید (O2^−•) به پراکسید هیدروژن (H₂O₂) نقش دارد (22). آنزیم کاتالاز در پراکسی­زوم­ها و گلی­اکسی­زوم­های گیاهی حضور دارد و نقش تجزیه­کننده H₂O₂ تولید شده طی تنفس نوری در پراکسی­زوم­ها یا H₂O₂ تولید شده طی بتا اکسیداسیون اسیدهای چرب در گلی­اکسی­زوم­ها را برعهده دارد. این آنزیم برای انجام فعالیت خود به نیروی احیایی نیاز ندارد. افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز یک پاسخ سازشی برای غلبه بر آسیب­های ناشی از سطوح بالا، سمی و احیاکننده H₂O₂ می­باشد که طی متابولیسم سلول تولید می­گردد. آسکوربات پراکسیداز نقش کلیدی در پاکسازیROS  و حفاظت سلول­ها در مقابل اثرات مخرب آن­ها در گیاهان عالی دارد (34). آسکوربات پراکسیداز، یک پراکسیداز اختصاصی می­باشد که H₂O₂ را از طریق چرخه آسکوربات-گلوتاتیون با کمک اسیدآسکوربیک به آب و مونو دهیدور آسکوربات تجزیه می­نماید (42). یکی دیگر از آنزیم‌های اکسیدکننده ترکیبات فنولی آنزیم گایاکول­پراکسیداز می­باشد که نقش مهمی در افزایش دفاع آنتی‌اکسیدانی دارد. گایاکول پراکسیدازها گلیکوپروتئین­هایی هستند که ترکیبات فنولی را مانند یک دهنده هیدروژن مصرف کرده و در فرآیندهای نمو، بیوسنتز اتیلن، لیگنین­سازی، دفاع و التیام زخم­ها شرکت می­کنند (56). در این مطالعه میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در ریشه های موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با کنترل افزایش یافته است که این افزایش ممکن است دو دلیل داشته باشد: 1- سطح بالای بیان ژن T-DNA از طریق
A. tumefaciens در مقایسه با A. rhizogenes  (14) 2- تولید بیشتر ROS در این غلظت از عصاره مخمر و مقابله گیاه با این ­ROSها با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی باشد. نتایج تحقیق Ara و همکاران (10) نشان داد با بیش بیانی ژن­های FeSOD و MnSOD در ساقه و ریشه دو گونه­ مختلف خیار Cucurbita maxima) و
(Cucurbita moschata میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافت. فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشه موئین بذرالبنج مشبک(Hyoscyamus reticulatus L)  بوسیله عصاره مخمر (250 میلی­گرم برعصاره مخمر بعداز 24 ساعت) افزایش یافت (35). در گیاهچه­های سویا (Glycine max) در اثر تیمار با غلظت­های مختلف عصاره مخمر (1/0، 2/0 و 5/0 درصد) به مدت 8 ساعت میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافته است (11).

در کل با توجه به نتایج مطالعه حاضر می­توان گفت که ترکیب بیش بیانی ژن pmt و استفاده از غلظت بهینه عصاره مخمر در مدت زمان تیمار 48 ساعت باعث افزایش رشد ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 نسبت به سویه A4 گردید. میزان تولید و تجمع ترکیبات فیتوشیمیایی از جمله فنول، فلاونوئید و آلکالوئید کل و به دنبال آن ظرفیت آنتی­اکسیدانی در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 را بیشتر از ریشه­های موئین سویه A4 افزایش داد. همچنین، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی شامل سوپر اکسیددیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 نسبت به سویه A4 افزایش یافت. نتایج آنالیز HPLC نیز نشان داد که تحت تأثیر بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر میزان تولید و تجمع هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های موئین حاصل از سویه C58C1 افزایش قابل توجهی داشتند. بنابراین، ترکیب بیش بیانی و محرک می­تواند بعنوان یک روش موفق آمیز جهت بهبود تولید تروپان آلکالوئیدها در شرایط درون شیشه­ای باشند.

سپاسگزاری

بدین وسیله نویسندگان مقاله حاضر از کارشناسان آزمایشگاه­های گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه و کارشناسان بخش آنالیز دانشگاه شهید بهشتی جهت همکاری ارزشمندشان صمیمانه تشکر و امتنان را دارند. همچنین از تمام افرادی که در انجام این مطالعه ما را راهنمایی نمودند قدردانی می­شود.