Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Callogenesis and indirect somatic embryogenesis of Persian leek (Allium ampeloprasum spp. Persicum)

Document Type : Research Paper

Authors

1 Graduated MSc Student, Department of Horticultural Sciences, Gorgan university of agricultural sciences and natural resources, Gorgan, Iran.

2 Associated prof. Department of Horticultural Sciences, Gorgan university of agricultural sciences and natural resources, Gorgan, Iran.

3 Assistance Prof. Department of Horticultural Sciences, Gorgan university of agricultural sciences and natural resources, Gorgan, Iran.

Abstract

Persian leek is a cross-pollinate and heterozygote plant due to protandrous behavior. For implementation of Persian leek breeding programs, somatic embryogenesis can be used to accelerate the hybrid production process. The present study was carried out with the aim of studying of callogenesis and indirect somatic embryogenesis of Persian leek explants under in vitro conditions. For this purpose, Persian leek seeds were planted in 1/2MS semi-solid medium and the seedlings were planted directly, as well as one-centimeter pieces of leaves and roots cultured onto B5 and NL liquid media. In order to induction of callus and somatic embryo, the indole acetic acid and 2,4-D were used in three concentrations of 0, 1 and 2 mg/l. The results revealed that the callus was not formed in leaf explants, and a small amount of callus was formed in the root explants. However, embryonic callus appeared directly in 100% seedlings after two weeks. Calli were yellow and compact with have a friable texture and spherical structure. The highest embryonic callus was formed in B5 medium containing 2mg/l 2,4-D, which somatic embryos were observed after eight weeks subculture in realization. In non-auxin media as well as in NL medium, somatic embryo was not formed. Growth of the roots was increased after subculture the embryos onto B5 medium with 1 mg/l 2,4-D and 2 mg/l kinetin. As a general conclusion, callus formation and somatic embryogenesis of Persian leek were carried out in liquid B5 containing 2mg/L 2,4-D. Seedling had the highest percentage of embryonic callus.

Keywords

Main Subjects

پینه­زایی  و جنین­زایی رویشی غیرمستقیم تره ایرانی

(Allium ampeloprasum spp. persicum)

طاهره نظری، کامبیز مشایخی* و سید جواد موسوی زاده

1 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گروه باغبانی.

تاریخ دریافت: 10/08/98              تاریخ پذیرش: 04/06/99

چکیده

تره­ایرانی به علت پروتاندری، گیاهی دگرگشن و هتروزیگوت می­باشد. جهت برنامه­های اصلاح تره ایرانی، تکنیک جنین­زایی رویشی جهت تسریع در روند تولید هیبرید کاربرد دارد. پژوهش حاضر با هدف پینه­زایی و جنین­زایی رویشی غیرمستقیم ریزنمونه­های تره­ایرانی در شرایط درون شیشه­ای انجام شده است. ابتدا بذرهای تره­ایرانی در محیط جامد 1/2MS کشت شدند. در ادامه به طور مستقیم از ریزنمونه­های یک سانتیمتری برگ و ریشه دانهال­ها در محیط کشت مایع B5 و NL استفاده شد. از اسید ایندول استیک و 2,4-D (2و4- دی کلرو فنوکسی استیک اسید) در سه غلظت صفر، یک و دو میلی­گرم بر لیتر جهت القای پینه­ و جنین رویشی استفاده شد. نتایج نشان داد که در ریزنمونه­های برگ، پینه تشکیل نشد و در ریزنمونه­های ریشه نیز مقدار کمی پینه تشکیل شد. اما پینه جنین­زا به طور مستقیم در 100 درصد ریزنمونه­های دانهالی پس از گذشت دو هفته ظاهر شد. پینه­ها زرد و دارای بافت متراکم، گره­دار و کروی شکل بودند. بیشترین پینه جنین­زا در B5 حاوی دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D تشکیل شد که بعد از گذشت هشت هفته و واکشت در فاز ظهور جنین (رئالیزاسیون)، جنین­های رویشی ظاهر شدند. در محیط­های کشت بدون اکسین و همچنین در محیط کشت NL، جنین رویشی تشکیل نشد. بعد از واکشت جنین­ها در محیط B5 حاوی یک میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و دو میلی­گرم کنیتین، رشد ریشه­ها بیشتر شد. به­عنوان نتیجه­گیری کلی، پینه ­زایی و جنین­زایی رویشی تره ایرانی در B5 مایع دارای دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D مشاهده شد. همچنین بیشترین درصد پینه  جنین­زا در دانهال­ها به دست آمد.

واژه های کلیدی: القای جنین، تره ایرانی، 2,4-D، ظهور جنین، ریزنمونه.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123169765 ، پست الکترونیکی: kkambizmashayekhi@gmail.com

مقدمه

 

تره ایرانی با نام علمیAllium ampeloprasum ssp. persicum از خانواده Alliaceae، گیاهی تک­لپه، علفی و از نظر گیاهشناسی، گیاهی دوساله شناخته می­شود. قسمت قابل استفاده این سبزی، برگ­های سبز آن است (4). ترکیبات گوگرددار از مهم­ترین ترکیبات موجود در گیاهان این جنس است (22). گیاهان این جنس خاصیت آنتی اکسیدانی و ارزش غذایی بالایی دارند. برگ­های این گیاه مقادیر بالایی از آهن و ویتامین C دارد. علاوه بر آن تره ایرانی دارای فسفر، کلسیم، منگنز،  سدیم،  پتاسیم،  ویتامین

های A، B1، B2 و B6 است (15).

منشاء تره ایرانی از ایران بوده و پراکنش گسترده­ای در نقاط مختلف ایران داشته و سال­های طولانی در این کشور مورد کشت و مصرف قرار گرفته است (4). این در حالی است که برنامه مدونی روی به‌نژادی و تولید بذر آن صورت نگرفته است. با وجودی که گل آن دوجنسی (هرمافرودیت) بوده ولی به‌علت داشتن پروتاندری، گیاهی دگرگشن و هتروزیگوت می­باشد (3). لذا جهت اجرای برنامه­های اصلاحی در آینده، استفاده از تکنیک­های درون شیشه­ای مانند جنین­زایی رویشی جهت تسریع در روند تولید لاین و هیبریدها ضروری به‌نظر می­رسد (10). جنین­زایی رویشی از روش­های مدرن تکثیر درون شیشه­ای گیاهان است. اساس این تکنیک به دست آوردن سلول­ بنیادی و تمایز آن به یک گیاه کامل است. در جنین­زایی رویشی سلول­های غیرجنسی تحت شرایط خاص به جنین­های رویشی تغییر می­یابند (6). از عوامل موثر در جنین­زایی رویشی می­توان به ترکیبات محیط کشت، تنظیم­کننده­های رشد و نوع ریزنمونه استفاده شده اشاره کرد (8). به‌منظور آغاز جنین­زایی استفاده از یک اکسین خارجی، باعث القای تشکیل پینه­های جنین­زا و تحریک تولید جنین­ها می­گردد. در مرحله بعد کاهش و یا حذف اکسین از محیط، سبب رشد و توسعه جنین­ها می­شود (13).

در منابع گزارش­های کمی در زمینه القای موفق جنین­زایی رویشی در تره ایرانی وجود دارد. به‌عنوان مثال پینه­زایی و جنین­زایی رویشی از ریزنمونه ریشه A. schoenoprasum که یک گونه نزدیک به تره ایرانی است با استفاده از مواد تنظیم کننده رشد 2,4-D، بنزیل آمینوپورین و کنیتین در محیط کشت MS انجام شده است (24). در تحقیقی دیگر پرآوری  تره­فرنگی A. ampeloprasum L. در محیط کشت MS با مواد تنظیم کننده رشد اسید نفتالین استیک و کنیتین انجام شده است (25). در تحقیقات داخل کشور، ماده­زایی در شرایط درون شیشه­ای در هفت توده تره ایرانی با موفقیت انجام گفته است (3). در تحقیقی دیگر پینه­زایی از ریزنمونه­های برگ و بذر تره ایرانی تحت مواد تنظیم کننده رشد 2,4-D و بنزیل آمینوپورین انجام شده است (15).

روش جنین­زایی رویشی به دلیل کاربرد فراوان و پیچیدگی دارای اهمیت بالایی است. این فرآیند یکی از روش­های مناسب برای درک مکانیزم تمایزیابی در گیاه و میزان توانمندی سلول­ها است. از طریق جنین­زایی رویشی می­توان در حجم اندکی از محیط کشت تعداد زیادی جنین را تولید کرده و سپس تبدیل به گیاهچه نمود. با توجه به اهمیت روش­های نوین ازدیاد گیاهی از قبیل کشت درون شیشه­ای و مزایای آنها در تولید ارقام جدید، می­توان از این تکنیک در اصلاح محصولات مهم کشاورزی نیز استفاده کرد. با توجه به کمبود اطلاعات در زمینه جنین­زایی تره ایرانی، در این تحقیق پینه­زایی و باززایی از طریق جنین­زایی رویشی در شرایط درون شیشه­ای مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

پژوهش حاضر طی سال­های 1397-1396 در آزمایشگاه کشت بافت گروه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد.

تهیه مواد گیاهی: بذرهای تره ایرانی از منطقه نودیجه شهر گرگان (36°50′15″N 54°16′25″E) جمع­آوری شده بود. در شروع آزمایش بذرها، به‌مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد غوطه‌ور شدند. پس از آن توسط هیپوکلریت سدیم دو درصد به مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند و در زیر هود لامینار سه مرتبه توسط آب مقطر شتشو شدند. به‌منظور تهیه ریزنمونه­ها، ابتدا بذرها در محیط MS (18)، با نصف غلظت (½ MS) کشت شد. محیط‌های کشت شده به اتاقک رشد با شدت نور 2000 لوکس و دمای 2±26 درجه سانتی‌گراد و طول روز 16 ساعت انتقال یافتند. بعد از دو هفته از زمان کشت، دانهال­های تره ایرانی به قطعات یک سانتی‌متری، از قسمت برگ و ریشه تقسیم شدند و برای آزمایش جنین­زایی مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین بذرها به‌طور مستقیم نیز در محیط القای جنین­زایی قرار گرفتند.

شکل پینه: شکل پینه بر اساس بافت پینه  (متراکم، سخت، نرم و ترد) و رنگ پینه  بر اساس ظاهر بافت تعیین شدند (12).

آماده سازی محیط‌های کشت برای القای جنین: ابتدا محیط‌های کشت پایه B5 (9) و NL (19) با توجه به دستورالعمل تهیه شد. در این تحقیق از مواد تنظیم کننده رشد 2,4-D با غلظت­های صفر، یک و دو میلی­گرم در لیتر در محیط مایع B5 استفاده شد و همچنین در محیط مایع NL اکسین اسید ایندول استیک با غلظت‌های صفر، یک و دو میلی­گرم در لیتر برای القای جنین رویشی به‌کار گرفته شد. pH محیط‌های کشت با استفاده از دستگاه pH متر و با کاربرد سود یا اسید کلریدریک در محدوده 7/5 تنظیم گردید. محیط‌های کشت شده در اتاقک رشد با نور 3000 لوکس و دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد و طول روز 16 ساعت نگهداری شدند. به‌منظور ظهور جنین­ها، نمونه­ها به محیط­های مشابه مرحله القا ولی بدون حضور اکسین منتقل شدند. جهت حذف کامل اکسین، نمونه­ها در محیط­های کشت استریل شده بدون اکسین در سه مرحله به مدت 5، 10 و 15 دقیقه شست‌وشو شدند پس از گذشت سه هفته، عمل واکشت (Subculture) ریزنمونه‏ها در محیط‏ قبل اما با هدف ظهور جنین‏ها در حالی­که 2,4-D از آنها حذف شده، انجام گرفت (16). در ادامه ریزنمونه­ها در بالن­های T شکل واکشت شدند و در دستگاه آکسوفیتون با دوران یک دور در دقیقه و نور دائم (2000 لوکس) قرار گرفتند. دستگاه آکسوفیتون دارای صفحات دوار با زاویه 10 تا 12 درجه نسبت به خط عمود می باشد. شیشه­های T شکل بر روی این صفحات دوار قرار داده می­شوند و با سرعت کنترل شده (یک دور در دقیقه) با حرکت دورانی می­چرخند و با چرخش خود سبب خارج شدن نمودن ریزنمونه از محلول غذایی شده و بدین وسیله هوادهی انجام می­شود. این دستگاه دارای لامپ­های مهتابی در اطراف صفحات دوار می­باشد که به‌صورت بهینه نور مورد نیاز (2000 لوکس) را فراهم می‌کند. پس از گذشت چهار هفته در مرحله ظهور جنین­ها، تعداد جنین‏های رویشی تولید شده در مراحل کروی شکل، قطبی و بالغ با استفاده از دستگاه استرئوسکوپ (Striyo, Sunny. Monitoring, Sony) متصل به کامپیوتر در دو  بزرگنمایی X20 و X40، شمارش و عکس‏برداری گردیدند.

محیط کشت باززایی جنین­های رویشی: به‌منظور تکامل و باززایی جنین­ها در محیط B5، مواد تنظیم کننده رشد کینتین با غلظت دو میلی­گرم بر لیتر به محیط اضافه شد.

تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیل داده‏ها با استفاده از طرح کاملاً تصادفی با چهار تیمار در چهار تکرار صورت گرفت. مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد و با استفاده از نرم‏افزار آماری SAS 9.1 انجام شد.

نتایج

اثر نوع ریزنمونه و محیط کشت بر پینه­زایی تره ایرانی: بررسی تشکیل پینه گیاه تره ایرانی به‌صورت کشت مایع در محیط B5 و NL انجام شد. در آزمایش اول، بذور تره ایرانی پس از ضدعفونی در محیط کشت ½ MS قرار داده شدند و پس از گذشت سه هفته، از دانهال­های به‌دست آمده جهت تهیه ریزنمونه­های برگ و ریشه استفاده شد. نتایج نشان داد که در ریزنمونه­های برگ هیچ پینه­ای تشکیل نشد ولی ریزنمونه­های ریشه بعد از گذشت دو هفته متورم شده و مقدار کمی پینه روی ریزنمونه­ها تشکیل گردید (شکل 1 و جدول 1). این در حالی است که در آزمایش دوم، بذور تره ایرانی پس از ضدعفونی به‌صورت مستقیم در محیط کشت مایع B5 قرار داده شد. نتایج این آزمایش نشان داد که پس از جوانه­زنی بذور و گذشت دو هفته در دانهال­ها، پینه  در 100 درصد نمونه­ها ظاهر شد. این پینه­ها زرد رنگ و دارای بافت متراکم و دارای ساختار گره­دار و کروی شکل بودند (شکل 1 و 2، جدول 1). در ادامه از این پینه­ها جهت تولید جنین­های رویشی استفاده شد.

بر اساس نتایج به دست آمده، تولید پینه جنین­زا فقط در محیط B5 حاوی 2,4-D مشاهده شد و در محیط NL حاوی اسید ایندول استیک پینه  جنین­زایی مشاهده نشد.

 

جدول 1- تأثیر نوع ریزنمونه بر کیفیت پینه و درصد پینه­زایی تره ایرانی در محیط کشت مایع B5 حاوی دو میلی‌گرم در لیتر 2,4-D.

 

ریز نمونه ریشه

نمونه دانهال بذری

میانگین وزن تر (gr)

253/0

64/0

کیفیت ظاهری پینه

سفید مایل به زرد، شکننده

زرد رنگ، بافت گره­دار و جنین­زا

درصد پینه­زایی

25 درصد

6/96 درصد

 

 

شکل 1- پینه­زایی تره ایرانی دو هفته بعد از کشت در محیط مایع B5 حاوی دو میلی گرم در لیتر 2,4-D. a) پینه‌زایی دانهال، b) پینه­زایی ریزنمونه ریشه (مقیاس = 1 میلی­متر).

 

 

 

شکل 2- پینه­های تشکیل شده روی دانهال­های تره ایرانی دو هفته بعد از کشت در محیط مایع B5 حاوی دو میلی گرم در لیتر 2,4-D.

 

نتایج نشان داد که در محیط فاقد اکسین، پینه­ای تشکیل نشد و با توجه به اندازه‌گیری­ها و سنجش از نظر کیفیت ظاهری و بررسی روند افزایش رشد پینه در محیط مایع B5، بیشترین درصد تولید پینه جنین­زا در محیط حاوی دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D به‌دست آمد. همچنین بیشترین وزن تر پینه (623/0 گرم) مربوط به تیمار دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D بود (شکل 3).

ظهور جنین­های رویشی: در این تحقیق که با  استفاده  از

دو محیط کشت B5 و NL انجام شد، جنین­زایی فقط در ریزنمونه‌های کشت شده در محیط B5 مشاهده شد، که نشان‌دهنده اثر معنی­دار نوع محیط کشت و تنظیم‌کننده­های رشد بر جنین­زایی رویشی در تره ایرانی است. نتایج نشان داد که در محیط NL حاوی اسید ایندول استیک جنین­ رویشی تشکیل نشد که دلیل آن می­تواند ضعیف بودن این نوع اکسین و یا مدت زمانی که ریزنمونه در مجاورت آن قرار داشته، باشد. بر این اساس در تجزیه و تحلیل آماری داده­ها از محیط کشت NL صرف نظر شد. نتایج به‌دست آمده از تجزیه واریانس (جدول 2) نشان داد که تیمارهای مورد استفاده، اثر معنی­داری بر جنین­زایی رویشی تره ایرانی دارند. جنین­های رویشی شش تا هشت هفته بعد از واکشت در مرحله ظهور (رئالیزاسیون) در مراحل مختلف جنینی مشاهده شدند (شکل 5 و 6). اولین جنین­های کروی­شکل، شش هفته بعد از واکشت پینه­های جنین­زا ظاهر شدند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که بیشترین درصد جنین­زایی در محیط مایع B5 حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4-D به دست آمده است (شکل 4).

 

 

 

شکل 3- اثر دو غلظت 2,4-D بر: الف) درصد پینه­­زایی و ب) وزن تر پینه دانهال تره ایرانی در محیط مایع B5.

 

جدول 2- جدول تجزیه واریانس اثر محیط کشت و تنظیم کننده­های رشد بر جنین­زایی رویشی تره ایرانی

میانگین مربعات

منابع تغییر

درجه آزادی

مرحله کروی

مرحله قلبی

مرحله دوقطبی

تعداد کل جنین

تیمار

6

**95/44

**88/96

**87/38

**29/530

خطا

8

78/0

46/0

67/0

31/0

ضریب تغییرات

31/18

42/16

22/21

65/8

** معنی دار بودن در سطح یک درصد.

شکل 4- مقایسه میانگین تعداد جنین­های رویشی تره ایرانی در محیط مایع B5 حاوی 2,4-D. -

میانگین­های دارای حروف مشترک اختلاف معنی­داری ندارند.

 

 

شکل 5- توسعه پینه جنین­زا روی دانهال تره ایرانی در محیط مایع B5 حاوی دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D .  الف) جنین­های کروی شکل شش هفته بعد از کشت و ب) جنین در مرحله دو­قطبی هشت هفته بعد از کشت. (مقیاس = 1 میلی­متر).

 

شکل 6- مراحل مختلف جنین­زایی رویشی درون شیشه­ای تره ایرانی در محیط مایع B5 حاوی دو میلی گرم بر لیتر 2,4-D. الف) جنین کروی شکل، شش هفته بعد از کشت، ب) جنین قلبی شکل، شش هفته بعد از کشت،ج ) جنین دوقطبی، هشت هفته بعد از کشت، د) جنین در مرحله بلوغ، هشت هفته بعد از کشت. (مقیاس = 1 میلی­متر).

 

ریشه­زایی در محیط B5 : در این آزمایش هر چهار هفته عمل واکشت نمونه‌ها در محیط جدید انجام شد. بررسی­های انجام شده در این آزمایش نشان داد که بعد از انتقال ریزنمونه­ها از محیط حاوی یک میلی­گرم بر لیتر 2,4-D به محیط حاوی یک میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D به همراه دو میلی­گرم کنیتین رشد ریشه­ها بعد از هشت هفته بیشتر شد (شکل 7). در محیط حاوی سیتوکنین باززایی بیشتر و در مدت زمان کمتر اتفاق افتاد که خود نشان‌دهنده تأثیر سیتوکنین در قابلیت تحریک، تکثیر و تقسیم سلولی در بافت پینه است.

بحث

تحقیقات گذشته نشان داده است که پینه­های زرد رنگ و دارای بافت متراکم و دارای ساختار گره­دار و کروی شکل توانایی تولید جنین­های رویشی را دارند (17، 23) که با نتایج حاصل از این آزمایش همسو بود (شکل 1).  

 

 

شکل 7- ریشه­زایی درون شیشه­ای جنین­های تره ایرانی هشت هفته بعد از کشت در محیط B5 حاوی یک میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و دو میلی­گرم بر لیتر کنیتین.

 

در آزمایشی دیگر روی پیاز (Allium cepa L.)، پینه­های به‌دست آمده در محیط MS به دو صورت گزارش شد. نوع اول پینه­هایی که شکننده و به رنگ سفید مایل به زرد بوده و به راحتی به قطعات کوچک تقسیم می­شدند و نوع دیگر پینه ­هایی که دارای بافت فشرده، زرد رنگ با سطح صاف و ساختار گره­دار بودند (21). در آزمایشی که روی ریزنمونه ریشه گیاه سیر (A. sativum L.) به‌منظور القای پینه و باززایی گیاه انجام شد، پس از 8 هفته پینه­های متراکم و گره­دار در محیط MS حاوی 2,4-D (0.3- 0.4- 0.5- 0.6 mg/l) مشاهده شد که محیط مطلوب برای القای پینه، محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D به همراه 5/0 میلی­گرم در لیتر کنیتین بود (14). گزارش شده است که بالاترین وزن تر کالوس گیاه مامیران در محیط MS تیمار شده با یک 1 گرم بر لیتر 2,4-D  در کنار یک و 5/0 میلی گرم بر لیتر BAP یا TDZ بدست آمد (1). همچنین در آزمایشی که فقط از 2,4-D به‌منظور القای پینه ­استفاده شده بود اثر تفاوت غلظت این تنظیم کننده رشد حتی افزایش غلظت از  5/0 به 1 میلی‌گرم در لیتر باعث افزایش القای پینه در گیاه سیر شد که با نتایج حاصل از این تحقیق همسو بود (11). در گزارشی دیگر پرآوری  تره­فرنگی A. ampeloprasum L. در محیط کشت MS با 25/0 میلی گرم در لیتر اسید نفتالین استیک و 2 میلی­گرم در لیتر کنیتین انجام شده است (25). همچنین نشان داده شده است که بیشترین درصد تشکیل پینه و بالاترین تعداد جنین رویشی در گیاه مارچوبه در محیط MS حاوی چهار میکرومولار BAP به همراه دو میکرومولار 2,4-D به دست آمد (5).

نتایج حاصل از آزمایش که روی پارانشیم ثانویه هویج انجام شد نشان داد که تفاوت معنی­داری در جنین­زایی در محیط کشت حاوی 2,4-D و محیط حاوی اسید ایندول استیک وجود دارد به‌طوری که اثر 2,4-D در جنین­زایی بیشتر بود که می‌توان دلیل آن را به ثبات 2,4-D و ناپایداری اسید ایندول استیک در محیط نسبت داد (6). مشخص شده که حتی در محیط کشت بدون ریزنمونه گیاهی نیز اسید ایندول استیک در اثر اکسیداسیون نوری از بین می­رود. بنابراین شاید زمان کافی جهت القای جنین­زایی رویشی وقتی که از اسید ایندول استیک استفاده می شود، وجود نداشته باشد. با افزودن اسید ایندول استیک به محیط کشت القاء به‌عنوان تنظیم کننده رشد اکسینی که به‌تدریج اکسید می­شود، می­توان در شرایطی که سلول­های ریزنمونه حساس بوده و دارای اکسین داخلی بالایی باشند، بدون انجام عمل بازگشت جنین رویشی به دست آورد. کشت ریزنمونه در محیط حاوی اسید ایندول استیک باعث می­شود که به علت غلظت بالای این تنظیم کننده رشد عمل القاء انجام گیرد (6).

در تحقیقی تأثیر غلظت‌های مختلف 2,4-D بر جنین­زایی رویشی گیاه .A. schoenoprasum L مورد بررسی قرار گرفت و گزارش شد که جنین­زایی رویشی و پینه­های جنین­زا به‌طور همزمان مشاهده نشد که نشان­دهنده این نکته است که جنین­زایی رویشی در این گیاه غیرهمزمان است (24). در تحقیقی دیگر بیشترین درصد ماده­زایی در توده گرگان تره ایرانی گزارش شده است (3). نتایج این آزمایش نشان داد که در محیط بدون اکسین جنینی تشکیل نشد، اما در حضور اکسین جنین­های رویشی شکل گرفت. در القا و تولید جنین­های رویشی، 2,4-D در بین انواع اکسین­ها به عنوان پرکاربردترین تنظیم کننده رشد گزارش شده است (6، 17). به‌منظور آغاز القای جنین­زایی استفاده از یک اکسین خارجی که به‌طور معمول از 2,4-D برای این منظور استفاده می‌شود باعث القای پینه­های جنین­زا و سپس رشد و تکامل جنین­ها می­شود (17). نتایج آزمایش روی ریزنمونه برگ گیاه Fritillaria meleagris L. از خانواده Liliaceae جهت جنین­زایی رویشی نشان داد که بهترین تنظیم کننده رشد برای این منظور استفاده از 2,4-D با غلظت 1/0 میلی‌گرم در لیتر بود (20). گزراش شده است که 2,4-D در غلظت 25/. میلی گرم در لیتر برای جنین زایی سوماتیکی بلوط مناسب هست (2). همچنین 2,4-D در غلظت دو و چهار میلی گرم در لیتر به‌طور موفقیت­آمیزی برای ماده­زایی تره ایرانی بکار گرفته شده است (3). در آزمایشی دیگر با افزایش غلظت 2,4-D، درصد پینه جنین­زا و تعداد جنین تشکیل شده افزایش یافت (24) که با نتایج این آزمایش مطابقت دارد. بسیاری از محقق­ها مشاهده کردند که کنترل فرآیندهای تمایزیابی وابسته به حضور اکسین و سیتوکنین است و توازن بین آنها منجر به تحریک تولید اندام هوایی و ریشه از پینه می­شود. همچنین از سیتوکنین با توجه به توانایی در افزایش تقسیم سلولی می­توان در تسریع بلوغ جنین­ها به ویژه در مرحله رشد و نمو لپه­ها و تبدیل آنها به گیاهچه بهره برد (6). گزارش­هایی بر القای موفق جنین با کاربرد سیتوکنین وجود دارد، به عنوان نمونه بنزیل­آدنین در القای ماده­زایی از گل تره ایرانی بکار گرفته شده است (3). همچنین افزودن کنیتین به میزان 5/2 میکرومولار در محیط MS سبب افزایش درصد بلوغ جنین­های گیاهی شد (7).

نتیجه گیری کلی

با توجه به نتایج به دست آمده از این تحقیق، مشخص شد که تره ایرانی توانایی پینه­زایی و جنین­زایی رویشی در محیط مایع B5 را دارا است. همچنین با توجه به نتایج اثر نوع ریزنمونه، محیط کشت و تنظیم کننده رشد مورد استفاده در جنین­زایی رویشی در گیاه تره ایرانی در سطح یک درصد معنی دار بوده که نشان می­دهد نوع ریزنمونه مورد کشت بر تشکیل پینه، درصد و وزن تر پینه جنین­زا اثر گذار است به طوری که بیشترین درصد تشکیل پینه در نمونه­های دانهال این گیاه بود. در این آزمایش محیط کشت مایعB5 حاوی دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D بهترین نتیجه را در پینه­زایی تره ایرانی به همراه داشت. نتایج حاصل از جنین­زایی رویشی تره ایرانی نشان داد که در محیط کشت بدون حضور تنظیم کننده رشد جنینی مشاهده نشد. مقایسه تیمارها نشان داد که محیط B5 حاوی دو میلی­گرم بر لیتر 2,4-D بیشترین تعداد جنین رویشی را تولید کرد. در حالی که در محیط NL حاوی اسید ایندول استیک هیچ جنینی تشکیل نشد. نتایج مربوط به اندام­زایی نیز نشان داد محیط B5 حاوی یک میلی­گرم بر لیتر 2,4-D به همراه دو میلی­گرم بر لیتر کنیتین، محیط مناسبی برای ریشه زایی تره ایرانی است. شاخه­زایی تره ایرانی، سازگاری جنین­های بالغ گیاهچه­ای با محیط برون شیشه­ای و همچنین خصوصیات مورفولوژیکی و فنوتیپی گیاه سازگار شده نیاز است که مورد بررسی قرار گیرد.

سپاسگزاری

از دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان جهت حمایت های مادی و معنوی جهت اجرای پژوهش حاضر تقدیر می گردد.

  • عزیزخواجه، آ.، دورانی، ا.، اهری زاد، س.، 1399. باززایی درون شیشه‌ای مامیران ایرانی (Chelidonium majus L.). مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 33(2). صفحات 434-445.
  • فیضی، ا.، مرادی، ع.، معصومی اصل، ا.، 1399. جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم و تولید بذر مصنوعی در بلوط ایرانی (Quercus brantii L.) با استفاده از هورمون 2,4-D. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 33(2). صفحات 316-327.
  • قهرمانی، ز.، حسندخت، م.، کاشی، ع.، امیدی، م.، جعفرخانی کرمانی، م.، 1392. واکنش برخی توده های تره ایرانی به ماده‌زایی در محیط درون شیشه ای. علوم باغبانی ایران. 44 (1). 80-73.
  • مشایخی، م.، شمالی، ا.، 1397. گیاهشناسی، فیزیولوژی و کشت سبزی. انتشارات دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان. 502 صفحه.

 

  • Azad, M.A.K., and Amin, M.N., 2017. Regeneration of Asparagus officinalis Through Embryogenic Callus. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 27, PP: 21-31.
  • Bhojwani, S.S., and Dantu, P.K. 2013. Somatic embryogenesis. In Plant Tissue Culture: An Introductory Text. Springer India. PP: 75-92.
  • Ceasar, S.A., and Ignacimuthu, S., 2010. Effects of cytokinins, carbohydrates and amino acids on induction and maturation of somatic embryos in kodo millet (Paspalum scorbiculatum). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 102, PP: 153-162.
  • Deo, P.C., Tyagi, A.P., Taylor, M., Harding, R., and Becker, D., 2010. Factors affecting somatic embryogenesis and transformation in modern plant breeding. South Pacific Journal of Natural Science, 28, PP: 27-40.
  • Gamburg, O.L., Miller, R.A., and Ojima, K., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, 50, PP: 151-158.
  • Gantait, S., Mandal, N., and Das, P.K., 2010. An Overview on in vitro Culture of Genus Allium. American Journal of Plant Physiology, 5, PP: 325-337.
  • Hassan, M., Haque, M., and Hassan, M., 2014. An efficient protocol for somatic embryogenesis of garlic (Allium sativum) using root tip as explant. Journal of Bangladesh Agricultural University, 12, PP: 1-6.
  • Ikeuchi, M., Sugimoto, K., Iwase, A., 2013. Plant callus: mechanisms of induction and repression. The Plant Cell, 25, PP: 3159-3173.
  • Kaur, R., and Kapoor, M. 2016. Plant regeneration through somatic embryogenesis in sugarcane. Sugar Technology, 18, PP: 93-99.
  • Khan, N., Chaudhary, M.F., Abbasi, A.M., Khan, A., Nazir, A., and Shah, G.M., 2017. Development of an Efficient Callus Derived Regeneration System for Garlic (Allium sativum L.) from Root Explant. Journal of Plant Biology and Agriculture Science, 1, PP: 1-12.
  • Monemi, M.B., Kazemitabar, S.K., Khaniki, G.B., Yasari, E., Sohrevardi, F., Pourbagher, R., 2014. Tissue culture study of the medicinal plant leek (Allium Ampeloprasum L). International Journal of Molecular and Cellular Medicine, 3, PP: 118–25.
  • Mousavizadeh, S.J., Mashayekhi, K., Akbarpoor, V., Kallati, H.R., and Ghasemi, Y., 2010. Effect of IAA and 2,4-D on somatic embryogenesis and pigments synthesis of carrot root secondary phloem. Australasian Journal of Agricultural Engineering, 1, PP: 126-131.
  • Mousavizadeh, S.J., Mashayekhi, K., and Hassandokht, M.R., 2017. Indirect somatic embryogenesis on rare octoploid Asparagus breslerianus plants. Scientia Horticulture, 226, PP: 184-190.
  • Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiology of Plant, 15, PP: 473-497.
  • Neumann, K.H., 1966. Wurzelbildung und Nukleinsauregehalt bei phloem Gewebekulturen der karrotenwurzel auf synthetischen Nahrmedium verschiedener Hormonkombina-tionen. Lees Phytohormones ET Organogenese, 38, PP: 95-102.
  • Petric, M., Subotic, A., Jevremovic, S., Trifunovic-Momcilov, M., Tadic, V., Grujic, M., and Vujcic, Z., 2017. Esterase and peroxidase isoforms during initial stages of somatic embryogenesis in Fritillaria meleagris L. leaf base. Archives of Biological Sciences, 69, PP: 619-625.
  • Ramakrishnan, M., Ceasar, S.A., Duraipandiyan, V., Daniel, M.A., and Ignacimuthu, S., 2013. Efficacious somatic embryogenesis and fertile plant recovery from shoot apex explants of onion (Allium cepa. L.). In Vitro Cell Development Biology –Plant, 49, PP: 285-293.
  • Sobolewska, D., Michalska, K., Podolak, I., and Grabowska, K., 2016. Steroidal saponins from the genus Allium. Phytochemistry Reviews, 15, PP: 1-35.
  • Sujana, P., and Naidu, C.V., 2011. High frequency rapid plant regeneration from shoot tip and nodal explants of Menhta piperita - An important multipurpose medicinal plant. Journal of Phytology, 3, PP: 9-13.
  • Zdravkovic-Korac, S., Milojevic, J., Tubic, L., Calic-Dragosavac, D., Mitic, N., and Vinterhalter, B., 2010. Somatic embryogenesis and plant regeneration from root sections of Allium schoenoprasum Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 101, PP: 237-244.
  • Gantait, S., Mandal, N., Bhattacharyya, S., Das, P.K., Mandal, N., Bhattacharyya, S., and Das, P.K., 2009. In vitro mass multiplication with genetic clonality in elephant garlic (Allium ampeloprasum). Journal of Crop Weed, 5, PP: 100-104.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 34, Issue 4
December 2021
Pages 1076-1085
  • Receive Date: 01 November 2019
  • Revise Date: 19 June 2020
  • Accept Date: 25 August 2020