تأثیر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید (SiO₂ NPs) بر میزان ترکیبات پلی فنولی و ظرفیت آنتی اکسیدانی ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک و کوتاه

احد هدایتی^1،2، بهمن حسینی^1*، رامین ملکی³ و خاویر پالازون⁴

¹ ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

² ایران، ارومیه، جهاد دانشگاهی آذربایجان غربی، گروه پژوهشی تولید متابولیت­های ثانویه در سامانه­های زیستی

³ ایران، ارومیه، جهاد دانشگاهی آذربایجان غربی،  گروه شیمی تجزیه

⁴ اسپانیا، بارسلونا، دانشگاه بارسلون، دانشکده داروسازی، گروه فیزیولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 12/03/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

نانوذرات به عنوان گروهی جدیدی از محرک­ها برای تولید متابولیت­های با ارزش استفاده می­شوند. در این مطالعه، تأثیر نانو ذرات سیلیسیم دی­اکسید بر برخی خصوصیات فیتوشیمیایی ریشه­های موئین دو گونه بذرالبنج مشبک
(Hyoscyamus reticulatus) و کوتاه (Hyoscyamus pusillus) مطالعه شد. ریشه­های موئین از تلقیح ریزنمونه­های کوتیلدون (در گونه مشبک) و برگ (در گونه کوتاه) با باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز تولید شد. سپس تأثیر غلظت­های مختلف نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید (0، 25، 50، 100 و 200 میلی­گرم بر لیتر) و مدت زمان تیمار (24 و 48 ساعت) بر میزان وزن تر، ظرفیت آنتی اکسیدانی و برخی ترکیبات پلی فنولی در ریشه­های موئین دو گونه بذرالبنج مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج نشان داد که حداکثر وزن تر (48/10 گرم) در ریشه­های موئین تیمار شده با 25 میلی­گرم بر لیتر محرک و مدت زمان تیمار 48 ساعت در گونه کوتاه بدست آمد. بیشترین میزان DPPH (05/18 درصد) و FRAP (mmol Fe⁺² g^-1 FW 26/6) به ترتیب در گونه مشبک تیمار شده با 25 و 200 میلی­گرم بر لیتر محرک و مدت زمان تیمار 48 و 24 ساعت مشاهده گردید. حداکثر میزان ترکیب با ارزش رزمارینیک اسید (02/9 میکرو گرم بر گرم وزن تر) در گونه مشبک تیمار شده با 25 میلی­گرم بر لیتر محرک و مدت زمان تیمار 48 ساعت مشاهده گردید، در حالی که این ترکیب در ریشه­های موئین گونه کوتاه شناسایی نگردید. نتایج مشخص کرد که نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید می­تواند به عنوان یک محرک جهت افزایش برخی ترکیبات پلی فنولی و ظرفیت آنتی اکسیدانی در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک و کوتاه استفاده شود.

واژه های کلیدی: بذرالبنج، ترکیبات پلی فنولی، ریشه موئین، محرک، نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید

* نویسنده مسئول، تلفن: 04432779558، پست الکترونیکی:   b.hosseini@urmia.ac.ir

مقدمه

جنس بذرالبنج یا بنگ دانه (Hyoscyamus) از تیره  Solanaceaeدارای 27 گونه بوده که 9 گونه آن منحصراً در ایران و 18 گونه در ایران و کشورهای اطراف پراکندگی دارند. گونه­های مختلف بذرالبنج، گیاهانی یکساله، دوساله و یا چندساله هستند که منابع غنی از آلکالوئیدهای تروپانی از جمله هیوسیامین و اسکوپولامین می­باشند. گونه بذرالبنج مشبک (H. reticulatus) گیاهی علفی و یکساله یا دوساله است که بومی مناطق خشک و نیمه خشک مصر، جنوب غرب آسیا، ایران و ترکیه است (7). گونه بذرالبنج کوتاه (H. pusillus L.) یکی دیگر از گونه­های این جنس و گیاهی یکساله و خاص تپه­های شنی، مزارع و مناطق بایر است. یکی از تفاوت­های این گونه با سایر گونه­ها، بالا بودن میزان اسکوپولامین نسبت به هیوسیامین در اندام­های این گیاه می­باشد و باتوجه به این­که تقاضای تجاری برای اسکوپولامین نسبت به هیوسیامین به­دلیل ارزش دارویی 10 برابر بیشتر است، این گونه می­تواند منبع مناسبی برای اسکوپولامین باشد (26). در سال­های گذشته علاوه بر تروپان آلکالوئیدها، متابولیت­های دیگری از جمله ساپونین­های استروئیدی، گلیکوزید­ها، لیگنان­ها، فلاونوئیدها و ترکیبات پلی فنولی (کوماریک اسید، گالیک اسید، کافئیک اسید، روتین و غیره) از گونه­های مختلف بذرالبنج استخراج و مورد بررسی قرار گرفته است (16). امروزه ارزش ضد اکسیداسیونی ترکیبات پلی­فنولی از جمله فلاونوئیدها بر کسی پوشیده نیست. این ترکیبات به دلیل نقشی که در زیست­شناسی سلول و سلامت انسان دارند مورد توجه زیادی هستند. روتین پایه تمامی بیوفلاونوئیدهاست و نقش مهمی در درمان دارد، به­عنوان مثال سبب کاهش درد و کاهش فشار چشم می­گردد (14). کلروژنیک­اسید یکی دیگر از ترکیبات فنولی مهم است که یک حد واسط بیوسنتزی مهم در سنتز لیگنین است و از خاصیت آنتی­اکسیدانی بالایی نیز برخوردار است. همچنین کلروژنیک­اسید و کافئیک­اسید دارای خاصیت ضددیابتی بوده و موجب کاهش قند خون می­گردند (4). کشت بافت گیاهی یکی از مهم‌‌ترین تکنیک‌‌ها در راستای تولید صنعتی متابولیت‌‌های ثانویه در گیاهان دارویی است، زیرا پتانسیل تولید متابولیت­های ثانویه توسط گیاهان در شرایط طبیعی از نظر کمیت و کیفیت ترکیبات بسیار محدود می‌‌باشد (35). بزرگ‌‌ترین چالش موجود در این زمینه، تولید متابولیت‌‌های مزبور در مرحله خاصی می­باشد و برخی از ترکیبات نیز تنها در سلول‌‌های تمایز‌‌یافته قابل سنتز و تجمع هستند. بنابراین در برخی موارد کشت‌‌های سلولی تمایز نیافته، توان بیوسنتزی فرآورده‌‌های ثانویه را از دست می‌‌دهند. باتوجه به نتایج بدست آمده از کشت بافت‌‌های تمایز یافته، بیشتر پژوهش‌‌ها بر کشت ریشه‌‌های موئین (Hairy Root Culture) تأکید دارند. ریشه موئین نوعی بیماری گیاهی است که توسط باکتری گرم منفی خاکزی آگروباکتریوم رایزوژنز ایجاد می‌‌گردد. ریشه‌‌های موئین دارای رشد سریع، تکثیر فراوان و عدم زمین گرایی در شرایط کشت فاقد تنظیم کننده رشد گیاهی می‌‌باشند. ویژگی‌‌هایی از قبیل ثبات بالا از نظر ژنتیکی و بیوسنتزی و نگه‌‌داری آسان، ریشه‌‌های موئین را به عنوان منبعی دائمی برای تولید متابولیت‌‌های ثانویه تبدیل کرده است (39). روش­های مختلفی به منظور افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی استفاده می­شود که یکی از آن­ها کاربرد محرک­ها (Elicitors) می­باشد. محرک­ها ترکیباتی با منشأ زیستی و غیرزیستی هستند که منجر به تغییرات فیزیولوژیکی و تجمع فیتوآلکسین شده و از طریق القاء پاسخ­های دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیت­های ثانویه می­شوند (46). عوامل مختلفی مثل نوع و غلظت محرک، سن کشت، زمان افزودن محرک به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض محرک قرار می­گیرد، بر افزایش تولید متابولیت­های ثانویه تأثیر می­گذارد (43). اخیراً، نانوذرات به عنوان نسل جدیدی از محرک‌‌های مؤثر، به­طور گسترده­ای در زمینه زیست­فناوری و به­منظور تحریک تولید متابولیت‌‌های ثانویه با ارزش از طریق القاء پاسخ‌‌های دفاعی، مورد استفاده قرار گرفته‌‌اند (9). نانوذرات سیلیسیم دی اکسید (SiO₂)، تیتانیوم دی اکسید ((TiO₂، اکسید روی (ZnO)، نقره  (Ag)و کبالت(Co)  به­طور گسترده‌‌ای در صنایع غذایی و کشاورزی کاربرد دارند (15)، نانو ذره سیلیسیم دی اکسید به­عنوان یک محرک غیرزیستی، دارای ویژگی‌‌های نوری، الکتریکی و کاتالیستی مطلوبی بوده و کاربردهای فراوانی در صنایع مختلف و همچنین کشاورزی دارد (21). تاکنون گزارشاتی مبنی بر تأثیر نانوذرات بر افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در گیاهان مختلف ارائه شده است. در مطالعه­ای تیمار ریشه­های موئین زرین گیاه (Dracocephalum kotschyi) با غلظت 100 میلی­گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید به مدت 48 ساعت، باعث افزایش تجمع رزمارینیک اسید 8 برابر بیشتر از ریشه­های موئین شاهد گردید. همچنین تولید ترکیبات پلی فنولی مثل گالیک اسید، کلروژنیک اسید و سینامیک اسید افزایش یافت (32). کاربرد محرک نانو اکسید آهن در ریشه‌های موئین گیاه بذرالبنج مشبک در غلظت‌‌های مختلف و زمان‌‌های مختلف تیمار مورد بررسی قرارگرفت. بالاترین میزان تولید هیوسیامین و اسکوپولامین در غلظت‌‌های 900 و 450 میلی‌‌گرم بر لیتر نانو اکسید آهن به‌‌ترتیب در زمان‌‌های 24 و 48 ساعت مشاهده گردید (27). در مطالعه‌‌ای که توسط Zhang و همکاران (45) صورت گرفت، بررسی اثر نانو ذرات Ag-SiO₂ در غلظت‌‌های مختلف به مدت سه روز بر ریشه‌های موئین گیاه درمنه(Artemisia annua L.)  نشان داد که کاربرد نانوذرات نقره منجر به القاء تنش اکسیداتیو و افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی در ریشه‌های موئین گردید. باتوجه به این که تولید سریع و بالای متابولیت­های ثانویه از طریق سنتز با روش­های شیمیایی عمدتاً پرهزینه، مشکل و یا غیرممکن می­باشد و نیز به دلیل اهمیت اقتصادی این متابولیت­ها و تولید اندک آن­ها در گیاهان دارویی، استفاده از راهکارهایی مثل کشت ریشه‌های موئین در بیوراکتور و استفاده از محرک­های زیستی و غیرزیستی می­تواند تولید این متابولیت­ها را بهبود بخشید. بنابراین، دراین پژوهش تأثیر محرک نانوذرات سیلیسیم دی اکسید بر فعالیت آنتی اکسیدانی و تولید ترکیبات پلی فنولی در ریشه­های موئین دو گونه بذرالبنج مشبک و کوتاه مورد مطالعه قرارگرفت.

مواد و روشها

کشت بذر، تهیه ریزنمونه و تلقیح با آگروباکتریوم: بذر گونه­های بذرالبنج مشبک و کوتاه از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه و در زیر هود لامینار توسط الکل اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه و محلول هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به مدت 10 دقیقه ضدعفونی سطحی گردید و جهت جوانه­زنی و تهیه ریزنمونه در محیط کشت پایهMS  (28) حاوی 7 گرم برلیتر آگار و دارای pH برابر 7/5 کشت گردید. بذرها در اتاق رشد با دمای2± 25 درجه سانتی­گراد و تحت شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار­گرفتند. به منظور تلقیح ریزنمونه­های گیاهی، دو هفته پس از جوانه­زنی و پس از انجام آزمایش­های انتخاب بهترین ریز نمونه، ریز نمونه کوتیلدونی (گونه مشبک) و برگی (گونه کوتاه) در زیر هود لامینار از گیاهچه­های مادری استریل جدا و داخل پتری دیش استریل قرارگرفتند. جهت تلقیح ریز نمونه­ها از سویه­های A7 (برای گونه مشبک) و A13 (برای گونه کوتاه) آگروباکتریوم رایزوژنز که از بانک میکروبی موسسه ملی مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی، تهران-ایران تهیه گردیده بودند استفاده شد. غلظت بهینه باکتری (OD₆₀₀) جهت تلقیح به میزان 5/0 الی 6/0 تعیین گردید. ریزنمونه­ها پس از ایجاد زخم سطحی توسط اسکالپل استریل در محل دمبرگ و پشت برگ، به مدت 10 دقیقه توسط سوسپانسیون باکتری تلقیح شدند و جهت هم­کشتی (Co-culture) در محیط کشت پایه MS فاقد هورمون به مدت 48 ساعت و در شرایط تاریکی قرار داده شدند. بعد از گذشت 48 ساعت هم­کشتی، ریزنمونه جهت حذف باکتری به محیط کشت پایه  MSحاوی 200 میلی­گرم بر لیتر آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند (32).

اثبات مولکولی ماهیت تراریختی ریشه­های موئین با واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR): به منظور تأیید حضور ژن  rol B آگروباکتریوم رایزوژنز، DNA ژنومی ریشه‌های موئین هر دو گونه به روش CTAB (Cetyl Trrimethyl Ammonium Bromide) استخراج گردید (18). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به منظور تأیید حضور ژن rol B در ریشه‌های موئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rol B انجام شد. شرایط دمایی مورد استفاده برای تکثیر ژن rol B شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه به مدت پنج دقیقه، 35 چرخه شامل دمای 94 درجه به مدت یک دقیقه، 60 درجه به مدت 80 ثانیه، 72 درجه به مدت 90 ثانیه و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه بود. محصول PCR در ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید. توالی آغازگرها که جهت تکثیر قطعات  bp780 ژن rolB  مورد استفاده قرارگرفت به صورت زیر بود:

F: 5´- TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3´

R: 5´- TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3´

تهیه غلظت­های مختلف محرک و تیمار ریشه­های موئین: نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید از شرکت پیشگامان نانو مواد ایرانیان (مشهد-ایران) تهیه شد. نانوذرات به­صورت بی­شکل و نامنظم (Amorphous) با اندازه 30-20 نانومتر بود. رنگ نانو ذرات سیلیکون سفید، مساحت سطح ویژه آن m² g^-1 600-180 و درصد خلوص این نانو ذره 99 درصد بود. غلظت­های مختلف نانو ذره سیلیسیم دی اکسید (0، 25، 50، 100 و 200 میلی­گرم بر لیتر) جهت تیمار ریشه­های موئین در محیط کشت MS تهیه گردید. یک گرم از ریشه‌های موئین هریک از گونه­ها به داخل ارلن مایرهای 250 میلی‌لیتری توری‌دار حاوی 15 میلی‌لیتر محیط کشت MS مایع در 3 تکرار، منتقل و داخل شیکر انکوباتور با 110 دور در دقیقه، دمای 25 درجه سانتی­گراد و در تاریکی نگه‌‌داری شدند. در روز 21 ام، محیط کشت MS مایع حاوی غلظت­های مختلف نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید به ارلن­ها اضافه گردید. پس از گذشت 24 و 48 ساعت از زمان تیمار، ریشه‌های موئین از محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف محرک نانو ذرات خارج و به محیط کشت MS مایع فاقد محرک انتقال یافتند. پس از گذشت یک هفته، عمل برداشت ریشه‌های موئین صورت گرفت و بعد از شستشو با آب مقطر و حذف رطوبت اضافی ریشه‌ها توسط کاغذ صافی، وزن تر اندازه‌گیری شد. همچنین ظرفیت آنتی اکسیدانی به دو روش DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) و FRAP (Ferric reducing antioxidant power) اندازه­گیری و در نهایت شناسایی ترکیبات پلی فنولی با آنالیز‌ HPLC انجام شد.

عصاره­گیری و اندازه­گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH و FRAP: جهت عصاره­گیری از روش حاجی مهدیپور و همکاران (13) استفاده شد. ابتدا 5/0 گرم از ریشه­های موئین گونه­های بذرالبنج مشبک و کوتاه داخل هاون توسط ازت مایع خرد شد، سپس 20 میلی­لیتر متانول 80 درصد به آن اضافه و 30 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک قرارگرفت. پس از آن عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه با دور 10000 در دمای 4 درجه سانتریفیوژ گردید و پس از گذراندن از کاغذ صافی جهت سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی مورد استفاده قرارگرفت. برای اندازه­گیری فعالیت آنتی­اکسیدانی به روش DPPH، مقدار مشخصی از عصاره متانولی هر نمونه را در یک لوله آزمایش ریخته و به آن 2000 میکرولیتر از محلول DPPH (004/0 گرم پودر DPPH در cc100 متانول80 درصد) اضافه شد و میزان جذب پس از 15 تا 30 دقیقه با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 517 نانومتر خوانده شده و با استفاده از فرمول زیر فعالیت آنتی­اکسیدانی تعیین گردید. جهت تهیه شاهد (Blank) نیز به روش بالا عمل و فقط به جای عصاره گیاهی، 50 میکرولیتر متانول 80 درصد اضافه شد (5).

DPPH (%) = [(AC-AS)/AC]×100

AC: میزان جذب بلنک

AS: میزان جذب نمونه

به منظور سنجش میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی ریشه­های موئین به روش  FRAP، مقدار مشخصی از هر عصاره با 3 میلی­لیتر از معرف تازه FRAP (25 میلی­لیتر بافر استات سدیم 300 میلی­مولار با اسیدیته 6/3، 5/2 میلی­لیتر محلول 10 میلی­مولار TPTZ (2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine) حلال در HCl 40 میل­مولار و 5/2 میلی­لیتر FeCl₃·6H₂O 20 میلی­مولار) باهم مخلوط شدند. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 37 درجه سانتی­گراد قرارگرفت و جذب آن در طول موج 593 نانومتر و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نسبت به شاهد خوانده شد. از سولفات آهن برای رسم منحنی استاندارد استفاده گردید و نتایج داده­ها براساس mmol Fe²⁺/g FW بیان شد (48).

استخراج ترکیبات پلی­فنولی و آنالیز به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC (High Performance Liquid Chramatography): جهت استخراج ترکیبات پلی­فنولی، 5/0 ‌‌گرم از ریشه‌‌های موئین فریز شده با ازت مایع خرد شده و بلافاصله 5 میلی­لیتر متانول 80 درصد به آن اضافه گردید. سپس مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه و در دمای °C 25 در دستگاه اولتراسونیک قرارگرفت. عصاره متانولی حاصل به مدت 10 دقیقه با 2000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و پس از گذراندن از فیلتر 22/0 میکرونی جهت آنالیز ترکیبات به دستگاه HPLC تزریق گردید. جداسازی، شناسایی و تعیین مقدار کمی ترکیبات پلی فنولی مورد مطالعه در این تحقیق با استفاده از دستگاه HPLC مدل سری 1100 ساخت کمپانی Agilent آمریکا مجهز به یک لوپ تزریق به حجم 20 میکرو­لیتر، پمپ گرادیانی چهار حلالی و آشکار ساز آرایه دیودی صورت گرفت. جداسازی بر روی ستون اکتا دسیل سیلان (به طول 25 سانتی­متر، قطر داخلی 6/4 میلی­متر و اندازه ذرات 5 میکرو‌‌متر (Shimadzu Kyoto, Japan)  انجام شد. منحنی استاندارد نیز براساس سطح زیر منحنی استاندارد تمام ترکیبات (محصولات شرکت سیگما) در غلظت‌‌های 5، 10، 25، 50، 100، 250 و 500 میلی‌‌گرم بر میلی‌‌لیتر رسم شد. سرعت جریان حلال 1 میلی‌‌لیتر بر دقیقه بود و فاز متحرک شامل استونیتریل و بافر استیک­اسید به نسبت‌‌های 10:80 بود. انتخاب طول موج مناسب یکی از نکات مهم در آنالیز ترکیبات می‌‌باشد و باتوجه به این‌‌که ترکیبات مورد آنالیز متفاوت بودند از طول موج‌‌های 250 نانومتر (رزمارینیک اسید)، 272 نانومتر (گالیک اسید)، 310 نانومتر (کافئیک اسید)، 320 نانومتر (کلروژنیک اسید)، 310 نانومتر (کوماریک اسید)، 272 نانومتر (سینامیک اسید)، 360 نانومتر (کوئرستین) و 310 نانومتر (روتین) استفاده شد (10).

آنالیز آماری داده ها: تمام آزمایش­ها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. داده‌های حاصل از آزمایشات در نرم افزار SAS 9.2 مورد تجزیه و تحلیل آماری قرارگرفتند. مقایسه میانگین داده‌ها براساس آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام گرفت و نمودارها با استفاده از نرم افزارExcel 2007  رسم گردید. همچنین همبستگی بین صفات مورد بررسی نیز با استفاده از نرم افزار R انجام گرفت.

نتایج

آنالیز PCR جهت تأیید حضور ژن rol B:  نتایج آنالیز الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد محصول واکنش زنجیره­ای پلی‌‌مراز برای ریشه های تراریخت احتمالی، حضور قطعه با اندازه حدودی  bp780 مربوط به ژن rol B در ریشه­های حاصل از هر دو گونه را تأیید نمود (شکل 1) که هم­اندازه قطعه تکثیر شده در نمونه کنترل مثبت (آگروباکتریوم مورد استفاده در تلقیح) بود. همچنین در DNA حاصل از ریشه‌‌های طبیعی دو گونه و محصول واکنش PCR بدون DNA الگو (به عنوان کنترل منفی)، هیچ باند تکثیری مشاهده نگردید. به عبارت دیگر، حضور باند قوی در منطقه bp 780 مؤید تکثیر قطعه مورد بررسی و حضور ژن rol B در ریشه­های موئین بود.

تأثیر تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر رشد ریشه­های موئین: در ریزنمونه­های کوتیلدونی گونه مشبک 15 روز و در ریزنمونه­های برگی گونه کوتاه 10 روز بعد از تلقیح، ریشه­های موئین از محل زخم ظاهر شدند (شکل 2). نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان وزن تر ریشه‌های موئین دو گونه بذرالبنج نشان داد که اثر متقابل غلظت و زمان تیمار تأثیر معنی‌‌داری بر میزان وزن تر ریشه‌‌های موئین هر دو گونه بذرالنج مشبک (در سطح احتمال 5 درصد) و کوتاه (در سطح احتمال 1 درصد) داشت (جدول 1). باتوجه به نتایج بیشترین میزان وزن تر (43/7 گرم) در گونه مشبک در تیمار 25 میلی‌‌گرم بر لیتر در مدت زمان تیمار 48 ساعت و کمترین میزان وزن تر (33/3 گرم) در تیمار 200 میلی‌‌گرم برلیتر در مدت زمان تیمار 48 ساعت مشاهده گردید.

شکل 1- الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد محصول واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز جهت تأیید حضور ژن rol B در ریشه‌های تراریخت: L: DNA مارکر (1 kb ladder Fermentas)، C⁺: باکتری آگروباکتریوم به عنوان کنترل مثبت، C^-1 و C^-2: ریشه‌های غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی، 1 و2 : ریشه‌های موئین القاء شده در گونه بذرالبنج مشبک، 3 و4 : ریشه‌های موئین القاء شده در گونه بذرالبنج کوتاه

شکل 2- مراحل مختلف رشد ریشه‌های موئین بذرالبنج گونه مشبک (1) و کوتاه :a .(2) ظهور ریشه‌های موئین از ریز نمونه‌های تلقیح یافته با آگروباکتریوم، :b رشد ریشه‌های موئین در محیط کشت جامد و c: کشت ریشه‌های موئین در محیط کشت مایع.

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان وزن تر و ظرفیت آنتی اکسیدانی ریشه‌‌های موئین بذرالبنج مشبک و کوتاه

**، * و ns به ترتیب نشان دهنده‌‌ی اختلاف معنی‌‌دار در سطح احتمال 1و 5 درصد و عدم وجود اختلاف معنی‌‌دار می‌‌باشد.

جدول 2- مقایسه میانگین اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان وزن تر ریشه‌‌های موئین بذرالبنج مشبک و کوتاه

              حروف مشابه نشان دهنده‌‌ی عدم اختلاف معنی‌‌دار در سطح احتمال 5 درصد (گونه مشبک) و 1 درصد (گونه کوتاه) در آزمون دانکن می‌‌باشد.

مشابه همین نتایج در گونه کوتاه نیز بیشترین میزان وزن تر (48/10 گرم) در تیمار 25 میلی‌‌گرم بر لیتر در مدت زمان تیمار 48 ساعت و کمترین میزان وزن تر (90/3 گرم) در تیمار 200 میلی‌‌گرم برلیتر در مدت زمان تیمار 48 ساعت مشاهده گردید (جدول 2).

تأثیر تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر ظرفیت آنتی­اکسیدانی (DPPH وFRAP) ریشه­های موئین: در مطالعه حاضر ظرفیت آنتی­اکسیدانی به وسیله دو روش DPPH و FRAP مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی ریشه‌‌های موئین دو گونه بذرالبنج در جدول 1 نشان داده شده است. باتوجه به نتایج، اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار بر ظرفیت آنتی­اکسیدانی به هر دو روش DPPH وFRAP در گونه مشبک در سطح احتمال 1 درصد و در گونه کوتاه در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود. همچنین نتایج مقایسه میانگین نشان داد که حداکثر ظرفیت آنتی­اکسیدانی در مهار رادیکال آزاد DPPH در گونه مشبک در غلظت 25 میلی‌‌گرم بر لیتر و مدت زمان تیمار 48 ساعت و به میزان 05/18 درصد و کمترین میزان هم در غلظت 200 میلی‌‌گرم برلیتر و مدت زمان تیمار 48 ساعت و به میزان 34/12 درصد بود (شکل a3). به طور کلی در گونه مشبک، در مدت زمان تیمار 48 ساعت با افزایش غلظت نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید ظرفیت آنتی­اکسیدانی کاهش یافته است. در گونه کوتاه، بیشترین میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی در مهار رادیکال آزاد  DPPH(78/17 درصد) در غلظت 200 میلی‌‌گرم بر لیتر و مدت زمان تیمار 48 ساعت و کمترین میزان (29/10 درصد) هم در غلظت 100 میلی‌‌گرم بر لیتر و مدت زمان تیمار 24 ساعت بدست آمد (شکل b3). در گونه مشبک بیشترین میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش FRAP در غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر و مدت زمان تیمار 24 ساعت و به میزان  mmol Fe⁺² g^-1 FW26/6 بود. کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی هم با مقدار  mmol Fe⁺² g^-1 FW7/0 در غلظت 200 میلی­گرم برلیتر و مدت زمان تیمار 48 ساعت مشاهده گردید (شکل a4). غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر به مدت 24 ساعت و تیمار شاهد به ترتیب بیشترین ( mmol Fe⁺² g^-1 FW92/3) و کمترین ( mmol Fe⁺² g^-1 FW69/0) میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی در ریشه­های موئین گونه کوتاه را نشان دادند (شکل b4). باتوجه به نتایج، در گونه کوتاه با افزایش غلظت و مدت زمان تیمار میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی افزایش یافت ولی در حالت کلی ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش FRAP ریشه­های موئین گونه بذرالبنج مشبک تقریباً دو برابر بیشتر از گونه کوتاه بود.

شکل 3- اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی به روش DPPH در ریشه‌‌های موئین بذرالبنج مشبک(a) و کوتاه (b). حروف مشابه نشان دهنده‌‌ی عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد (گونه مشبک) و 5 درصد (گونه کوتاه) در آزمون دانکن می‌‌باشد

تأثیر تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر ترکیبات پلی فنولی ریشه­های موئین: کروماتوگرام حاصل از تزریق نمونه­های استاندارد هریک از ترکیبات در شکل 5 آمده است. در گونه بذرالبنج مشبک، نتایج HPLC وجود ترکیبات پلی فنولی شامل گالیک اسید، کافئیک اسید، کلروژنیک اسید، کوماریک اسید، رزمارینیک اسید، سینامیک اسید، روتین، کوئرستین و آپی ژنین را نشان داد. همچنین باتوجه به نتایج تجزیه واریانس، اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید در مورد تمامی این ترکیبات در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود.

شکل 4- اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان ظرفیت آنتی­اکسیدانی روش FRAP در ریشه‌‌های موئین بذرالبنج مشبک(a) و کوتاه (b). حروف مشابه نشان دهنده‌‌ی عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد (گونه مشبک) و 5 درصد (گونه کوتاه) در آزمون دانکن می‌‌باشد

نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که بیشترین میزان گالیک اسید (33/16 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه‌‌های موئین تیمار شده توسط 25 میلی‌‌گرم بر لیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و در مدت زمان 24 ساعت حاصل گردید در حالیکه کمترین میزان این ترکیب (60/3 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه‌‌های موئین تیمار شده توسط 200 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و در مدت زمان 48 ساعت مشاهد شد. باتوجه به نتایج میزان گالیک اسید با افزایش غلظت و مدت زمان تیمار با محرک کاهش پیدا کرد.

میزان کافئیک اسید در ریشه‌‌های موئین، به­طور قابل توجهی متفاوت بود، بیشترین (49 میکروگرم بر گرم وزن تر) و کمترین (81/10 میکروگرم بر گرم وزن تر) میزان تجمع این ترکیب، به‌‌ترتیب در ریشه‌‌های موئین در تیمار 200 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید (زمان تیمار 24 ساعت) و شاهد مشاهده گردید که افزایش حدود پنج برابری را نشان می­دهد. بیشترین میزان ترکیبات کلروژنیک اسید (53/59 میکروگرم بر گرم وزن تر)، کوماریک اسید (44/130 میکروگرم بر گرم وزن تر) و روتین (52/10 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین تیمار شده با 200 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار 24 ساعت بدست آمد. در مورد ترکیب با ارزش رزمارینیک اسید، تیمار ریشه­های موئین با 25 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید به مدت 48 ساعت بیشترین میزان (02/9 میکروگرم بر گرم وزن تر) این ترکیب را تولید کرد. کمترین میزان (64/2 میکروگرم بر گرم وزن تر) رزمارینیک اسید نیز در ریشه­های موئین تیمار شده با 100 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار 24 ساعت بدست آمد. بیشترین میزان ترکیبات کوئرستین (60/42 میکروگرم بر گرم وزن تر)، سینامیک اسید (79/2 میکروگرم بر گرم وزن تر) و آپی ژنین (73/94 میکروگرم بر گرم وزن تر) به ترتیب در غلظت­های 50، صفر و 200 میلی­گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار 24 ساعت مشاهده گردید (جدول 3)

در مورد گونه بذرالبنج کوتاه، هشت ترکیب پلی فنولی شامل گالیک اسید، کافئیک اسید، کلروژنیک اسید، کوماریک اسید، سینامیک اسید، روتین، کوئرستین و آپی ژنین شناسایی گردید که مطابق نتایج تجزیه واریانس، اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید در مورد تمامی این ترکیبات در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود. براساس نتایج HPLC، در غلظت 100 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و در مدت زمان تیمار 24 ساعت، بیشترین میزان گالیک اسید (37/45 میکروگرم بر گرم وزن تر) بدست آمد که این مقدار 2/2 برابر بیشتر از میزان این ترکیب نسبت تیمار شاهد بود. بیشترین میزان کافئیک اسید (45/61 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه‌‌های موئین تیمار شده توسط 200 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و در مدت زمان 24 ساعت حاصل گردید در حالیکه کمترین میزان این ترکیب (54/40 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه‌‌های موئین تیمار شده توسط 100 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و در مدت زمان 24 ساعت مشاهد شد. در مورد کلروژنیک اسید، بیشترین میزان (65/20 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین شاهد و کمترین میزان (09/7 میکروگرم بر گرم وزن تر) در غلظت 200 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار 48 ساعت بدست آمد. همچنین براساس نتایج، در هر دو مدت زمان تیمار 24 و 48 ساعت با افزایش غلظت محرک میزان کلروژنیک اسید کاهش پیدا کرد. بیشترین میزان روتین (96/7 میکروگرم بر گرم وزن تر) و کوماریک اسید (22/58 میکروگرم بر گرم وزن تر) در ریشه­های موئین کشت شده در محیط کشت حاوی 25 میلی‌‌گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار 48 ساعت تولید گردید. بیشترین میزان ترکیبات کوئرستین (89/20 میکروگرم بر گرم وزن تر)، سینامیک اسید (07/5 میکروگرم بر گرم وزن تر) و آپی ژنین (78/42 میکروگرم بر گرم وزن تر) به ترتیب در غلظت­های 100، 25 و 200 میلی­گرم برلیتر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید و مدت زمان تیمار48، 24 و 24 ساعت مشاهده گردید (جدول 4).

شکل 5- کروماتوگرام پیک­های استاندارد حاصل از دستگاه HPLC ترکیبات پلی فنولی

همبستگی بین صفات مورد بررسی: آنالیز همبستگی بین صفات مورد بررسی در ریشه­های موئین دو گونه بذرالبنج مشبک و کوتاه با نرم افزار R انجام شد. همبستگی مثبت و منفی به ترتیب با رنگ­های آبی و قرمز نشان داده شده است. همچنین اندازه دایره­ها و شدت رنگ آن­ها نیز متناسب با ضرایب همبستگی می­باشد. نتایج نشان داد که در گونه مشبک، بین کافئیک اسید با کوماریک اسید، روتین و آپی ژنین همبستگی بالایی وجود دارد. همچنین بین روتین با کوماریک اسید و آپی ژنین همبستگی بالایی بدست آمد. بین ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP با اکثر پلی فنول­ها از جمله رزمارینیک اسید، گالیک اسید، سینامیک اسید و کوئرستین همبستگی مثبت بالایی مشاهده گردید. هر دو روش سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی (FRAP و DPPH) نیز همبستگی مثبتی باهم نشان دادند.

جدول 3- مقایسه میانگین اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر ترکیبات پلی فنولی در ریشه‌‌های موئین بذرالبنج مشبک

حروف مشابه نشان دهنده‌‌ی عدم اختلاف معنی‌‌دار در سطح احتمال 1 درصد در آزمون دانکن می‌‌باشد.

جدول 4- مقایسه میانگین اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر ترکیبات پلی فنولی در ریشه‌‌های موئین بذرالبنج کوتاه

حروف مشابه نشان دهنده‌‌ی عدم اختلاف معنی‌‌دار در سطح احتمال 1 درصد در آزمون دانکن می‌‌باشد. ND: عدم شناسایی (Not Detect)

در مورد گونه کوتاه، همبستگی مثبت بالایی بین FRAP و DPPH مشاهده شد. همچنین بین گالیک اسید و سایر ترکیبات پلی فنولی مانند سینامیک اسید، کوماریک اسید، کلروژنیک اسید و کوئرستین همبستگی مثبتی وجود داشت (شکل 6).

شکل 6- آنالیز همبستگی بین صفات مورد بررسی در ریشه­های موئین گونه­های بذرالبنج مشبک (a) و کوتاه (b) تیمار شده با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید

بحث و نتیجه­گیری

سیلیسیم دومین عنصر فراوان در سطح زمین است که بیش از 41 درصد پوسته زمین را تشکیل می‌‌دهد. عنصر سیلیسیم به دلیل اثرات حفاظتی و ایجاد استحکام ساختاری در گیاهان، بر میزان رشد آن‌‌ها بسیار مؤثر و مفید می‌‌باشد (47). دراین پژوهش بیشترین میزان وزن تر در هر دو گونه در تیمار 25 میلی‌‌گرم برلیتر و مدت زمان 48 ساعت بدست آمد و با افزایش غلظت محرک، میزان رشد ریشه­های موئین کاهش پیدا کرد. مطالعات در خصوص کاربرد نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید در گیاهان محدود می‌‌باشد. تیمار گیاهچه فلفل (Capsicum frutescens) توسط 60 پی پی ام نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید سبب افزایش میزان رشد گردید (8). حقیقی و پسرکلی (2013) (10)، اثر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید را در گیاه گوجه فرنگی(Solanum lycopersicum L.)  و در مرحله رشد اولیه مورد بررسی قرار دادند. با کاربرد نانو سیلیسیم دی اکسید، وزن تر و خشک گیاه و حجم ریشه افزایش پیدا کرد.Suriyaprabha  و همکاران (2012) (40)، پاسخ‌‌های رشدی و فیزیولوژیکی ذرت (Zea mays L.) به کاربرد نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید را مورد بررسی قرار دادند. نتایج حاصل از تحقیق آن‌‌ها نشان داد که، پاسخ‌‌های رشدی با افزایش غلظت نانو سیلیسیم دی اکسید بیشتر تحت تأثیر قرارگرفت و نانوذرات سیلیسیم دی اکسید در مقایسه با سیلیسیم تأثیرات مثبت بیشتری بر ویژگی‌‌های رشدی و فیزیولوژیکی ذرت نشان داد. نانو سیلیسیم دی اکسید به عنوان یک محرک غیرزیستی، تحریک­کننده رشد در گیاهان شناخته شده است (8). اگرچه سیلیسیم از دیدگاه تغذیه گیاه به‌‌عنوان عنصر ضروری شناخته نشده است، لیکن اثرات مثبت آن بر رشد و بهبود مقاومت گیاهان در تنش‌‌های مختلف زیستی و غیرزیستی اثبات شده است (25). در مطالعات دیگر گزارش شده است که نانوذرات سیلیسیم دی اکسید در غلظت های بالا، منجر به کاهش مقاومت غشاء و نیز تخریب تمامیت غشاء سلولی شده و در نتیجه کاهش وزن در گیاه را به دنبال دارد که با نتایج این پژوهش که در غلظت­های بالای محرک وزن تر کاهش یافت مطابقت دارد (24). همچنین گزارش شده است که غلظت­های بالای محرک با ایجاد تنش­های شدید، با آسیب به غشای سلولی و یا لیز شدن سلولی منجر به کاهش و عدم رشد و همچنین کاهش متابیولیسم سلولی می­شود (1).

فعالیت آنتی­اکسیدانی وابسته به ساختارهای شیمیایی ترکیبات است که به آن­ها اجازه می­دهد به عنوان عوامل احیاء کننده عمل کنند.DPPH  یک رادیکال آزاد ناپایدار است که در حضور ترکیبات آنتی­اکسیدان، می تواند یک الکترون و یا یک اتم هیدروژن بپذیرد تا به یک مولکول بسیار پایدار DPPH  تبدیل گردد (31). در روش FRAP فعالیت آنتی­اکسیدانی از طریق پتانسل کاهش اکسیداسیون مورد ارزیابی قرارگرفته است. در این روش ترکیبات آنتی­اکسیدانی با Ferric tri-pyridyl-triazine complex (Fe (III)-TPTZ) واکنش می­دهند و موجب ایجاد رنگ آبی می­شوند (11). نانو ذره سیلیسیم دی اکسید، یک نانو ذره شناخته شده با کاربردهای زیست­پزشکی فراوان است که اثرات ناشی از القاء تنش اکسیداتیو توسط آن، در بسیاری از مطالعات گزارش شده است (33و 42). نانو ذره سیلیسیم دی اکسید از طریق رهاسازی یون‌‌های فلزی و یا رادیکال‌‌های آزاد به داخل محیط کشت، باعث ایجاد تنش اکسیداتیو داخل سلولی می‌‌گردد. به‌‌نظر می‌‌رسد که کاهش آسیب اکسیداتیو از طریق تغییر در میزان فعالیت آنزیم‌‌های دفاعی و متابولیت‌‌ها و همچنین تغییرات در میزان تعرق و افزایش فعالیت متابولیسم آنتی­اکسیدانی نقش مهمی در کاهش تنش غیرزیستی القاء شده توسط سیلیسیم ایفاء می‌‌کند (3و 21). دراین تحقیق بیشترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH در گونه مشبک و در غلظت 25 میلی­گرم بر لیتر و در گونه کوتاه در غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر محرک مشاهده گردید. از نتایج این گونه استنباط می­شود که در گونه مشبک با افزایش غلظت محرک ظرفیت آنتی اکسیدانی کاهش ولی در گونه کوتاه ظرفیت آنتی اکسیدانی افزایش می­یابد. در حالی که از نظر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP در هر دو گونه بیشترین میزان در علظت 200 میلی­گرم برلیتر محرک مشاهده گردید. مکانیسم عمل نانوذرات بسیار گسترده است و سمیت آن‌‌ها ممکن است به دلیل اندازه سطح نانوذرات باشد که در تماس با مولکول‌‌های زیستی موجب انجام واکنش می‌‌شود (37). گزارش شده است که زمان افزودن محرک و مدت زمانی که سلول‌‌ها در معرض محرک قرار دارند از فاکتورهای مؤثر در تولید متابولیت‌‌ها بوده و دسترسی به حداکثر میزان متابولیت بسته به غلظت و نوع محرک متفاوت است (29). نتایج سایر مطالعات نشان داد که، غلظت محرک نقش مهمی در فرایند تهیج دارد و غلظت مؤثر هر محرک به گونه گیاهی مورد نظر بستگی دارد. بنابراین ممکن است غلظتی از محرک، دارای اثرات تحریک­کنندگی بر روی تولید ترکیبات فعال در برخی از گونه‌‌های گیاهی و یا بدون هیچ اثر مؤثر در گونه‌‌ای دیگر باشد (20). مطابق نتایج حاصل از این تحقیق، در ریشه­های موئین زرین گیاه تیمار شده با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید، حداکثر ظرفیت آنتی­اکسیدانی در مهار رادیکال آزاد DPPH در غلظت 200 میلی‌‌گرم بر لیتر و مدت زمان تیمار 24 ساعت و به میزان 47/35 درصد بود. همچنین بیشترین میزان ظرفیت آنتی‌‌اکسیدانی از طریق قدرت احیاء کنندگی آهن (FRAP) نیز در غلظت 200 میلی‌‌گرم برلیتر و مدت زمان تیمار 24 ساعت و به میزان 37/23 میلی‌‌مول آهن II بر گرم وزن تر بود (30). ظرفیت آنتی­اکسیدانی در گیاهان دارویی عمدتأ به­دلیل حضور ترکیبات فنولی در این گیاهان بوده و رابطه قوی بین ظرفیت آنتی­اکسیدانی و تولید ترکیبات فنولی در کشت‌‌های درون شیشه‌‌ای مشاهده شده است (19و 41).

ترکیبات فنولی رایج­ترین و وسیع­ترین گروه از ترکیبات دفاعی بررسی شده در گیاهان هستند. این ترکیبات طی مسیری که به مسیر فنیل پروپانوئید معروف است سنتز می­شوند. برخی از این متابولیت­های ثانویه مانند پلی­فنول­ها، دارای ساختمان شیمیایی مناسب برای پاک­کردن رادیکال­های آزاد بوده و به­عنوان آنتی­اکسیدان­های گیاهی شناخته می­شوند (44). گزارشات بسیار زیادی، القاء انباشتگی ترکیبات پلی فنولی و فعالیت پراکسیدازها در گیاهان تیمار شده با غلظت بالای عناصر را نشان می­دهند (17). انجام مطالعات جهت شناسایی غلظت‌‌های بهینه نانو ذرات، به­طوریکه دارای تأثیر مثبت بر میزان رشد و تولید متابولیت‌‌های ثانویه و حداقل اثرات منفی بر روی گیاه باشند، بسیار ضروری می‌‌باشد. استفاده از محرک غیرزیستی نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید باعث افزایش میزان ترکیبات پلی فنولی در ریشه­های موئین هر دو گونه گردید. در گونه مشبک، مدت زمان تیمار 24 ساعت بیشترین افزایش را در میزان گالیک اسید، کافئیک اسید، کلروژنیک اسید، کوماریک اسید، روتین، کوئرستین و آپی ژنین باعث شد. در گونه کوتاه مدت زمان تیمار 24 ساعت حداکثر میزان گالیک اسید، کافئیک اسید، سینامیک اسید و آپی­ژنین را تولید کرد در حالی که میزان کوماریک اسید، روتین و کوئرستین در زمان تیمار 48 ساعت بیشترین میزان را نشان داد. یکی از تفاوت­های آشکار بین این دو گونه، وجود رزمارینیک اسید به عنوان ترکیب فنولی با ارزش در ریشه­های موئین گونه مشبک تیمار شده با محرک نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بود که در ریشه­های موئین گونه کوتاه شناسایی نگردید. در کل می­توان گفت که استفاده از محرک غیرزیستی نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید موجب افزایش متابولیت­های ثانویه در گونه­های بذرالبنج مشبک و کوتاه گردید و گونه مشبک افزایش بیشتری نسبت به گونه کوتاه در تولید این ترکیبات نشان داد.

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که سیستم کشت ریشه‌‌های موئین و همچنین تیمار با نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید، می‌‌تواند به عنوان روشی جایگزین به منظور تولید پلی فنول­ها به عنوان ترکیبات فعال مهم در گیاه، در نظر گرفته شود. ترکیبات فنولی گروهی از آنتی‌‌اکسیدان‌‌ها با خواص مهار­کننده تنش اکسیداتیو به‌‌شمار می‌‌روند (15). تحریک‌‌زایی سلول‌‌ها و اندام‌‌های گیاهی منجر به فعال­شدن ژن‌‌های کلیدی مربوط به مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدی و تجمع ترکیبات فنولی می‌‌گردد (41). اثرات مثبت سیلسیوم در مقاومت به تنش، با نقش آن در افزایش فعالیت پمپ‌‌های پروتونیH+-ATPase  (موجود در غشاء سلولی) و H+-PPase (موجود در تونوپلاست)، جذب بیشتر یون پتاسیم، افزایش غلظت داخل سلول، جذب و نگه­داری آب، تأثیر بر فعالیت برخی آنزیم‌‌­ها و فرایندهای فیزیولوژیکی در ارتباط می­باشد (23). باتوجه به اثرات فتوکاتالیستی نانو ذرات به­عنوان نسل جدید محرک‌‌ها، چنین به نظر می‌‌رسد که ترکیبات فنولی به عنوان متابولیت‌‌های ثانویه در نتیجه شرایط تنش، در سلول‌‌های گیاهی تولید می‌‌شوند. متابولیسم ترکیبات فنولی به­عنوان ترکیبات محافظتی به شدت تحت تأثیر شرایط محیطی و عوامل تنش­زا می‌‌باشد (34). انتقال T-DNAی باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز به ریشه­های موئین گونه­های بذرالبنج نیز ممکن است در مسیر سنتز ترکیبات پلی­فنولی اختلال ایجاد کرده و میزان تولید این ترکیبات را تحت تأثیر قرار دهد (2).

رزمارینیک اسید به­عنوان مهمترین ترکیب پلی‌‌فنولی در گیاهان، به دلیل خواص آنتی­اکسیدانی، ضد باکتریایی و ضد ویروسی خود، دارای کاربردهای فراوانی در صنایع داروسازی می‌‌باشد (22). این ترکیب بر خلاف ریشه­های موئین گونه مشبک، در گونه کوتاه شناسایی نگردید و این می­تواند به دلیل تفاوت در پاسخ گونه­های مختلف یک جنس به انواع محرک­های خارجی و مقابله با تنش­ها با تولید متابولیت­های ثانویه باشد. متفاوت بودن پروفایل شیمیایی گونه­های مخالف یک جنس در دیگر گیاهان نیز به اثبات رسیده است و امروزه از این تفاوت­ها در دانش شیمیو تاکسنومی برای مطالعه فیلوژنی و روابط خویشاوندی بین گیاهان استفاده می­شود (38). گزارشات در خصوص تأثیر کاربرد نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید بر میزان تولید ترکیبات پلی فنولی در کشت ریشه‌‌های موئین محدود می‌‌باشد. در یک مطالعه­ای بر روی ریشه­های موئین زرین گیاه، نتایج نشان داد که استفاده از محرک نانو سیلیسیم دی اکسید باعث افزایش قابل توجه تولید ترکیباتی مثل رزمارینیک اسید، گالیک اسید، کافئیک اسید، کوماریک اسید و کوئرستین گردید (32 و 36). افزایش در میزان برخی پلی فنول‌‌ها (گالیک اسید، کافئیک اسید، فرولیک اسید، کوماریک اسید، روتین، کلروژنیک اسید، کوئرستین و سینامیک اسید) در کشت ریشه‌‌های موئین گیاه دارویی کارلا (Momordica charantia) تحت تأثیر تیمار با جاسمونیک اسید و سالیسیلیک اسید در مقایسه با کشت‌‌های شاهد، گزارش گردیده است (6) که نتایج بدست آمده از این پژوهش در زمینه تولید ترکیبات پلی­فنولی تحت تأثیر تیمار با محرک با گزارشات قبلی مطابقت داشت. در کل باتوجه به نتایج پژوهش حاضر می­توان گفت که استفاده از غلظت­های پایین نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید در مدت زمان تیمار 48 ساعت باعث افزایش رشد ریشه­های موئین به­ویژه در گونه کوتاه گردید. همچنین، کاربرد نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید ظرفیت آنتی اکسیدانی در گونه مشبک را بیشتر از گونه کوتاه افزایش داد. نتایج آنالیز HPLC نیز نشان داد که تحت تأثیر نانو ذرات سیلیسیم دی اکسید تولید ترکیباتی مثل کافئیک اسید، روتین، کلروژنیک اسید و رزمارینیک اسید در گونه مشبک افزایش قابل توجهی داشتند در حالی که در گونه کوتاه ترکیباتی مثل گالیک اسید، کوماریک اسید و آپی ژنین به صورت چشمگیر بیشتر شده و رزمارینیک اسید شناسایی نگردید. آنالیز همبستگی بین صفات مورد بررسی نشان داد که بین ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP با اکثر پلی فنول­ها از جمله رزمارینیک اسید، گالیک اسید، سینامیک اسید و کوئرستین در ریشه­های موئین گونه مشبک همبستگی بالایی وجود دارد و بالا بودن میزان FRAP در این گونه نسبت به گونه کوتاه می­تواند همین مسئله باشد.

سپاسگزاری

بدین وسیله نویسندگان مقاله حاضر از کارشناسان آزمایشگاه‌های گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه و کارشناسان بخش آنالیز جهاد دانشگاهی واحد آذربایجان غربی جهت همکاری صمیمانه تشکر و امتنان را دارند. همچنین از تمام افرادی که در انجام این پژوهش ما را یاری و راهنمایی نمودند سپاسگزاری می‍شود.