Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Application of activated charcoal and carbon nanotubes on phenol exclusion from tissue culture media in Grapevine and Paulownia

Document Type : Research Paper

Authors

1 Presently he has no academic position

2 Associated Prof., Hort Dep., Gorgan University Of Agricultural Sciences and natural Resources

3 Gorgan University of Agri. Sci. Natural Resources

4 Hort Departement,, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources

Abstract

Numerous factors limit the plant propagation under in vitro conditions. Tissue browning is a serious problem in the establishment of explants in woody perennials and complicates the successful implementation of in vitro techniques. To solve this problem, application of activated charcoal resources was used, hence by controlling the effect on browning of plant tissue culture media the concentration of phenolic compounds was reduced. Furthermore, some easy methods were followed to solve the problem of oxidative browning, especially in Paulownia and Grapevine explants. The present study was conducted in Tissue Culture Laboratory, Dep. of Horticulture, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources. The basal MS medium supplemented with IBA (2 and 4 mg / l, for Grapevine and Paulownia, respectively), was fortified with different concentrations of activated charcoal and carbon nanotubes (0, 50, 100, 200, 400 mg/l). The estimation of phenolic compounds was performed with the calorimetric Folin-Ciocaltea method at 760 nm. The experiment was undertaken as completely randomized design. The results showed that both activated charcoal and carbon nanotubes had positive and significant effects on the absorption of phenol in the culture medium and the propagation of in vitro explants. The results of this study indicated that concentrations of 400 mg/l activated charcoal and 200 mg/l carbon nanotubes can be used as phenol-absorbing carbon sources in the culture media of these plants. Also, after minor modifications, the results of the present may be utilized in commercial propagation of other crops and plant species.

Keywords

Main Subjects

کاربرد زغال فعال و نانولوله­های کربنی در حذف مواد فنولی از محیط کشت

بافت گیاهان انگور و پالونیا

محمد زارعی، مهدی علیزاده*، سارا خراسانی نژاد و مصطفی خوشحال سرمست

ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه باغبانی

تاریخ دریافت: 27/1/1400            تاریخ پذیرش:14/7/1400

چکیده

عوامل متعددی در ریزازفزایی گیاهان در شرایط درون­شیشه محدودیت ایجاد می­کنند. قهوه­ای شدن یک مشکل جدی در استقرار ریزنمونه­ها در گیاهان چند ساله چوبی است و انجام موفقیت­آمیز تکنیک­های درون­شیشه‌ای را پیچیده   می­سازد. در جهت حل این مشکل، کاربرد منابع زغال (جاذب فنول)، با هدف کنترل عوامل موثر بر قهوه­ای شدن محیط کشت بافت صورت گرفت تا غلظت ترکیبات فنولی کاهش یافته و راهکاری برای حل مسئله قهوه­ای شدن اکسیداتیو در ریزنمونه­های درون­شیشه­ای پالونیا و انگور دنبال شود. پژوهش حاضر در آزمایشگاه گروه باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام گرفت. محیط پایه MS حاوی IBA    (به ترتیب ۲ و ۴ میلی­گرم در لیتر برای انگور و پالونیا)، در محیط تکثیر با غلظت­های مختلف زغال فعال و نانولوله کربن (۴۰۰، ۲۰۰، ۱۰۰، ۵۰، ۰ میلی­گرم بر لیتر)، در قالب طرح کاملاً تصادفی مورد بررسی قرار گرفت. میزان ترکیبات فنولی کل محیط کشت بافت با روش رنگ­سنجی فولین-سیکالتیو و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 760 نانومتر اندازه­گیری شد. نتایج نشان داد که هر دو فرم زغال فعال و نانولوله کربن بر میزان جذب فنول محیط کشت و پرآوری ریزنمونه­های درون شیشه­ای اثرات مثبت و معنی­دار داشت. نتایج این مطالعه نشان دهنده آن است که می­توان از تیمارهای ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال و ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله­های کربن به عنوان منابع کربن جذب کننده فنول در محیط­های کشت این گیاهان استفاده کرد. نتایج این پژوهش با اندکی تغییر در سایر گیاهان و ریزافزایی تجاری قابل استفاده خواهد بود.

واژه­های کلیدی: فنول، قهوه­ای شدن، زغال فعال، نانو لوله کربن

* نویسنده مسئول،  تلفن: 0132423303 ، پست الکترونیکی:  mahdializadeh@gau.ac.ir

مقدمه

 

از دیدگاه تجاری کشت انگور، پیوندزنی بر روی یک پایه مناسب، روش مورد استفاده در تاکستان­های استاندارد در بیشتر مناطق جهان است. اکثر تاکستان­های تجاری در حال حاضر از کاشت مستقیم انواع انگور به دلیل حساسیت ارقام کشت شده به آفات به عنوان مثال، میکروب­ها، کنه­ها، حشرات، نماتدها و مهم‌تر از همه فیلوکسرا که منجر به زوال و مرگ نهال می‌شود، اجتناب می­نمایند. برای کشت استاندارد در تاکستان­های تجاری، تمرکز بیشتر بر روی کلون­های یکسان به تعداد زیاد است. از این رو ریزازدیادی گزینه مهمی برای روش­های متداول تکثیر گیاه است. در واقع، تقاضا برای مواد گیاهی جهت کشت نشان می‌دهد که ازدیاد زیاد در سطح کم برای تکثیر انبوه در محصولات مختلف باغی ضروری است. علاوه بر تولید پایه‌های یکنواخت در مدت زمان کوتاه و خارج از فصل رشد گیاهان، این روش همچنین در بین روش­های مبتنی بر کشت بافت مانند جهش، غربالگری آزمایشگاهی، مهندسی ژنتیک و تبادل ژرم پلاسم، دارای ارزش است (3، 5).

از مشکلات مهم مهندسی ژنتیک و تبادل ژرم­پلاسم تراوش فنول از بافت گیاهی در محیط کشت می­باشد (3، 26). بنابراین خنثی­سازی و حذف فنول­های آزاد شده در محیط کشت اولین اقدام ضروری در کشت بافت محسوب می­شود (3). همچنین پروتکل‌هایی برای تکثیر انگور گزارش شده است (20، 38، 41، 44، 32). استفاده از تکنیک­های درون­شیشه­ای برای تکثیر ارقام مختلف انگور به خوبی اثبات شده است (3، 6، 24، 36، 37). امروزه با توجه به، مطالعات گسترده در حوزه نانو مواد در سایر بخش­ها و قرار گرفتن آن به عنوان علم روز  (16، 30)، ارزیابی استفاده این مواد در زمینه کشت بافت گیاهی و علوم وابسته به آن و بهینه­سازی غلظت مناسب زغال در محیط کشت احساس می­شود.  همچنین نیاز به چوب با ارزش در مبلمان، سازه­های موسیقی، و محصولات دیگر چوبی باعث شده در سال‌های اخیر استفاده از پالونیا مورد توجه قرار گیرد. پالونیا درختی سریع الرشد با چوب سبک وزن است (46)، که چوب آن در بازارهای جهانی محبوبیت بالایی دارد (10). تقاضای زیاد برای کاشت مواد گیاهی در بازارهای داخلی و بین المللی برای جلوگیری از جنگل­زدایی و تولید انرژی زیستی نیاز به ایجاد پروتکل­های ریزازدیادی کارآمد برای تکثیر سریع و گسترده پالونیا را دارد.

کشت بافت گیاهی کشت ضدعفونی شده سلول­ها، بافت­ها و اندام­ها و اجزای آنها در شرایط فیزیکی و شیمیایی در شرایط درون شیشه­ای تعریف شده است (13). منشأ این تکنیک در ابتدای قرن بیستم توسط دانشمند آلمانی به نام    «هابرلنت» که در نامه خود به آکادمی علوم آلمان در سال ۱۹۰۲ در آزمایش‌های خود بر روی تک سلول ابداع شد. مطالعات اولیه منجر به کشت ریشه­ها، کشت جنین و اولین کالوس در کشت بافت شد (43). کشت بافت گیاهی همچنین به عنوان کشت سلول ضدعفونی شده (شرایط درون­شیشه­ای، محیط کنترل شده و یا کشت استریل) نامیده می­شود (43). یکی از عواملی که باعث از بین رفتن ریزنمونه در کشت بافت گیاهی ایجاد مشکل می‌کند اکسیداسیون ترکیبات فنولی است که در اثر زخم بافت گیاهی و ترشح این ترکیبات از سلول ایجاد می‌شود (25).

یکی از موانع موجود در کشت درون شیشه ای تراوش فنول­ها است. آزاد شدن ترکیبات فنولی باعث قهوه­ای شدن محیط کشت و از بین رفتن ریزنمونه می­گردد. دلیل اصلی قهوه­ای شدن بافت­های گیاهی تجمع و اکسایش ترکیبات فنولی در بافت­ها می­باشد. که اغلب به عنوان پاسخ دفاعی گیاه به استرس‌های زنده و غیرزنده می­باشد (1). غلظت و عناصر محیط­های کشت نقش موثری در تولید این ترکیبات دارند. اکسیداسیون ترکیبات فنلی در محیط کشت موجب کاهش موفقیت در فرآیند کشت بافت و پیچیده شدن مراحل آن می‌شود (2). برای کاهش مشکل قهوه­ای شدن از زردچوبه، زغال فعال، اسید آسکوربیک، اسید سیتریک، و پلی وینیل پیرولیدون (pvp)، جابجایی ریزنمونه و نگهداری در شرایط تاریکی مورد استفاده قرار می­گیرد (42). شدت قهوه­ای شدن با توجه به گونه بافت یا اندام، فاز رشد و نمو گیاه، سن بافت یا اندام و مواد مغذی و سایر متغیرهای کشت بافت متفاوت است (15). مسیر بیوسنتز ترکیبات فنولی در منبع شماره 27 شرح داده شده است.

زغال فعال ماده­ای بی مزه نافذ و دارای سیستم بسیار مناسبی از منافذ با سطح داخلی زیاد است که باعث از بین بردن تمام ناخالصی­های غیر کربن می­شوند. این مواد، برای جذب ترکیبات فنولی و جلوگیری از قهوه­ای شدن ریز نمونه­ها و محیط کشت کاربرد دارد (42). عوامل متعددی مانند چگالی، خلوص زغال و pH بر ظرفیت جذب زغال فعال تاثیر می­گذارد (14).

نانولوله کربن (CNTs) جنس دیواره­اش از اتم­های کربن است. که به دلیل خاصیت الکتریکی و مکانیکی آن طی سال­های اخیر مورد توجه زیادی قرار گرفته است (9). این روزها ذرات نانو تقریباً در کلیه محصولاتی مانند خوشبو کننده­های اتاق، شوینده­های لباس، محصولات بیولوژیکی و منسوجات، حذف عنصر نقره از فاضلاب مورد استفاده قرار گرفته است (30). کاربرد نانو ذرات (اندازه 1 تا 10 نانومتر) در کشت بافت گیاهی، بیشتر با هدف کاهش آلودگی و حذف عوامل آلوده­گر از محیط کشت یا نمونه­های گیاهی بوده است (29). نانوذرات نقره در این مورد کاربرد گسترده­ای داشته است. مثلا سرمست و همکاران (33) گزارش کردند که نانوذرات نقره، بدون تاثیر منفی بر رشد بافت­های گیاهی میتواند آلودگی را حذف نماید. برخی دیگر از پژوهشگران، تاثیر منفی و مثبت این موارد را در کنار نقش ضدعفونی کننده آن­ها، بیان کرده اند (29). کیم و همکاران (2017) در یک مقاله مروری، کاربرد نانومواد در کشت بافت گیاهی را مرور کرده اند (18). طاها و همکاران (2016) کاربرد نانولوله کربنی را در کشت بافت گیاه خرما آزمون نموده­اند. اگر چه در تولید جنین رویشی تاثیر منفی داشته است، ولی در مراحل تولید شاخه و باززایی آن بسیار مفید بوده است (39).

در پژوهش حاضر، کاربرد منابع زغال (زغال فعال معمولی و نانولوله کربنی)، با هدف کنترل عوامل موثر بر قهوه­ای شدن محیط کشت بافت گیاهان انگور و پالونیا مطالعه شد.

مواد و روشها

انتخاب و آماده سازی گیاهان مادری: دو گیاه انگور و پالونیا که هر دو متعلق به گروه گیاهان چوبی هستند، به هنگام کشت درون­شیشه­ای دارای تراوش فنول زیادی هستند. در این پژوهش، انگور رقم «قزل اوزوم» (Vitis vinifera cv Ghezel Uzum)  و پالونیا گونه فورچونی (Paulownia fortunei) استفاده شد. ریزنمونه انگور از شاخه سال جاری از تاک­های پنج ساله در تاکستان­های اطراف استان گلستان جمع آوری شد. سالم­ترین شاخه­های انگور به صورت بصری جمع­آوری شده و به آزمایشگاه منتقل شدند. از بذور پالونیا تهیه شده از کلکسیون گیاهی در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، برای تهیه ریزنمونه و تکثیر درون­شیشه­ای استفاده شد.

کشت و استقرار درون­شیشه­ای: شاخه­های انگور که در سال جاری شروع به رشد کرده­اند، فقط قسمت بالغ حدود (۳ ماهه) در خردادماه جمع­آوری شدند و بلافاصله در نایلون پیچیده و به آزمایشگاه منتقل شدند. برگ­ها و پیچک­ها حذف شده و با کوتاه کردن ساقه­ها به بخش­های گره­ای، ریزنمونه­های تک­گره آماده شدند (هر کدام حدوداً به طول ۵/۱ تا ۲ سانتیمتر حاوی یک جوانه جانبی). بخش­هایی که در قسمت میانی شاخه قرار دارند، یعنی بالاتر از گره دوم تا سوم از پایه و زیر گره چهارم تا پنجم از قسمت نوک شاخه انتخاب شدند. این­ ریزنمونه­های تک­گره کاملاً در محلول ۴ گرم بر لیتر قارچکش کاربندازیم روی شیکر (۱۲۰ دور در دقیقه) به هم زده شدند، و سپس با آب و مایع ظرفشویی ضدعفونی شده و سپس ۴ نوبت آبکشی شد.  در ادامه با آب مقطر اتوکلاو شده، شستشو صورت گرفت. این ریزنمونه­های پیش تیمار شده، به مدت 30 دقیقه تحت محلول هیپوکلریت سدیم (40 ٪) قرار گرفتند. و پس از آن در اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲۵ ثانیه در داخل هود لامینار قرار گرفت. پس از هر تیمار، نمونه ها حداقل در سه نوبت در آب مقطر استریل شسته شدند و در نهایت به طور انفرادی در هر شیشه کشت بر روی محیط جامد MS (موراشیگی و اسکوک، ۱۹۶۲)، حاوی NAA و BAP (به ترتیب2/0 و 2 میلی­گرم در لیتر) کشت شدند. شاخه­های درون شیشه­ای حاصل از این نمونه­ها بریده شده و روی محیط پایه MS حاوی IBA  ‏ با غلظت 2 میلی­گرم در لیتر کشت شدند تا تعداد زیادی نمونه برای آزمایش کاربرد زغال ایجاد شود.

در مورد پالونیا نیز بذرها به دلیل ریز بودن در درون یک سرنگ پزشکی بارگذاری شدند و سپس در داخل هود لامینار سه نوبت با اتانول مطلق، هر نوبت به مدت 40 ثانیه سترون شدند. بدین ترتیب که اتانول با کشیدن دسته سرنگ به داخل مخزن مکیده شد و پس از طی مدت زمان موردنظر، تخلیه شد. بلافاصله پس از تخلیه اتانول، چندین نوبت آب مقطر با سرنگ مکیده و تخلیه شد تا بذرها کاملا شسته شوند. سپس بذرهای سترون شده به صورت 4 تایی روی محیط کشت نیم غلظت MS کشت شدند. پس از 4 هفته، دانهال­های تولید شده روی محیط کشت MS حاوی (4 میلی­گرم در لیتر IBA) قرار گرفتند و در این محیط کشت به صورت نمونه­های دوبندی تا چندین چرخه بازکشت شدند تا تعداد کافی نمونه درون­شیشه­ای برای آزمایش اصلی ایجاد شود. ظروف کشت انگور و پالونیا در کل آزمایش در دمای ۱+۲۵ درجه سانتی­گراد با دوره نوری ۸/۱۶ ساعت روشنایی و تاریکی (۲۷ میکرومول m-2 s-1) انکوبه شدند.

کاربرد منابع زغال: برای ارزیابی تاثیر زغال، گیاهان درون­شیشه­ای که در مراحل قبل تولید شده بودند به تعداد کافی انتخاب شدند.   ریزنمونه­های دوبندی ساقه از هر دو گیاه انگور و پالونیا تهیه و روی محیط کشت حاوی 2 یا 4 میلی­گرم در لیتر IBA (به ترتیب برای انگور و پالونیا) حاوی هر دو فرم زغال (۴۰۰، ۲۰۰، ۱۰۰، ۵۰، ۰ میلی­گرم بر لیتر) کشت شدند. در هر تیمار 3 تکرار و حداقل 10 ظرف کشت در هر تکرار کشت شد. در تمام محیط کشت­ها از آگار (۸ گرم بر لیتر) استفاده شد و  pHقبل از اتوکلاو (۲۰ دقیقه) در ۸/۵ تنظیم شد.

اندازه­گیری فنول محیط کشت: میزان ترکیبات فنولی کل محیط کشت بافت بر اساس روش شارما (۱۹۹۴) (35)، رنگ سنجی فولین-سیکالتو و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانومتر اندازه­گیری شد. از اتانول %80 به عنوان شاهد استفاده شد. مقدار معینی از محیط کشت، یعنی 20 میلی­لیتر برای تخمین تراوش فنول کل مورد استفاده قرار گرفت. ریزنمونه­های تک­گره از لوله­های کشت خارج شدند و به هر لوله، 10 میلی­لیتر اتانول 80 % اضافه شد. سپس با یک میله شیشه­ای کاملا مخلوط شد. این لوله­های آزمایش حاوی مخلوط بدست آمده در نیم ساعت با سرعت 120 دور در دقیقه (شیکر دوار) و سپس با سانتریفوژ (۴۰۰0 دور در دقیقه به مدت نیم ساعت) انجام شد. بدین ترتیب مخلوط به دست آمده با آب مقطر و با فیلتر کاغذی واتمن شماره 42 فیلتر شده و حجم نهایی بعد از فیلتر شدن به 20 میلی­لیتر توسط اتانول 80 %رسانده شد. دو میلی­لیتر از این عصاره برای برآورد فنول استفاده شد. به عصاره، 10 میلی­لیتر از محلول (۱0/1 رقیق) استوک معرف Ciocalteau  Folin_ اضافه شد. پس از 10 دقیقه، 8 میلی­لیتر محلول  5/7 %کربنات سدیم اضافه شد. این واکنش به مدت دو ساعت در دمای اتاق قرار گرفت. پس از دو ساعت، جذب رنگ در اسپکتروفتومتر در طول موج 765 نانومتر توسط اسپکتوفتومتر انجام شد. سپس محتوای کل فنول در نمونه محاسبه شد و توسط قرار دادن داده­های بدست آمده در منحنی استاندارد اسید گالیک میزان جذب فنول محاسبه شد.

اندازه­گیری صفات درون­شیشه­ای: صفات مورفوفیزیولوژیکی مربوط به ریشه و شاخساره در دوره­های مشخصی پس از بازکشت در نمونه­های انگور و پالونیا اندازه­گیری شد. میزان رنگدانه­های کلروفیل با روش بارنز و همکاران (7) انجام شد. سطح برگ با کاغذ میلیمتری اندازه­گیری شد. کیفیت ظاهری گیاهچه­ها نیز به صورت امتیازدهی و طبق روش پیشنهادی علیزاده (1390)، برآورد شد که 1 کمترین و 5 بالاترین کیفیت بود (3).

تجزیه و تحلیل: پژوهش حاضر به صورت طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. در هر تکرار حداقل 10  عدد ظرف کشت استفاده شد (تعداد کشت بیش از 10 عدد ظرف بود که برخی از کشت­ها در اثر آلودگی کنار گذاشته شد و در نهایت 10 عدد ظرف که نمونه­ها در حال رشد فعال بودند برای داده­برداری استفاده شدند). تجزیه و تحلیل و مقایسه میانگین داده­ها (در سطح آماری یک و پنج درصد) با استفاده از نرم افزار  SAS نسخه­ی 8.2 (34) و رسم نمودارها با Excel صورت گرفت.

نتایج

تعیین نحوه رشد  و  پاسخ  درون­شیشه­ای  ریزنمونه‌های

انگور و پالونیا بر روی صفات مربوط به ریشه، ساقه، کیفیت ظاهری، میزان زنده مانی و خصوصیات شیمیایی ریزنمونه بعد از ۴۰ روز انکوبه کردن معنی­دار بود (جدول 1).  

 

 

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از تاثیر مقادیر مختلف زغال فعال بر گیاه انگور

منابع تغییرات

درجه آزادی

تعداد برگ

تعداد شاخه

ریشه­زایی (%)

تعداد ریشه

طول ریشه (cm)

طول ساقه (cm)

کیفیت ظاهری

سطح برگ (mm2)

زنده مانی (%)

تیمار

8

**00/121

**56/4

**363

**89/89

**28/122

*28/10

**85/0

**93/1

**11/170

خطا

18

18/4

59/0

1

48/1

22/3

75/3

21/0

06/0

64/0

ادامه جدول 1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از تاثیر مقادیر مختلف زغال فعال بر گیاه انگور

کلروفیل a

(mg/g F.W)

کلروفیل b

(mg/g F.W)

کلروفیل کل

(mg/g F.W)

کارتنوئید

(mg/g F.W)

فنول بافت گیاهی

(GA mg/g D.W)

فنل محیط کشت

 (GA μg/ml)

**016/0

**019/0

**08/0

**30/0

**0004/0

**00001/0

0004/0

0004/0

001/0

004/0

000007/0

0000005/0

** اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد، * اختلاف معنی­داری در سطح پنج درصد، ns عدم وجود اختلاف معنی­دار

 

در بررسی اثر مقادیر زغال بر گیاه انگور، نتایج زیر بدست آمد. القای ریشه­زایی در ریزنمونه دوبندی انگور در تیمار ۵۰ میلی‌گرم بر لیتر نانولوله کربن به مدت یک هفته زودتر از سایر تیمارها رخ داد. رشد شاخساره در ۲۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال ۶ روز بعد از انجام تیمارها نسبت به سایر غلظت­ها سریعتر مشاهده شد. همچنین شروع بازشدن جوانه در تک­گره انگور در ۱۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال (نه روز بعد از انکوبه کردن) سریعتر از سایر تیمارها مشاهده شد.

بیشترین تعداد برگ در ۴۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال بیشتر از سایر غلظت­ها بود، و صرف­نظر از ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال با افزایش غلظت زغال فعال محیط کشت، تعداد برگ تولید شده در گیاهچه­های انگور افزایش پیدا کرد (شکل 1).  غلظت­های مختلف زغال بر پرآوری شاخه اثر مثبتی نداشت (شکل 1). با توجه به سهل ریشه­زایی انگور صرف نظر از بالاترین غلظت نانولوله‌های کربن ریشه­زایی در ریزنمونه­های انگور به طور کامل صورت گرفت (شکل 1).

اثر متفاوت فرم زغال بر محل القا ریشه در انگور و پالونیا به صورت بصری، مشاهده شد به طوری که در هر دو گیاه انگور و پالونیا به طور یکسان در مجاور غلظت­های نانولوله‌ کربن جهت تشکیل ریشه، ابتدا کالوس و سپس از کالوس حاصله باززایی ریشه صورت گرفت. که با توجه به غلظت­های متفاوت، تشکیل کالوس در ابعاد متفاوت مشاهده شد. ولی در رابطه با غلظت‌های مختلف زغال فعال تشکیل کالوس در محل ظاهر شدن ریشه مشاهده نشد (شکل 2). که این موضوع به تنهایی نیاز به بحث و بررسی مفصل در مورد بروز چنین رویداد و یافتن اثرات فیزیولوژیکی و ژنتیکی دخیل در پدید آمدن این چنین تفاوتهایی دارد.

بیشترین تعداد ریشه در ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربن مشاهده شد. در حالی که غلظت­های بالای زغال فعال بر تعداد ریشه اثر منفی داشته است (شکل 1). غلظت بالای زغال فعال باعث افزایش طول ریشه در گیاه انگور شد که در نانولوله کربن افزایش طول ریشه مشاهده نشد (شکل 1). بلندترین طول ساقه در ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربنی (۲۶/۱۱ سانتی­متر)‌ مشاهده شد. افزایش هر دو نوع زغال در محیط کشت، باعث افزایش طول ساقه گیاه انگور شد (شکل 1). مقادیر مختلف زغال، اثرات مثبت بر کیفیت ظاهری ریزنمونه انگور داشت. که از نظر مورفولوژی بالاترین شادابی و سرحالی ریزنمونه درون­شیشه­ای در ۱۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربنی مشاهده شد (شکل 1). که این نتایج نشان دهنده اثر مثبت زغال بر رشد و شادابی ریزنمونه در شرایط درون­شیشه­ای است. این شادابی باعث تقویت گیاهچه شده که در مراحل سازگاری و انتقال به خاک بسیار مفید است. شکل 3، مقادیر مختلف زغال در محیط کشت و میزان رشد و کیفیت ظاهری ریزنمونه درون شیشه­ای را نشان می­دهد.

روند مشخصی از اثر زغال بر سطح برگ مشاهده نشد. بیشترین سطح برگ در ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربنی مشاهده شد (شکل 1). میزان زنده­مانی (در مرحله پرآوری) گیاه انگور در تمام سطوح نانولوله کربن ۱۰۰ درصد بود. همچنین در غلظت بالای زغال فعال میزان زنده­مانی کامل بود، در حالی که در غلظت‌های پایین زغال فعال در اثر تراوش فنول از ریزنمونه و قهوه­ای­شدن محیط کشت، درصد زنده­مانی کمتر بود (شکل 1). که می­توان این اثر مثبت نانو لوله کربن حتی  در غلظت پایین در محیط کشت گیاه را مورد توجه قرار داد.

صفات شیمیایی: طبق نتایج مقایسه میانگین، در مورد اثر غلظت­های مختلف زغال بر میزان کلروفیل، روند مشخصی مشاهده نشد. به هرحال در نمونه­های رشد یافته در ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر نانولوله کربنی، بیشترین میزان کلروفیل a حاصل شد. جالب توجه است که این موضوع با نتایج حاصل از کیفیت ظاهری هم­خوانی دارد، که نشان دهنده اثر مثبت ۱۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربن بر کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل، کارتنوئید و کیفیت ظاهری گیاه انگور بود. صرف­نظر از 100 میلی گرم بر لیتر نانولوله، میزان کلروفیل b نیز مشابه کلروفیل a، اثر افزایشی در غلظت‌های مختلف زغال نشان نداد. در واقع میزان کم کلروفیل a و b می‌تواند به حساس بودن کلروفیل در شرایط درون شیشه­ای (پدیده شیشه­ای شدن) یا عدم نیاز گیاه به فتوسنتز، که تمام مواد غذایی در محیط کشت فراهم است، مرتبط باشد. حساسیت در شرایط درون شیشه‌ای با برون­شیشه­ای (محیطی) تفاوت زیادی در کارکرد و عملکرد اندام­های گیاهی دارند. ۱۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربن بیشترین تاثیر گذاری بر خصوصیات شیمیایی ریزنمونه درون­شیشه­ای انگور داشت، به طوری که افزایش میزان کارتنوئید گیاه نیز در این غلظت بالاترین حد را نشان داد (شکل 4).

 

 

شکل 3- اثرات مقادیر مختلف زغال بر رشد درون شیشه ای گیاه انگور. AC: زغال فعال، NA : نانولوله کربن

 

   
   
   
   
 

 

شکل 3- اثرات مقادیر مختلف زغال بر صفات مورفولوژی گیاهان درون­شیشه­ای انگور. AC: زغال فعال، NA: نانولوله کربن

 

ارزیابی فنول محیط کشت: بعد از کشت تک گره انگور بر روی محیط­های حاوی غلظت­های مختلف زغال، میزان ترشح فنول محیط کشت بافت در طی یک دوره سه هفته­ای، به طور متوالی در حجم­های ۲۰ میلی­لیتری محیط کشت اندازه‌گیری شد. نتایج تجزیه واریانس داده­های حاصل از این آزمایش نشان داد، که اندازه­گیری فنول در طول سه هفته متوالی در سطح احتمال 1% معنی­دار بود (جدول 2). بیشترین میزان فنول در هفته اول و سوم با ۵۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربن مشاهده شد، که در هفته دوم بیشترین میزان فنول محیط کشت در ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال مشاهده شد. غلظت­های مختلف زغال فعال در هفته سوم کاهش میزان فنول محیط کشت را نسبت به هفته اول نشان داد، که در رابطه با لوله کربن این موضوع برعکس بود (شکل 5).

 

   
   
   

شکل 4- اثرات مقادیر مختلف زغال بر صفات شیمیایی گیاهان درون­شیشه­ای انگور. AC: زغال فعال، NA: نانولوله کربن

 

 

 

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس حاصل از تاثیر مقادیر مختلف زغال بر  میزان فنول کل ارزیابی شده در محیط کشت انگور

منابع تغییرات

درجه آزادی

هفته اول

هفته دوم

هفته سوم

تیمار

8

**19/912

**29/678

**30/1824

خطا

18

12/70

04/64

28/174

** اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد، * اختلاف معنی­داری در سطح پنج درصد، ns عدم وجود اختلاف معنی­دار

صفات رشدی نمونه­های پالونیا: با توجه به اثرات مثبت هر دو فرم زغال در نمونه­های انگور و بررسی اثر آنها در نمونه­های پالونیا، نتایج امیدوار کننده بیشتری در جهت کاربرد این مواد بر دیگر گیاهان چوبی، نشان داد. نتایج تجزیه واریانس صفات درون­شیشه­ای پالونیا سطوح معنی­داری مختلفی را نشان داد (جدول 3). که میزان تعداد برگ در گیاه پالونیا در مجاور با سایر غلظت­های زغال افزایش چشم­گیری نشان داد. بیشترین و کمترین تعداد برگ به ترتیب در ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال و شاهد مشاهده شد.

 

   
 

 

شکل 5- اثرات مقادیر مختلف زغال بر میزان فنول محیط کشت بافت گیاه انگور. AC: زغال فعال، NA: نانولوله کربن

 

 

حداقل تعداد ریشه در ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله­های کربن و حداکثر در ۵۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربنی مشاهده شد. در غلظت­های کم نانولوله کربن، تعداد ریشه  بیشتری مشاهده شد. در بالاترین غلظت نانولوله‌ کربن، کمترین درصد ریشه­زایی ثبت شد (شکل 6).  طول ریشه در غلظت 50 میلی­گرم در لیتر نانو کربن بیشترین میزان بود. طول ساقه حداکثر میزان رشد را در ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال داشت. بر طبق شکل (7) کیفت ظاهری در بین غلظت­های مختلف زغال اثر یکسان و مثبتی را نشان داد. همچنین افزایش سطح برگ در مقادیر نانولوله بالاترین حد نسبت به زغال فعال بود (شکل 6).

بحث

در بخش اول این پژوهش، نتایج مثبت و قابل قبولی از کاربرد زغال در باززایی شاخساره، ریشه و کیفیت ظاهری انگور مشاده شد، که باعث شد مطالعه وسیع­تر آن بر روی گیاه پالونیا نیز بررسی شود. تکثیر و پرآوری در شرایط درون شیشه­ای بر روی دو گیاه انگور و پالونیا، سطوح مختلفی از موفقیت را در مطالعه حاضر نشان داد که با مطالعات فیگیرودو و همکاران (۲۰۰۱)  مطابقت داشت (11).

 

 

جدول 3- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف زغال بر پارامترهای رشد درون شیشه­ای گیاه پالونیا

منابع تغییرات

درجه آزادی

تعداد برگ

تعداد شاخه

تعداد ریشه

ریشه­زایی (%)

طول ریشه (cm)

طول ساقه (cm)

کیفیت ظاهری

سطح برگ (mm2)

تیمار

8

**67/30

ns33/0

**14/365

**64/208

**30/22

**20/3

ns34/0

**91/1

خطا

18

59/2

18/0

77/2

85/0

94/0

38/0

17/0

06/0

**اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد، * اختلاف معنی­داری در سطح پنج درصد، ns عدم وجود اختلاف معنی­دار

 

   
   
   

شکل 6- اثرات مقادیر مختلف زغال بر صفات مورفولوژی گیاهان درون­شیشه­ای پالونیا. AC: زغال فعال، NA: نانولوله کربن

 

به طور کلی نتایج حاصله منجر به بهینه­سازی هر دو گیاه در خصوص ریشه­زایی، ارزیابی رشد شاخساره هر دو گیاه شد. همچنین بررسی صفات شیمیایی گیاه انگور و میزان فنول محیط کشت و ارتباط آن با رشد درون­شیشه­ای مورد بررسی قرار گرفت. پاسخ نوع گیاه به غلظت­های مختلف زغال فعال و نانولوله کربن تفاوت جزیی مشاهده شد. خداکسکیا و همکاران (۲۰۱۲)، نیز بر روی مکانیسم مولکولی در رشد سلول­های تکثیر شده بر روی محیط حاوی زغال فعال و نانو لوله نتایج مشابهی گزارش نمودند (17). تاثیر فرم­های مختلف کربن فعال در محیط MS بر استقرار ریزنمونه مفید بود. برخلاف نتایج این پژوهش، رومانو و همکاران (۲۰۰۲)، اثر زغال فعال را در رشد ریز نمونه‌های درون شیشه­ای منفی گزارش دادند (31). این ممکن است به دلیل تفاوت ژنوتیپ­ها و نوع محیط کشت استفاده شده باشد. زیرا غلظت­های مختلف زغال اثر متفاوت بر ترکیبات محیط کشت و گیاه درون شیشه­ای دارد. شرایط رشدی گیاه برای یک گونه گیاهی، ممکن است برای رقم یا گونه دیگر به همان اندازه موثر نباشد (28، 31).  بر خلاف انتظار تعداد شاخه در پالونیا و انگور با افزودن زغال کاهش یافت. این امکان وجود دارد که زغال فعال علاوه بر جذب مواد مضر، بطور ناخواسته موجب جذب مواد مفید نیز شود (45). در حالی که تکثیر شاخساره به نوع گیاه، ارقام و غلظت سیتوکینین نیز بستگی دارد (31). با انکوبه کردن ریزنمونه در محیط حاوی زغال اکسیداسیون فنولی مانع رشد شاخه نشد و حضور زغال باعث افزایش در رشد و تقویت شکل ظاهری ریزنمونه­ها شد. این یافته­ها با مشاهدات قبلی مطابقت داشته است که میزان قهوه­ای شدن بافت­های بریده شده، در مجاور محیط کشت همراه با زغال فعال کاهش یافت و باعث تقویت رشد گیاه شد (8).

رشد ساقه در حضور مقادیر زغال، مثبت ارزیابی شد. کاربرد ۲۰۰ میلی گرم بر لیتر نانولوله کربن به عنوان ترکیب برتر برای سطح برگ هر دو گیاه مشاهده شد. همین­طور ۴۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال بهترین ترکیب در محیط کشت برای طول شاخه در پالونیا و ۲۰۰ میلی گرم بر لیتر نانولوله کربنی برای انگور بود. در این آزمایش بهترین ریزنمونه از نظر بیشترین تعداد برگ در غلظت­های زغال فعال به ترتیب ۴۰۰ و ۲۰۰ میلی گرم در لیتر برای انگور و پالونیا بود. کیفیت ظاهری در ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر نانولوله‌های کربن بهترین کیفیت را نشان داد.

اثر نانو مواد نسبت به زغال فعال بر تعداد ریشه در انگور بیشتر بود. حداقل تعداد ریشه در ۲۰۰ میلی گرم در لیتر زغال فعال و حداکثر در ۵۰ میلی گرم بر لیتر نانو کربن نشانگر اثر مثبت غلظت پایینی از نانولوله کربنی است، بیشتر می­توان این پدیده را در اثر افزایش بیان ژن­های درگیر در تقسیم سلولی در مجاور نانو لوله­های کربنی بیان نمود (16). در مطالعه لوپز پرز و همکاران (۲۰0۵)، تمایز جنین در حضور زغال فعال سریع تر از محیط فاقد زغال فعال مشاهده شد (23). در پژوهش حاضر، غلظت ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال بهترین استقرار را نشان داد (رشد جوانه، ۹ روز پس از انکوبه کردن). هنگامی که جوانه­ها به طول سه سانتی متر (حداقل دو گره) رسیدند، آنها از ریزنمونه­های اصلی (تک گره) جدا شدند و در محیط ریشه­زایی قرار گرفتند. که القای ریشه­زایی ریزنمونه انگور با غلظت کم نانولوله کربن و رشد جوانه دوبندی انگور در ۲۰۰ میلی گرم بر لیتر زغال فعال بهترین نتیجه را داد. که با نتایج تانگ و همکاران (۲۰۰۰)، مطابقت داشت (40)، آنها بیان کردند که حداکثر ریشه­زایی در مجاور زغال فعال مشاهده شد. درصد ریشه­زایی در نانولوله‌های کربنی برای هر دو گیاه بهترین نتیجه را داشت. بهترین طول ریشه در بالاترین مقادیر زغال فعال (۴۰۰ میلی گرم) برای انگور و برای پالونیا در پایین­ترین مقدار نانولوله کربن (۵۰ میلی گرم) در لیتر در محیط کشت بود، که با نتایج تانگ و همکاران (۲۰۰۰)، مطابقت داشت (40). از آنجا که اکسین ریشه­زایی را تحریک می‌کند زغال فعال باعث جذب مقداری از اکسین می شود (42)، که غلظت مناسب زغال فعال در محیط کشت اهمیت بالایی دارد.

ریشه­زایی به یکسری عوامل بستگی دارد، که محل ریشه­زایی ممکن است بسته به عوامل متعددی متفاوت باشد. همانطور که مشاهده شد ریشه­زایی هر دو گیاه در مجاور فرم­های مختلف زغال رفتار متفاوتی را نشان دادند.

در دو هفته اول افزایش میزان فنول محیط کشت مشاهده شد. که در هفته سوم این میزان کاهش یافت. افزایش درمیزان فنول در هفته­های ابتدایی ممکن است به خاطر جراحت ریزنمونه باشد. که احتمالاً در هفته سوم با جذب مواد ناخالص از جمله فنول از اثرات مخرب آنها جلوگیری می‌شود (19).

در این پژوهش تیمار با ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال، در بین سایر غلظت‌های زغال تاثیر بیشتری بر صفات اندازه گیری شده در نمونه درون­شیشه­ای انگور داشت. که با نتایج علیزاده و همکاران (۲۰۱8)، مشابه بود (6). آنها بیان کردند بیشترین اثر در غلظت بالای زغال فعال (۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر) بدست آمد.  با توجه به مشاهدات لوپز پرز و همکاران، (۲۰۰۵)، اولاه، (۲۰۱۷)، لوپز آرانالدوس و همکاران، (۲۰۰۱)، اثر مثبت زغال فعال در القای کالوس و میزان زنده­مانی کالوس بر روی محیط کشت، نتایج مشابه و مثبتی در میزان زنده­مانی ریزنمونه­های انگور در غلظت­های بالای زغال فعال وسایر غلظت­های نانولوله کربن در شرایط درون­شیشه‌ای به دست آمد. که با نتایج لگراند و بوازا (۱۹۹۱)، بر روی Cuchorium مطابقت داشت. با این حال در بین سایر غلظت­های زغال ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال و ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله کربنی بیشترین اثر را بر صفات مورفولوژی گیاه درون­شیشه­ای پالونیا و انگور داشته است. که می­توان این دو میزان غلظت زغال را برای پژوهش­های بعدی پژوهشگران و شرکت­های تجاری تولید کننده گیاهان کشت بافتی به عنوان منابع کربن جذب کننده فنول معرفی کرد.

در طول رشد و نمو درون شیشه­ای، بافت­های گیاهی نه تنها مواد غذایی محیط کشت را جذب می‌کنند، بلکه موادی را آزاد می‌کند که در محیط کشت تجمع می‌یابند. این مواد مانند فنول­ها، ممکن است اثرات زیان‌آور فیزیولوژیکی در بافت‌های کشت شده داشته باشند، مانند سایر گونه­های چوبی، بافت‌های انگور سطح بالایی از پلی­فنول و تانن از خود نشان می‌دهند (32). در مطالعه حاضر زغال در شروع کشت و همچنین محیط ریشه­زایی افزوده شد تا چنین مشکلاتی را به حداقل برساند، و غلظت بهینه آن برای استفاده در آزمایشگاه­ها و تولید کنندگان تجاری گیاهان و پژوهش­های بعدی مثمرثمر باشد. با توجه به افزایش مطالعات روز افزون در زمینه کشت بافت و علوم وابسته به آن در ژنتیک مولکولی، انتقال ژن، امتزاج پروتوپلاست و نیاز به تکثیر درون­شیشه­ای گیاهان، مطالعات گسترده­تر به منظور ارزیابی کاربرد منابع زغال ضروری است. در جمع­بندی نهایی لازم به ذکر است که می­توان از تیمارهای ۴۰۰ میلی­گرم بر لیتر زغال فعال و یا ۲۰۰ میلی­گرم بر لیتر نانولوله­های کربن به عنوان منابع کربن جذب کننده فنول در محیط­های کشت انگور و پالونیا استفاده کرد. نتایج این پژوهش با اندکی تغییر در سایر گیاهان و ریزافزایی تجاری قابل استفاده خواهد بود.

سپاسگزاری

پژوهش حاضر با حمایت مالی معاونت پژوهشی، دانشگاه علوم کشارزی و منابع طبیعی گرگان انجام شده است. نویسندگان از آقای مهندس صادق آتشی، کارشناس آزمایشگاه­های گروه علوم باغبانی  به دلیل همکاری در اجرای این پژوهش قدردانی می­نمایند.

  1. سبحانی­نژاد، ع.، سلوکی، م.، و فاضلی­نسب، ب. 1396. بهینه سازی کالوس زایی و تاثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی بر میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی سیاه دانه در شرایط آزمایشگاهی. مجله سلول و بافت (علمی- پژوهشی)، 8 (2)،صفحات 165-184.
  2. قزلباش، س.، قادری، ا.، بداقی، ح. ا.، قسیمی حق،ز.، کاشفی، م.، و زارع کاریزی، ا .ر. 1395 . اثار آنتی اکسیدانها و محیط کشت بر بیوسنتز ترکیبات فنولی محدودکننده رشد در کشت درون شیشه­ای گیاه نعناع وحشی (Mentha arvensis L)، فصلنامه گیاهان دارویی، 10، صفحات 1 - 9 .
  3. علیزاده، مهدی. 1390. راهنمای کاربران کشت بافت گیاهی و ریزازدیادی، انتشارات نوروزی گرگان، ایران.

 

  1. Alizadeh, M., Singh, S. K., Patel, V.B., Bhattacharya, R. C., and Yadav, B. P., 2010. In vitro responses of grape rootstocks to NaCl. Biologia Plantarum, 54(2), PP: 381-385.
  2. Alizadeh,, Singh, S.K., Patel, V.B., Deshmukh, P.S. 2018. In vitro clonal multiplication of two grape (vitis spp.) rootstock genotypes. Plant tissue cult biotechnol 28: 1-11.
  3. Barnes, J.D., Balaguer, L., Manrique, E., Elvira, S., Davison, A.W. 1992. A reappraisal of the use of DMSO for the extraction and determination of chlorophyll ‘a’ and ‘b’ in lichens and higher plants. exp. Bot. 32: 85-90.
  4. Cresswell, R. and C. Nitsch., 1975. Organ culture of Eucalyptus grandis L. Planta, 125, PP: 87-90.
  5. Datsyuk, V., Kalyva, M., Papagelis, K., Parthenios, J., Tasis, D., Siokou, A., Kallitsis. I., and Galiotis, C. 2008. Chemical oxidation of multiwalled carbon nanotubes. Carbon. 46 (6): 833-840.
  6. El-Showk, S., and El-Showk, N., 2003. The Paulownia tree. An alternative for sustainable forestry, Crop Development, Morocco, PP: 1-8.
  7. Figueiredo, S. F. L., Albarello, N., and Viana, V. R. C., 2001. Micropropagation of Rollinia mucosa (JACQ.) baill. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 37 (4), PP: 471-475.
  8. Haberlandt, G., 1902. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. d. Akad. d. Wissensch. Wien, math.-naturw. Klasse, 111, PP: 1913-1921.
  9. Halhouli, K.A., Darwish, N.A, Aldhoon, N.M., 1995. Effects of pH and inorganic salts on the adsorption of phenol from aqueous systems on activated decoloring charcoal. Separ Sci Technol, 30 (17), PP:3313–3324.
  10. Huang, L. C., Lee, Y. L., Huang, B. L., Kuo, C. I., and Shaw, J. F., 2002. High polyphenol oxidase activity and low titratable acidity in browning bamboo tissue culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 38 (4), PP: 358.
  11. Huang, Y., Li, N., Ma, Y., Du, F., Li, F., He, X., Lin, X., Gao, H., and Chen, Y., 2007. The influence of single-walled carbon nanotube structure on the electromagnetic interference shielding efficiency of its epoxy composites. Carbon, 45 (8), PP: 1614-1621.
  12. Khodakovskaya, M. V., De Silva, K., Biris, A. S., Dervishi, E., and Villagarcia, H., 2012. Carbon nanotubes induce growth enhancement of tobacco cells. ACS NANO, 6 (3), PP: 2128-2135.
  13. Kim, D.H.; Gopal, J.; Sivanesan, I. Nanomaterials in plant tissue culture: The disclosed and undisclosed. RSC Adv. 2017, 7, 36492–36505.
  14. Krishna, H., Sairam, R. K., Singh, S. K., Patel, V. B., Sharma, R. R., Grover, M., Nain, L., and Sachdev, A., 2008. Mango explant browning: Effect of ontogenic age, mycorrhization and pre-treatments. Scientia Horticulturae., 118 (2), PP: 132-138.
  15. Lee, N., Wetzstein, H.Y., 1990. In vitro propagation of muscadine grape by axillary shoot proliferation. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 115: 324-9.
  16. Legrand, B., & Bouazza, A., 1991. Changes in peroxidase and IAAoxidase activities during adventitious bud formation from smallroot explant of Cichorium intybys L.: influence of glucose. J. Plant Physiol, 138, PP: 102–106.
  17. López Arnaldos, T., Muñoz, R., Ferrer, M. A., and Calderón, A. A., 2001. Changes in phenol content during strawberry (Fragaria× ananassa, cv. Chandler) callus culture. Physiologia Plantarum, 113 (3), PP: 315-322.
  18. López-Pérez, A. J., Carreño, J., Martinez-Cutillas, A., and Dabauza, M., 2005. High embryogenic ability and plant regeneration of table grapevine cultivars (Vitis vinifera L.) induced by activated charcoal. Vitis, 44 (2), PP: 79-85.
  19. Mhatre, M., Salunkhe, C.K., Rao, P.S., 2000. Micropropagation of Vitis vinifera L.: Towards an improved protocol. Sci. Hort., 84: 357-63.
  20. Mitsukuri, K., Mori, G., Johkan, M., Shimada, Y., Mishiba, K. I., Morikawa, T., and Oda, M., 2009. Effects of explant position and dark treatment on bud formation in floret culture of Ponerorchis graminifolia Rchb. f. Scientia Horticulturae, 121 (2), PP: 243-247.
  21. Olah, R., 2017. The use of activated charcoal in grapevine tissue culture. Vitis, 56 (4), PP: 161-171.
  22. Ozyigit, I. I., 2008. Phenolic changes during in vitro organogenesis of cotton (Gossypium hirsutum L.) shoot tips. African Journal of Biotechnology, 7 (8), PP: 1145-1150.
  23. Ozyigit, I. I., Kahraman, M. V., and Ercan, O., 2007. Relation between explant age, total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton (Gossypium hirsutum L.). African Journal of Biotechnology, 6 (1), PP: 003-008.
  24. Parzymies, M. Nano-Silver Particles Reduce Contaminations in Tissue Culture but Decrease Regeneration Rate and Slows Down Growth and Development of Aldrovanda vesiculosa Explants. Appl. Sci. 2021, 11, 3653. https://doi.org/ 10.3390/app11083653
  25. Rameshaiah, G. N., Pallavi, J., and Shabnam, S., 2015. Nano fertilizers and nano sensors–an attempt for developing smart agriculture. International Journal of Engineering Research and General Science, 3 (1), PP: 314-320.
  26. Romano, A., Barros, S., and Martins-Loução, M. A., 2002. Micropropagation of the Mediterranean tree Ceratonia siliqua. Plant Cell, Tissue and Organ Culture., 68 (1), PP: 35-41.
  27. Roubelakis-Angelakis, K.A., 2001. Molecular Biology and Biotechnology of the Grapevine. Kluwer Academic Publishers, London, 474p.
  28. Sarmast, M.; Salehi, H.; Khosh-Khui, M. Nano silver treatment is effective in reducing bacterial contaminations of Araucaria excelsa R. Br. var. glauca explants. Acta Biol. Hung. 2011, 62, 477–484.
  29. SAS Institute Inc., 2003. The SAS System for Windows, Release 8.2. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.
  30. Sharma, R. R., 1994. In vivo and in vitro polyphenol oxidase activity in grape (Vitis vinifera L.). (Doctoral dissertation, Thesis, Post Graduate School, IARI, New Delhi).
  31. Singh, S.K., Khawale, R.N., Singh, S.P., 2004. Techniques for rapid in vitro multiplication of Vitis vinifera L. cultivars. J. Hort. Sci. Biotech., 19: 267-72.
  32. Singh, S.K., Sharma, H.C., Singh, S.P., Sharma, R.R., 2000. Propagation of grape through repetitive micro-cutting technique. Indian Hort., 3: 14-15.
  33. Sudarsono, A., Goldy, R.G., 1991. Growth regulator and axillary bud position effects on in vitro establishment of Vitis routondifoila. HortSci., 26: 304-7.
  34. Taha, R.A., Hassan, M.M., Ibrahim, E.A. et al.Carbon nanotubes impact on date palm in vitro cultures. Plant Cell Tiss Organ Cult127, 525–534 (2016). https://doi.org/10.1007/s11240-016-1058-6
  35. Tang, H., Ren, Z., and Krczal, G., 2000. Improvement of English walnut somatic embryo germination and conversion by desiccation treatments and plantlet development by lower medium salts. In Vitro Cell. Deve. Plant, 36, PP: 47-50.
  36. Thies, K.L., Graves, C.H., 1992. Meristem micropropagation protocols for Vitis rotundifolia Michx. HortSci., 27: 447-9.
  37. Thomas, T. D., 2008. The role of activated charcoal in plant tissue culture. Biotechnology Advances, 26 (6), PP: 618-631.
  38. Thorpe, T. A., 2007. History of plant tissue culture. Molecular Biotechnology, 37 (2), PP: 169-180.
  39. Torregrosa, L., Bouquet, A., 1995. In vitro propagation of Vitis × Muscadinia hybrids by microcuttings or axillary budding. Vitis, 34: 237-8.
  40. Vahdatpour, F., Mashayekhi, K., and Piri, Z. M., 2009. Investigation of Ontioxidant effect turmeric in comparing with active coal and ascorbic acid in cultural medium of ulmas pavrifolia jasq. Journal of plant production (Journal of aAgricultural Sciences and Natural Resources)., 2, PP: 1-14.
  41. Yadav, N. K., Vaidya, B. N., Henderson, K., Lee, J. F., Stewart, W. M., Dhekney, S. A., and Joshee, N., 2013. A review of Paulownia biotechnology: a short rotation, fast growing multipurpose bioenergy tree. American Journal of Plant Sciences, 4 (11), 2070.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 36, Issue 1
March 2023
Pages 46-61
  • Receive Date: 16 April 2021
  • Revise Date: 26 August 2021
  • Accept Date: 06 October 2021