پاسخ­های بیوشیمیایی گیاه شمعدانی عطری Pelargonium graveolens L^′­Her تحت تنش پرتو فرابنفش درشرایط درشیشه

مرجان آذرافشان¹، مریم پیوندی^1*، حسین عباسپور¹، زهرا نورمحمدی² و احمد مجد¹

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی

2 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 02/08/1399          تاریخ پذیرش: 10/09/1399

چکیده

گیاه شمعدانی عطری (Pelargonium graveolens) گیاهی دارویی و معطر است که در صنعت داروسازی، عطر سازی و صنایع غذایی کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه اثر تابش پرتو فرابنفش با شدت­های متفاوت (وات بر مترمربع 38/0و 26/0، 12/0، 0) بر روی این گیاه در محیط کشت بافت بررسی شد. میزان فنل کل، فلاونوئید, آنتوسیانین، رنگیزه­های فتوسنتزی، کربوهیدرات­ها، پروتئین و فعالیت آنزیم­های فنیل آلانین آمونیا لیاز، کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز سنجش شدند. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره متانولی با استفاده از 2­و2- دیفنیل 1- پیکریل هیدرازیل (DPPH) اندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که با افزایش شدت تابش پرتو UV-B، میانگین پروتئین کل و کلروفیل­های a و b در شدت­های بالای پرتو فرابنفش کاهش یافته و مقدار کاروتنوئید افزایش معنی­داری (05/0  (P≤داشته است. میانگین فنل کل، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­های برگ گیاهان تحت تیمار افزایش معنی­داری در سطح(05/0  (P≤نشان دادند. همچنین با افزایش شدت تابش، میانگین IC₅₀ عصاره متانولی کاهش یافت. الگوی کاهش IC₅₀ با روند افزایش میانگین فنل­ها همخوانی داشت. نتایج حاضر نشان می­دهد گیاه شمعدانی در پاسخ به تنش UV-Bتوان آنتی اکسیدانی خود را با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان وافزایش انواع فنل­ها بالا برده است.

واژه های کلیدی: شمعدانی عطری، اشعه فرابنفش، متابولیت­های ثانویه، کشت بافت

* نویسنده مسئول، تلفن: 02122454688  ، پست الکترونیکی: m_peyvandi@iau-tnb.ac.ir

مقدمه

P.graveolens گیاهی متعلق به خانواده شمعدانی است (4). این گیاه اسانس­دار و با ارزش، بومی آفریقای جنوبی است و توسط دریانوردان اروپایی قرن 17 همراه با گیاهان طبی و ادویه‌ای به اروپا راه یافت (14و 45). این گیاه دارای خاصیت بسیار بالایی از فعالیت آنتی اکسیدانی است که بر ضد بیماری‌هایی مانند سرطان، بیماری‌های قلبی و دیابت تأثیرگذار است و ریسک ابتلا به این بیماری‌ها را کاهش می­دهد و از گسترش آن‌ها جلوگیری می‌کند. عصارة آبی ساقه و برگ P.graveolens دو برابر تیمول خاصیت آنتی‌اکسیدانی دارد. همینطور این گیاه دارای خواص ضد کرم پارازیت Meloidogyne incognita می‌باشد (46). در طب سنتی بسیاری از کشورها مانند یونان از برگ این گیاه به عنوان نوعی دمنوش‌ برای رفع مشکلات روحی مانند استرس و اضطراب و همچنین در بهبود جریان خون و درمان ورم لوزه استفاده می‌شود (20). اشعه UV-B با طول موج 315-290 نانومتر پرانرژی‌ترین ترکیب نور خورشید است و در نتیجه کاهش لایه ازن میزان رسیدن این نوع اشعه به زمین بیشتر شده است. این اشعه دارای تأثیرات منفی بر روی گیاهان می‌باشد و در نتیجه رشد و تکامل آنها به طور منفی تحت تأثیر قرار می‌گیرد (25). هنگامیکه گیاهان در برابر تشعشع UV-B قرار می‌گیرند، تولید متابولیت­های ثانویه آن‌ها افزایش می‌یابد و اینگونه است که می‌توانند به وسیله دفاع فیتوشیمیایی، خود را از تأثیرات مخرب تشعشع دور نگه دارند (43). امروزه استفاده از عصاره های گیاهی یا متابولیت های ثانویه استخراج شده از گیاهان در صنایع پزشکی، دارویی و غذایی کاربرد گسترده ای یافته است. تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) در گیاهانی که تحت تأثیر عوامل تنش­زای زیستی و غیر­زیستی مانند پرتو فرابنفش قرار دارند بیشتر از گیاهان در شرایط کنترل شده است. از این رو تولید ترکیبات دفاعی همانند آنتی اکسیدان­ها در این گیاهان بالاتر است (6). افزایش به کارگیری روشهای کشت سلول و اندامهای گیاهی منجر به تولید متابولیت­های گیاه در مقیاس وسیع شده است. پیشرفت در این تحقیقات، جنبه جدیدی را در کشت درون شیشه ای ایجاد کرده است که افزایش عملکرد و همچنین تولید محصولات متعدد از آن جمله می­باشد (5). یکی از این روش­ها که جهت افزایش تولید متابولیت­های­ ثانویه به کارمی­رود، استفاده از الیسیتورها در کشت درون شیشه(in vitro)  می­باشد (1). نتایج حاصل ازمطالعات قبلی ما بر روی گیاه شمعدانی عطری (گیاه کامل) در شرایط گلخانه نشان داد که با افزایش شدت پرتو، میزان پروتئین، قند و رنگیزه های فتوسنتزی کاهش و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی (9) و میزان فنل­ها از جمله فلاوانول­هائی نظیر کوئرستین، روتین،کامفرول و میریستین افزایش می­یابد (10).

هدف از پژوهش حاضر ارزیابی تأثیرات تابش پرتو فرابنفش بر روی پاسخ­های بیوشیمیایی گیاه شمعدانی عطری درشرایط کشت در شیشه می­باشد تا از این طریق امکان استفاده از UV-B به عنوان یک الیسیتور جهت افزایش متابولیت­های ثانویه در این گیاه به دست آید.

مواد و روشها

ماده گیاهی و روش سترون سازی: گیاه شمعدانی  عطری

از گلخانه وابسته به باغ گیاه­شناسی ایران واقع در بلوار باغ گیاه­شناسی تهیه شد. رشد گیاه مادر در گلخانه ای با دمای بیشینه 22 درجه سانتی گراد ودمای کمینه 17 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت طول روز (روشنایی) و 8 ساعت طول شب (تاریکی) انجام گرفت. جداکشت های تک گره­ از شاخه­های هم­سن که از نقاط یکسان تهیه شده بودند، به مدت 5 دقیقه در محلول ضدعفونی کننده و گندزدای دتول(Dettol)  (که به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق شده بود) و 10 دقیقه در محلول 15 درصد از هیپوکلریت سدیم 05/0 (وایتکس تجاری) قرارگرفتند. سپس شستشو با آب مقطر سترون (پنج بار) انجام گرفت.

محیط کشت و تیمار با اشعه UV-B : از محیط کشت MS2/1 (2/1 غلظت عناصر ماکرو و میکرو و سایر مواد کامل)استفاده شد. pH مناسب برای محیط کشت بین 7/5 تا 8/5 تنظیم گشت. دراین آزمایش از هورمون 2ip با غلظت 5/0 میلی­گرم برلیتر استفاده شد. آزمایش به صورت کاملاً تصادفی و 3 تکرار برای هر تیمار طراحی شد. نمونه های جدا کشت های تک گره با شدت­هائی از پرتوی UV-B (وات بر متر مربع 38/0 T3:و 26/0 T2:، 12/0 T1:، شاهد:0) به مدت 10 دقیقه در روز و برای یک هفته تیمار شدند. منبع تابش UV-B به صورت مصنوعی به وسیله لامپ‌های Sankio Denki (ژاپن / E 8T 15 G) که در فاصله 70 سانتی­متری از گیاهان قرارگرفته بودند تأمین ‌شد. دمای اتاق رشد 3±25 درجه سانتی گراد، طول دوره روشنایی 16 ساعت و طول دوره تاریکی 8 ساعت ولوکس نوری 4500 لوکس بود. برگ گیاهان بعد از گذشت 21 روز (سه هفته بعد از تیمار) برداشت شدند.

سنجش رنگیزه های فتوسنتزی: جهت اندازه­گیری رنگیزه­های کلروفیل aوb و همینطور کاروتنوئید از روش  WellburntوLichtenthaler  (1983) استفاده شد (31). 1/0گرم از وزن تر برگ­ همراه 5 میلی لیتر استون 80 درصد در هاون چینی ساییده شد. پس از سانتریفوژ جذب فاز بالایی به دست آمده توسط طیف­سنج نوری در طول موج های 663 نانومتر (کلروفیلa) 646 نانومتر(کلروفیلb) و 470 نانومتر (کاروتنوئید) خوانده شد.

aکلروفیل: 21/12A₆₆₃ – 81/2A₆₄₆

bکلروفیل: 13/20A ₆₄₆ – 03/5 A ₆₆₃

کارتنوئید: 1000 A ₄₇₀ - (27/3 aکلروفیل) - (104 bکلروفیل) /227

کلروفیل کل: aکلروفیل + bکلروفیل

سنجش کربوهیدرات­ها: جهت بررسی میزان کربوهیدرات­های برگ­ از روشKochert  (1978) استفاده شد (28). استخراج به وسیله اتانول 70 درصد انجام شد و جذب نمونه­ها در طول موج 485 نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت­های مشخص گلوکز استفاده گردید.

سنجش پروتئین: 5/0 گرم ماده تر برگ در 5 میلی لیتر بافر تریس– گلایسین در هاون چینی سائیده شد و از 100 میکرولیتر از عصاره پروتئینی حاصله جهت سنجش میزان پروتئین به روش Bradford (1976) استفاده گردید (13). جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت های مشخص آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز: فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از روش Pereira و همکاران (2002) در طول موج 240 نانومتر(42)، فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از روش Koroi (1989) در طول موج 530 نانومتر(29) و فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به وسیله روش (1977) Ries وGiannopolitie  در طول موج560 نانومتر(21) در برگ به وسیله دستگاه طیف سنج نوری سنجیده شد. سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز با استفاده از غلظت اسید سینامیک تولید شده به روشWang  و همکاران (2006) انجام شد (52). جذب نمونه­ها در طول موج 290 نانومتر خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از  غلظت

های مشخص اسید سینامیک استفاده شد.

سنجش میزان فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و IC₅₀: 1/0 گرم از وزن تر برگ در 10 میلی لیتر متانول 80% برای مدت 24 ساعت خیسانده شد. از این عصاره برای اندازه­گیری میزان فلاونوئید کل با استفاده از روشChang  و همکاران (2002) و اندازه­گیری میزان فنل کل به روش Marrinova و همکاران (2005) استفاده شد (16و 35). جهت رسم منحنی استاندارد برای محاسبه میزان فنل کل ازغلظت­های مشخص اسید گالیک و جهت محاسبه میزان فلاونوئیدها از غلظت های مشخص کوئرستین استفاده شد. همچنین از عصاره بالا جهت سنجش میزان IC₅₀ با استفاده از روش Akowuah و همکاران (2005)  استفاده گردید (7). میزانIC₅₀ نمونه ها به وسیله رسم منحنی غلظت در برابر درصد ممانعت کنندگی محاسبه شد. جهت اندازه گیری آنتوسیانین از روش (2000) Baker وNouges  استفاده شد (40). 1/0 گرم از وزن تر برگ همراه 10 میلی لیتر متانول اسیدی (99 حجم متانول و 1 حجم اسید کلریدریک) در هاون سائیده شد. سپس جذب محلول در طول موج 530 نانومتر توسط دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد و با استفاده از ضریب خاموشی  ^1-cm ^1- mm 33000= ε میزان آنتوسیانین محاسبه گردید.

آنالیز آماری: آنالیز آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار آماری (16 Version) SPSS انجام شد. اختلاف بین میانگین­ها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (one-way ANOVA) محاسبه شد. بررسی نتایج آزمایش­ها ورسم منحنی­ها برمبنای مقایسه میانگین­ها وانحراف از میانگین  (Mean±SE)صورت گرفت و گروه بندی تیمار­ها درسطح احتمال)05/0 (P≤ با آزمون دانکن (Dunkan) در سه تکرار انجام شد.

نتایج

فنل  کل،  فلاونوئید،  آنتوسیانین و IC₅₀ :  بررسی  آنالیز

واریانس داده­ها نشان داد که میانگین فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و IC50 در بین تیمارها تفاوت معنی­داری )05/0 (P≤ را نشان می­دهد (شکل1). گروه بندی میانگین فنل، با آزمون دانکن نشان داد که با افزایش شدت پرتو در تیمارها، میزان فنل به طرز معنی داری )05/0 (P≤ افزایش یافت. بیشترین میزان فنل (18/90 میلی گرم بر گرم وزن تر) در تیمار38/0 وات بر متر مربع و کمترین (01/73 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاه شاهد به دست آمد. گروه بندی میانگین فلاونوئید با آزمون دانکن نشان داد، با افزایش شدت پرتو در تیمارها، مقدار فلاونوئید افزایش معنی داری )05/0 (P≤ یافته است. بیشترین میزان فلاونوئید ) 58/2 میلی گرم بر گرم وزن تر) در تیمار 38/0 وات بر مترمربع و کمترین میزان در گیاه شاهد مشاهده شد (شکل1). اثر افزایشی به علت تابش پرتو فرابنفش بر روی میزان آنتوسیانین نیز دیده شد. نتایج نشان داد که با افزایش شدت پرتو میزان آنتوسیانین به طور معنی داری )05/0 (P≤ افزایش یافته است. بالاترین میزان آنتوسیانین (38/1 میکرومول بر گرم وزن تر) در تیمار 38/0 وات بر مترمربع و کمترین مقدار(91/0 میکرومول بر گرم وزن تر) در تیمار شاهد به دست آمد (شکل1). همینطور نتایج نشان داد که افزایش شدت تابش پرتو باعث کاهش معنی دار )05/0 (P≤ IC₅₀ شده است. تیمار 38/0 وات بر مترمربع کمترینIC₅₀  و گیاه شاهد بیشترین IC₅₀  را دارا بود (شکل1).IC₅₀  به دست آمده در تیمارهای 26/0 وات بر مترمربع و 38/0 وات بر مترمربع نزدیکتر به IC₅₀ اسید اسکوربیک بودند (شکل1).

شکل1- میانگین فنل کل(A)، فلاونوئید(B)، آنتوسیانین  (C)و IC₅₀  (D)عصاره متانولی در شدت­های متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و 38/0 T3:وات بر مترمربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان می­دهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی­دار بودن تفاوت ها در سطح )05/0 (P≤ براساس آزمون دانکن می­باشند.

رنگیزه­های فتوسنتزی، پروتئین و کربوهیدرات­ها: کلروفیل a با افزایش شدت تابش کاهش یافت، که این کاهش در تمام تیمارها نسبت به گیاه شاهد معنی­دار )05/0 (P≤ بود (شکل2). کلروفیل b نیز در شدت­های 38/0 و 26/0 وات بر مترمربع کاهش یافت. میانگین کلروفیل کل نیز کاهش معنی داری را )05/0 (P≤ در تمام تیمارها در مقایسه با گیاه شاهد نشان داد. میزان کاروتنوئیدها تنها در تیمار 38/0 وات بر مترمربع افزایش معنی داری )05/0 (P≤ را نشان داد (شکل2). تحلیل نتایج نشان داد که افزایش معنی داری )05/0 (P≤ در میزان کربوهیدرات­ها در گیاهان مورد مطالعه وجود دارد (شکل2). این افزایش در تیمارهای 26/0 و 38/0 وات بر مترمربع در مقایسه با گیاه شاهد معنی دار است (شکل2). همچنین میانگین پروتئین تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ را در بین گروه­های مورد مطالعه نشان داد (شکل2).  بررسی آنالیز داده­ها نشان داد که تابش پرتو فرابنفش باعث کاهش میزان پروتئین در گیاهان رشد یافته در محیط کشت بافت شده است (شکل2).

شکل 2- میانگین کلروفیل (A)، کاروتنوئید(B)، قند (C) و پروتئین  (D)در شدت­های متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و  38/0 T3: وات بر متر مربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان می­دهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت ها درسطح
)05/0 (P≤ براساس آزمون دانکن می­باشند.

آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز: نتایج نشان داد، فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) ، پراکسیداز(POD) و سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) در بین گروه­های مورد مطالعه تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ دارد. با افزایش شدت تابش پرتو، فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت به طوریکه در تیمار 38/0 وات بر مترمربع ناگهان افزایش چشمگیری در میانگین فعالیت این آنزیم نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد اما بین گیاه شاهد و تیمار 12/0 وات بر مترمربع تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ مشاهده نشد (شکل3). با افزایش تابش، میانگین فعالیت آنزیم پراکسیداز نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی داری )05/0 (P≤ یافت اما تفاوت معنی داری بین تیمار 26/0 و 38/0 وات بر مترمربع مشاهده نشد (شکل3). نتایج نشان داد که با افزایش شدت تابش فرابنفش میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافته و تفاوت بین تمام تیمارها معنی دار است (شکل3). بررسی داده ها نشان داد که با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش میانگین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز افزایش داشت و تفاوت در بین تمامی تیمارها معنی دار )05/0 (P≤ بود (شکل3).

شکل 3- فعالیت آنزیم­های کاتالاز (A)، پراکسیداز(B)، سوپراکسید دیسموتاز (C) و فنیل آلانین آمونیا لیاز  (D)در شدت­های متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و 38/0 T3:وات بر مترمربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان می­دهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت ها در سطح )05/0(P≤ براساس آزمون دانکن می­باشند.

بحث

استفاده از تکنیک کشت بافت برای کوتاه کردن زمان تولید گیاهان زینتی و داروئی در سال­های اخیر افزایش یافته است. گیاه شمعدانی عطری نیز یک گیاه دارویی و معطر بسیار مهم است و به طور معمول از طریق قلمه و بذر تکثیر می شود. روند قلمه زدن احتیاج به نگه داری زیادی از قلمه­ها دارد و این قلمه­ها ممکن است دچار بیماری­های قارچی و باکتریایی شوند. ازدیاد از طریق بذر نیز به علت گران بودن بذرهای این گیاه چندان مورد استقبال قرار نگرفته است .بنابراین به نظر می­رسد تکنیک کشت بافت می­تواند راهکار مناسبی برای افزایش تکثیر این گیاه باشد که مزایایی از جمله تکثیر انبوه و سریع,راحتی در ذخیره سازی و حمل و نقل را دارا می­باشد (37و 15). نتایج مطالعات ما بر گیاهان گلخانه ای نشان داد با افزایش شدت تابش پرتو، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، قدرت آنتی­اکسیدانی و انواع فلاونول­های برگ­های تحت تیمار افزایش می­یابد (9 و 10). نتایج حاضر نیز نشان داد با افزایش شدت تابش پرتو UV-B، الگوی کاهش IC₅₀با روند افزایش محتوای فلاونونید­ها و آنتوسیانین­های برگ همخوانی دارد. مکانیسم عمل فنل به عنوان یک متابولیت ثانویه به دو روش می‌باشد: 1- جذب مستقیم پرتو UV و جلوگیری از نفوذ آن به بافت‌های حساس و 2- جاروب کردن گونه‌های فعال اکسیژن و ایفای نقش آنتی‌اکسیدانی (38و 39). این آنتی اکسیدان های غیرآنزیمی، حفاظت از گیاهان در حین تنش را برعهده دارند و ثابت شده است که غلظت بالای فنل‌ها توانایی مقاومت بالاتری را در برابر اشعه UV به گیاه می‌دهد (26) .پژوهش حاضر نشان می دهد گیاه تحت تأثیر پرتو فرابنفش برای مقابله با تأثیرات مخرب این پرتو شروع به تولید متابولیتهای ثانویه جهت دفاع از خود کرده است. بررسی تأثیر پرتو UV-B برگیاه شمعدانی در شرایط گلخانه نشان داد میزان انواع فلاونول­هائی نظیر روتین، کوئرستین، کامفرول و میریستین وابسته به شدت تابش تغییر می­کند. به طوریکه با افزایش شدت تابش اشعه، نسبت کوئرستین/کامفرول افزایش می­یابد (10). در مطالعه تأثیر پرتوی فرابنفش بر روی گیاه Artemisia annua L. در محیط کشت بافت مشاهده شد که میزان ترکیبات فنلی در گیاهان تیمار یافته نسبت به گیاه کنترل افزایش یافته است (41). همچنین مطالعه تغییرات فنل در گیاهان Echium orientale L.رشد یافته در محیط کشت نشان داد که میزان فنل در گیاهانی که دو هفته بعد از تیمار برداشت شدند نسبت به گیاهانی که بلافاصله بعد از تیمار برداشت شده­اند افزایش داشته است (54). در بررسی تاثیر پرتوی UV-B بر روی کالوس‌های گیاه Echinacea Purpurea  و کشت سوسپانسیونی آن Manaf و همکاران (2016) گزارش دادند که میزان فنل، در گیاه تحت تأثیر اشعه UV-B افزایش یافته است (34). همچنین در بررسی تأثیر میزان متفاوت تابش اشعه UV-B بر روی کالوس‌های گیاه چای Zagoskina و همکاران (2003) عنوان کردند که میزان فنل در این گیاه افزایش یافته است (55). فلاوونوئیدها ترکیبات عمده در بافت‌های گیاهی هستند که عمل حفاظتی آن‌ها دفاع در برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از UV-B است (8). فلاونوئید از طریق جلوگیری از سنتز و شکل گیری مالون دی آلدئید باعث پایداری غشاء و نفوذ پذیری غشاء در نمونه های تحت تابش می­شود. در واقع افزایش بیوسنتز فلاونوئیدها تحت فاکتورهای محیطی مختلف و شرایط تنش­زا نوعی سازش با شرایط نامساعد محیطی می باشد (2). به طور مثال قرارگرفتن کالوس Passiflora Quadrangularis درمعرض دوز مطلوب UV-B باعث افزایش میزان فلاوونوئیدها شده است (26). همچنین تابش UV-B باعث القاء افزایش سطح فلاوونوئید در کالوس Ginko biloba می‌شود (22). افزایش میزان فلاونوئیدها در بررسی تأثیر پرتو UV-B بر روی گیاهان Artemisia annua L. و Echium orientale L. در محیط کشت بافت نیز مشاهده شده است (41و 54). اولین مکانیسم دفاعی برای گیاهان در برابر اشعه UV احتمالاً دفاع غیرنفوذی است و تابش UV-B باعث تجمع ترکیبات جذب‌کننده UV مانند آنتوسیانین‌ها می­شود که از دستگاه فتوسنتزی در برابر آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند (36و 48). مطالعه بر روی گیاه Artemisia annua L. در محیط کشت بافت تحت تأثیر پرتو UV-B افزایش میزان آنتوسیانین را نشان داد (41). گزارش Basahiو همکاران (2013)، در بررسی تأثیر پرتو فرابنفش بر روی گیاه Lactuca Sativa نشان داد که تمام ترکیبات جاذب UV مانند کاروتنوئیدها، فنل­ها و آنتوسیانین‌ها افزایش یافته‌اند (12). همچنین در بررسی دانه رست­های  Vigna Mungo تحت تیمار UV-B عنوان شد که میزان آنتوسیانین‌ها افزایش یافته است (47). افزایش میزان آنتوسیانین در گیاه کاهو نیز پس از تیمار توسط پرتو UV-B  مشاهده شد (3). در مطالعه حاضر تحت تأثیر پرتو فرابنفش میزان IC₅₀  عصاره متانولی شمعدانی عطری کاهش یافت. دلیل به وجود آمدن این حالت را به بیشتر بودن میزان فنل‌های کل محلول در گیاه مرتبط می‌دانند که رابطه همبستگی مستقیمی بین فعالیت آنتی‌اکسیدانی و میزان فنل کل را نشان می­دهد. بیشتر ترکیبات آنتی‌اکسیدانی طبیعی معمولاً برای ایجاد یک طیف وسیع از خواص آنتی‌اکسیدانی تا یک سیستم دفاعی قوی در برابر رادیکال‌های آزاد با هم همکاری می‌کنند. توانایی آنتی‌اکسیدانی ترکیبات فنلی بیشتر به دلیل خاصیت اکسید و احیاء آنها وهمینطور ساختار شیمیایی آن‌ها است، که به توانایی آن‌ها در کلات کردن فلزات انتقالی، ممانعت کردن از لیپوکسی ژناز و جاروب‌کردن رادیکال‌های آزاد منجر می­شود (34). نتایج پژوهش حاضر نشان می­دهد گیاه شمعدانی عطری در پاسخ به تنش UV-B مقدار فنل­ها­ی برگ را افزایش داده است. از این­رو گیاهان تحت تنش، قدرت آنتی اکسیدانی بیشتری (IC₅₀ کمتر) را از خود نشان داده­اند. در بررسی کالوس‌هایEchinacea Purpurea تحت پرتو UV-B، Manaf و همکاران (2016)، افزایش میزان خاصیت آنتی‌اکسیدانی (IC₅₀ کمتر) را در کالوس‌های تحت پرتو UV-B در مقایسه با کنترل، گزارش دادند (34). در مطالعه ای Li و همکاران (2017)، دریافتند که تحت تنش UV-C میزان ترکیبات فنلی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی چند نوع میوه نیمه گرمسیری در فرم‌های متفاوت میوه بالا می‌رود (32). در بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی کالوس‌های Pelargonium Sidoides­, Kumar و همکاران (2015)، عنوان کردند که خاصیت آنتی‌اکسیدانی گیاهان دارویی رابطه ای نزدیک با میزان ترکیبات فنلی دارد و بیشتر بودن خاصیت آنتی‌اکسیدانی نیز باعث بالا رفتن ارزش دارویی یک گیاه می‌شود (30). همچنین افزایش میزان خاصیت آنتی‌اکسیدانی (IC₅₀ کمتر) در گیاهان Artemisia annua L.  و Echium orientale L. در محیط کشت بافت تحت تأثیر پرتو UV-B مشاهده شد (41و 54). نتایج پژوهش حاضر نشان داد با افزایش شدت تابش میانگین محتوای کلروفیل­های a, b و کلروفیل کل کاهش نشان داده و میزان کاروتنوئید افزایش یافته است. کاهش میزان کلروفیل ممکن است به ممانعت از بیوسنتز کلروفیل و یا تخریب رنگیزه‌ها و یا پارامترهای آن‌ها مانند پروتوکلروفیل و یا پروتوکلروفیلید وابسته باشد (23و 44) و یا کاهش میزان کلروفیل ممکن است با تأثیرات فتومورفولوژی مشاهده شده در گیاه مانند کاهش طول، تغییر شکل و سطح برگ نیز در ارتباط باشد (17). کاروتنوئیدها جاروب کننده‌های مؤثری برای ROS هستند و کلروفیل‌ها را در برابر آسیب‌های اکسیداتیو نوری ایجاد شده به وسیله اشعه UV-B از طریق از بین بردن انرژی بیش از حد رسیده به گیاه محافظت می‌کنند (40). به نظر می­رسد که گیاه شمعدانی نیز تحت تأثیر پرتو فرابنفش میزان کاروتنوئید را افزایش داده است تا با آسیب ناشی از تخریب کروفیل مقابله کند. در بررسی تشعشعات UV-B و UV-C بر روی گیاه Artemisia Annua L عنوان شد که میزان کلروفیل تحت تأثیر اشعه UV به طرز معنی‌داری کاهش یافته است و افزایش میزان کاروتنوئید ممکن است به علت نقش جاروب کنندگی آن برای اکسیژن تکی باشد (44). Azarafshan و همکاران (2019) نشان دادند که در گیاه شمعدانی تحت تیمار UV-B میزان کلروفیل­ها کاهش و مقدار کاروتنوئیدها افزایش می­یابد (9). همچنین در بررسی تأثیر اشعه UV-B بر روی میزان کلروفیل خزه Bryum argenteum توسط Hui و همکاران (2015)، عنوان شد که کلروفیل a و b و کلروفیل کل کاهش داشته است (23). مطابق با یافته های ما  در شرایط کشت بافت (شیشه) میزان قند با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش افزایش نشان می­دهد، که می­تواند به دلیل تنش اضافی ناشی از کشت بافت علاوه بر تنش UV باشد. علاوه بر این محیط کشت میتواند تنش اسمزی را نیز ایجاد کند که تحت این تنش میزان کربوهیدرات ها به عنوان اسمولیت­های سازگار بالا می رود. Tegelberg و همکاران (2002)، در بررسی تأثیر پرتو UV-B بر روی فاکتورهای بیوشیمیایی گیاه Betula Pendula گزارش کردند که میزان کربوهیدرات­های کل و محلول افزایش یافته است که ممکن است نتیجه تغییر تقسیم‌بندی کربن یا شکستن کربوهیدرات‌های ذخیره به حالت کربوهیدرات­های محلول باشد و یا اینکه تعمیر و پروسه ممانعت از آسیب‌های UV بیشتر از این که احتیاج به کربوهیدرات­ها ذخیره داشته باشد محتاج کربوهیدرات­های محلول باشد (50). همینطور Huima و همکاران (2016)، در بررسی تأثیر UV-B بر گیاه داروئی Chrysanthemum عنوان کردند که تحت تأثیر UV میزان کربوهیدرات­ها افزایش یافته است (24). دراین مطالعه میزان پروتئین با تابش اشعه فرابنفش کاهش معنی داری یافت. تخریب پروتئین تحت تیمار UV-B ممکن است مستقیم (از طریق تخریب یا تغییر شکل باقی مانده‌های آمینواسیدی) یا غیرمستقیم (از طریق آسیب اکسیداتیو مربوط به افزایش تولید ROS یا مربوط به تغییر ساختار DNA و RNA که در نتیجه تغییر در نسخه‌برداری، ترجمه و در نهایت کاهش سنتز پروتئین را همراه دارد) باشد (48). در بررسی تأثیر اشعه UV-B در گیاه Solanum lycopersicum L مشاهده شد که میزان پروتئین با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش کاهش می‌یابد (11). کاهش در میزان پروتئین در نخود فرنگی و لوبیای مانگ نیز گزارش شده است (18). دراین مطالعه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز تحت تأثیر پرتو فرابنفش افزایش داشته است. اشعه UV به عنوان محرک آنزیم‌ فنیل آلانین آمونیا لیاز و آنزیم‌های دیگر مسیر ساخت فنیل پروپانوئیدها مطرح شده است. PAL فنیل آلانین را به تراس اسید سینامیک تبدیل می‌کند و این ترکیب با واکنش‌های متوالی تبدیل به ترکیباتی نظیر فلاوونوئیدها و فنل‌ها می‌شود. در بررسی سازش دفاعی در گیاه دارویی Coleus Forskohii در مقابل پرتو تابی UV-B, Takshak و Agrawal (2015) عنوان کردند که میزان آنزیم PAL تحت تنش UV-B افزایش یافته است (49). در بررسی سطوح مقاومت در برابر اشعه UV-B در گیاه Vaccinium Corymbosum,  Ecsobarو همکاران (2017)، عنوان کردند که میزان PAL و بیان ژن‌های مربوط به آن در ارقام مقاوم نسبت به ارقام حساس بیشتر بوده است (19). دراین مطالعه مشخص شد که میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در گیاهان تحت تیمار افزایش یافته است. تحت افزایش میزان UV-B سلول‌های گیاهی تولید ROS می‌کنند که به گیاه‌ آسیب می­رساند. گیاهان راهکارهای متفاوتی برای جاروب‌کردن ROS ها دارند. یکی از آن‌ها سیستم آنزیمی و آنزیم‌هایی مانند CAT، SOD و POD است (56). به نظر می­رسد که گیاه مورد مطالعه در این پژوهش نیز دفاع آنزیمی را برای مقاومت در برابر تاثیرات مخرب پرتو فرابنفش که توسط ROSها ایجاد می‍شود فعال می­کند. افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه سویا توسط Xu و همکاران(2008) گزارش شده است (53). در بررسی گیاه Pelargonium Zonal تحت تنش
 UV-B,Vidovic و همکاران (2015) مطرح کردند که میزان فعالیت کاتالاز در پاسخ به شدت تابش افزایش یافته است (51). Rai و همکاران (2011)، در بررسی تأثیر UV-B و UV-C بر گیاه Artemisia Annua L., گزارش دادند که فعالیت پراکسیداز با افزایش شدت پرتو UV-B افزایش یافته است (44). افزایش در میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز تحت تأثیر اشعه UV در دانه رست‌های بادام زمینی نیز گزارش شده است (27). همچنین در مطالعه پاسخ‌های مسیر فلاوونوئید به تیمار پرتو UV-B و همبستگی آن با پراکسیداسیون لیپیدها و سیستم آنتی‌اکسیدانی در Caryopteris Mongolica گزارش شد که فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافته است (33).

نتایج این پژوهش نشان داد گیاه شمعدانی معطر در پاسخ به تابش شدت­های مختلف پرتو  UV-B، توان آنتی اکسیدانی خود را, هم از طریق افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان و هم بالابردن مقدار فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها افزایش داده است.

تشکر و قدردانی

از شهرداری منطقه 3 تهران و مرکز تحقیقات و مشاوره گل

و گیاه  پارک ملت به علت در اختیار قرار دادن امکانات کشت بافت و گلخانه این مجموعه تقدیر و تشکر می­گردد.