Factors affecting hairy roots induction efficiency via Agrobacterium rhizogenes and evaluation of Valerenic acid production in the hairy root culture of medicinal plant Valeriana officinalis L.

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Mohaghegh Ardabili

2 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran

Abstract

Hairy root cultures due to the their higheir genetic and biological stability, high growth rate and rapid growth on hormone-free medium are an effective alternative method for production of secondary metabolites. In this research, the effects of different factors including type of Agrobacterium rhizogenes strain (A4, 15834 and 2656), type of explants (leaf and petiole), inoculation conditions (inoculation time (10 and 15 minutes), co-cultivation time (48 and 72 hours), use and non-use of asetosyringone) and salts concentration of medium (MS and 1/2MS) on induction of hairy roots in valerian were investigated. Among the Agrobacterium strains, the highest percentage of hairy root induction and the number of roots per explant was obtained using A4 strain. Also, the percentage of hairy root induction and the number of roots per explant in the leaf explant were significantly higher than those of petiole explant. Among the different inoculation conditions, the highest percentage of hairy root induction was obtained in 10 minutes inoculation and 72 hours of co-cultivation and the highest number of roots per explant was obtained in 10 minutes inoculation and 72 hours co-cultivation in medium containing 100 μM asetosyringone. Also, the percentage and number of roots per explant on ½ salt concentration of MS medium were significantly higher than those of MS medium. The HPLC results showed that valerenic acid is produced at 3.77 mg/l in V. officinalis hairy root cultures.

Keywords

Main Subjects

عوامل مؤثر بر کارایی اگروباکتریوم رایزوژنز در القای ریشه‌های مویین تراریخت و ارزیابی تولید والرنیک اسید در ریشه‌مویین گیاه دارویی سنبل‌الطیب

(Valeriana officinalis L.)

ناصر زارع*، ویدا مدنی، اصلان جمالی گله‌شیخان و رسول اصغری زکریا

ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 07/04/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

کشت ریشه‌های مویین به دلیل پایداری ژنتیکی و بیولوژیکی بالا و قابلیت رشد سریع و تولید متابولیت‌های ثانویه در زمان کوتاه و بدون نیاز به هورمون‌های گیاهی، راهکار مؤثری را برای تولید متابولیت های ثانویه گیاهی فراهم نموده است. دراین تحقیق تأثیر عوامل مختلف شامل نوع سویه اگروباکتریوم (شاملA4 ، 15834 و 2656)، نوع ریزنمونه (برگ و دمبرگ)، شرایط تلقیح (مدت زمان تلقیح (10 و 15 دقیقه) و هم‌کشتی (48 و 72 ساعت) و حضور و عدم حضور استوسرینگون) و همچنین غلظت ترکیبات معدنی محیط‌کشت ( MS و  MS2/1) در القاء و تولید ریشه­های مویین سنبل‌الطیب مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج نشان داد در بین سویه­های باکتری، سویه A4 بیشترین درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه مویین در هر ریزنمونه را داشت. همچنین ریزنمونه برگ نیز در مقایسه با ریزنمونه دمبرگ درصد ریشه‌زایی و تعداد ریشه در هر ریزنمونه بیشتری را دارا بود. ارزیابی شرایط تلقیح مختلف نشان داد که بیشترین درصد ریشه‌زایی مویین در تیمار 10 دقیقه تلقیح ریزنمونه و 72 ساعت هم­کشتی و بیشترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه نیز در تیمار 10 دقیقه تلقیح ریزنمونه و 72 ساعت هم­کشتی به همراه 100 میکرومولار استوسرینگون بدست آمد. همچنین، محیط کشتMS 2/1 از نظر درصد و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه در مقایسه با محیط کشت MS از کارایی بالاتری برخوردار بود. نتایج HPLC نشان داد که والرنیک اسید با مقدار 77/3 میلی‌گرم برلیتر در کشت‌های ریشه‌مویین سنبل‌الطیب تولید و تجمع می‌یابد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در تولید ریشه‌های مویین و افزایش زیست توده کلی ریشه‌های مویین گیاه سنبل‌الطیب جهت بالا بردن میزان متابولیت‌های دارویی با ارزش، نوع سویه آگروباکتریوم رایزوژنز، نوع ریزنمونه و بهینه‌سازی شرایط کشت از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. بهترین ترکیب‌های تیماری برای تولید ریشه‌مویین سنبل‌الطیب شامل 10 دقیقه تلقیح و 72 ساعت هم‌کشتی ریزنمونه برگ  با سویه A4 آگروباکتریوم و محیط کشتMS 2/1 بود.

واژه های کلیدی: سویه اگروباکتریوم، گیاه دارویی، متابولیت ثانویه، نوع ریزنمونه، L.   Valeriana officinalis

* نویسنده مسئول، تلفن:  04533510140  ،  پست الکترونیکی:  nzare@uma.ac.ir

مقدمه

 

گیاه دارویی سنبل‌الطیب با نام علمی Valeriana officinalis L. در پزشکی به عنوان مسکن، آرام‌بخش، خواب‌آور، درمان اسپاسم، هیجان، میگرن و روماتیسم کاربرد دارد (8). مطالعات آزمایشگاهی نشان داده که اثر آرام‌بخشی سنبل‌الطیب مربوط به روغن فرار و ترکیبات والپوتریات آن است. هم‌چنین مشخص شده است که والرنال و اسید والرنیک از قوی‌ترین ترکیبات آرام بخش موجود در گیاه سنبل‌الطیب هستند. مقدار این ترکیبات در ریشه‌ها زیاد و در اندام‌های هوایی کم هستند (36 و 42).

یکی از بخش‌های مهم زیست‌فناوری، کشت سلول، بافت و اندام گیاهی است که کاربردهای آن در زمینه گیاهان دارویی، از جنبه‌های مختلفی از جمله تولید ریشه‌مویین قابل بررسی است. ریشه‌های مویین دارای ویژگی‌هایی چون سرعت رشد بالا در محیط فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی، انشعابات فرعی فراوان، پایداری ژنتیکی و بیوسنتزی بوده و در مقایسه با ریشه‌های معمولی گیاه، در برخی مواقع سطح بالاتری از متابولیت‌های ثانویه را تولید می‌کنند. بنابراین، می‌توان از آن‌ها به عنوان منبع مداومی برای تولید متابولیت‌های ثانویه با اهمیت، در بیوراکتور برای تولید نیمه صنعتی و صنعتی استفاده کرد (18، 20 و 30). ریشه‌های مویین از طریق تراریختی سلول‌های گیاهی با اگروباکتریوم رایزوژنز تولید می‌شوند (11). عوامل متعددی تراریختی سلول‌های گیاه به واسطه اگروباکتریوم رایزوژنز و تولید ریشه‌های مویین را تحت تأثیر قرار می‌دهند که از مهمترین این عوامل می‌توان به ژنوتیپ، زخمی شدن بافت گیاهی، سنتز القاکننده‌های فنولی توسط گیاه، سویه اگروباکتریوم، نوع ریزنمونه و شرایط تلقیح و هم‌کشتی اشاره کرد (26). در طبیعت اگروباکتریوم اساساً به بافت­های زخمی حمله می­کند، بافت زخمی ترکیباتی از جمله فنول­ها (نظیر استوسیرینگون و آلفا هیدروکسی استوسیرینگون) و قندها را ترشح می­کند و شرایطی از جمله pH پایین را ایجاد می­کند که این شرایط یک محیط مناسب برای باکتری بوده و بیان ژن­های vir را القاء می­کند (43). در شرایط آزمایشگاهی از روش‌های مختلفی برای القای ریشه‌های مویین استفاده می‌شود. به عبارت دیگر تماس بین سلول‌های گیاهی و باکتری به‌وسیله تزریق مستقیم سوسپانسیون باکتری به داخل گیاهچه یا توسط غوطه‌ورسازی بافت‌های گیاهی در سوسپانسیون باکتری امکان‌پذیر است (39). انتقال T-DNA از A. rhizogenes به ژنوم گیاهی فرایند پیچیده­ای است که تحت تأثیر عوامل مختلفی نظیر سویه باکتری (13 و 17)، نوع و سن ریزنمونه گیاهی (25) و دوره هم کشتی (7) قرار می‌گیرد. دلیل این پدیده را می‌توان در قالب اثرات متقابل گیاه-پاتوژن بررسی کرد. Bandyopadhyay و همکاران (6) نشان دادند که الحاق T-DNA به داخل ژنوم گیاه می­تواند مرتبط با نوع سویه باکتریایی و تعداد نسخه­های انتقال یافته باشد که این امر بر رشد و متابولیسم ثانویه ریشه­های مویین تراریخته اثر می­گذارد. Granicher و همکاران (19) برای اولین بار موفق به تولید ریشه مویین در گیاه Valeriana sambucifolia  شدند. Pirian و همکاران (35) تراریختی ریزنمونه­های مختلف برگ، ساقه و ریشه گیاه Portulaca oleracea با استفاده از اگروباکتریوم رایزوژنز را مورد بررسی قرار داده و گزارش کردند که ریزنمونه­های برگ همراه با دمبرگ در مقایسه با سایر ریزنمونه­ها بیشترین درصد تراریختی را نشان دادند. اگروباکتریوم اساساً به بافت­های زخمی حمله می­کند، بافت زخمی ترکیباتی از جمله فنول­ها (نظیر استوسیرینگون و آلفا هیدروکسی استوسیرینگون) و ترکیبات قندی را ترشح می­کند و شرایطی از جمله pH پایین را ایجاد می­کند که این شرایط باعث تحریک سیستم‌ بیماری‌زایی اگروباکتریوم و القاء بیان ژن­های vir می‌شود (43). به‌عبارت دیگر، استوسیرینگون و مشتقات آن باعث افزایش قدرت تراریختی اگروباکتریوم از طریق افزایش بیان ژن­های vir در پلاسمید باکتری می­گردند (20). 

باتوجه به اهمیت متابولیت‌های ثانویه موجود در ریشه‌ گیاه دارویی سنبل‌الطیب و در معرض خطر قرارگرفتن این گیاه به خاطر برداشت بی‌رویه ریشه آن از رویشگاه‌های طبیعی، استفاده از روش‌ها و رهیافت‌های بیوتکنولوژی برای تولید متابولیت‌های ثانویه این گیاه از اهمیت بالایی برخوردار است. همچنین، با ارزیابی میزان پاسخ‌دهی سنبل‌الطیب به آلودگی با سویه‌های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز و میزان پاسخ‌دهی به ریزنمونه‌ ها و شرایط کشت مختلف می‌توان از آن به‌عنوان یک گیاه بالقوه برای انتقال ژن و مهندسی ژنتیک در جهت افزایش متابولیت‌های ثانویه با استفاده از محرک‌های زیستی و غیرزیستی نیز بهره برد. به‌طوری‌که بهینه‌سازی هریک از عوامل موثر در القاء و رشد ریشه‌های مویین ممکن است افزایش بازده تولید ترکیبات دارویی را از طریق کشت ریشه‌های مویین گیاه سنبل‌الطیب به دنبال داشته باشد. لذا، در این پژوهش امکان تولید ریشه‌های مویین از گیاه Valeriana officinalis L. به کمک سویه­های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز، تأثیر عوامل مختلف (مدت زمان تلقیح، مدت زمان هم کشتی، نوع ریزنمونه، سویه باکتری و نوع محیط کشت) مؤثر در اثر متقابل بین سلول باکتری و سلول گیاهی بر تولید ریشه‌های مویین، همچنین تکثیر ریشه‌های مویین در محیط کشت مایع و میزان تولید والرنیک اسید در این ریشه‌ها مورد ارزیابی قرارگرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی و تهیه ریزنمونه‌ها: بذور سنبل­الطیب ازشرکت پاکان بذر (اصفهان، ایران) تهیه شدند. بذور پس از شستشو با آب مقطر به­مدت چند دقیقه، ابتدا در اتانول 70 درصد به­مدت 30 ثانیه غوطه­ور شدند و پس از شستشو با آب مقطر استریل به­مدت 15 دقیقه با هیپوکلریت سدیم دو درصد تیمار شدند. سپس بذرهای ضدعفونی­شده سه بار و هربار به­مدت 5 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو داده شده و آب اضافی با کاغذ صافی استریل حذف گردید. بذور ضدعفونی شده در ظروف شیشه­ای حاوی محیط کشت MS جامد کشت شده و در اتاقک رشد با شرایط دمایی0C  2±25 و دوره نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی با نور فلورسنت نگهداری شدند. بعد از جوانه‌زنی بذور و رشد گیاهچه‌ها (هفته سوم تا چهارم کشت)، ریز نمونه­های برگ و دمبرگ سنبل­الطیب در قطعاتی به اندازه 2-1 سانتی­متر به­وسیله اسکالپل تیز و استریل در زیر هود لامینار تهیه گردید و به منظور تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز مورد استفاده قرارگرفتند.

سویه باکتری و تلقیح ریزنمونه‌ها: سویه‌های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز شاملA4 ، 15834 و 2656 به منظور القای ریشه‌های مویین در گیاه دارویی سنبل‌الطیب مورد استفاده قرارگرفتند. به­منظور کشت سویه‌های باکتری از محیط کشت جامد MYA به همراه 50 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک ریفامپسین (برای جلوگیری از رشد باکتری‌های دیگر و صرفا رشد باکتری مورد نظر) استفاده گردید. یک کلونی از سویه باکتری به 10 میلی­لیتر محیط کشت  MYAمایع حاوی 50 میلی‌گرم برلیتر ریفامپسین منتقل گردیده و به­صورت شبانه در 0C 28 و 120 دور در دقیقه رشد داده شدند. سپس حدود یک میلی‌لیتر از کشت شبانه باکتری به 50 میلی‌لیتر محیط کشت MYA مایع تازه حاوی 50 میلی‌گرم بر لیتر ریفامپیسین اضافه گردید و در دمای 28 درجه سانتی­گراد تا رسیدن به OD 600 برابر با 8/0-6/0 رشد داده شدند. برای اندازه‌گیری OD 600 ، مقدار یک میلی‌لیتر از باکتری رشد داده شده در دستگاه اسپکتروفتومتر(BIORAD, SmartspecTM plus- ساخت کشور آمریکا) قرارداده شد و تغییرات جذب در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. از محیط کشت بدون باکتری به‌عنوان بلانک استفاده شد. از این سوسپانسیون باکتری برای تلقیح ریزنمونه­های گیاهی استفاده شد. سپس ریزنمونه­های تهیه­شده در سوسپانسیون باکتری و در حضور و عدم حضور استوسرینگون (100 میکرومولار) به مدت زمان 10 و 15 دقیقه غوطه­ور شدند و پس از حذف باکتری اضافی با کاغذ صافی استریل، روی محیط کشت MS فاقد هورمون‌های گیاهی و آنتی‌بیوتیک به مدت 48 و 72 ساعت و در دمای 2±25 درجه سانتی­گراد در تاریکی هم‌کشت شدند. پس از سپری شدن مدت زمان هم‌کشتی، ریزنمونه‌ها به محیط کشت جامد MS وMS 2/1 بدون هورمون و حاوی 500 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم (جهت جلوگیری از رشد آگروباکتریوم) منتقل شدند. زیرکشت ریزنمونه­ها با فواصل یک هفته­ای انجام شد (2 و 31). لازم به ذکر است ریزنمونه­های تیمار شده با محیط کشت بدون باکتری به عنوان شاهد در نظر گرفته شد.

آنالیز مولکولی ریشه‌ها از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): استخراج DNA ژنومی ریشه­های تراریخت احتمالی با استفاده از روش CTAB، با اندکی تغییرات طبق روشDoyle  و Doyle (16) انجام گرفت. به­منظور اثبات مولکولی ماهیت تراریختی ریشه­های مویین از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگر اختصاصی ژن rolB (آغازگر رفت با توالی5’-gctcttgcagtgctagattt-3’ و آغازگر برگشت با توالی5’-gaaggtgcaagctacctctc-3’) و ژن rolC (آغازگر رفت با توالی 5’-ctcctgacatcaaactcgtc-3’ و آغازگر برگشت با توالی(5’-tgcttcgagttatgggtaca-3’ استفاده شد. محصولات PCR پس از الکتروفورز روی ژل آگارز 1درصد، با استفاده از دستگاه ژل‌داک مورد مشاهده و بررسی قرار گرفتند.

عوامل مورد بررسی در تلقیح ریزنمونه‌های سنبل‌الطیب با اگروباکتریوم رایزوژنز: در این پژوهش تأثیر نوع سویه (A4، 15834 و 2656) اگروباکتریوم رایزوژنز، نوع ریزنمونه (برگ و دمبرگ)، نوع محیط کشت (MS وMS 2/1) و شرایط آلوده‌سازی شامل سه تیمار استوسرینگون (صفر و 100 میکرومولار)، مدت زمان تلقیح (10 و 15 دقیقه) و مدت زمان هم‌کشتی (48 و 72 ساعت) بر القای ریشه‌های مویین مورد ارزیابی قرار گرفت (جدول1). سه هفته بعد از تلقیح ریزنمونه‌ها، درصد ریشه‌زایی مویین (رابطه1) و هم‌چنین تعداد ریشه‌های مویین در هر ریزنمونه ثبت گردید. 

= درصد ریشه‌زایی (رابطه 1)

اندازه‌گیری میزان والرنیک اسید ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب با استفاده از HPLC: پس از رشد ریشه­های مویین به اندازه یک تا سه سانتی‌متر روی محیط جامد، ریشه‌ها از ریزنمونه جدا شده و به محیط کشت MS مایع منتقل شدند. ریشه­ها هر دو هفته یک بار زیرکشت شدند و برای استخراج متابولیت‌های ثانویه مورد استفاده قرار گرفتند. به منظور استخراج متابولیت‌های ثانویه حدود 5/0 گرم از ریشه‌های مویین در داخل ازت مایع پودر گردید و سپس درون یک فالکون 50 میلی‌لیتری، 10 میلی‌لیتر متانول به آن اضافه شده و دو نوبت به­مدت 40 دقیقه درون حمام اولتراسوند قرار داده شد. محلول حاصل با سیستم فیلتراسیون شیشه­ای (سینتر­دگلس) و فیلتر 2/0 میکرو­متری فیلتر شد، سپس در دمای 40 درجه سانتی‌گراد تا زمان خشک شدن عصاره در دستگاه آون نگهداری شد و در نهایت با 500 میکرولیتر متانول رقیق گردید. عصاره حاصل برای تزریق به دستگاه HPLC استفاده شد (29). دراین تحقیق برای اندازه‌گیری والرنیک اسید از سیستم Agilent HPLC (1200 series, Diode array detector) استفاده گردید. 10 میکرولیتر از عصاره سلولی به ستون C-18 فاز معکوس Agilent طول 15 سانتی‌متر و قطر 6/4 میلی‌متر پر شده با ذراتی به قطر 5 میکرومتر (Eclipse XDB-C18, 5 µm, 4.6 × 150 mm) تزریق گردید. فاز متحرک شامل آب با 3/0 درصد فسفریک اسید و متانول با 3/0 درصد فسفریک اسید بود که با سرعت جریان  ml/min   1از ستون عبور می‌کرد. اﺑﺘﺪا دﻳﺘﻜﺘﻮر­ UV ﺑﻪ ﻣﺪت 15دﻗﻴﻘﻪ ﮔﺮم ﺷﺪ و ﻗﺒﻞ از ﺗﺰرﻳﻖ ﻧﻤﻮﻧﻪ، ﻓﺎز ﻣﺘﺤﺮک ﺑﻪ ﻣﺪت 20 دﻗﻴﻘﻪ در ﺷﺮاﻳﻂ آزﻣﺎﻳﺶ از ﺳﺘﻮن ﺟﺪاﺳﺎزی ﻋﺒﻮر داده ﺷﺪ. ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﺳﺮﻧﮓ 10 میکرولیتر از عصاره ﺑﻪ دﺳﺘﮕﺎه ﺗﺰرﻳﻖ گردید. جذب نوری خروجی ستون در طول موج 225 نانومتر اندازه­گیری شد. سنجش کمی با استفاده از منحنی استاندارد والرنیک اسید انجام گرفت (29). اندازه‌گیری میزان والرنیک اسید در سه تکرار انجام شد.

آنالیز آماری: طرح آزمایشی مورد استفاده در این تحقیق به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار و حداقل 12 ریزنمونه در هر تکرار انجام گرفت.

 

جدول1 – شرایط آلوده‌سازی  مختلف، سویه‌های آگروباکتریوم رایزوژنز و محیط کشت مورد بررسی در تلقیح ریزنمونه­های گیاه سنبل­الطیب با اگروباکتریوم رایزوژنز

تیمار  تلقیح

استوسرینگون (میکرومولار)

زمان تلقیح (دقیقه)

زمان هم‌کشتی (ساعت)

سویه باکتری

محیط کشت

T1

0

10

48

A4

2/1 MS

T1

0

10

48

A4

MS

T1

0

10

48

15834

2/1 MS

T1

0

10

48

15834

MS

T1

0

10

48

2656

2/1 MS

T1

0

10

48

2656

MS

T2

0

10

72

A4

2/1 MS

T2

0

10

72

A4

MS

T2

0

10

72

15834

2/1 MS

T2

0

10

72

15834

MS

T2

0

10

72

2656

2/1 MS

T2

0

10

72

2656

MS

T3

0

15

48

A4

2/1 MS

T3

0

15

48

A4

MS

T3

0

15

48

15834

2/1 MS

T3

0

15

48

15834

MS

T3

0

15

48

2656

2/1 MS

T3

0

15

48

2656

MS

T4

0

15

72

A4

2/1 MS

T4

0

15

72

A4

MS

T4

0

15

72

15834

2/1 MS

T4

0

15

72

15834

MS

T4

0

15

72

2656

2/1 MS

T4

0

15

72

2656

MS

T5

100

10

48

A4

2/1 MS

T5

100

10

48

A4

MS

T5

100

10

48

15834

2/1 MS

T5

100

10

48

15834

MS

T5

100

10

48

2656

2/1 MS

T5

100

10

48

2656

MS

T6

100

10

72

A4

2/1 MS

T6

100

10

72

A4

MS

T6

100

10

72

15834

2/1 MS

T6

100

10

72

15834

MS

T6

100

10

72

2656

2/1 MS

T6

100

10

72

2656

MS

T7

100

15

48

A4

2/1 MS

T7

100

15

48

A4

MS

T7

100

15

48

15834

2/1 MS

T7

100

15

48

15834

MS

T7

100

15

48

2656

2/1 MS

T7

100

15

48

2656

MS

T8

100

15

72

A4

2/1 MS

T8

100

15

72

A4

MS

T8

100

15

72

15834

2/1 MS

T8

100

15

72

15834

MS

T8

100

15

72

2656

2/1 MS

T8

100

15

72

2656

MS

                                                                                                                                     

 

فاکتورهای مورد بررسی شامل نوع سویه آگروباکتریوم، نوع ریزنمونه، شرایط تلقیح و نوع محیط کشت بود. محاسبات آماری و تجزیه واریانس با استفاده از نرم‌افزار SPSS ver. 23 و مقایسه میانگین‌ها نیز با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت. مقایسات گروهی با استفاده از نرم‌افزار MSTATC انجام شد. نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel رسم گردید.

نتایج

اثر عوامل مختلف مؤثر بر القای ریشه‌ مویین: بعد از گذشت دو تا سه هفته از تلقیح ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ گیاه سنبل‌الطیب با سویه‌های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز، ریشه‌های مویین ظاهر گردید (شکل1). نمونه­هایی از ریشه­های مویین تولید و تکثیر یافته در محیط­ کشت­های جامد و مایع در شکل‌های 2 و 3 آورده شده است. ریشه‌زایی سویه 2656 در هر دو ریزنمونه برگ و دمبرگ بسیار کم و بیش از نیمی از داده‌های مربوطه صفر بود، بنابراین، در تجزیه و تحلیل نهایی داده‌ها از این سویه صرف نظر گردید.

 

 

 

 

شکل1- القای ریشه‌مویین در گیاه سنبل‌الطیب با استفاده از سویه‌های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز در ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ در محیط MS2/1  و تحت شرایط تیمار T6، A و B (سویه 15834)، C و D (سویه A4)،  EوF (سویه 2656)

 

 

 

شکل 2- اثر محیط­های­ کشت MS و MS2/1 بر ریشه‌زایی برگ و دمبرگ با سویه A4 و تحت شرایط تیمار T6، شکل­های A، B، C و D: ریشه­های مویین تولید شده روی محیط MS2/1، شکل­های E، F، G و H: ریشه­های مویین تولید شده روی محیط MS

 

شکل 3- A) انتقال ریشه­های مویین سنبل‌الطیب به شیشه‌های حاوی محیط کشت MS 2/1 و MS مایع و نگهداری آن­ها روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی­گراد، B) رشد کامل ریشه­های مویین سنبل‌الطیب در محیط کشت  MS2/1مایع

 

درصد القای ریشه مویین و تعداد ریشه مویین در هر ریزنمونه تحت تأثیر نوع سویه‌ اگروباکتریوم، نوع ریزنمونه، شرایط تلقیح و اثرات متقابل بین آنها قرارگرفت. ارزیابی ترکیب تیماری نوع سویه و شرایط تلقیح نشان داد که سویه A4 در تمامی سطوح شرایط تلقیح از نظر درصد و تعداد ریشه‌مویین در هر دو ریزنمونه برگ و دمبرگ مؤثرتر از سویه 15834 بود. بطوری‌که سویه A4 در سطح تیمار T2 (تلقیح به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 16/74 درصد بیشترین درصد ریشه‌مویین و سویه 15834 در سطح تیمار T1 (تلقیح به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 48 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 15/3 درصد کمترین درصد ریشه‌مویین را داشت. درصد ریشه‌مویین و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه حاصل از سویه اگروباکتریوم 15834 در تمامی سطوح شرایط تلقیح از نظر آماری یکسان بوده ولی برای سویه A4 درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه در هر ریزنمونه از سطحی به سطح دیگر متفاوت بود (شکل های 4 و 5). همانطوریکه در شکل‌های 4 و 5 مشاهده می‌شود در سویه A4 استفاده از استوسرینگون باعث افزایش تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه و درصد ریشه‌زایی مویین (به غیر از تیمار تلقیح  T6برای درصد ریشه‌زایی موئین) نسبت به شرایط عدم استفاده از استوسرینگون شده است. ولی استوسرینگون در کارایی تراریختی توسط سویه 15834 تأثیر معنی‌داری نداشته است.

 

 

شکل 4- میانگین درصد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب­های تیماری متفاوت سویه  اگروباکتریوم و شرایط تلقیح؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

شکل 5- میانگین تعداد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب­های تیماری سویه اگروباکتریوم و شرایط تلقیح؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

در مورد صفت تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، سویه A4 در سطح تیمار T6 (تلقیح به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط 100 میکرومولار استوسرینگون) با میانگین 75/9 بیشترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، و سویه 15834 در سطح تیمار T4 (تلقیح به مدت 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 35/0 کمترین تعداد ریشه‌مویین را داشت (شکل 5).

ارزیابی ترکیب تیماری سویه اگروباکتریوم و نوع محیط کشت نشان داد که بیشترین درصد و تعداد ریشه‌مویین متعلق به سویه A4 به ترتیب با میانگین %71/51 (در محیط کشت MS2/1) و 53/5 عدد (در محیط کشت MS2/1)، و کمترین درصد و تعداد ریشه‌مویین متعلق به سویه 15834 به ترتیب با میانگین %6/3 و 43/0 عدد در محیط کشت MS است (شکل 6). همانطوری‌که در شکل 6 مشاهده می‌شود سویه 15834 در هر دو محیط کشت MS و MS2/1 پاسخ یکسان و پایینی را نشان داده ولی پاسخ سویه A4 در محیط کشت‌های MS و MS2/1 متفاوت بود (شکل 6).

 

 

 

شکل6- اثر سویه اگروباکتریوم و نوع محیط کشت بر تعداد (A) و درصد ریشه مویین (B) در گیاه سنبل­الطیب؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

شکل 7- میانگین درصد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب­های تیماری متفاوت ریزنمونه گیاهی و شرایط تلقیح؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

 

کمترین درصد ریشه مویین با ریزنمونه برگ در سطح تیمار تلقیح T1 (تلقیح به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 48 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 9/15 درصد و کمترین درصد ریشه مویین توسط ریزنمونه دمبرگ در سطح تیمار تلقیح T4 (تلقیح به مدت 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 62/5 درصد به دست آمد (شکل 7). در مورد صفت تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، نیز ریزنمونه برگ در سطح تیمار تلقیح T6 (مدت زمان 10 دقیقه تلقیح و هم‌کشتی 72 ساعت و حاوی 100 میکرومولار استوسرینگون) با میانگین 8/5 و ریزنمونه دمبرگ در سطح تیمار تلقیح T6 و T2 (10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 55/4 بیشترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه را داشتند (شکل 8).

 

 

 

شکل 8- میانگین تعداد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب­های تیماری ریزنمونه گیاهی و شرایط تلقیح؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

ارزیابی ترکیب تیماری ریزنمونه و محیط کشت نشان داد که درصد ریشه‌زایی مویین هر دو ریزنمونه مورد استفاده در محیط MS یکسان بوده و در محیط MS2/1 درصد ریشه‌زایی مویین ریزنمونه برگ به‌طور معنی‌داری بیشتر از دمبرگ بود (شکل 9). 

 

شکل 9- درصد ریشه زایی مویین ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ در محیط کشت‌های MS وMS 2/1؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

ارزیابی ترکیب تیماری محیط کشت پایه و شرایط تلقیح نشان داد که بیشترین درصد ریشه‌زایی مویین در محیط کشت MS2/1 در سطح تیمار T2 (تلقیح 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 2/50 درصد و کمترین آن در محیط کشت MS در شرایط تلقیح T4 (تلقیح به مدت 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 16/9 درصد بدست آمده است (شکل10). در مورد صفت تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، نیز محیط کشت MS 2/1 در شرایط تلقیح T6  (تلقیح به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت و 100 میکرومولار استوسرینگون) با میانگین 89/5 بیشترین تعداد ریشه‌مویین و محیط کشت MS در سطح تیمار ) T4تلقیح به مدت 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت و بدون استوسرینگون( با میانگین 75/0 کمترین تعداد ریشه‌مویین را داشت. تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، حاصل از محیط کشتMS 2/1 و MS در سطوح شرایط تلقیح T2 (10 دقیقه تلقیح و هم‌کشتی 72 ساعت و بدون استوسرینگون) و T6 (10 دقیقه تلقیح و هم‌کشتی 72 ساعت و 100 میکرومولار استوسرینگون) از نظر آماری کاملاً یکسان بود. در حالی‌که در شرایط 10 دقیقه تلقیح و 48 ساعت هم‌کشتی (T1) استفاده از استوسرینگون (T5) باعث افزایش معنی‌دار هر دو صفت درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه‌مویین در هر دو محیط کشت MS وMS 2/1 شده است (شکل های 10و 11). ولی چنین روندی در شرایط 15 دقیقه تلقیح ریزنمونه و 72 ساعت هم‌کشتی (T4 در مقایسه با T8)  مشاهده نمی‌شود.

ارزیابی ترکیب سه‌تایی نوع سویه اگروباکتریوم، ریزنمونه و شرایط تلقیح نشان داد که تفاوت معنی‌داری بین ترکیب‌های تیماری از نظر درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه در هر ریزنمونه وجود دارد.

 

 

 

شکل 10- میانگین درصد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب تیماری­ شرایط تلقیح و محیط کشت؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

شکل 11- میانگین تعداد ریشه­های مویین سنبل­الطیب در ترکیب­ شرایط تلقیح و محیط کشت؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

بطوری‌که سویه A4 با ریزنمونه برگ و در شرایط تلقیح T6 (به مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت و 100 میکرومولار استوسرینگون) بیشترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه (58/10) و سویه 15834 با ریزنمونه دمبرگ و در شرایط تلقیح T3 و T4 و نیز T6 و T8 کمترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه را داشتند. در ریزنمونه دمبرگ بیشترین تعداد ریشه‌مویین حاصل از سویه A4 با میانگین 93/8 در سطح تیمار تلقیح T6 (تلقیح 10 دقیقه + هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط استفاده از 100 میکرومولار استوسرینگون) مشاهده شد. بیشترین تعداد ریشه‌مویین حاصل از سویه 15834 با میانگین 43/1 در ریزنمونه دمبرگ و شرایط تلقیح T5 (10 دقیقه + هم کشتی 48 ساعت و شرایط  100 میکرومولار استوسرینگون) مشاهده شد (شکل 12).

 

 

 

شکل 12- مقایسه میانگین اثر متقابل سویه، ریزنمونه و شرایط تلقیح بر تعداد ریشه مویین؛ حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

ارزیابی ترکیب سه عامل نوع سویه، محیط کشت و شرایط تلقیح نشان داد که سویه A4 در محیط کشتMS 2/1 و تیمار T6 (تلقیح به‌مدت 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط µM100 استوسرینگون) بیشترین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه با میانگین 10/11 و سویه 15834 در محیط کشت MS و تیمار T4 (تلقیح 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) کمترین تعداد ریشه‌مویین با میانگین 25/0 را ایجاد کرده است. همچنین کمترین تعداد ریشه‌مویین حاصل از سویه A4 با میانگین 20/1 در محیط کشت MS2/1 و تیمار T4 (تلقیح 15 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) و نیز بیشترین تعداد ریشه‌مویین (با میانگین 1 ریشه‌مویین در هر ریزنمونه) حاصل از سویه 15834 در محیط کشت MS 2/1 و تیمار T2 (تلقیح 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) به دست آمد (شکل 13). همانطوری‌که در شکل 13 مشاهده می‌شود استفاده از استوسرینگون در سویه A4 کارایی تراریختی اگروباکتریوم را از نظر تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه در محیط MS2/1 بطور معنی‌داری نسبت به عدم استفاده از استوسرینگون افزایش داده است. در حالیکه چنین افزایشی معنی‌داری در محیط MS و همچنین سویه 15834 در هیچ کدام از محیط کشت‌های پایه مشاهده نشده است. این امر نشان می‌دهد که اثر متقابل بین عوامل فوق در تراریختی ریزنمونه‌های سنبل‌الطیب و تولید ریشه‌های مویین بیشتر ناشی از سویه A4 است.

 

 

شکل 13- میانگین تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه، سنبل­الطیب در ترکیب­های تیماری سویه، شرایط تلقیح و محیط کشت، حروف متفاوت بالای ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

 

مقایسه تیمار شاهد (بدون تلقیح با اگروباکتریوم) با بقیه تیمارها از نظر درصد ریشه‌زایی و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه: ریزنمونه­های تلقیح نشده با آگروباکتریوم رایزوژنز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. بنابراین تیمار شاهد شامل همه مراحل به‌جز تلقیح با آگروباکتریوم بود. مقایسه گروهی تیمار شاهد در برابر تیمارهای تلقیح با اگروباکتریوم نشان داد که بین این دو گروه از نظر هر دو صفت درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه در سطح احتمال 1 درصد اختلاف معنی‌داری وجود دارد (جدول 2).

 

جدول 2- مقایسه گروهی تیمار شاهد در برابر تیمارهای تلقیح با اگروباکتریوم از نظر صفات درصد ریشه­زایی و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه گیاه سنبل‌الطیب

 

 

 

میانگین مربعات

 

منابع تغییر

درجه آزادی

درصد ریشه مویین

تعداد ریشه مویین

شاهد در برابر بقیه

1

** 016/3491

** 743/45

 

خطا

136

164/0

014/0

 

                 

                                 ** معنی­داری در سطح احتمال 1درصد

 

 

تایید مولکولی ریشه‌های مویین: برای بررسی حضور ژن‌های rolB و rolC در لاین ریشه‌مویین و در نتیجه تأیید ماهیت تراریختی آن، از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی ژنهای rolB و rolC استفاده شد. حضور نوار با طول 586 جفت باز برای ژن rolC و با طول 383 جفت باز برای ژن rolB در ریشه‌های ‌مویین نشانگر تراریخت بودن این ریشه‌ها توسط اگروباکتریوم رایزوژنز می‌باشد (شکل 14).

 

 

 

 

600 bp

400 bp

1

2

3

4

5

 

 

 

 

 

 

 

شکل 14- بررسی تراریختی ریشه­های مویین، ستون 1 : مارکر Kb1، ستون 2 : DNA ریشه مویین تراریخت احتمالی با آغازگرهای اختصاصی ژن rolC، ستون 3: DNA ریشه‌مویین تراریخت احتمالی با آغازگرهای اختصاصی ژن rolB، ستون 4 و 5 : DNA گیاه غیرتراریخت بترتیب با آغازگرهای اختصاصی ژن‌های rolC و rolB

 

 

ندازه‌گیری والرنیک اسید در ریشه‌های مویین: به منظور ارزیابی تولید و تجمع متابولیت والرنیک اسید از تجزیه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) استفاده شد (شکل15). نتایج حاصل از HPLC نشان داد که والرنیک اسید با مقدار 77/3 میلی‌گرم برلیتر در کشت‌های ریشه‌مویین سنبل‌الطیب تولید و تجمع می‌یابد. این نتایج نشان می‌دهد که می‌توان از کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب به عنوان یک رهیافت جایگزین برای تولید‌ متابولیت‌های ثانویه با ارزش این گیاه دارویی استفاده کرد.

بحث و نتیجه گیری

در تحقیق حاضر بین سویه‌های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز، نوع ریزنمونه‌ها، شرایط تلقیح و محیط کشت از نظر صفات درصد ریشه‌زایی ‌مویین و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه سنبل‌الطیب اختلاف معنی‌داری وجود داشت (شکل4). بطوری‌که پاسخ تراریختی ریزنمونه‌های گیاه سنبل‌الطیب به سویه A4  در مقایسه با سویه‌های 15834 و 2656 بهتر بود.

 

 

شکل 15- کروماتوگرام HPLC (A): والرنیک اسید (استاندارد) و (B) عصاره ریشه‌مویین سنبل‌الطیب

 

 

سویه  A4با میانگین 8/41 درصد ریشه‌زایی‌مویین و 87/4 ریشه‌‌مویین در هر ریزنمونه از پتانسیل القای ریشه‌‌مویین بیشتری نسبت به سویه 15834 با میانگین 15/5 درصد ریشه‌زایی مویین و 7/0 ریشه‌مویین در هر ریزنمونه برخوردار بود. این تفاوت در قابلیت تراریختی را می‌توان به تفاوت در قدرت بیماری‌زایی سویه‌ها به‌دلیل پلاسمیدهای متفاوت قرارگرفته در سویه‌های باکتری و همچنین بیان متفاوت ژن‌های T-DND درج شده در ژنوم گیاه بواسطه اثرات محل درج T-DND در ژنوم گیاه نسبت داد (5 و31). چنین تفاوتی در گیاهان و ریزنمونه‌های مختلف گزارش شده است. برای مثال Baskaran  و Jayabalan (9) با به­کارگیری سویه­های A4 و 15834 و مدت زمان­های مختلف هم­کشتی (0، 24، 36، 48 و 72 ساعت) برای القای ریشه­های مویین درPsoralea coryfolia، دریافتند که بین دو سویه در توانایی تراریختی سلول‌های گیاهی اختلاف وجود داشته و گزارش کردند که بیشترین درصد ریشه‌مویین و تعداد ریشه‌مویین در سویه A4 و 48 ساعت هم­کشتی می­باشد. در مطالعه Ooi و همکاران (31) سویه‌ A4 بالاترین درصد القای ریشه‌های مویین را در گیاه تاجریزی (Solanum mammosum) نشان داده است. چنین تفاوتی بین سویه­های باکتری از نظر القای تولید ریشه‌مویین با یافته­های Lee Young و همکاران (27) که اثر سویه­های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز (13333، 15834 ، 1000 R،1200 R و 1601 R) بر القای ریشه‌مویین در گیاه Rubia akane Nakai را مورد بررسی قرار دادند مطابقت دارد. آنها گزارش کردند که سویه 1601 R بالاترین درصد آلودگی (6/85 درصد) و بیشترین تعداد ریشه‌مویین (3/5) را داشته، در حالی­که سویه 15834 کمترین درصد آلودگی (4/ 56 درصد) و کمترین تعداد ریشه‌مویین (7/2) را دارا بود.Khelifi  و همکاران (24) در بررسی‌های خود گزارش کردند که در بین سویه‌های مختلف اگروباکتریوم، سویه A4 بیشترین درصد تراریختگی در گیاه Datura innoxia را نشان داده است. همچنین نتایج تحقیقات Khatodia و همکاران (23) نیز بر روی چند گیاه از خانواده سولاناسه که به بررسی ترکیبات ثانویه مهم آنها در ریشه‌های مویین تراریخته با استفاه از سویه‌های A4 و 15834 اگروباکتریوم رایزوژنز پرداخته بودند حاکی از افزایش معنی‌دار این ترکیبات در ریشه‌های مویین القاء شده توسط سویه A4  نسبت به سویه 15834 است. همچنین سهرابی‌نژاد و همکاران (3) در پژوهش‌های خود گزارش کردند که سویه‌های 15834 و A4 اگروباکتریوم رایزوژنز به‌ترتیب با 4/39 و 4/26 درصد بالاترین و سویه 2656 با 69/13 درصد کمترین میزان تولید ریشه‌مویین را در گیاه Calendula officinalis L. نشان دادند.  نتایج تحقیق حاضر نشان داد که نوع ریزنمونه نیز در تولید ریشه‌های مویین تراریخته سنبل‌الطیب حائز اهمیت است. بطوری‌که درصد ریشه‌مویین و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه برگی به ترتیب با 82/25 درصد و 98/2 عدد، بیشتر از درصد ریشه‌مویین با میانگین 14/21 درصد و تعداد ریشه‌مویین (45/2) در هر ریزنمونه دمبرگ بود (شکل 9). درصد تراریختی بالای ریزنمونه برگ­ توسط اگروباکتریوم نسبت به ریزنمونه­ دمبرگ می­تواند مرتبط با حساسیت بالای ریزنمونه­های برگ این گیاه به اگروباکتریوم باشد که این حساسیت بستگی به وضعیت فیزیولوژیکی بافت­ها نیز دارد (34). Mehrota و همکاران (28) نیز گزارش کردند که میزان ریشه‌زایی و تعداد ریشه‌های مویین تحت تأثیر نوع ریزنمونه قرار می‌گیرد. بطوری‌که، براساس مطالعه مذکور ریزنمونه‌های برگی بیشترین ریشه‌زایی را نشان داد. نتایج پژوهش Jenifer و همکاران (21) که به بررسی القای ریشه‌های مویین در گیاه تاجریزی پرداخته بودند نشان داد، ریشه‌های مویینی که حاصل از قطعات جداکشت برگ بودند، قادر به تولید لاین‌های تراریخته پر رشد بودند. در بررسی تأثیر سویه­های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز (9402 LBA ، 193 NRRLB وA4 ) بر القای ریشه­های مویین در Artemisia annua L. گزارش شده که سویه 9402 LBA با 100 درصد تراریختی در ریزنمونه برگ بیشترین درصد ریشه‌مویین را دارا می­باشد. همچنین گزارش شده که ریزنمونه برگ در مقایسه با ساقه‌ها برای سویه 193NRRLB راحت‌تر تراریخت می‌شود (4). در تحقیق حاضر شرایط تلقیح و محیط کشت نیز از فاکتورهایی بودند که تأثیر زیادی بر تولید ریشه‌های مویین داشتند، بطوری‌که بیشترین درصد ریشه‌زایی ‌مویین متعلق به سطح تیماری T2 (تلقیح به‌مدت 10 دقیقه، هم‌کشتی 72 ساعت و تحت شرایط بدون استوسرینگون) با میانگین 52/40 درصد و بیشترین تعداد ریشه ‌مویین در هر ریزنمونه نیز متعلق به سطوح تیماری T6 (تلقیح 10 دقیقه، هم‌کشتی 72 ساعت و تحت شرایط 100 میکرومولار استوسرینگون) و T2 (تلقیح 10 دقیقه، هم‌کشتی 72 ساعت و تحت شرایط بدون استوسرینگون) به‌ترتیب با میانگین 13/5 و 3/4 بود. ترکیب فنولی استوسرینگون به‌عنوان القاء کننده ژن Vir در اگروباکتریوم در جایگزینی T-DND در سلول‌های گیاهی نقش دارد (14) و انتخاب مقدار بهینه این ترکیب نیز می‌تواند در افزایش موفقیت تراریختی مؤثر باشد، زیرا غلظت پایین آن بیماری‌زایی اگروباکتریوم را تشدید نمی‌کند، و غلظت بالای آن نیز برای اگروباکتریوم و سلول‌های گیاهی اثر سمیت دارد (37). علاوه‌براین، تأثیر استوسرینگون می‌تواند تحت تأثیر سایر عوامل دیگری از جمله گونه گیاهی، نوع ریزنمونه، مدت زمان هم‌کشتی و مدت زمان تلقیح قرار گیرد (25). Cardoza  و Stewart (12) زمان پیش کشت، زمان هم­کشتی و غلظت استوسرینگون را از عوامل مهم تأثیرگذار در انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم گزارش کرده‌اند. Karmarkar و Keshavachandran (22) نیز گزارش کردند که درصد تراریختی (القای ریشه‌مویین) تحت تأثیر هم سویه باکتریایی و هم مدت زمان هم­کشتی قرار می‌گیرد.

همچنین در تحقیق حاضر در محیط MS2/1 درصد ریشه‌زایی ‌مویین (21/29 درصد) و تعداد ریشه‌مویین در هر ریزنمونه (11/3) به­طور معنی­داری بیشتر از محیط MS به ترتیب با میانگین 74/17 و 32/2 درصد بود. مشابه با نتایج پژوهش حاضر، در تحقیقی رشد ریشه‌های مویین حاصل از گیاه سنیل‌الطیب در محیط کشت‌های MS،  MS2/1 و N6 مورد مطالعه قرار گرفت که بعد از سه هفته، بیشترین تجمع زیست‌توده در ریشه‌های مویین کشت شده در محیط MS2/1 و بعد از آن در محیط MS و کمترین در محیط N6 مشاهده شد (32). همچنین در آزمایشی طی مقایسه اثر نوع محیط کشت MS،  MS2/1 و B5 بر رشد ریشه‌های مویین در گیاه علف خنازیر آبی، محیط کشت MS2/1، مناسب‌ترین محیط کشت برای رشد ریشه‌ها معرفی شد (33). همچنین در مطالعه‌ای از محیط‌های MS،MS 2/1،MS 4/1 و B5 به‌منظور بهینه‌سازی محیط کشت تحریک ریشه‌مویین در گیاه Hypericum perforatum استفاده شده که درصد تحریک ریشه‌‌زایی مویین در محیطMS 2/1 بیشتر از MS گزارش شده است (10). طی تحقیقی بر روی گیاه Artemisia vulgaris نیز همانند پژوهش حاضر، محیط کشت MS2/1 بهترین محیط برای ریشه‌زایی و رشد ریشه‌های مویین گزارش شده است (38).

نتایج حاصل از ارزیابی تولید متابولیت ثانویه والرنیک اسید در ریشه‌های مویین سنبل‌ا‌لطیب با استفاده از HPLC نشان داد که این متابولیت در مقدار قابل ملاحظه‌ای در ریشه‌های مویین تولید و تجمع می‌یابد (شکل 15). مطالعات متعدد نشان داده که میزان تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه در کشت‌های درون‌شیشه‌ای را می‌توان با استفاده از رهیافت‌های متعددی مانند استفاده از محرک‌ها، گزینش‌لاین‌های پرمحصول و تغذیه سلول‌ها با پیش‌ماده بطور مؤثری افزایش داد (41 و 44). در پژوهشی تأثیر محرک­های عصاره قارچی Fusarium graminearum، متیل جاسمونات و سالسیلیک ­اسید در تولید والرنیک ­اسید در ریشه­های مویین V. officinalis در مدت زمان 3 و 7 روز مورد بررسی قرارگرفته و گزارش شده که عصاره­ی قارچی و متیل جاسمونات بیشترین مقدار والرنیک ­اسید را در زمان 7 روز بعد از اعمال تیمار تولید می­کنند، در حالی که سالسیلیک ­اسید به طور معنی­داری تولید والرنیک ­اسید را تحت تأثیر قرار نمی­دهد (15). سلطانی (2) تأثیر محرک­های متیل­جاسمونات، اسید سالیسیلیک، امواج فراصوت، و پیش­ساز L-لوسین و ترکیب آن­ها را روی ریشه­های مویین سنبل­الطیب بررسی کردند. نتایج افزایش تولید والرنیک اسید در تیمار ترکیبی متیل جاسمونات با L-لوسین را نشان داد. همچنین در پژوهش پارسا و زینالی (1) بیشترین مقدار آتروپین و اسکوپولامین در کشت ریشه‌های مویین گیاه Hyoscyamus niger L. در تیمار با غلظت یک میلی‌مولار متیل جاسمونات در زمان 96 ساعت پس از اعمال تیمار مشاهده شد.

نتیجه­گیری

بنابرابن، براساس نتایج تحقیق حاضر می توان نتیجه‌گیری کرد که عوامل مختلفی از قبیل سویه اگروباکتریوم ، نوع ریزنمونه، مدت زمان تلقیح و هم‌کشتی و غلظت محیط کشت MS بر درصد ریشه‌زایی مویین و تعداد ریشه‌ در گیاه سنبل‌الطیب مؤثر بود. در مجموع نتایج نشان داد که بهترین ترکیب‌های تیماری از نظر درصد ریشه‌زایی در این پژوهش، ترکیب تیماری سویه A4 در ریزنمونه برگ و محیط کشت MS2/1 و تحت شرایط تلقیحT6  (تلقیح 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط استوسرینگون (100 میکرومولار) و T2 (تلقیح 10 دقیقه و هم­کشتی 72 ساعت تحت شرایط بدون استوسرینگون) می باشند. علاوه بر‌این، والرنیک اسید در ریشه‌های مویین تکثیر شده سنبل‌الطیب در شرایط درون‌شیشه‌ایی تولید و تجمع می‌یابد. این نتایج می‌توانند در تولید متابولیت‌های ثانویه با ارزش مانند والرنیک اسید در گیاه سنبل‌الطیب از طریق کشت ریشه‌ی مویین مورد استفاده قرار گیرند.

1- پارسا، م.، و زینالی، ا.، 1396. تأثیر الیسیتورهای جاسمونیک اسید و متیل جاسمونات بر میزان تروپان آلکالوئیدهای آتروپین و اسکوپولامین در ریشه‌های مویین و ریشه‌های حاصل از کشت بافت گیاه Hyoscyamus niger L.، مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 30 (4)، صفحات 791-778.
 2- سلطانی، ن.، 1393. تأثیر محرک­ها بر تولید متابولیت ثانویه و فعالیت آنزیمی در ریشه­های مویین سنبل­الطیب، پایان‌نامه کارشناسی ارشد، مهندسی کشاورزی- بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی، صفحات 76-72.
3- سهرابی‌نژاد، ز.، مرعشی، ح.، و مشتاقی، ن.، 1397. بهینه‌سازی کشت ریشه‌های مویین گیاه دارویی همیشه بهار (Calendula officinalis L.) به‌منظور تولید ترکیب دارویی اولئانولیک اسید، مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست‌شناسی ایران)، 31 (3)، صفحات 654-640.
 
4- Ahlawat, S., Saxena, P., Ram, M., Alam, P., nafis, T., Mohd, A., and Zainul Abdin, M., 2012. Influence of Agrobacterium rhizogenes on induction of hairy roots for enhanced production of artemisinin in Artemisia annua L. plants. African Journal of Biotechnology, 35, PP: 8684-8691.
5- Akramian, M., Fakhr Tabatabaei, S.M., and Mirmasoumi, M., 2008. Virulence of different strains of Agrobacterium rhizogenes on genetic transformation of four Hyoscyamus species. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Science, 3(5), PP: 759-763.
6- Bandyopadhyay, M., Jha, S., and Tepfer, D., 2007. Changes in morphological phenotypes and withanolide composition of Ri-transformed roots of Withania somnifera, Plant Cell, Reports, 26, B PP: 599-609.
7- Barik, D.P., Mohapatra, U., and Chand, P.K., 2005. Transgenic grasspea (Lathyrus sativus L.,), factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration, Plant Cell Reports, 24, PP: 523-531.
8- Barnes, J., Anderson, L.A., and Philipson, J.D., 2002. Herbal medicines. A Guide Healthcare Professionals, 2th edition. Pharmaceutical Press, London, 565 pp.
9- Baskaran, P., and Jayabalan, N., 2009. Psoralen production in hairy roots and adventitious roots cultures of Psoralea coryfolia, Biotechnology Letters, 31, PP: 1073-1077.
10- Bivadi, V., Zakaria, R.A., Zare, N., and Yazdani, B., 2014. Effects of different tissue culture conditions in hairy roots induction in Hypericum perforatum L. International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 8, PP: 597-604.
11- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., and Gontier, E., 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective, Plant Science, 161, PP: 839-851.
12- Cardoza, V., and Stewart, C.N., 2003. Increased Agrobacterium- mediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyl segment explants, Plant Cell Reports, 21, PP: 599-604.
13- Crane, C., Wright, E., Dixon, R.A., and Wang, Z.Y., 2006. Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots, Planta, 223, PP: 1344-1354.
14- De Clercq, J., Zambre, M., VanMontagu, M., Dillen, W., and Angenon, G., 2002. An optimized Agrobacterium-mediated transformation procedure for Phaseolus acutifolius, Plant Cell Reports, 21, PP: 333–340.
15- Dini Torkamani, M.R., Jafari, M., Abbaspour, N., Heidari, R., and Safaie, N., 2014. Enhanced production of valerinic acid in hairy root culture of Valeriana officinalis by elicitation, Central European Journal of Biology, 9, PP: 853-863.
16- Doyle, J.J., and Doyle, J.L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue, Focus, 12, PP: 13-15.
17- Gelvin, S.B., 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and interaction. Annu. Rev. Plant, Physiol, Plant Molecular Biology, 51, PP: 223-256.
18- Giri, A., and Lakshmi-Narasu, M., 2001. Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advances, 18, PP: 1-22.
19- Granicher, F., Christen, P., and Kapetanidis, I., 1995. Essential oils fram normal and hairy roots of Valeriana officinalis var, sambucifolia, Phytochemistry, 40, PP: 1421-1424.
20- Hu, Z.B., and Alferman, A.W., 1993. Diterpenoid production in hairy root culture of Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry, 32, PP: 699-703.
  21- Jenifer, U., Francina Cecilia, K., and Ravindhran, R., 2012. In vitro adventitious root and hairy root cultures in Boerhaavia diffusa L., International Journal of oral care Reaserch, 4 (1), PP: 65 – 7
22- Karmarkar, S.H., and Keshavachandran, R., 2001. Genetic transformation and hairy root induction in Holostemma ada-kodien K. Schum-a vulnerable medicinal plant. Indian Journal of Experimental Biology, 39, PP: 1263-1267.
23- Khatodia, S., and Biswas, K., 2014. A comparative study of hairy root culture induction efficiency in four medicinally important plants using Agrobacterium rhizogenes. International Journal Microbiology Applied Sciences, 3 (5), PP: 625 – 33
24- Khelifi, L., Zarouri, B., Amdoun, R., Harfi, B., Morsli, A., and Khelifi-Slaoui, M., 2011. Effects of elicitation and permeabilization on hyoscyamine content in Datura stramonium hairy roots. Plant biology, 5 (2), PP: 329 - 34.
25- Kim, K.H., Lee, Y.H., Kim, D., Park, Y.H., Lee, J.Y., Hwang, Y.S., and Kim, Y.H., 2004. Agrobacterium mediated genetic transformation of Perilla frutescens. Plant Cell Reports, 23, PP: 386-390.
26- Kumar, V., Sharma, A., Prasad, B,C,N., Gururaj, H.B., and Ravishankar, G.A., 2006. Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of Biotechnology, 9, PP: 349-357.
27- Lee Young, S., Kim, S.K., Lee, Y.C., Park, I.N., and Park, U.S., 2010. Influence of different strains of Agrobacterium rhizogenes on hairy root induction and production of alizarin and purpurin in Rubia akane Nakai. Romanian Biotechnology Letters 15(4), PP: 5405-5409.
28- Mehrota, T., Kukreja, A.K., Khanuja, S., and Mishra, B.N., 2008. Genetic transformation studies and scale up of hairy root culture of Glycyyhiza glabra in bioreactor. Electronic Journal of Biotechnology, 11(2), PP: 1-7.
29- Nam, S.M., Choi, J.H., Yoo, Dae, Y., and Kim, W., 2013. Valeriana officinalis extract and its main component, Valerenic acid, ameliorate D-galactose-induced reductions in memory, cell proliferation, and neuroblast differentiation by reducing corticosterone levels and lipid peroxidation, Experimental Gerontology, 48, PP: 1369-1377.
30- Namdeo, A. G., 2007. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites, Pharmacognosy Reviews, 11, PP: 69-79.
31- Ooi, C.T., Syahida, A., Stanslas, J., and Maziah, M., 2013. Efficiency of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy roots induction in Solanum mammosum, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 29(3), PP: 421-430.
32- Pakdin Parizi, A., Farsi, M., Nematzadeh, G. A., and Mirshamsi, A., 2014. Impact of different culture media on hairy roots growth of Valeriana officinalis L., Acta agriculturae Slovenica, 103, PP: 299-305
33- Park, S. U., Li, X., Eom, S. H., Lee, C. Y., and Lee, S.Y., 2010. E-P-Methoxycinnamic acid production in hairy root cultures of Scrophularia buergeriana miquel. Archives of Biological Sciences, 62, PP: 649-652.
34- Pawar, P.K., and Maheshwari, V.L., 2003. Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family Solanaceae. Indian Journal of Biotechnology, 3, PP: 414-417.
35- Pirian, K., piri, K.H., and ghiyasvand, T., 2012. Hairy roots induction from Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to Noradrenaline’s production, International Research Journal of Applied and Basic Sciences Vol 3, 3, PP: 642-649.
36- Sah, S.P., Mathela, C.S., and Chopra, K., 2010. Elucidation of possible mechanism of analgesic action of Valeriana wallichii DC chemotype (patchouli alcohol) in experimental animal models. Indian Journal of Experimental Biology, 48, PP: 289-93.
37- Sivanandhan, G., Arunachalam, C., Vasudevan, V., Kapildev, G., Sulaiman, A. A., Selvaraj, N., Ganapathi, A., and Lim, P. Y., 2016. Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation in Hybanthus enneaspermus L., Plant Biotechnology Reports, 10, PP: 49–60.   
38- Sujatha, G., Zdravkovic-Korac, S., alic, D., Flamini, G., and Ranjitha Kumaria, B.D., 2012. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: Hairy root production and essential oil analysis, Industrial Crops and Products, 6341, PP: 1-10.
39- Tomilov, A., Tomilova, N., and Yoder, J. I., 2007. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes transformed roots of the parasitic plant Triphysaria versicolor retain parasitic competence, Planta, 225, PP: 1059–1071.
40-Vasconsuelo, A., and Boland, R., 2007. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science, 172, PP: 861-875.
41- Verpoorte, R., Contin, A., Memelink, J., 2002. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites, Phytochemistry Reviews 1, PP: 13-25.
42- Wegner, H., Jurcic, K., and Schaette, R., 1990. Comparative studies on the sedative action of Valeriana extracts, valepotriates and their degredation products, Planta ,39, PP: 358-65.
43- Wolanin, P., Thomason, P., and Stock, J., 2002. Histidine protein kinases: key signal transducers outside the animal kingdom. Genome Biology, 3, PP: 3013-3018.
44- Zare, N., Farjaminezhad, R., Asghari-Zakaria, R., and, Farjaminezhad, M., 2014. Enhanced thebaine production in Papaver bracteatum cell suspension culture by combination of elicitation and precursor feeding, Natural Product Research 28, PP: 711–717.
Volume 35, Issue 1
April 2022
Pages 69-83
  • Receive Date: 31 December 2019
  • Revise Date: 27 June 2020
  • Accept Date: 28 September 2020