اثر سلنیوم بر رشد و برخی صفات فیزیولوژیک گیاه ریحان (Ocimum basilicum) در شرایط تنش آرسنیک

مهدی رستمی¹، حسین عباسپور^2*، اکبر صفی پور افشار^3* و قدیر طاهری³

¹ ایران، دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیست شناسی

² ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، گروه زیست شناسی

³ ایران، نیشابور، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد نیشابور، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 14/10/1399          تاریخ پذیرش: 27/06/1400

چکیده

مطالعات گذشته مشخص کرده است که سلنیوم در کاهش آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش­های غیر زیستی در گیاهان بسیار موثر است. این تحقیق به بررسی اثرات سلنیوم بر صفات رشدی و فیزیولوژیکی گیاه ریحان در شرایط سمیت آرسنیک پرداخته است. نتایج نشان داد که صفات رشدی شامل طول ریشه و ساقه و وزن ریشه و ساقه در شرایط سمیت آرسنیک بویژه در غلظت بالا به طور معنی داری در مقایسه با شاهد کاهش یافت. همچنین در سمیت شدید آرسنیک میزان رنگیزه های فتوسنتزی، میزان نیتروژن و پروتئین کاهش و فعالیت آنزیم­های کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز نسبت به گیاهان ریحان بدون تنش افزایش یافت. اسپری برگی سلنیوم خصوصا در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر بر گیاهان چه در شرایط تنش و چه بدون تنش منجر به افزایش صفات رشدی، رنگیزه­های فتوسنتزی، میزان نیتروژن و پروتئین شد. بعلاوه کاربرد سلنات سدیم در غلظت کم فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی را کاهش و در غلظت بالا فعالیت آن­ها را در شرایط سمیت آرسنیک در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش داد. در مجموع به نظر می­رسد سلنیوم با تقویت فعالیت آنتی اکسیدانی و بهبود رشد گیاه سبب کاهش اثرات سمی آرسنیک در گیاه ریحان شده است.

واژه های کلیدی: آنزیم­های آنتی اکسیدان، تنش غیر زیستی، سلنات سدیم، رنگیزه­های فتوسنتزی، فلزات سنگین

* نویسندگان مسئول، تلفن: 05142613905، پست الکترونیکی:asafshar@iau-neyshabur.ac.ir  و abbaspour75@yahoo.com

مقدمه

آرسنیک، عنصری شبه فلز، سمی و غیرضروری برای گیاهان و جانوران (13) با حالات اکسیداسیون متفاوت است که به وسیله­ی منابع طبیعی: آتشفشان­ها، معادن آرسنیک و طلا  و منابع مصنوعی: حشره­کش­ها و علف­کش­ها و سموم، کودها، مواد نگهدارنده چوب، سوختن زغال سنگ، احتراق سوخت­های فسیلی و فعالیت­های صنعتی و کشاورزی در محیط انتشار می­یابد (42). آرسنیک معدنی باعث تولید گونه فعال اکسیژن در گیاهان می­شود (20). آرسنیک شبه فلزی است که توانایی تجمع در گیاهان و جانوران را داشته و به وسیله­ی زنجیره­ غذایی و همچنین از طریق فعالیت­های انسانی در مناطق آلوده و مصرف آب و مواد غذایی آلوده به آرسنیک به انسان منتقل می­شود. تجمع آرسنیک در انسان سبب اختلال در دستگاه گردش خون، گوارش و سیستم عصبی می­شود (14).

بنابر استانداردهای جهانی میزان قابل تحمل آرسنیک در خاک و آب به ترتیب 40 میلی­گرم بر کیلوگرم و 10 میکروگرم بر لیتر است در حالیکه در مناطقی که به طور طبیعی (ناشی از فعالیت­های زمین­شناسی) آلوده به آرسنیک هستند غلظت آن در خاک می­تواند به بیش از 1000 میلی­گرم بر کیلوگرم و در آب به بیش از 1000 میکروگرم بر لیتر برسد (10). آبیاری مزارع کشاورزی با استفاده از آب­های سطحی و زیرزمینی آلوده به آرسنیک باعث تجمع این عنصر در خاک شده و انتقال آن به اندام­های مختلف گیاه را افزایش می­دهد که در نهایت منجر به مختل شدن رشد طبیعی گیاه با علائم سمیتی نظیر مهار جوانه زنی، کاهش رشد، نکروزه شدن جوانه­های برگی، کاهش سطح فتوسنتز، تخریب غشای کلروپلاستی می­شود (15). در صورتی ­که غلظت این عنصر در بخش­های هوایی گیاه به بیش از 10 میکروگرم در کیلوگرم افزایش یابد، باعث ایجاد سمیت می­گردد (40). آرسنیک میتواند در غلظتهای بالا با گروههای تیولی پروتئینها واکنش داده و باعث کاهش فعالیت آنزیم­ها و القای تنش اکسیداتیو شود (34). گونه­های فعال اکسیژن (ROS) با پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و در نتیجه تخریب غشاهای سلولی، می­توانند باعث مرگ سلول­ها و در نهایت سبب کاهش رشد گیاه شوند (29).

سلنیوم یک عنصر غیر فلزی است که در گروه اکسیژن در جدول تناوبی قرار گرفته و دارای ظرفیت اکسیداسیونی می­باشد (11). بعلاوه، سلنیوم در بدن جانوران و گیاهان به عنوان بخشی از اسیدهای آمینه و به صورت سلنومتیونین و سلنوسیستئین وجود دارد. کمبود سلنیوم می­تواند موجب افزایش خطر سرطان، بیماریهای قلبی، آب مروارید و کاهش عملکرد سیستم ایمنی بدن گردد (7). به نظر می رسد سلنیوم به دلیل اثر آنتاگونیستی می­تواند به بیرون راندن فلزات سنگین مانند سرب، جیوه، آلومینیوم و کادمیوم از بدن موجودات زنده کمک کند (17 و 28). مطالعات متعدد حاکی از تاثیر سلنیوم بر افزایش تحمل گیاهان به تنش­های غیر زیستی همچون تنش فلزات سنگین است (16، 19 و 28) . بنابر گزارش­ها سلنیوم از طریق مکانیسم­هایی چون تنظیم گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن و سیستم آنتی­اکسیدانی، بهبود سیستم فتوسنتزی و ممانعت از جذب و انتقال فلزات سنگین باعث عملکرد فوق می­شود (32).

با توجه به اهمیت گیاه ریحان به عنوان سبزی خوراکی و کشت آن در زمین­های آلوده به آرسنیک بویژه در حاشیه شهرهای بزرگ و نظر به نقش سلنیوم در بهبود تحمل گیاهان به فلزات سنگین، در این پژوهش به بررسی بر هم کنش متقابل سلنات سدیم و آرسنیک بر صفات رشدی، میزان رنگیزه­های فتوسنتزی، مقدار پروتئین، میزان نیتروژن، پرولین و آنزیم­های آنتی اکسیدان کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز در گیاه ریحان پرداخته شد.

مواد و روشها

بذور ریحان از مرکز تحقیقات کشاورزی شهرستان بیرجند تهیه گردید. ابتدا بذرها به وسیله محلول هیپوکلریت سدیم 5% به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شدند. سپس شستشوی بذرها با آب مقطر سه بار انجام شد پس از آن بذر ها به مدت 24 ساعت در آب مقطر خیسانده شد و در گلدانهایی به قطر 8 سانتی متر و ارتفاع 15 سانتی متر که با شن نرم و ضد عفونی شده پر شده‌ بودند، کاشته شد.

آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار به شرح زیر اجرا شد. در این آزمایش غلظت سلنیوم در چهار سطح (صفر، 5/2 ، 5 ، 10 میلی گرم در لیتر) از منبع سلنات (Na2SeO3)، و آرسنیک در چهار سطح (صفر، 100، 200، 300 میکرو مولار) از منبع ارسنات (Na2HAsO4 _7 H2O) مورد استفاده قرار گرفت. نمونه‌ها بعد از جوانه زنی به محیطی با دمای حداکثر C˚ 23 و حداقل C˚ 16 و دوره نوری 16 ساعت روشنایی (با شدت روشنایی 80 میکرومول بر مترمربع برثانیه) و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. پس از مطمئن شدن از جوانه زنی و رشد گیاه، در مرحله چهار برگی تعداد گیاه در هرگلدان به 10 عدد کاهش یافت. آبیاری به میزان نیاز در هر سه روز انجام گرفت و در طی رشد گیاه تا مرحله 4 برگی، به منظور تامین نیاز غذایی گیاهان آبیاری با محلول هوگلند یکبار در هفته انجام شد. تیمار آرسنیک در مرحله چهار برگی، همراه با آب آبیاری به فواصل منظم و بطور کلی در 3 مرحله اعمال شد. غلظت‌های مختلف سلنیوم نیز به صورت محلول پاشی همزمان با تیمار آرسنیک به فواصل منظم و با تکرارسه بار تا مرحله جمع آوری گیاهان به انجام رسید. چهار هفته پس از اعمال تیمارها نمونه ها جمع آوری شده و صفات مرفولوژیک مورد سنجش قرار گرفت. نمونه­ها برای سنجش­های بیشتر به فریزر 80- درجه منتقل گردید.

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی: مقدار کلروفیل a وb و کاروتنوئید به روش لیچنتالر 1987 (24) سنجیده شد. بدین منظور 1/0 گرم برگ با 4 میلی لیتر استون 80% در هاون سائیده شد سپس محلول حاصل به مدت 5 دقیقه در 3000 دور سانتریفیوژ شده، سپس جذب محلول رویی توسط اسپکتروفتومتر جهت تعیین مقدار کلروفیل­های a وb و کاروتنوئید در طول موج 647، 664 و 470 نانومتر قرائت شد. سپس با استفاده از فرمول­های مربوطه میزان رنگدانه­ها بر اساس میلی گرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.

سنجش پرولین: اندازه­گیری پرولین برگ به روش بیتز و همکاران (4) انجام شد. برای این منظور 2/0 گرم از بافت برگ در 4 میلی لیتر محلول اسید سولفوسالیسیلیک آبدار (3%) ساییده شد و صاف شد. 2 میلی لیتر از عصاره صاف شده، با 2 میلی لیتر محلول معرف ناین هیدرین و 2 میلی لیتر اسید استیک مخلوط و به مدت یک ساعت در بن ماری با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شد. نمونه ها براساس محتوای پرولین به رنگ زرد تا قرمز تغییر رنگ می­دهند. سپس بلافاصله نمونه ها به ظرف حاوی یخ منتقل شدند تا واکنش خاتمه یابد و پس از آن به دمای اتاق منتقل شدند. سپس به محتوای داخل لوله 4 میلی لیتر تولوئن مواد اضافه و به مدت 30 ثانیه به شدت تکان داده شدند. پس از 20 دقیقه، جذب نوری محلول فوقانی در طول موج 520 نانومتر خوانده شد و با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت پرولین در محلول محاسبه شد. در نهایت مقدار پرولین بر اساس میکرو­مول در گرم وزن­تر نمونه گیاهی محاسبه شد. از محلول غلظت­های مختلف پرولین جهت رسم منحنی استاندارد استفاده گردید.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT): فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از روش پریرا و همکاران (33) با بررسی مقدار کاهش در میزان جذب در طول موج 240‌‌ نانومتر سنجیده شد. محلول مورد استفاده شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مولار با PH=7 و پراکسید هیدروژن mM30 بود. سنجش با افزودن مقدار مناسب عصاره آنزیمی (10میکرو لیتر) در حجم نهایی 3 میلی لیتر آغاز شد. بلافاصله پس از افزودن عصاره آنزیمی، کاهش جذب در دمای 25 درجه سانتیگراد در 240 نانومتر به مدت 2 دقیقه و هر 30 ثانیه یک بار به وسیله اسپکتروفتومتر ثبت گردید. از محلول فاقد عصاره برای محلول بلانک استفاده گردید و مقدار فعالیت آنزیم در تیمارهای مختلف بر اساس تجزیه یک مول پراکسید هیدروژن در دقیقه به ازای هر گرم وزن تر بیان گردید.

سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز(SOD): فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز با استفاده از روش بیچ مپ (5) سنجیده شد و با استفاده از سنجش مهار احیای نوری‌ نیتروبلو تترازولیوم کلراید NBT)) در طول موج 560 نانومتر انجام گرفت. اختلاف جذب نمونه ها و شاهد روشنایی، احیای نوری NBT در حضور آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز موجود در نمونه را نشان داد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه ها محاسبه و فعالیت آنزیمی بر حسب واحد آنزیمی در مقدار پروتئین کل (میلی­گرم) در 100 میکرو لیتر عصاره که به روش نوری محاسبه شد، بیان گردید.

سنجش پروتئین: در این سنجش با استفاده از احیاء مس توسط پروتئین‌ها (روش لوری)، غلظت پروتئین مورد سنجش قرار گرفت (25). به حجم 100 میکرو لیتر عصاره گیاهی و یا استاندارد 100 میکرولیتر هیدروکسید سدیم 2 نرمال اضافه و به مدت 10 دقیقه در بن ماری و دمای 100 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از سرد شدن در دمای اتاق به آن 1 میلی لیتر کمپلکس اضافه شد. کمپلکس با استفاده از محلول استوک کربنات سدیم 2 درصد، سولفات مس 1 درصد و سدیم پتاسیم تارتارات 2 درصد ساخته می شود که نسبت حجمی آن ها به ترتیب 1:1:100 است. سپس به محلول حاصل 100 میکرولیتر فولین خالص اضافه و جدب نوری آن پس از 30 دقیقه ماندن در تاریکی و دمای اتاق در طول موج 750 نانومتر قرائت می­شود. مقدار پروتئین کل بر حسب میلی­گرم در گرم وزن تر محاسبه و گزارش شد.

سنجش نیتروژن: برای محاسبه مقدار نیتروژن از مقدار پروتئین خام به روش کجلدال (21) استفاده شد. به منظور برآورد درصد ازت، ابتدا نمونه مورد نظر توسط اسید سولفوریک هضم شده و ازت موجود به‌ صورت سولفات آمونیوم تبدیل می­گردد. سپس ازت موجود در سولفات آمونیوم به صورت آمونیاک آزاد و توسط اسیدبوریک به بورات آمونیوم تبدیل شده و با استفاده از اسیدسولفوریک1/0 نرمال تیتر می­شود و آنگاه با محاسبه اسید مصرفی مقدار ازت بدست می­آید. بدین منظور، ابتدا به 3/0گرم از نمونه گیاهی خشک شده 3/2 میلی لیتر اسید سولفو سالیسالیک اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. سپس نمونه­ها در دمای 180 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت قرار داده شد و پس از آن دما به 280 درجه سانتی گراد رسانیده شد و در این مرحله تقریباً هر 5 دقیقه 2 قطره آب اکسیژنه به نمونه اضافه شد. سپس مقدار 15 سی­سی اسید بوریک به محلول اضافه و به آن چند قطره معرف بروموکروزال افزوده شد تا محلول از بی رنگ به رنگ قرمز آلبالویی تبدیل شود در اینجا محلول به دست آمده در محل خروج گاز آمونیاک متصاعد شده از نمونه ها قرار داده می­شود و در نهایت درصد نیتروژن بر اساس فرمول مربوطه محاسبه می­شود.

تجزیه و تحلیل داده ها: تجزیه و تحلیل آماری داده­های جمع آوری شده در این تحقیق با استفاده از نرم افزار آماری SAS (9.4) انجام گرفت. مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال خطای 5 درصد و رسم نمودارها و منحنی­های استاندارد نیز توسط نرم افزار(2007) Excel انجام شد.

نتایج

صفات رشدی: با توجه به نتایج حاصل از تحلیل داده­ها آرسنیک اثر معنی داری بر طول ساقه و ریشه گیاه ریحان داشت (01/0≥α). بررسی اثرات همزمان آرسنیک و سلنات سدیم نشان داد که تیمار با سلنات سدیم (در غلظت 5/2 میلی گرم بر لیتر) رشد ساقه را در آرسنیک صفر نسبت به شاهد افزایش داد (شکل a1). در حالیکه بیشترین طول ریشه در آرسنیک 200 میکرو مولار و سلنیوم صفر مشاهده شد (شکل b1). طبق نتایج حاصل از داده ها تیمار آرسنیک باعث تغییرات معنی داری در وزن تر ریشه شد. اما بر وزن تر ساقه معنی دار نبود. بررسی در تیمار همزمان آرسنیک و سلنیوم نشان داد که بیشترین مقدار وزن تر گیاه در غلظت 300 میکرومولار آرسنیک توام با 5/2 میلی گرم بر لیتر سلنات سدیم است که نسبت به شاهد 46% افزایش داشت. کمترین مقدار این پارامتر در غلظتهای حداکثر از آرسنیک و سلنات واقع شد. اثر متقابل آرسنیک و سلنیوم بر وزن تر ریشه گیاه ریحان نیز معنی دار بود (01/0≥α). مقایسه میانگین ها نشان داد که بیشترین مقدار این پارامتر مربوط به سلنیوم صفر و غلظت آرسنیک 200 میکرومولار است (شکل c1).

صفات فیزیولوژیک

میزان کلروفیل a، b و کاروتنویید: اثرات متقابل آرسنیک و سلنیوم بر میزان کلروفیل a، b و کاروتنوئید معنی دار بود (01/0≥α). بیشترین مقدار کلروفیلa در سطح شاهد مشاهده شد و کمترین مقدار در سلنیوم صفر و آرسنیک 300 میکرومولار که نسبت به سطح شاهد 68% کاهش نشان داد (شکل a2).

شکل 1- اثر متقابل سلنیوم و آرسنیک بر صفات رشدی گیاه ریحان.(a: طول ساقه، b: طول ریشه، c: وزن تر ساقه، d: وزن تر ریشه). میانگین‌ها حاصل 3 تکرار و حروف غیر مشترک نشانه اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون LSD است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک در سطح پنج درصد (p≤0.05) تفاوت معنی داری با هم ندارند. میله های روی ستونها خطای استاندارد را در هر گروه نشان می دهد

بررسی اثرات متقابل نشان داد که میزان کلروفیل b در غلظت آرسنیک 300 میکرو مولار و سلنیوم 10 میلی گرم بر لیتر نسبت به شاهد 60% کاهش یافته است در حالیکه سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر در آرسنیک صفر منجر به افزایش 19% کلروفیل b نسبت به سطح شاهد شد (شکل b2). تیمار با آرسنیک از میزان کاروتنئیدهای گیاه نیز کاست. در مقابل تیمار با سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر در سطح آرسنیک صفر منجر به افزایش قابل توجه میزان کاروتنوئید گردید و کمترین مقدار مربوط به غلظت­های حداکثر سلنیوم و آرسنیک می­باشد که 57% کاهش نسبت به سطح شاهد نشان می­دهد (شکل c2).

نسبت کلروفیل a/b: تیمار با آرسنیک (به خصوص در غلظت 300 میکرومولار) نسبت کلروفیل a به b را  نسبت به شاهد کاهش داد (47%). مقایسه میانگین­ها بیانگر آن است که بیشترین نسبت کلروفیل a/b مربوط به آرسنیک 200 میکرو مولار و سلنیوم 10 میلی گرم بر لیتر است که منجر به افزایش 25% این پارامتر، نسبت به سطح شاهد شده است (شکل d2).

میزان نیتروژن: اثر متقابل آرسنیک و سلنیوم بر میزان نیتروژن گیاه ریحان در سطح 1% معنی دار بود. میزان نیتروژن با افزایش آرسنیک کاهش پیدا کرد. در این حالت تیمار با سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر منجر به افزایش 13.5% نیتروژن گیاه نسبت به سطح شاهد شد. در آرسنیک 300 میکرو مولار و سلنیوم صفر کمترین میزان نیتروژن مشاهده شد ( شکل a3).

میزان پروتئین: نتایج نشان داد که تیمار آرسنیک به خصوص در غلظت300 میکرومولار، میزان پروتئین گیاه را 52% کاهش داده است. بررسی اثرات متقابل آرسنیک و سلنات سدیم نشان می­دهد که سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر در همه غلظت­های آرسنیک اثر افزایشی در مقدار پروتئین داشته است (شکل b3).

شکل 2- اثر متقابل سلنیوم و آرسنیک بر میزان رنگیزه­های فتوسنتزی در گیاه ریحان: a: کلروفیل a، b: کلروفیل b، c: نسبت کلروفیل a به b، d: کاروتنوئید. میانگین­ها حاصل 3 تکرار و حروف غیر مشترک نشانه اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون LSD است. ستون­های دارای حداقل یک حرف مشترک در سطح پنج درصد (p≤0.05) تفاوت معنی داری با هم ندارند. میله های روی ستونها خطای استاندارد را در هر گروه نشان می­دهد.

میزان پرولین: طبق نتایج حاصل از تحلیل داده­ها، تنش آرسنیک میزان پرولین گیاه را نسبت به سطح شاهد افزایش داده است. در آرسنیک 300 میکرومولار میزان پرولین 95 درصد افزایش یافته است. کاربرد سلنات سدیم در غلظت­های 5 و 10 میلی گرم بر لیتر این پارامتر را افزایش و در غلظت­های کمتر (صفر و 2.5) آنرا کاهش داده است (شکل a4).

فعالیت آنزیم کاتالاز: با افزایش غلظت آرسنیک میزان فعالیت کاتالاز افزایش چشمگیری یافت و در سطح آرسنیک 300 میکرومولار حداکثر فعالیت کاتالاز مشاهده شد که نسبت به سطح شاهد بیش از 4 برابر افزایش داشت. اما کمترین میزان فعالیت این آنزیم در غلظت سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر و در شرایط فقدان آرسنیک مشاهده شد (شکل b4).

فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز: با افزایش غلظت آرسنیک بر میزان فعالیت این آنزیم افزوده شد. بیشترین میزان فعالیت SOD در سطح آرسنیک 300 میکرومولار مشاهده شد که نسبت به سطح شاهد 2 برابر بود و کمترین مقدار به غلظت آرسنیک صفر و سلنیوم 5 میلی گرم بر لیتر مربوط است که با 50% کاهش در فعالیت آنزیم همراه بوده است ( شکل c4).

شکل 3- اثر متقابل سلنیوم و آرسنیک بر a) : درصد نیتروژن و (b): میزان پروتئین گیاه ریحان. میانگین­ها حاصل 3 تکرار و حروف غیر مشترک نشانه اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون LSD است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک در سطح پنج درصد (p≤0.05) تفاوت معنی داری با هم ندارند. میله­های روی ستون­ها خطای استاندارد را در هر گروه نشان می دهد.

شکل 4- اثر متقابل سلنیوم و آرسنیک بر (a): میزان پرولین، (b): فعالیت کاتالاز، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در گیاه ریحان. میانگین­ها حاصل 3 تکرار و حروف غیر مشترک نشانه اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون LSD است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک در سطح پنج درصد (p≤0.05) تفاوت معنی داری با هم ندارند. میله­های روی ستون­ها خطای استاندارد را در هر گروه نشان می­دهد.

بحث و نتیجه گیری

صفات رشدی: طبق نتایج تحقیق حاضر تیمار گیاهان ریحان با آرسنیک سبب کاهش صفات رشدی گیاه شامل طول ساقه و ریشه و وزن تر ریشه و ساقه شده است و کاربرد سلنیوم بویژه در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر باعث افزایش پارمترهای مذکور در شرایط تنش آرسنیک نسبت به گیاهان شاهد شده است. مطالعات محققین دیگر نیز بیانگر اثر منفی آرسنیک بر رشد گیاهان همچون برنج و گندم بوده است (38). پژوهشگران دلایلی همچون اختلال در جذب فسفر، کاهش دسترسی آب برای ریشه ها، برهم زدن توازن عناصر غذایی، افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژن، افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، کاهش فتوسنتز و تنفس از طریق تخریب غشاهای کلروپلاست و میتوکندری، کاهش محتوای رنگیزه های فتوسنتزی و به طور کلی القای تنش اکسیداتیو در گیاهان آلوده شده به آرسنیک را  علت سمیت آرسنیک و در نتیجه کاهش رشد گیاهان، معرفی می­کنند (9، 10، 15 و 20). اثر بهبود دهنده سلنیوم بر رشد گیاهان چه در شرایط تنش و چه در شرایط غیر تنش موضوع پژوهش­های متعدد بوده است از جمله در تحقیقات پنان و همکاران تیمار با سلنیوم موجب افزایش طول بخش هوایی شد (32). همچنین بررسی­ها در گندم بهاره تحت تنش خشکی نشان داد سلنیوم مانع کاهش رشد گیاهان در اثر کمبود آب گردید (27). این محققین چنین نتیجه­گیری کردند که غلظت­های کم سلنیوم به دلیل افزیش رنگ­دانه­های فتوسنتزی، افزایش تثبیت کربن و همچنین سنتز و هیدرولیز نشاسته و ساکارز موجب افزایش رشد گیاه می­شود اما در سطوح بالاتر با اثر کاهشی بر مقدار رنگدانه­ها، بر میزان فتوسنتز تاثیر گذاشته و در نتیجه منجر به کاهش رشد و متابولیسم گیاه می­شوند. سلنیوم در غلظت­های پایین تقسیم سلولی را در سلول­های مریستمی نوک ریشه تحریک کرده و متعاقبا رشد ریشه را در گیاه بهبود می­بخشد اما در سطوح بالا منجر به کاهش تقسیم سلولی در این سلول­ها می شود (35 و 37).

رنگیزه های فتوسنتزی: کلروفیل از رنگیزه­های فتوسنتزی است که مقدار آن در گیاه و به ویژه نسبت کلروفیل a/b  به عنوان شاخصی از مقدار تحمل گیاه به استرس­های محیطی ارزیابی شده است. در پژوهش حاضر با افزایش غلظت آرسنیک محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی کاهش پیدا کرده است. آرسنیک دارای یک اثر مهاری وابسته به غلظت، بر سنتز کلروفیل می باشد. به نظر می­رسد که سیستم سنتز و تجزیه کلروفیل توسط غلظت­های بالای آرسنیک تحت تاثیر قرار می­گیرد. انتقال یون فلزی به اندام­های هوایی و در نهایت تجمع آن در سلول­های برگ، باعث بروز علائم مورفولوژیک و فیزیولوژیک ناشی از تنش در برگ­ها می­شود که از شاخص­ترین این علائم می­توان به نکروز و کلروز شدن برگ­ها اشاره کرد (38). کاهش مقدار کلروفیل و کاروتنوئید بر اثر تیمار آرسنیک در گیاه سویا (2)، ذرت (10) و نخود (15) گزارش شده است. چن و همکاران معتقدند که کاهش کلروفیل عمدتاً به دلیل تخریب ساختمان کلروپلاست و دستگاه فتوسنتزی، فتواکسیداسیون کلروفیل­ها، تخریب پیش ماده­های سنتز کلروفیل و یا ممانعت از بیوسنتز کلروفیل است. آرسنیک باعث تغییر شکل کلروپلاست، گرد شدن و کوتاه شدن محور طولی سلول، تو رفتگی غشاء و خمیدگی و تخریب غشاء شده که در نتیجه موجب کاهش غلظت کلروفیل برگ می­گردد (8). همچنین، تغییر در نفوذپذیری غشای کلروپلاست به علت پراکسیداسیون لیپیدها، در واکنش به سمیت آرسنیک، می­تواند در کاهش محتوی رنگیزه­های گیاه دخیل باشد. انواع اکسیژن فعال که به طور مستقیم و یا غیر مستقیم در اثر تنش آرسنیک ایجاد می­شوند و آسیب جدی به اجزای مختلف سلولی به ویژه غشاهای زیستی از جمله غشاهای تیلاکوئیدی در پروتوپلاست­ها وارد می­کنند (9).

در این تحقیق افزودن سلنات سدیم 5 میلی گرم بر لیتر در آرسنیک صفر منجر به افزایش کلروفیل و کاروتنوئید گردید. به نظر می­رسد با افزایش سطوح مناسب سلنیوم در تیمار­های همزمان با آرسنیک محتوی کلروفیل و کاروتنوئید افزایش پیدا کرده است و سلنیوم توانسته است اثرات سمی آرسنیک را تعدیل کند. زمانی که گیاهان در معرض تنش­های محیطی و فلزات سنگین قرار می­گیرند کلروپلاستها تخریب شده و فتوسنتز به سمت گسیختگی هدایت می­شود در این مواقع با افزودن سطوح مناسبی از موادی مثل سلنیوم میتوان تا حدی از تخریب کلروپلاست­ها جلوگیری کرد و محتوای کلروفیل را افزایش داد (12). استفاده از سلنیوم می­تواند باعث تنظیم گونه­های واکنش پذیر اکسیژن و آنتی اکسیدان­ها، جلوگیری از جذب و انتقال فلزات سنگین، تغییر در ویژگی­های فلزات سنگین، بازسازی غشای سلولی، ساختمان کلروپلاست و بهبود سیستم فتوسنتزی شود (23). تحقیقات انجام شده بیانگر آن است که تیمار با غلظت­های کم سلنیوم با محافظت از آنزیم­های کلروپلاستی، بیوسنتز رنگدانه­های فتوسنتزی را افزایش می­دهد (35)، اما با افزایش غلظت سلنیوم، این عنصر می­تواند آنزیم­های بیوسنتز کلروفیل (مانند پورفوبیلینوژن سنتاز) را مهار کرده و با گروه سولفیدریل موجود در آنزیم­های 5 آمینولوولینیک اسید دهیدراتاز و پورفوبیلینوژن دآمیناز برهمکنش کرده و از این طریق بر سنتز کلروفیل اثر گذار باشد (30). به نظرمی­رسد یکی دیگر از دلائل کاهش میزان کلروفیل در سطوح بالاتر سلنیوم، مربوط به کاهش سطح پهنک برگ در شرایط تنش باشد. تحقیقات انجام شده در این زمینه بر مقدار کلروفیل در گیاهانی مانند لوبیا و کاهو و جلبک کلرلا نیز نتایج مشابهی را به دنبال داشت بطوری که با افزایش غلظت تیمار سلنیوم در جلبک کلرلا میزان کلروفیل کاهش پیدا کرد ولی میزان گزانتوفیل و کارتنویید افزایش یافت (8).

میزان پروتئین و نیتروژن: سنتز پروتئین­ها در پاسخ به تنش‌های محیطی نظیر شوک گرمائی، تنش سرما، تنش خشکی و شوری تغییر می‌نماید. چنین تنش‌هایی سبب افزایش سنتز برخی از پروتئین­ها و کاهش سنتز عده­ای دیگر از آنها می­شود (26). در شرایط تنش، کاهش پتانسیل آب و پژمردگی، اغلب منجر به کاهش سنتز پروتئین­ها می­گردد. در تحقیق حاضر آرسنیک به خصوص در غلظت300 میکرومولار، میزان پروتئین گیاه را 52% کاهش داده است. کاهش پروتئین می­تواند به دلیل کاهش میزان سنتز یا افزایش میزان هیدرولیز آن در شرایط تنش باشد. پروتئین­ها در اثر هیدرولیز توسط پروتئازها به اسیدهای آمینه تبدیل می­شوند. اسیدهای آمینه­ای که به این ترتیب ایجاد می­شوند، در تنظیم اسیدیته سلول، ذخیره­سازی نیتروژن، حفاظت از ماکروملکولهای سلولی، تنظیم اسمزی، سمیت زدایی و مهار رادیکال­های آزاد بکار گرفته می­شوند (31). در تحقیق حاضر، استفاده از سلنات سدیم (به خصوص در غلظت 5 میلی گرم بر لیتر) افزایش چشمگیری بر میزان پروتئین و نیتروژن داشته است. سلنات سدیم می­تواند با آنزیم­های دارای گروه سولفیدریل در سنتز پروتئین برهم کنش داشته باشد. سطوح مختلف غلظتی این عنصر می­تواند منجر به تغییر بیان ژن آنزیم نیترات ردوکتاز گردد و در فرآیند تولید ترکیبات نیتروژن دار و پروتئین در گیاه نقش داشته باشد (18). بر اساس مطالعات انجام شده سطوح مختلف سلنات سدیم می­تواند در متابولیسم نیتروژن در گیاه نقش داشته باشد. در واقع سلنیوم با افزایش فعالیت آنزیم­های درگیر در متابولیسم نیتروژن مانند نیترات ردوکتاز، منجر به افزایش سنتز پروتئین شده که افزایش بیومس گیاه را به دنبال دارد (3 و 41).

میزان پرولین: در این تحقیق تنش آرسنیک میزان پرولین گیاه ریحان را نسبت به سطح شاهد افزایش داده است. عناصر و فلزات سنگین در گیاه موجب تجمع پرولین می­شوند که به عنوان یک علامت بیوشیمیایی ایجاد تنش در گیاهان محسوب می­شود. پرولین محافظت کننده اسمزی است و مقدار آن در هنگام تنش­ها در گیاه افزایش پیدا می­کند. پرولین در کنار تنظیم اسمزی وظایف دیگری همچون حفاظت از غشای پلاسمایی، زدودن رادیکال­های هیدروکسیل و اکسیژن فعال نیز دارد و می­تواند منبعی برای کربن و نیتروژن باشد (36). در این تحقیق پاسخ گیاه به استفاده از سلنات سدیم بسته به غلظت اعمال شده و شرایط تنش متفاوت بود. به طوری که در غلظت صفر آرسنیک مقدار پرولین با افزایش غلظت سلنات سدیم افزایش یافت. در تحقیقات قبلی نیز کاربرد سلنات سدیم منجر به افزایش میزان پرولین در گیاه شده است (1و 39). اما کاربرد همزمان آرسنیک و سلنات سدیم موجب کاهش نسبی میزان پرولین گردید. به نظر می­رسد سطح سلنات سدیم 5/2 میلی گرم بر لیتر بیشترین اثر را در کاهش میزان پرولین داشته است.

آنزیم های انتی اکسیدان: علاوه بر تغییرات فیزیولوژیکی که در اثر تنش در گیاه ایجاد می­شود، صدمات اکسیداتیو نیز از عوامل مهم محدود کننده رشد و تولیدات گیاهی هستند که در اثر عدم وجود شرایط مناسب ایجاد می­شود. بیشترین صدمه به گیاهان مربوط به آسیب اکسیداتیو در سطح سلول است. گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از آلودگی با فلزات سنگین در محیط داخل و خارج سلولی از مکانیسم­های دفاعی مختلفی استفاده می­کنند. مکانیسم­های دفاعی، اغلب از همکاری آنزیم ها و ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند فلاونوئید، کاروتنوئید و غیره تشکیل شده اند. ترکیبات آنتی اکسیدان در حفظ تعادل سلول­های گیاهی نقش بسیار مهمی را ایفا می­کنند زیرا این متابولیت­ها توانایی واکنش مستقیم با انواع اکسیژن­های واکنش­گر و جمع­آوری آن­ها را دارند (22).

در تحقیق حاضر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در شرایط تنش آرسنیک افزایش یافت. در مطالعات مشابه نیز که گیاهان ذرت و ماش تحت تیمار آرسنات و آرسنیت قرار گرفته بودند، افزایش فعالیت کاتالاز مشاهده شد (10). آرسنیک در غلظت­های بالا همچون سایر فلزات سنگین  می­تواند با تخریب زنجیره­های انتقال الکترون میتوکندریایی سبب رها سازی رادیکال­های آزاد و در نتیجه القای تنش اکسیداتیو شود. آرسنیک با اختلال در متابولیسم فسفر و کاهش فعالیت در برخی آنزیم­های حیاتی باعث تجمع گونه­های فعال اکسیژن از جمله پراکسید هیدروژن در گیاه می­شود (29).

در این تحقیق استفاده از سلنات سدیم در غلظت­های کم از مقدار این آنزیم­ها در گیاه کاسته است. تنها در غلظت بالای سلنات (10 میلی­گرم بر لیتر) و در شرایط آرسنیک صفر افزایش قابل توجه فعالیت آنزیم­های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز مشاهده شد. به نظر می­رسد سلنات سدیم در غلظت بالا بصورت عامل تنش عمل کرده و سیستم آنزیمی آنتی اکسیدانی گیاه را فعال کرده است. در حالی­که در غلظت­های کم از شدت تنش آرسنیک کاسته و در نتیجه میزان فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان کاهش یافته است. نتایج تحقیقات دیگر نیز فعالیت آنتی اکسیدانی سلنیوم در برخی گیاهان را تایید کرده است. به طور مثال استفاده از سلنات سدیم در پیاز منجر به افزایش ترکیبات فلاوونوئیدی و اسید اسکوربیک گردید (16).

در مجموع با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق آرسنیک اثرات تخریبی در رشد گیاه، میزان رنگیزه های فتوسنتزی، مقدار پروتئین و نیتروژن گیاه داشته و منجر به افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه گشته است. در چنین شرایطی استفاده از سلنات سدیم در غلظت­های کم اثرات بهبود دهنده قابل توجهی در پارامترهای فوق الذکر داشته و از میزان تنش در گیاه ریحان کاسته است. در حالی که کاربرد این عنصر در غلظت بالا بر شدت تنش و کاهش پارامترهای رشدی و فعال شدن سیستم آنتی اکسیدانی گیاه افزوده است.

سپاسگزاری

از دانشگاه آزاد اسلامی واحد نیشابور به خاطر در اختیار قرار دادن امکانات آزمایشگاهی قدردانی می­شود.