Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Improving seed germination, in vitro organogenesis and regeneration of Plantago major medicinal plant

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran

2 Department of Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmacy, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran

3 Zanjan Pharmaceutical Nanotechnology Research Center, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran

Abstract

The seed germination of Plantago major requires pre-treatment in the off-season. Thus, the effect of gibberellic acid, potassium nitrate, cold, daylight and different Murashige and Skoog medium (MS) salt concentrations on the germination of seeds were studied. The modified Timson index was applied to calculate the germination rate.
Effect of different concentrations of 6-Benzyl amino purine (BAP) or Thidiazuron (TDZ) in combination with α-Naphtalen acetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) or indole-3-butyric acid (IBA) was studied for callus induction and regeneration of various explants.
The results showed that cold, daylight and full salt MS medium are more suitable for high germination of P. major. The highest percentage of callus formation (100%) was observed in the most of the explants. The highest regeneration frequency (100%) was observed in leaf explant in MS medium containing 1:0.5; 1.5:1; 1.5:2 and 2: 1 mg.L-1 TDZ: IBA, as well as, 2:0.5 mg.L-1 BAP: NAA in stem explant and in root explant at concentration of 1.5 mg.L-1 BAP, 1.5:0.2; 2:0.2 and 3:0.2 mg.L-1 TDZ: NAA and 2:1; 2:2; 3:1; 3:2 mg.L-1 TDZ: IBA. 41.67 shoot number obtained with 1: 2 mg.L-1 TDZ: IBA in leaf explants, as well as, 27 shoot number in 1.5: 1 mg.L-1 TDZ: IBA and 20 shoot number in 2:0.2 mg.L-1 TDZ: NAA were obtained in shoot and root explants, respectively. For root induction, regenerated shoots were transferred into MS medium supplementation with 0.5 mg.L-1 IBA. The survival rate of plantlets was 80% and they were acclimatized in the greenhouse.

Keywords

Main Subjects

بهبود جوانه­زنی بذر، اندام­زایی و باززایی گیاه داروئی بارهنگ کبیرPlantago major در شرایط درون شیشه­ای

سمانه راه آموز حقیقی1، خدیجه باقری1*، علی شرفی2 ، حسین دانافر3

1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی

2 ایران، زنجان، دانشگاه علوم پزشکی، دانشکده داروسازی، گروه زیست فناوری داروئی

3 ایران، زنجان، دانشگاه علوم پزشکی، دانشکده داروسازی، گروه شیمی دارویی

تاریخ دریافت: 05/08/1399          تاریخ پذیرش: 25/10/1399

چکیده

جوانه­زنی بذر بارهنگ کبیر(Plantago major) در شرایط خارج از فصل نیاز به پیش تیمار­های خاص دارد. تأثیر پیش تیمارهای اسیدجیبرلیک، پتاسیم نیترات، سرما، نور و غلظت نمک  محیط Murashige and Skoog medium (MS) بر جوانه­زنی بذر این گیاه بررسی شدند. از شاخص تیمسون (Timson Index) برای تعیین نرخ جوانه­زنی استفاده گردید. تأثیر غلظت­های مختلف سیتوکینین­های 6-آمینو پورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در ترکیب با اکسین­های آلفا-نفتالین اسید استیک (NAA)، 3-ایندول-3- استیک اسید (IAA) و اسید ایندول 3- بوتیریک (IBA) برای القاء کالوس و باززایی ریزنمونه­های برگ، ساقه و ریشه مطالعه شد. یافته­ها نشان داد که پیش تیمار سرما، نور روز و محیطMS کامل برای جوانه­زنی بذور بارهنگ کبیر مناسب­تر هستند. بیشترین درصد کالوس­زایی (100 درصد) در اکثر ریز نمونه­ها پدیدار گردید. بالاترین فراوانی باززایی(100 درصد) در ریزنمونه برگ در محیط MS حاوی 5/0: 1؛ 1: 5/1؛ 2: 5/1 و 1: 2 میلی­گرم بر لیتر TDZ: IBA، در ریزنمونه ساقه 5/0: 2 میلی­گرم بر لیتر BAP: NAA و در ریزنمونه ریشه در غلظت 5/1 میلی­گرم بر لیتر BAP  ،2/0: 5/1 ؛2/0: 2 و 2/0 : 3 میلی­گرم برلیتر TDZ: NAA و2:1؛ 2:2؛ 1: 3؛ 2: 3 TDZ: IBA مشاهده گردید. 67/41،  27 و20 تعداد شاخه به ترتیب در محیط حاوی 1:2 و 1:5/1 میلی­گرم برلیتر TDZ:IBA و 2/2:0 میلی­گرم برلیتر TDZ:NAA در ریزنمونه­های برگ، ساقه و ریشه بدست آمد. گیاهچه­های باززایی شده به محیط ریشه­زایی حاوی غلظت 5/0 میلی­گرم بر لیتر IBA منتقل و با نرخ بقای 80 درصد در گلخانه سازگاری یافتند.

واژه های کلیدی: اندام­زایی شاخه، بارهنگ کبیر، باززایی درون شیشه­ای، جوانه­زنی، کالوس­زایی

* نویسنده مسئول، تلفن: خدیجه باقری تلفن : 982433054523+  ،  پست الکترونیکی: bagheri.khadijeh@znu.ac.ir

مقدمه

 

Plantago بزرگترین جنس از خانواده Plantaginaceae است که حدود 483 گونه از این جنس در مقالات گزارش شده است (39، 43). بارهنگ کبیر (Plantago major) یکی از قدیمی­ترین گیاهان دارویی است که در طب سنتی بسیار مورد استفاده قرارگرفته و یکی از گسترده­ترین گونه­های گزارش شده در مقالات می­باشد (شکل1). این گیاه در سراسر جهان و در چمنزارهای معتدل اروپا، آسیا، جنوب استرالیا و همچنین شمال آفریقا و آمریکا توزیع شده است (12و 40). ترکیبات فعال بیولوژیکی مختلفی در گونه­های بارهنگ وجود دارد از جمله آن­ها می­توان به آلکالوئیدها، مشتقات اسید کافئیک، کومارین­ها، چربی­ها، فلاونوئیدها، ایریدوئیدها، موسیلاژها، پلی ساکاریدها، استرول­ها و مواد فرار اشاره کرد (10). ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در برگ، ریشه و بذرهای بارهنگ باعث خواص درمانی قابل توجهی دراین گیاه شده که شامل خواص ضد ویروس، ضد میکروب، ضد التهاب، ضد درد، ضد هیستامین، ضد روماتیسم، ضد سرطان، ضد زخم و کاهش فشار خون می­شود (3و 18). همچنین از قسمت­های هوایی گونه­های بارهنگ معمولاً در درمان تعدادی از بیماری­های مرتبط با پوست، دستگاه تنفس، گوارش، تولیدمثل و همچنین در برابر عفونت­ها استفاده می­گردد (35).

 

 

شکل1- گیاه خودرو بارهنگ کبیر (Plantago major)

 

 

باتوجه به پیشینه بسیار طولانی در استفاده از بارهنگ کبیر به عنوان گیاه دارویی و همچنین به دلیل اهمیت ترکیبات فیتوشیمیایی و فعالیت­های بیولوژیکی موجود در آن، لازم است که مطالعات بیشتری بر روی این گیاه دارویی انجام گیرد. تکنیک کشت بافت به عنوان ابزاری مهم شناخته شده است که منجر به توسعه ژنوتیپ­های جدید گیاهی می­شود (19) همچنین متخصصان ژنتیک و پرورش دهندگان گیاهان، از این تکنیک به عنوان منبع تنوع استفاده می­کنند (14). کشت بافت این گیاه می­تواند به تکثیر آن در شرایط درون شیشه­ای کمک قابل توجهی بکند، زیرا اکثر بذرهای خریداری شده از کلکسیون­ها، هرباریوم­های خصوصی و بانک ژن دارای قوه نامیه پایین و درصد جوانه زنی اندکی هستند و اغلب تحقیقات خارج از فصل رشد گیاه صورت می­گیرد. همچنین بررسی ویژگی­های جوانه زنی در آزمایشگاه می­تواند تعیین کننده میزان موفقیت تولید باشد (15). کالوس­زایی متفاوت در ریزنمونه­های گیاهی می­تواند به دلیل فعالیت­های متابولیکی متفاوت و میزان هورمون­های درونزا باشد و ممکن است تیمار با اکسین به عنوان یک وضعیت تنش­زا توسط بافت گیاه تلقی ­گردد و روند تقسیمات سلولی را به سوی جنین­زایی تغییر دهد (23). اکثر باززایی­ها از ریزنمونه­های گیاهی به صورت غیرمستقیم واز طریق القاء کالوس اتفاق می افتد که این روش گاهی باعث ایجاد تنوع سوماکلونی می­شود. به همین منظور از روش باززایی مستقیم برای تکثیر استفاده می­گردد که دارای مزیت­های بیشماری است. از آن جمله میتوان به سهولت تهیه ریزنمونه، قابلیت باززایی بالا و کاهش زمان اشاره کرد (16). اخیراً این گیاه مورد توجه محققان زیادی بوده است (42). 

القاء کالوس از ریزنمونه­های محور زیر لپه گونه­های Plantago و باززایی از کالوس حاصل از کشت­های ریشه در محیط MS (30) همراه با 3-ایندول-3- استیک اسید IAA)) قبلاً گزارش شده است (41). تشکیل کالوس و باززایی از ریزنمونه­های محور زیر لپه P.ovata نیز بررسی شده است. تولید شاخه­های جانبی در محیط MS حاوی غلظت­های مختلفIAA ، اسید ایندول 3- بوتیریک (IBA) ، الفا-نفتالین اسید استیک (NAA) ، 2، 4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید(2,4-D) ، 6-بنزیل آمینو پورین BAP و کینیتین(Kin) نیز بررسی شده است. در غلظت 5/0 میلی­گرم بر لیتر   IBAرشد کالوس همراه با تشکیل ریشه مشاهده شد. 2,4-D کالوس­زایی را با سرعت یکنواخت با غلظت از 5/1 میلی­گرم بر لیتر تا 5/2 میلی­گرم بر لیتر القاء کرد (22). ریزازدیادی نوک ساقه P.asiatica در محیط MS با 1/0میلی­گرم برلیترIAA و 1 میلی­گرم برلیتر BAPانجام گردید (25). بالاترین مقدار باززایی شاخه از ریزنمونه­های لپه و محور زیر لپه P.afra در محیط MS، حاوی 2/0 میلی­گرم برلیتر تیدیازورون (TDZ)  و 2/0 میلی­گرم برلیتر IBA مشاهده شد. شاخه­های موجود بهترین ریشه­دهی را در محیط MS حاوی 6/0 میلی­گرم برلیتر NAA داشتند (36). در مطالعه­ای دیگر، کشت درون شیشه­ای گیاه P.major با استفاده از محیط MS همراه با 2/0 میلی­گرم برلیتر IAA و0/1 میلی­گرم برلیتر TDZ گزارش شده است (21). در مطالعه اسماعیلی و همکارانش در2014، القاء کالوس در ریزنمونه­های برگ و ریشه گونه P.major با استفاده از غلظت­های مختلف 2,4-D/Kin بهینه گردید. مقایسه الگوهای باندینگ مشتق شده از 6 آغازگر ISSR نشان داد که کالوس­ها تنوع سوموکلونال آشکاری را نشان می­دهند که می­تواند در نهایت برای سیستم­های انتخاب آزمایشگاهی مورد بهره برداری قرارگیرند (9).

بنابراین این گونه نیازمند پروتوکل جامع و مناسبی برای  بهبود جوانه­زنی بذر و سپس تکثیر گیاه از طریق القاء کالوس، اندام زایی و باززایی در شرایط درون شیشه­ای است، لذا انجام تحقیقات مکرر و بصورت جامع برای دستیابی به روشی کارامد برای کشت بافت گیاه ضروری بنظر می­رسد که بتوان از گیاهانی انبوه و عاری از هرگونه بیماری در روند تحقیقات دارویی از جمله تولید متابولیت­های ثانویه با ارزش و از لحاظ تجاری نیز سوداور استفاده کرد که این موضوع برای کشورهایی همچون ایران که دارای گیاهان دارویی متنوعی هستند، بسیار باارزش می­باشد. بارهنگ کبیر نیز حاوی متابولیت­های ثانویه مهم از جمله ایریدوئیدهای اکوبین و کاتالپل است که دارای خواص متعددی از جمله ضدالتهاب، ضد سرطان و ضد میکروب هستند، بنابراین کشت­های درون شیشه­ای می­تواند برای تولید این ترکیبات مهم باشد.

بنابراین، هدف از این مطالعه افزایش جوانه زنی بذر و معرفی یک پروتکل ساده، و جامع برای تکثیر این گیاه دارویی با ارزش از طریق القاء کالوس، اندام زایی و باززایی در شرایط بهینه است.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی و ضدعفونی کردن بذرها: در ابتدا بذر گیاه بارهنگ کبیر از بانک ژن موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع استان تهران در آبان ماه سال 1396 خریداری شد. در ابتدا بذرها سه دفعه با آب مقطر استریل شستشو شدند و در اتانول 70 درصد به مدت 30 ثانیه غوطه­ور گشتند، سپس بذور با هیپوکلریت سدیم 5 درصد همراه با یک قطره توئین-20 به مدت 10 دقیقه و مجددا با آب مقطر استریل سه دفعه شستشو شدند.

آزمایشات جوانه زنی: در آزمایش اول 10 عدد بذر استریل روی کاغذ صافی و درون پتری دیش 10 سانتی­متری قرارگرفتند و 10 میلی­لیتر از محلول­های آزمایش 1/0 میلی­مولار جیبرلین (GA3) و 1 میلی­مولار نیترات پتاسیم (KNO3) به مدت 24 ساعت به پتری­ دیش­ها اضافه گردید. بذرهای تیمار شده در محیط MS با 8 گرم در لیتر آگار کشت شدند. pH محیط برابر با 8/5 قبل از اضافه کردن آگار تنظیم گردید و سپس بوسیله اتوکلاو و در شرایط 121 درجه سانتیگراد بمدت 20 دقیقه استریل گردیدند. کشت­ها در اتاقک رشد با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±22 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 5±70 نگهداری شدند. تیمار با آب مقطر استریل به عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. شرایط تیمار شاهد همانند سایر تیمارها بود. برای بررسی تأثیر سرما بر جوانه­زنی، بذرهای ضدعفونی شده در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت در تاریکی قرار گرفتند و سپس در محیط MS کشت شدند (37). در آزمایش دوم به منظور بررسی تأثیر نور روز بر جوانه­زنی، بذرها مجددا سرمادهی شده و در محیط  MSجامد کشت شدند و در شرایط روشنایی روز (16 ساعت روشنایی) و شرایط تاریکی کامل تقسیم گردیدند (10). در آزمایش سوم، بذور سرما­دهی شده در محیط MS با غلظت­های مختلف نمک (کامل، ، و ) قرارگرفتند و تیمار با آب مقطر استریل به همراه آگار به عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. نمونه‌ها به مدت 4 هفته در معرض نور روز (16 ساعت) قرارگرفتند. نرخ جوانه­زنی از هفته اول تا هفته چهارم ثبت گردید. برای محاسبه نرخ جوانه­زنی از شاخص تیمسون (Timson Index) اصلاح شده استفاده گردید.

 

Timson germination index (TGI) = ΣG/T

 

(G) درصد جوانه­زنی بذر در فواصل 2 روزه در یک دوره 28 روزه و(T)  دوره جوانه­زنی کل است (8).

کشت بافت: براساس نتایج بهینه شده آزمایش جوانه­زنی، بذرهای سرما دیده در محیط کاملMS کشت شدند و به مدت 4 تا 8 هفته در 16 ساعت روشنایی قرارگرفتند. ریزنمونه­های برگی، ساقه و ریشه به اندازه یک سانتی­متر از گیاهچه­ها بریده شده و در محیط MS حاوی ترکیب سیتوکینین­های BAP یا TDZ و اکسین­های NAA، IAA یا IBA در غلظت­های مختلف کشت گردیدند. غلظت هر دو سیتوکینین 5/0، 1، 5/1، 2 و 3 میلی­گرم برلیتر و برای اکسین­ها صفر، 2/0، 5/0، 1 میلی­گرم برلیتر (NAA)، 1/0، 5/0، 1، 5/1 میلی­گرم برلیتر (IAA) و 5/0، 1، 5/1، 2 میلی­گرم برلیتر (IBA) بودند. برای جلوگیری از قهوه­ای شدن، القاء کالوس و شاخه­زایی، هر دو هفته یکبار نمونه­ها به محیط تازه MS منتقل شدند. ریزنمونه­ها با باززایی مستقیم به محیط MS بدون هورمون و کالوس­ها به محیط کشت MS همراه با 5/0 میلی­گرم برلیتر سیتوکینین مربوطه برای القاء شاخه منتقل شدند. گیاهچه­های باززا شده به محیط بدون هورمون و یا محیط ریشه­زایی حاوی غلظت 5/0 میلی­گرم برلیتر IBA منتقل شدند. سپس گیاهچه­های رشدیافته با موفقیت به گلدان حاوی مخلوطی از 80 درصد پیت ماس و 20 درصد پرلیت استریل پس از دو هفته انتقال یافتند و در فواصل منظم، گیاهچه­ها با محلول هوگلند آبیاری شدند.

تحلیل آماری: آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با سه تکرار و 10 ریزنمونه در هر تکرار استفاده شد. درصد کالوس­زایی، باززایی و تعداد شاخه در هر ریزنمونه ثبت گردید. داده ها با استفاده از تجزیه واریانس مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفتند و میانگین­ها با استفاده از آزمون توکی با استفاده از نرم افزار SPSS 21 مقایسه شدند و مقایسه میانگین­ها از نظر آماری 5 درصد معنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تأثیر عوامل مختلف بر جوانه­زنی بذر بارهنگ کبیر: در ابتدا، بذرهای بارهنگ کبیر ضدعفونی شدند و با تیمارهای مختلف GA3، KNO3، سرما و آب مقطر استریل به عنوان شاهد آزمایش شدند. یافته­ها نشان داد که در هفته اول، اثر پیش تیمار سرما (18 درصد جوانه زنی)،KNO3  (45/9 درصد) و GA3 (صفر درصد) بود و پس از گذشت 28روز، بترتیب 80، 65 و50 درصد جوانه­زنی نسبت به شاهد (35 درصد) مشاهده شد (شکل 2).

 

شکل2- تأثیر پیش­تیمارهای مختلفCold  (4 درجه سانتی­گراد)، GA3  (1/0میلی مولار)،KNO3  (1 میلی مولار) و آب مقطر استریل (کنترل) بر درصد جوانه­زنی بذر گیاه بارهنگ کبیر، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار ذکر گردید.

 

باتوجه به تأثیر بهتر سرما­دهی بر جوانه­زنی بذرها، برای آزمایش دوم، مجددا بذرها سرما دیدند و در معرض روشنایی نور روز (16 ساعت) و تاریکی کامل در محیط MS  قرارگرفتند و درصد جوانه­زنی به مدت دو هفته ثبت گردید.

 

شکل3- تأثیر نور و تاریکی بر جوانه­زنی بذر گیاه بارهنگ کبیر.(Plantago major) Cold  بذرهای سرما دیده و Control: گیاهان شاهد، Light: شرایط طول روز (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) وDark : شرایط تاریکی کامل، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری داده­ها می­باشد

 

 

یافته­ها به وضوح تأثیر بهتر روشنایی طول روز را بر جوانه­زنی و سرعت جوانه­زنی نشان می­دهند (شکل 3).

به منظور بهینه کردن روشی برای جوانه­زدن سریع و خارج از فصل، در آزمایش سوم بذرها ضدعفونی شده و با سرما تیمار شده و در محیط MS با غلظت­های مختلف نمک (1، ، و) کشت شدند. یافته­ها نشان داد که محیط ​​با درصد نمک بیشتر، جوانه­زنی و رشد سریعتری را نشان می­دهد، زیرا در هفته اول 50 درصد جوانه­زنی مربوط به محیط MS کامل و MS  بود و بعد از سه هفته، محیط MS کامل، جوانه زنی 80 درصد را نشان داد. کشت بذر در آب مقطر استریل و آگار نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و در هفته اول 54/11 درصد جوانه­زنی داشت که نسبت به محیط کامل MS کمتر بود و بعد از سه هفته جوانه­زنی 76/30 درصد را نشان داد که مشابه با محیط MS  بود (شکل 4).  

 

شکل4- تأثیر غلظت­های مختلف نمک محیط  MSبر جوانه­زنی بذر گیاه بارهنگ کبیر.(Plantago major) نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و برحسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید. حروف متفاوت نشاندهنده تفاوت آماری تیمارها می­باشند.

 

 

در نهایت شاخص نرخ جوانه زنی بذر بارهنگ کبیر برای پیش تیمارهای مختلف در آزمایش اول اندازه­گیری گردید (شکل5). آزمایش اول در این مطالعه نشاندهنده بهترین پیش تیمار بوده است و آزمایشات بعدی، آزمایشات تکمیلی برای برقراری شرایط بهینه می­باشند و هدف مطالعات بعدی نشان دادن سرعت جوانه­زنی بهتر در شرایط پیش تیمار سرما است از طرفی نیز آزمایشات تکمیلی نیازمند برقراری شرایط نور و تاریکی در بازه زمانی موردنظر هستند، لذا در صورت اندازه­گیری­های متناوب درصد جوانه­زنی، این شرایط در تیمار تاریکی مختل می­شدند، بنابراین شاخص نرخ جوانه­زنی برای پیش تیمار سرما اندازه­گیری گردید.

 

شکل5- نرخ جوانه زنی شاخص تیمسون اصلاح شده، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و برحسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید، حروف متفاوت نشاندهنده تفاوت آماری تیمارها می­باشند.

 

 

یافته­های کشت بافت گیاه بارهنگ کبیر در ترکیبات مختلف تنظیم کننده­های رشدی: پس از 2 یا 3 زیرکشت، کالوس­ها در اکثر ریزنمونه­­ها ظاهر شدند (شکل 6 و7). بیشترین درصد کالوس­زایی (100 درصد) در اکثر ترکیبات هورمونی مشاهده شد. با این حال در ریز نمونه برگی با غلظت­ هورمون TDZ (5/1 میلی­گرم برلیتر) در هر چهار سطح NAA  مقدار کالوس 100 درصد القاء شد. در ریزنمونه ساقه، القاء کالوس نمایان­تر بود به این صورت که در هورمون TDZ (3 میلی­گرم برلیتر) در تمام سطوح NAA و (5/1و 3 میلی­گرم برلیتر) در سطوح IAA ، کالوس­زایی 100 درصد مشاهده شد و در ریزنمونه ریشه، القاء کالوس در اکثر ترکیبات هورمونی رخ داد. چنانچه که در هورمونBAP   (5/1 و 2 میلی­گرم برلیتر) در سطوح NAA وBAP   (2 میلی­گرم برلیتر) و همچنین TDZ (3 میلی­گرم برلیتر) برای تمام سطوح IAA و (2 و 5/1 میلی­گرم برلیتر) در سطوحIBA  کالوس تشکیل شد. هورمون TDZ (5/1 و 3 میلی­گرم برلیتر) و BAP (5/1 و 2 میلی­گرم برلیتر)،  NAA (5/0 و 1 میلی­گرم برلیتر) ، IAA (1و 5/1میلی­گرم برلیتر) و IBA (5/1 میلی­گرم برلیتر) در ترکیب با هم کالوس­زایی بیشتری را القاء کرده­اند.

مشخصات ظاهری کالوس­ها نشان دهنده سن کالوس و قدرت باززایی آن­ها در محیط کشت می­باشد. کالوس­های زرد رنگ معمولاً نیاز به چند دوره زیرکشت در محیط حاوی سیتوکینین دارند. کالوس­هایی که در محیط حاوی اکسین به تنهایی و یا مقدار اکسین بیشتر شکل می­گیرند، تمایل بیشتری به تشکیل ریشه نشان دادند. بااین حال کالوس­های سبزرنگ از ریزنمونه­های مختلف معمولاً نیازی به زیرکشت نداشتند و پتانسیل تشکیل نوساقه در محیط کشت پایه MS حاوی غلظت­های مختلف سیتوکینین/اکسین خوبی را نشان دادند. در این مطالعه اکثر کالوس­های TDZ/IBA نیازی به زیرکشت نداشتند و کشت­های حاوی اکسین NAA معمولاً کالوس­های بزرگتری را تشکیل دادند (شکل 6). بدین­ترتیب ریزنمونه­های مختلف تحت تأثیر تنظیم­کننده­های رشدی متفاوت، میزان متفاوتی از کالوس­دهی را نشان دادند.

 

 

شکل6- کالوس­زایی ریزنمونه­ها با ترکیبات هورمونی مختلف، (A) کالوس درترکیب هورمونی ;BAP/NAA (B,C) ;BAP/IBA (D) ;BAP/IAA   (E) کالوس چهارهفته­ایBAP/NAA (F) BAP/IAA

 

 

باززایی از کالوس­ها پس از 2 هفته در هر سه ریزنمونه ظاهر شد و بیشترین درصد باززایی­ها (باززایی که حروف a را در آزمون مقایسه میانگین دانکن به خود اختصاص داده­اند) در هر ترکیب هورمونی سیتوکینین/ اکسین در جدول های 1، 2و 3 آورده شد.  در هر جدول بالاترین باززایی به همراه درصد شکل گیری کالوس مرتبط با آن و نوع باززایی از نوع مستقیم و یا غیرمستقیم و تعداد شاخه از هر ریزنمونه نیز ذکر شده است.

بالاترین فراوانی باززایی در ریزنمونه برگ (100 درصد) در محیط MS حاوی 5/0: 1؛ 1: 5/1؛ 2: 5/1 و 1: 2 میلی گرم برلیتر TDZ: IBA مشاهده گردید. میزان کمی از باززایی (2 درصد) در ترکیب 1: 5/0 میلی­گرم برلیتر IAA : BAP مشاهده شد (شکل8).

 

 

جدول 1- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه برگ در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوس­ و تعداد شاخه­زایی مرتبط با هر باززایی

تعداد جوانه در هر ریزنمونه

(عدد)

باززایی غیرمستقیم

(درصد)

باززایی مستقیم

(درصد)

باززایی

(درصد)

کالوس زایی

(درصد)

سیتوکینین/اکسین

(میلی گرم بر لیتر)

سیتوکینین

اکسین

2/6± 60/7

3/6± 33/53

8/3± 20/11

6/64 ±1/9

50± 5/2

5:0/1

BAP

none

3/3± 33/12

6/2± 83/45

3/33± 67/6

52±4/5

85±4/3

5/1:0

BAP

NAA

11±2/1

3/2± 67/16

33/8± 67/46

33/63 ±13/3

2/8± 67/46

1/1:0

BAP

IAA

2/6± 6/15

50/17

60±4/4

58±5/5

30±5/5

28±2/1

90±2/0

2/2± 86

5/3± 70

66± 8/4

2:1

5/2:0

BAP

IBA

-

-

-

-

-

-

TDZ

none

9±3/0

100±0/0

0/0±0/0

50±14/3

100±0/0

5:1/1

TDZ

NAA

3/3± 3/5

8/2± 14/27

50±5/3

14/77 ±2/4

50±5/1

5/1:0

TDZ

IAA

4/8± 2/17

3/8± 25/14

6/3± 05/22

6/2± 01/18

100±0/0

3/3± 33/73

5/2± 70

3/12± 5/67

0±0/0

3/6± 66/26

2± 30

5/7± 5/32

100±0/0

100±0/0

100±0/0

100±0/0

100±0/0

3/3± 33/73

80±4

5/5± 95/30

2:1

5:2/1

5:1/ 1

5/1:0

TDZ

IBA

نتایج بصورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند

 

جدول 2- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه ساقه در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوس­زایی و تعداد شاخه­زایی مرتبط با هر باززایی

تعداد جوانه در هر ریزنمونه (عدد)

باززایی غیرمستقیم

(درصد)

باززایی مستقیم

(درصد)

باززایی

(درصد)

کالوس زایی

(درصد)

سیتوکینین/اکسین

(میلی گرم بر لیتر)

سیتوکینین

اکسین

-

-

-

-

-

-

BAP

none

1/5± 25

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

5/2:0

BAP

NAA

32±2/2

70±10

0/0±0/0

70±6/4

100±0/0

5/5:1/1

BAP

IAA

4/2± 24

5/2± 5/26

6/1± 28

54±3/8

5/1±52

55±5/0

0/0±0/0

54±3/8

5/1±52

55±5/0

72±2

1/1± 94

70±3.3

2:2

5:1/1

5/5:0/1

BA

IBA

-

-

-

-

-

-

TDZ

none

1/3 15±

3/7± 25/81

0/0±0/0

8/10 ±25/81

100±0/0

1:1

TDZ

NAA

5/2± 5/7

32±3

0/0±0/0

32±4/2

100±0/0

1/3:0

TDZ

IAA

3/1± 37/27

14± 66/86

0/0±0/0

3/3 ± 66/86

95 ±2/5

5:1/1

TDZ

IBA

 

جدول 3- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه ریشه در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوس­زایی و تعداد شاخه­زایی مرتبط با هر باززایی

تعداد جوانه در هر ریزنمونه (عدد)

باززایی غیرمستقیم

(درصد)

باززایی مستقیم

(درصد)

باززایی

(درصد)

کالوس زایی

(درصد)

سیتوکینین/اکسین

(میلی گرم بر لیتر)

سیتوکینین

اکسین

14±6/0

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

5/1

BAP

none

21±5/7

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

1:5/1

BAP

NAA

8±2/4

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

0/0±0/0

1/5:0/1

BAP

IAA

6±2/1

100±0/0

0/0±0/0

50±0/15

4/5±50

100±0/0

5:1/1

1:1

BAP

IBA

-

-

  

-

-

-

TDZ

none

12±4/3

20±4

5/0± 5/5

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

2/0: 2

2/5:0/1

2/3:0

TDZ

NAA

10±2

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

5:1/1

TDZ

IAA

12±3/0

5/2±10

0/9±1

15±2/3

100±0/0

0/0±0/0

100±0/0

100±0/0

3:2

3:1

2:2

2:1

TDZ

IBA

نتایج بصورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند

شکل 7- کالوس­زایی و باززایی از ریزنمونه­های برگ، ساقه و ریشه بارهنگ کبیر.(Plantago major) (A-C) القاء کالوس و باززایی از کالوس در ریزنمونه برگ (غیرمستقیم) در غلظت 5/1:0 میلی گرم بر لیتر BAP:IAA  و  (D-E) باززایی مستقیم در غلظت 5/1میلی گرم بر لیتر BAP ، (F)  باززایی مستقیم در غلظت 1میلی­گرم بر لیتر BAP. (G-I) القاء کالوس از ریزنمونه ساقه و باززایی غیرمستقیم از کالوس در نمونه ساقه در غلظت 1/5:0/1 میلی­گرم بر لیترTDZ:IBA ،  (J-L) باززایی مستقیم از ساقه در غلظت 5:1/1 TDZ:IBA،(M, N) باززایی مستقیم ریشه در غلظت 1/5:0/1 میلی­گرم برلیتر BAP:IAA و (O) تشکیل کالوس و باززایی از ریشه در غلظت5:1/1 میلی­گرم برلیتر  TDZ:IBA

 

5/0: 2 میلی­گرم برلیتر BAP: NAA و 1: 5/0میلی­گرم برلیتر TDZ: NAA به ترتیب بیشترین (100 درصد) و کمترین باززایی (33/8 درصد) را در ریزنمونه ساقه نشان دادند (شکل 9). در ریزنمونه ریشه (100 درصد باززایی) در غلظت 5/1 میلی­گرم برلیتر BAP، 1: 5/1 BAP: NAA، 1/0: 5/1BAP: IAA ،2/0: 5/1 ؛2/0: 2 و 2/0 : 3 میلی­گرم برلیتر TDZ: NAA، 1: 5/1 TDZ: IAA و 2:1؛ 2:2؛ 1: 3؛ 2: 3 TDZ: IBA مشاهده گردید (شکل 10). فراوانی بالای تعداد شاخه­های باززا شده 67/ 41 و 22 در محیط حاوی 1:2 و 5:1/1 میلی­گرم برلیتر TDZ:IBA در ریزنمونه برگ و به ترتیب 27 و 20 تعداد شاخه در ترکیب 1:5/1 میلی­گرم برلیتر TDZ:IBA در ریزنمونه ساقه و 2/2:0 میلی گرم برلیتر TDZ:NAA در ریزنمونه ریشه بدست آمد.

 

 

شکل 8- درصد باززایی در ریزنمونه برگی بارهنگ کبیر.(Plantago major)  A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.

 

بعضی از گیاهچه­های باززا شده در محیط بدون هورمون، ریشه­دار شدند و نیازی به انتقال به محیط هورمون دار نداشتند با این حال گیاهچه­های بدون ریشه به محیط ریشه­زایی حاوی غلظت 5/0 میلی­گرم برلیتر IBA منتقل شدند (شکل11).

 

 

شکل 9- درصد باززایی در ریزنمونه ساقه بارهنگ کبیر.(Plantago major)  A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA ، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.

 

یک هفته بعد، گیاهچه­های ریشه­دار شده برای رشد بیشتر به محیط MS بدون هورمون انتقال یافتند و سپس گیاهچه­های رشدیافته با موفقیت در گلدان پس از دو هفته قرار گرفتند و با نرخ بقای 80 درصد در گلخانه سازگاری یافتند (شکل12).

 

 

 

 

شکل 10- درصد باززایی در ریزنمونه ریشه بارهنگ کبیر.(Plantago major)  A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.

 

 

بررسی مورفولوژی گیاهچه سازگار شده در شرایط درون شیشه­ای در مقایسه با گیاهان رشد یافته از بذور تیمار شده و گیاهان وحشی نشان داد که گیاهان بازایی شده جوانه­های جانبی بیشتری داشتند. گیاه وحشی دارای برگ­های عریض­تر و رگبرگ­های برجسته­تری است.

 

 

شکل11- مقایسه ریشه­زایی گیاه باززا شده در محیط ریشه­زایی، (A) باززایی مستقیم از ریزنمونه برگی، (B) ریزنمونه رشد یافته در محیط MS عاری از تنظیم کننده رشدی (PGRs) و محیط حاوی 5/0 میلی­گرم برلیتر IBA، (C) گیاهچه رشدیافته

 

شکل 12- مرحله سازگاری و انتقال گیاهچه­های باززاشده از محیط ریشه­زایی به گلدان A: گیاهان باززا شده رشد یافته در شرایط درون شیشه­ای، B: گیاهچه منتقل شده به گلدان و سازگار شده در شرایط اتاقک رشد (یک هفته) و گلخانه، C: گیاه وحشی رشد یافته از بذر در گلخانه و D: گیاه رشد یافته از بذر و تحت شرایط اپتیمم در شرایط درون شیشه­ای در اتاقک رشد.

 

نتایج ما نشان داد که بیشترین و معنی­دارترین (تفاوت در سطح 5 درصد) باززایی درترکیب TDZ: IBA برای هر سه ریزنمونه بدست آمد. به طورکلی، ریزنمونه ریشه نسبت به دو ریزنمونه برگ و ساقه باززایی کمتری را نشان می­دهد و همچنین بیشترین باززایی­ها از نوع غیرمستقیم بودند. ریزنمونه برگی بیشتر از دو ریزنمونه دیگر باززایی مستقیم را نشان داده است بطوری که در غلظت سیتوکینین 1 و 5/1 میلی­گرم برلیتر BAP باززایی مستقیم قابل توجهی مشاهده گردید (شکلD-F  7). تیمار ریزنمونه­ها با هورمون سیتوکینینBAP باززایی مستقیم بیشتری را موجب می­شود اما تیمار با سیتوکینین TDZ  باززایی بیشتر از نوع غیرمستقیم را نشان دادند.

بحث

بذر بارهنگ کبیر به دلیل اهمیت فراوان برای تحقیقات متعددی استفاده می­گردد و اغلب از کلکسیون­های خصوصی، باغ­های گیاه شناسی و موسسات تحقیقاتی جمع­آوری می­گردد، همچنین از گیاهان وحشی و یا از پرورش دهندگان متخصص خریداری می­شود (10). بنابراین، این بذرها ممکن است از جوانه­زنی پایینی برخوردار باشند که خود نیازمند روشی مناسب برای جوانه­زنی بذر و تکثیر در شرایط آزمایشگاهی هستند.

برخی از محققین  برای افزایش درصد جوانه­زنی بذر و به منظور شکستن خواب بذر از GA3 استفاده کرده­اند (13).Pons (1992) بیان کرد تأثیر پیش تیمار 10 میلی مولار KNO3 بر جوانه­زنی بذرهای بارهنگ کبیر در شرایط نور ناکافی، مفید بوده است (32). همچنین اثر این دو پیش تیمار بر جوانه­زنی بذرها آزمایش گردید و یافته­های مطالعه حاضر نشان داد که پیش تیمار با KNO3 باعث افزایش درصد جوانه­زنی در مقایسه با پیش تیمارGA3 شد. نتایج محققان نشان داده است که پیش تیمار بذرها در دمای 5 درجه سانتیگراد به مدت 7 تا 14 روز جوانه­زنی بارهنگ کبیر را افزایش می­دهد (29و 33) و همچنین سرمادهی بذرهای بارهنگ کبیر، جوانه زنی آن را بهبود بخشید (32). در مطالعه حاضر نیز، پیش تیمار سرما، میزان جوانه­زنی در هفته اول را 18 درصد افزایش داد، اما در شاهد هیچگونه درصد جوانه­زنی مشاهده نشد و همچنین بذرهای سرما دیده نسبت به سایر پیش تیمارها سرعت و درصد جوانه­زنی بالاتری داشتند. محققان بیان کردند که پیش تیمار با دمای پایین علاوه بر بهبود جوانه­زنی بذور، می­تواند القای ساقه و ریشه را نیز بر روی کشت­های کالوس افزایش دهد (11). یافته­های بسیاری از محققان نشان دادند که شرایط تاریکی برای جوانه­زنی بذر گیاه بارهنگ مهم است (38و 41) در حالی که در مطالعات دیگر، بیان شد که اکثر بذرهای بارهنگ در شرایط روشنایی طول روز نیز جوانه می­زنند و بذر­های بارهنگ کبیر در تاریکی جوانه نزده (4) و یا جوانه­زنی اندکی داشتند (5 درصد) (33) .همچنین در مطالعات دیگری گزارش شده است که نور جوانه­زنی بذرها را افزایش می­دهد (4). نتایج تحقیق فعلی، گزارش­های قبلی محققان درباره گونه بارهنگ کبیر را تأیید می­کند، زیرا مشاهده گردید که شرایط روشنایی طول روز (16 ساعت) برای جوانه­زنی گیاه مفیدتر بود و علاوه بر جوانه­زنی، رشد بهتر گیاه را به همراه داشت. محققان بسیاری از محیط­های مختلفی برای کشت­های درون شیشه­ای گونه­های بارهنگ استفاده کردند از جمله این محیط ها NT (31) وMS  (30) هستند (5). با این وجود استفاده از محیط MS ارجح است (24)، محیط MS معمولاً برای مراحل مختلف ریزازدیادی، از جمله القاء کالوس (6)، تکثیر ساقه­های جانبی (27) و القاء ریشه (10و 19) در مطالعات تغییر یافته است. دراین پژوهش محیط MS برای کشت این گیاه انتخاب گردید و برای بهینه ساختن شرایط تکثیر و جوانه­زدن بذرها، غلظت­های مختلفی از آن تهیه شد. یافته­ها بهتر بودن محیط کامل MS را نشان دادند. محققان تنظیم کننده­های رشدی مختلفی را به منظور القاء کالوس و ریشه­زایی در ریزنمونه­های برگ بارهنگ کبیر آزمایش کردند. بهترین نتیجه از تکثیر کالوس با (2 میلی­گرم برلیتر 2,4-D ، به همراه 5/0 میلی­گرم برلیتر Kin)، ساقه­زایی (5/0 میلی­گرم برلیتر IAA به همراه 1 میلی­گرم برلیتر  Kinو ریشه­زایی (2 میلی­گرم برلیتر IBA به همراه 1 میلی­گرم برلیتر NAA) بدست آمده است (34). محقق دیگری نیز از ریزنمونه­های برگ برای القاء کالوس و سپس تکثیر جوانه و تشکیل ریشه استفاده کرد و یافته­های بهینه با استفاده از 8/0 تا 2/1 میلی­گرم برلیتر NAA برای القاء کالوس و به همراه 5/3 تا 5/4 میلی­گرم برلیتر BAP بدست آمد (20). در مطالعه دیگر کالوس­های بارهنگ کبیر، برای تشکیل ریشه و ساقه­زایی بر روی محیط MS به همراه 1میلی­گرم برلیتر2,4-D  و 5/0 میلی­گرم برلیتر BAP زیرکشت شدند و سپس به محیط حاوی 5/0 میلی­گرم برلیترBAP منتقل شدند (26). ساقه­زایی و ریشه­زایی از کشت­های نوک ساقه بارهنگ کبیر بر روی محیطMS  تغییریافته به همراه 1/0 میلی گرم برلیتر BAP و سپس 18/0 میلی­گرم برلیتر NAA بدست آمد (28). پس از مطالعه نتایج سایر محققان، نتایج ارزشمندی حاصل گردید، که نشان می­دهد بارهنگ کبیر پتانسیل خوبی برای تکثیر در شرایط درون شیشه­ای دارد و می­تواند به طور مستقیم و غیرمستقیم اندام زایی کند. ریشه­زایی خوب نیز می­تواند به دلیل محتوای بالای تنظیم کننده­های رشدی درون زا باشد (7). نتایج سلیمانی و همکارانش (1398) نشان داد که القای اندام هوایی در Narcissus tazetta به مقادیر هورمون NAA وابسته نبوده ولی مقادیر هورمون BAP در القاء موثر بوده است (2). در پژوهش حاضر نیز مشاهده گردید که هورمونBAP  به تنهایی باعث ایجاد باززایی مستقیم در ریزنمونه­های برگی شده است. بنابراین با مقایسه ترکیبات تنظیم کننده­های رشدی آزمایش شده، بهترین و کارآمدترین ترکیب هورمونی مشخص گردید که باززایی سریع­تر و بهتری در این گیاه ایجاد شود. بنابراین، بسیاری از گیاهان باززا شده در مطالعه حاضر در محیط عاری از هورمون ریشه­دار شدند به جز در مورد تیمار با TDZ، همانطور که قبلاً بیان شده است که TDZ کاملاً از رشد ریشه جلوگیری می­کند (17). همچنین در مطاله­ای دیگر یافته­های محققان نشان دادند که تمام گیاهچه­های باززایی شده از ریزنمونه­های سنبل الطیب، به راحتی در محیط فاقد هورمون قادر به ریشه زایی بودند (1).

نتیجه گیری کلی

تحقیقات جامع به منظور بهبود جوانه­زنی و روشی بهینه برای القاء کالوس، اندام­زایی مستقیم و یا از طریق کالوس می­تواند راه گشای انجام مراحل پیشرو در روند تحقیقات درون شیشه­ای باشد. متابولیت­های ثانویه با ارزشی درP.major  وجود دارند که می توان با تولید انبوه از طریق ریزازدیادی، تولید و خالص­سازی گردند. این گیاه پتانسیل خوبی برای پاسخ به هورمون­های برون زا نشان داده است و برای تولید نوساقه­های فراوان و بازده زمانی کوتاه­تر میتوان از ترکیب TDZ/IBA نسبت به دیگر هورمون­های مورد مطالعه استفاده نمود. بنابراین در مطالعات پیشرو قصد داریم بصورت پیوسته روشی بهینه جهت تکثیر ریشه­های ترانسژن شده توسط اگروباکتریوم رایزوژنز و ازدیاد این متابولیت­های با ارزش و ارزیابی­های فیتوشیمیایی و دارویی در شرایط درون شیشه­ای و برون تنی ارائه نماییم.

سپاسگزاری

این مطالعه بخشی از پایان نامه دوره دکتری در دانشگاه زنجان است. همچنین نویسندگان مراتب قدردانی خود را از دانشکده داروسازی ، دانشگاه علوم پزشکی زنجان اعلام می دارند.

  1. پشم فروش، ن.، و احمدآبادی، م.، 1399. بهینه سازی کشت بافت و باززایی گیاه سنبل الطیب (Valeriana officinalis)، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد33، شماره 1، صفحات 166-156.
  2. سلیمانی، ح.، برنارد، ف.، و فاضلی نژاد، س.، 1398. ریزازدیادی گیاه نرگس(Narcissus tazetta L.) تحت تیمارهای هورمونی متفاوت و انتقال به خاک گیاهچه­ها، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 32، شماره 2، صفحات 389-379.

 

  1. Basri, D.F., Tan, L.S., Shafiei, Z. and Zin, N.M., 2012. In vitro antibacterial activity of galls of Quercus infectoria Olivier against oral pathogens. Evidence-Based. Complementary. Altern .Med, 2012:632796, doi:10.1155/2012/
  2. Blom, C.W.P.M., 1992.- Ecology of Plantago populations. Germination and establishment. In: Plantago: a multidisciplinary study., P.J.C., Kuiper & M. Bos (eds.), Ecological Studies, 89, Springer-Verlag, PP: 88-98.
  3. Bräutigam, M., and Franz, G., 1985. Versuche zur Gewebekultur von schleimbildenden pflanzlichen Geweben. Scientia Pharmaceutica, 53, PP: 237-46.
  4. Budzianowska, A., Skrzypczak, L., and Budzianowski, J., 2004. Phenylethanoid glucosides from in vitro propagated plants and callus cultures of Plantago lanceolata. Planta, medica, 70(09), PP: 834-40. doi:10.1055/s-2004-827232.
  5. Centeno, M., Rodríguez, A., Feito, I., and Fernández, B., 1996. Relationship between endogenous auxin and cytokinin levels and morphogenic responses inActinidia deliciosa tissue cultures, Plant, Cell, Rep. 16(1-2), PP: 58-62. doi:10.1007/BF01275450.
  6. Das Pal, M., and Raychaudhuri, S.S., 2001. Enhanced development of somatic embryos of Plantago ovata by additives. In Vitro. Cell. Dev. Bioly – Plant, 37(5), PP: 568-571. doi:10.1007/s11627-001-0099-6.
  7. Esmaeili, F., Shooshtari, L., Ghorbanpour, M., and Etminan, A., 2014. Assessment of somaclonal variation in Plantago major using molecular markers. , Journal of Biodiversity and Environmental Science, 5(4), PP: 402-408.
  8. Fons, F., Gargadennec, A., and Rapior, S., 2008. Culture of Plantago species as bioactive components resources: a 20-year review and recent applications, Acta. bot. gallica, 155(2), PP: 277-300. doi:10.1080/12538078.2008.10516109.
  9. George, E.F., 1993. Plant propagation by tissue culture. Netherlands:Springer, Part 1: The technology, 2ed., Exegetics limited, 1., doi: 10.1007/978-1-4020-5005-3.
  10. Haddadian, K., Haddadian, K., and Zahmatkash, M., 2014. A review of Plantago plant. Indian., J., Tradit. Know. 13(4), PP: 681- 685.
  11. Horner, J., and Bell, J., 1995. Evolution of fluoride tolerance in Plantago lanceolata. Sci. Total. Environt, 159(2-3), PP: 163-168. doi:10.1016/0048-9697(95)04318-U.
  12. Hossain, M.A., Konisho, K., Minami, M., and Nemoto, K., 2003. Somaclonal variation of regenerated plants in chili pepper (Capsicum annuum L.). .), Euphytica. 130(2), PP: 233-239. doi.org/10.1023/A:1022856725794.
  13. , 2010. International rules for seed testing. Basserdorf, Switzerland, (Handbook)
  14. Khademi, M., and Nazarian Firouzabadi, F., 2013. The influence of two types of hormones on appearance of shoot base explants in sugar beet (Beta vularis L.). Biotechnology in Agriculture, 12 p.
  15. Khawar, K., Sarhin, E., Sevimay, C., Cocu, S., Parmaksiz, I., Uranbey, S., Ipek, A., Kaya, M., Sancak, C., and Ozcan, S., 2005. Adventitious shoot regeneration and micropropagation of Plantago lanceolata L., Periodicum Biologorum, 107(1), PP: 113-116.
  16. Kobeasy, M.I., Abdel-Fatah, O.M., El-Salam, S.M.A., and Mohamed, Z.E.M., 2011. Biochemical studies on Plantago major, L., and Cyamopsis tetragonoloba L., Int., J., Biodivers, Conserv, 3(3), PP: 83-91.
  17. Kuksova, V.B., Pieven, N.M., and Gleba, Y.Y., Somaclonal variation and in vitro induced mutagenesis in grapevine. Plant Cell Tiss Org Cult, 49(1), PP: 17-27.
  18. Li, P., Chen, H., and Li, Y.X., 2005. Establishment and optimization of in vitro regeneration system for Plantago major Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 21(6), PP: 916–922.
  19. Li, Y., and Li, P., 2005. In vivo culture method of Plantago major, Patent written in Chinese CN1701657, 9 p.
  20. Mahato, S., and Mehta, A., 2015. Optimization Of in-Vitro Propagation Protocol for Plantago Ovata Forsk, The Journal of Indian Botanical Society, 94(3and4), PP: 245-251.
  21. Majd, A., Poor Mohammad, F., and Mirzaei, M., 2010. Study effects of some plant growth regulators on somatic embryogenesis and its histological stages in tomato (Lycopersicum esculentum ) var, Y. J., Plant Reasearches, 20 (4), PP: 49-56.
  22. Makowczyńska, J., and Andrzejewska-Golec, E., 2000. Somatic embryogenesis in in vitro culture of Plantago asiatica, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 69 (4), PP: 245-50.
  23. Makowczynska, J., and Andrzejewska-Golec, E., 2003. Micropropagation of Plantago asiatica L., through culture of shoot-tips. Acta SOC BOT POL, 72(3), doi.org/10.5586/asbp.2003.025 
  24. Mathur, J., Mukunthakumar, S., Gupta,N., and Mathur, S.N., 1991. Growth and morphogenesis of plant tissue cultures under mineral-oil. Plant Science, 74(2), PP: 249- 254, doi.org/10.1016/ 0168-9452(91)90053-B.
  25. Mederos, M.S., 1994. In vitro cultivation of stem apexes of Plantago major L. Proceedings das II Jornadas Ibericas de Plantas medicinais, Aromaticas e Oleos Essenciais, 1, PP: 107-10.
  26. Mederos, , Martin, C., Navarro, E., and Ayuso, M.J., 1997. Micropropagation of a medicinal plant, Plantago major L. Biologia, Plantarum, 40(3), PP: 465-468.
  27. Mook, J.H., Haeck, J., van der Toorn, J., van Tienderen, P.H., Blom, C.W.P.M., Woldendorp, J.W., Smit, A.J., Blacquière, T., and Troelstra, S.R., 1992. Ecology of Plantago Populations. In: Kuiper, P.J.C., Bos, M. (eds) Plantago: A Multidisciplinary Study. Ecological Studies, vol 89. Springer, Berlin, Heidelberg.
  28. Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15(3), PP: 473–
  29. Nagata, T., and Takebe, I., 1971. Plating of isolated tobacco mesophyll protoplasts on agar medium, Planta, 99(1), PP: 12-20.
  30. Pons, T., 1992. Seed germination of Plantago major ssp. major and Plantago lanceolata, Seed germination of Plantago major ssp, major and Plantago lanceolata, PP: 161-169.
  31. Sagar, G.R., and Harper, J.L., 1960. Factors affecting the germination and early establishment of plantains (Plantago lanceolata,, media and P., major), In: Biology of Weeds Symposium of the British Ecological Society, PP: 236-245.
  32. Saker, M.M., and Kawashity, S.A., 1998. Tissue culture and flavonoid content of Nepeta and Plantago species endemic in Egypt, Fitoterapia, 69(4), PP: 358-64.
  33. Samuelsen, A, 2000. The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. A., review., J., Ethnopharmacol, 71, PP: 1–21.
  34. Sarihan,O., Khawar, M.D., and Özcan, S., 2005. Prolific adventitious shoot regeneration from black psyllium (Plantago afra L.). .), Gen., Appl. Plant Physiol. , 31(1-2), PP: 81-87.
  35. Sarihan, E.O., Ipek, A., Khawar, K.M. and Gurbuz, B., 2005. Role of GA3 and KNO3 in improving the frequency of seed germination in Plantago lanceolata L, Pakistan Journal of Botany, 37(4), PP: 883-887.
  36. Siegel, B.Z., and Siegel, S.M., 1975. A selective role for potassium in the phytotoxicity of thallium. Bioinorg. Chem. 4(2), PP: 93-97. doi:10.1016/S0006-3061(00)81017-0.
  37. Van der Aart, P.J., Vulto, J.C., Soekarjo, R., and Damme, J., 1992. General biology of Plantago: Biogeography and human effects:5-6. In: Kuiper, P.J.C., Bos, M., (Eds.)., Plantago: a multidisciplinary study. Paris, Springer-Verlag Heidelberg, Ecological Studies, 1nd, 89p. doi: 10.1007/978-3-642-76392-2. 
  38. Velasco-Lezama, R., Tapia-Aguilar, R., Román-Ramos, R., Vega-Avila, E., Pérez- and Gutiérrez, M.A.S., 2006. Effect of Plantago major on cell proliferation in vitro. J., ethnopharmacol, 103, PP: 36-42.
  39. Wakhlu, A.K., Barna, K.S. 1989. Callus initiation growth and plant regeneration in Plantago ovata Forsk cultivar GI-2, Plant Cell Tiss Org Cult, 17 (3), PP: 235-242. doi.org/10.1007/BF00046870.
  40. Zakaria, M. S., Golzardi, F., and Vazan, S., 2014. Environmental maternal effects on drought and salinity tolerance of common plantain (Plantago major) at germination and seedling growth stage., Journal of Biodiversity and Enviromental Science, 5(2), PP: 578-585.
  • Zubair, M., 2012. Genetic variation, biochemical contents and wound healing activity of Plantago major. Diss. (sammanfattning/summary) Alnarp, Sweden: Sveriges lantbruksuniv., Acta Universitatis agriculturae Sueciae, 1652-6880, 20 p. [Doctoral thesis].
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 35, Issue 1
April 2022
Pages 189-205
  • Receive Date: 02 March 2020
  • Revise Date: 26 October 2020
  • Accept Date: 14 January 2021