Evaluation of water deficite stress and plant growth-promoting rhizobacteria effect on some of morphological traits and expression level of TDC and STR at the root of Catharanthus roseus

Document Type : Research Paper

Authors

1 Agronomy & Plant Breeding Department, , Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan- Iran.

2 Bu-Ali Sina University

3 Seed and Plant Certification and Registration Institute, Karaj, Iranmo

4 College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran,, Karaj, Iran.

Abstract

Catharanthus roseus is one of the most extensively investigated medicinal plants. Increase the concentrations of TIAs in plant organs, by biotic and abiotic treatments, is an important breeding objective on C. roseus. The effect of plant growth promoting rhizobacteria, Pseudomonas fluorescens and Azospirillum brasilense separately and in combination along with moisture treatment at two levels were tested in Catharanthus roseus as a factorial experiment based on randomized complete block design in three replications. Effect of treatments was evaluated 30 days after applying moisture treatments on some of morphological traits and Tdc and Str genes expression at the root of plant using qRT-PCR reaction. Water deficit significantly increased root length but it had no significant effect on the expression of these genes. Treatment with A. brasilense in normal condition enhanced length, volume and surface of roots, also significantly increased Str key gene expression. P. fluorescens had a positive and significant effect on the expression of the studied genes under normal and stress conditions compared to the control plants, despite the decrease in the amount of morphological traits. P. fluorescens and A. brasilense, separately, performed better in terms of their effects on the expression of the studied genes and increased the gene expression in normal and stress conditions compared to control plants. It is expected that by increasing the expression of Tdc and Str genes, the product of these genes as well as the final products of TIAs biosynthetic pathway, including ajmalicin content enhance at the root of periwinkle plant.

Keywords

بررسی اثر تنش کمبود آب و باکتری­های تقویت کننده رشد گیاه بر برخی از صفات ریخت­شناسی و بیان ژن­های Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش (Catharanthus roseus)

مریم احمدزاده1، امیرحسین کشت­کار1*، کبری مسلم­خانی2 و مسعود احمدزاده3

1 ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی

2 ایران،  تهران، موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال

3 ایران، کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی

تاریخ دریافت:14/04/1399           تاریخ پذیرش: 12/05/1399

چکیده

گیاه پروانش یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی است. افزایش مقدار ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها (TIA) در اندام­های این گیاه از طریق اعمال تیمارهای زیستی و غیر زیستی یکی از اهداف فعالیت­های اصلاحی می­باشد. در این بررسی تاثیر دو گونه از باکتری­های تقویت­گر رشد Pseudomonas fluorescens و Azospirillum brasilense به صورت جداگانه و ترکیبی همراه با دو سطح تیمار رطوبتی به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفتند. اثر تیمارها بر برخی صفات ریخت­شناسی در مرخله گلدهی و نیز بیان دو ژن Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش با استفاده از تکنیک qRT-PCR بررسی گردید. تنش کمبود آب، رشد طولی ریشه را به طور معنی­داری افزایش داد ولی تاثیر معنی­داری بر بیان ژن­ها نداشت. باکتری A. brasilense در شرایط عدم تنش، با افزایش طول، حجم و سطح ریشه، افزایش معنی­دار بیان ژن کلیدی Str را در پی داشت. باکتری P. fluorescens نیز با وجود کاهش مقادیر صفات رویشی، تاثیر مثبت و معنی­داری بر بیان ژن­های مورد بررسی در شرایط عدم تنش و تنش نسبت به گیاهان شاهد داشت. از نظر تاثیر بر بیان ژن­های مورد بررسی، دو گونه باکتریایی به­طور جداگانه بهتر عمل نموده و بیان ژن­ها را در هر دو شرایط رطوبتی نسبت به گیاهان شاهد بدون تنش و تحت تنش افزایش دادند. انتظار می­رود با افزایش بیان دو ژن Tdc و Str محصول این ژن­ها و محصولات نهایی مسیر بیوسنتزی انواع TIA از جمله مقدار آجمالیسین در ریشه گیاه پروانش افزایش یابد.

واژه های کلیدی: پروانش، ریزوباکتری­های تقویت کننده رشد گیاه، واکنش qRT-PCR، ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها، تنش کمبود آب

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188109096 ، پست الکترونیکی: akesht@googlemail.com

مقدمه

 

گیاه پروانش با نام علمی Catharanthus roseus (L.) G. Don متعلق به تیره خرزهره (Apocynaceae)، به عنوان یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی به شمار می­رود (28، 45 و 54). ارزش بسیار بالای پروانش بر اساس منفعت دارویی هنگفت آن که تولید کننده بیش از 130 نوع ترپنوئید ایندول آلکالوئید Terpenoid indole alkaloid (TIA) می­باشد، قرار دارد (13). گروه TIA، یکی از بزرگترین و متنوع­ترین گروه آلکالوئیدی در گیاه پروانش است. این گیاه منبع انحصاری دو آلکالوئید وین­بلاستین و وین­کریستین می­باشد که به دلیل داشتن فعالیت ضد سرطانی، از جمله مهم­ترین آلکالوئیدها محسوب می­شوند (54). علاوه براین ریشه این گیاه محل تجمع دو آلکالوئید آجمالسین و سرپنتین است (7، 28،  29، 33 و 45). آجمالیسین اولین بار در سال 1957 به عنوان داروی ضد فشار خون برای درمان اختلالات گردش خون و بیماران دارای فشار خون بالا، شناخته شد (51). امروزه با وجود پیشرفت­های زیاد در زمینه ساخت ترکیبات دارویی، این آلکالوییدها هنوز از طریق استخراج از گیاه پروانش به دست می­آیند (7، 9 و 35). هزینه بالای تولید آلکالوئیدهای مهم دارویی به مقدار کم تجمع این مواد در اندام­های گیاه پروانش مربوط می­شود. بنابراین افزایش مقدار TIA در اندام­های این گیاه یکی از اهداف فعالیت­های ژنتیکی و اصلاحی در گیاه پروانش محسوب می­شود (28).

  1. roseus یک سیستم مدل مفید برای مطالعه مسیر بیوسنتزی ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها است (51). پیشرفت­های حاصل شده در زمینه مسیر بیوسنتزی TIA و نیز شناسایی ژن­های کد کننده آنزیم­های مرتبط با این مسیر در یک مقاله مروری بیان شده است (52). ژن­های مهم کد کننده آنزیم­های کلیدی در ابتدای مسیر بیوسنتزی شامل ژن­های گرانیول 10-هیدروکسیلاز Geraniol hydroxylase (G10h)، تریپتوفان دکربوکسیلاز Tryptophan decarboxylase (Tdc)، استریکتوسیدین سنتتاز Strictosidine synthase (Str) و استریکتوسیدین β- D- گلوکوسیداز Strictosidine b-D-glucosidase (Sgd) می‍باشد (25). Tdc و G10h مراحل اولیه بیوسنتز TIA را به ترتیب در مسیر ایندولی (تریپتامین) و مسیر ترپنوئیدی (سکولوگانین) کاتالیز می­کنند. سپس آنزیم Str، در شاخه میانی مسیر، تریپتامین و سکولوگانین را متراکم ساخته و استریکتوسیدین را تولید می­نماید (25 و 51). آلکالوئید استریکتوسیدین یک حد واسط مرکزی در بیوسنتز انواع TIA بوده (54) و حکم ستون فقرات را در ساختمان آن­ها دارد (25). در واقع استریکتوسیدین پیش­ماده مشترک انواع مختلف TIA است که می­تواند به یک سری از منوترپنوئید ایندول آلکالوئید با ساختار و عملکردهای زیستی متنوع تبدیل شود (54).

تحقیقات نشان داده است که بین میزان بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی TIA و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط با این ژن­ها در گیاه پروانش ارتباط وجود دارد (18، 25 و 52). Dutta et al در سال 2005 بمنظور درک این ارتباط، شش منبع ژنتیکی مختلف از C. roseus را مورد مطالعه قرار دادند. در این بررسی، نیمرخ بیان یک ژن ابتدای مسیر بیوسنتزی (str) و دو ژن انتهای این مسیر (d4h و dat) مورد مطالعه قرار گرفت و همبستگی مثبتی بین فراوانی رونویسی و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط در منابع ژنتیکی مختلف یافت شد (18).

طبق مطالعات صورت گرفته، تولید متابولیت­های ثانویه اغلب در واکنش به هر دو شرایط تنش زیستی و غیر زیستی افزایش می­یابد (38 و 39). در گیاه پروانش نیز بمنظور افزایش مقدار آلکالوئیدهای گیاه، از عوامل زیستی و غیر زیستی در مطالعات مختلف بهره گرفته شده است (19؛ 30، 32 و 40). به عنوان نمونه،  Jaleel et al در سال 2008 با مطالعه اثرات تنش کمبود آب بر متابولیسم اکسیژن فعال و نیز تجمع آلکالوئید آجمالیسین، نشان دادند که میزان آلکالوئید آجمالیسین در گیاهان پروانش تحت تنش به طور معنی­داری نسبت به گیاهان شاهد بیشتر است. آن­ها بر اساس نتایج به دست آمده چنین بیان نمودند که مناطق جغرافیایی دچار کمبود آب می­توانند به خوبی برای کشت گیاهان دارویی نظیر پروانش مورد استفاده قرار گیرند و بدین ترتیب میزان آلکالوئید مهم اقتصادی گیاه افزایش پیدا می­کند (31).

همچنین بر اساس گزارش برخی از محققین، میکروارگانیسم­های ریزوسفری، به عنوان الیسیتور زیستی عمل نموده و می­توانند سنتز تولیدات ثانویه را در گیاه القا نمایند (23 و 46). الیسیتورهای زیستی به عنوان فرآورده­های بدون خطر می توانند برای پایداری تولیدات کشاورزی مناسب باشند (6). در میان میکروارگانیسم­های موجود در ریزوسفر، ریزو­باکتری­های تقویت­گر رشد گیاهی Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) از اهمیت زراعی بالایی برخوردار هستند (15). امروزه انواع PGPR و اثر متقابل­شان با گیاه، مورد بهره­برداری تجاری قرار گرفته و کاربردهای عملی برای کشاورزی پایدار دارند (16و 26). نقش برخی از این میکروارگانیسم­ها در افزایش تعدادی از آلکالوئیدهای گیاهان دارویی از جمله پروانش به اثبات رسیده است (30 و 32). در سال 2007، Jaleel et al اثر باکتری تقویت­گر P.  fluorescens را روی پارامترهای رویشی و میزان تولید آلکالوئید آجمالیسین در C. roseus تحت تنش کمبود آب مورد مطالعه قرار دادند. در این مطالعه، تیمار با گونه فلورسنت باکتری Pseudomonas ، پارامترهای رشدی را تحت تنش کمبود آب افزایش داد و ممانعت رشدی ناشی از تنش را از طریق افزایش معنی­دار وزن تر و خشک گیاه بهبود بخشید. مقدار آجمالیسین نیز در تیمار گیاهان تحت تنش با این باکتری افزایش یافت. نتیجه این بررسی نشان داد که تیمار گیاهچه با انواع بومی PGPR می­تواند روش مناسبی برای افزایش عملکرد بیوماس و محتوای آلکالوئید در گیاهان دارویی باشد (30). همچنین استفاده تلفیقی از PGPR و تنش کمبود آب به عنوان یک تدبیر مفید برای حفظ محیط زیست معرفی شده که می­تواند همزمان با بهبود شرایط تنش، مقدار و عملکرد آلکالوئید را در اندام گیاهان دارویی افزایش دهد (23 و 30).

همانطور که از مرور منابع مختلف پیداست با وجود انجام برخی مطالعات در زمینه تاثیر تنش کمبود آب و نیز باکتری­های تقویت­گر رشد گیاه بر صفات ریخت­شناسی و محتوای آلکالوئیدهای گیاه پروانش، اثر این تیمارها بر بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی TIA به ویژه در ریشه گیاه، مورد بررسی واقع نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، از تیمارهای تنش کمبود آب و دو گونه از باکتری­های تقویت کننده رشد گیاه برای بررسی برخی از صفات رویشی و نیز ارزیابی نیمرخ بیان دو ژن Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش استفاده گردید. همانطور که بیان شد، این دو ژن، جزء ژن­های ابتدای مسیر بیوسنتزی بوده و برای بسیاری از انواع TIA از جمله آجمالیسین در گیاه پروانش مشترک می­باشند (شکل 1).

شکل 1- بخشی از مسیر بیوسنتزی ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها در گیاه پروانش

(نشان­دهنده ژن­های مورد بررسی در پژوهش حاضر، برگرفته از منبع شماره 38)

مواد و روشها

کاشت و تیمار گیاه پروانش با PGPR: بذر F1 گیاه پروانش (Catharanthus roseus L.) از شرکتPanAmerican Seed  تهیه گردید. بذرها با آب جاری شسته شده و برای ضدعفونی آن­ها از محلول هیپوکلریت سدیم (NaClO) 1/0 درصد به مدت 15 دقیقه استفاده شد. سپس بذرها توسط آب مقطر استریل طی چهار مرحله شسته شدند (5).

بر اساس مرور منابع مختلف، دو گونه از باکتری­های تقویت کننده رشد گیاه، به نام­های Pseudomonas fluorescens (سویه 169) و Azospirillum brasilense که توانایی کلونیزه کردن ریزوسفر گیاه پروانش را نیز دارند (32)، به صورت سوسپانسیون 108 واحد تشکیل کلونی Collony Forming Unit (cfu) بر میلی­لیتر (10 و 20)، از مؤسسه تحقیقات خاک و آب کشور (بخش تحقیقات بیولوژی خاک)- کرج، تهیه شد و طبق دستورالعمل موسسه، در سه نوبت مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا بذرها با مایه تلقیح باکتریایی به مدت 30 دقیقه آغشته و در سینی­های کشت دارای ترکیب پرلیت و کوکوپیت به صورت سطحی کاشته شدند. سینی­های کشت، پس از آب­دهی بمنظور جذب کامل رطوبت، زیر پوشش پلاستیکی، در دمای 20 تا 25 درجه سانتی­گراد و نور طبیعی نگهداری شدند (4). آبیاری سینی­های کشت به صورت روزانه و در شرایط یکسان انجام گرفت. گیاهچه­ها پس از ظهور و در مرحله شش برگی، از سینی­های کشت خارج و در گلدان­های پلاستیکی جداگانه با قطر دهانه 15 سانتیمتر و ارتفاع 15 سانتی متر، کاشته شدند. تلقیح خاک گلدان و نیز تلقیح ریشه گیاهچه­ها قبل از انتقال از سینی کشت به گلدان صورت گرفت. به این ترتیب که ریشه گیاهچه­ها به مدت 20 دقیقه در بشرهای دارای هریک از مایه­های تلقیح غوطه­ور شد. از آب مقطر نیز به میزان مساوی و هم حجم با تیمار باکتریایی به عنوان شاهد (عدم تلقیح باکتری) استفاده شد.

تنش رطوبتی: گیاهان پس از انتقال نشا به گلدان، برای اطمینان از استقرار، به مدت یک ماه تا حد ظرفیت زراعی آبیاری شدند. بافت خاک از نوع شنی لومی بود و ظرفیت زراعی خاک گلدان با استفاده از دستگاه صفحه فشاری Pressure plate تعیین گردید. پس از طی این مدت، گیاهان تحت تیمار رطوبتی قرار گرفتند. تیمار تنش رطوبتی در دو سطح شاهد (95 درصد ظرفیت زراعی) و تنش (55 درصد ظرفیت زراعی) اعمال گردید. به این ترتیب که گیاهان مربوط به هر یک از چهار سطح تیمار باکتریایی به دو قسمت تقسیم شده و بخشی به عنوان شاهد و بخش دیگر برای اعمال تنش در نظر گرفته شد. آبیاری گلدان­ها و اعمال تنش به روش وزنی انجام گرفت. به این ترتیب که از هر تیمار تعداد 4 گلدان اضافه برای تعیین وزن گیاهچه در طی دوره رشد و بمنظور تعیین وزن خاک گلدان بدون وزن گیاهچه استفاده شد. در مجموع، تیمارها شامل تیمار رطوبتی در دو سطح  شاهد (95 درصد ظرفیت زراعی) و تنش (55 درصد ظرفیت زراعی) و تیمار باکتریایی در چهار سطح شاهد، P. fluorescens ،
A. brasilense و تلقیح ترکیبی بودند که به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوک کاملا تصافی در سه تکرار بر گیاهان پروانش اعمال شدند.

اندازه­گیری صفات ریخت­شناسی و نمونه­برداری از ریشه گیاهان برای بررسی بیان ژن، 30 روز پس از شروع اعمال تیمار رطوبتی و در مرحله گلدهی انجام شد. شکل 2 تصویر گیاهان شاهد را تحت شرایط آبیاری نرمال (الف) و تنش رطوبتی (ب) در زمان نمونه­برداری نشان می­دهد. ارتفاع و طول ریشه با خط­کش اندازه­گیری شد. بمنظور محاسبه حجم ریشه از استوانه مدرج cc 10 استفاده و تفاوت حجم آب استوانه مدرج قبل و پس از غوطه­ور کردن ریشه به عنوان حجم ریشه در نظر گرفته شد. سطح ریشه نیز با استفاده از فرمول زیر تعیین گردید:

(8)                                ) RA= 2(MRL × MRV × π

که در آن RA= سطح ریشه، MRL= طول ریشه، MRV= حجم ریشه و 14/3 = π می­باشد.

 

الف  ب

شکل 2- گیاهان شاهد پروانش، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی.

الف) در شرایط آبیاری نرمال ب) در شرایط تنش رطوبتی

 

تجزیه­های آماری: پس از بررسی نرمال بودن باقی­مانده­ها، از داده­های اصلی برای انجام تجزیه­های آماری استفاده گردید. تجزیه واریانس  و مقایسه میانگین­ها به وسیله نرم­افزار SAS Ver. 9.2 (SAS Institute Inc., 2008) و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.

آنالیزهای مولکولی بیان ژن­ها: استخراج RNA و qRT –PCR: نمونه­های ریشه جمع­آوری شده برای بررسی بیان ژن، در فریزر c°80- نگهداری شدند. آنالیزهای مولکولی بیان ژن­ Str در چند مرحله صورت گرفت. ابتدا استخراج RNA از 100 میلی­گرم ریشه پودر شده و با استفاده از کیت استخراج RibospinTM Seed/ Fruit ساخت شرکت GeneAll کره‌ی جنوبی طبق پروتکل شرکت سازنده انجام و کمیت و کیفیت RNA استخراج شده به ترتیب با استفاده از دستگاه نانودراپ مدل (Thermo Scientific, Nanodrop, 2000C) و ژل الکتروفورز 5/1 درصد تعیین شد. واکنش ساخت cDNA با استفاده از یک میکروگرم RNA و آغازگر الیگو dT، توسط کیت Hyperscript RT-PCR master mix® بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (GeneAll، کره جنوبی) صورت گرفت. با استفاده از برنامه Primer Quest موجود در سایت IDT (Integrated DNA Technologies) آغازگر ژن Str طراحی شد. در انتخاب توالی آغازگر، طول آغازگر، درصد GC (40 تا 60 درصد)، مکمل بودن آغازگرها با هم و احتمال تشکیل حلقه مورد توجه قرار گرفت. همچنین اندازه محصول Product size آغازگر مورد نظر، با استفاده از توالی آغازگر رفت و آغازگر برگشت در سایت NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) محاسبه و در انتخاب توالی آغازگر، لحاظ گردید. اندازه محصول آغازگر، با استفاده از واکنش PCR و الکتروفورز ژل آگارز مورد تایید قرار گرفت. آغازگر Ribosomal protein synthesis (RPS9) (ژن خانه­دار) نیز به عنوان ژن کنترل داخلی تعیین شد (جدول 1). برای اطمینان از توالی صحیح و عملکرد اختصاصی آغازگر و همچنین پیدا کردن دمای بهینه اتصال به cDNA سنتز شده، واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلرBio-Rad  و به صورت شیب دمایی Gradiant انجام گرفت.

 

جدول 1- توالی آغازگرهای رفت و برگشت استفاده شده در واکنش qRT-PCR

ردیف

نام ژن

آغازگر

توالی آغازگر

5´- 3´

طول قطعه (bp)

شماره دسترسی

منبع

1

Tdc

F

ACCTACGACCGTCGAAACGGATTT

232

MG748691.1

Goklany et al, 2009 (25)

R

AAACTCGGGACATATACAGGCGCT

2

Str1

F

CGCCTACGCATCTCCCTTCT

82

X53602.1

-

R

TGTCCTCCCACACAATGGTCT

3

RPS92

F

TCCACCATGCCAGAGTGCTCATTA

203

A749993.1

Goklany et al, 2009 (25)

R

TCCATCACCACCAGATGCCTTCTT

1. آغازگر Str طراحی شد.

2. ژن RPS9 به عنوان ژن کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت.

 

در نهایت، بر اساس الکتروفورز ژل آگارز محصول PCR، دمای بهینه اتصال مختص هر آغازگر تعیین گردید. واکنش qRT-PCR در 40 چرخه، در دستگاه StepOnePlus Real-Time PCR System شرکت Applied Biosystem Incorporation (ABI)، با استفاده از کیت Real Q Plus 2x Master Mix Green, High ROXTM انجام گرفت. برای هر سه ژن، سه تکرار بیولوژیکی (از سه گیاه متفاوت) و دو تکرار تکنیکی (دو تکرار برای هر cDNA) در نظر گرفته شد. برای انجام واکنش qRT-PCR تمام cDNAهای سنتز شده به غلظت ng/µl 100 رسانده شدند. مواد لازم برای انجام واکنش qRT-PCR شامل cDNA رقیق شده، آغازگر رفت، آغازگر برگشت و Master Mix Green بودند. پروتوکل دمایی مربوطه در جدول 2 نشان داده شده است.

 

جدول 2- پروتوکل دمایی برای انجام واکنش qRT-PCR

تعداد چرخه

نام مرحله

زمان اجرا

درجه حرارت (C˚)

1

واسرشت سازی اولیه

10 دقیقه

95

40

واسرشت سازی ثانویه

10 ثانیه

95

اتصال

10  ثانیه

دمای مختص به هر پرایمر

گسترش

15  ثانیه

72

1

واسرشت سازی

15 ثانیه

95

اتصال و گسترش

60 دقیقه

65

 

 

تجزیه داده­های مولکولی: برای تجزیه داده­های به­دست آمده، از روش اختلاف در تغییرات چرخه آستانه (∆∆Ct) استفاده شد. بدین صورت که ابتدا چرخه آستانه برای نمونه­‌های مختلف با استفاده از ژن مرجع (خانه­دار)، نرمال­سازی شد و سپس تفاوت نسبی در میزان بیان ژن­های هدف با استفاده از نرم افزار REST® (42) محاسبه گردید. اختلاف معنی­داری بین تیمارها نیز در سطح یک و پنج درصد مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

ارزیابی صفات ریخت­شناسی: تجزیه واریانس داده­ها ابتدا به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوک­های کامل تصادفی انجام شد اما با توجه به عدم معنی­داری اثر بلوک برای تمام صفات مورد ارزیابی اثر بلوک حذف و آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جدول 4 نتیجه تجزیه واریانس صفات مورد اندازه‍گیری را 30 روز پس از اعمال تنش خشکی نشان می­دهد. نتیجه مقایسات میانگین اثرات متقابل نوع باکتری در شرایط رطوبتی و نیز اثرات اصلی تیمار تنش رطوبتی بر صفات مورد نظر بترتیب در جداول 5 و 6 آورده شده است.

 

جدول 4- تجزیه واریانس داده­های اثر دو شرایط مختلف رطوبتی و چهار سطح عامل باکتریایی بر صفات ریخت­شناسی گیاه پروانش 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات (MS)

ارتفاع گیاه

طول ریشه

حجم ریشه

سطح ریشه

نسبت طول ریشه به ارتفاع

نوع باکتری

3

*81/4

**70/17

*39 /0

** 26/22

ns 08/0

شرایط رطوبتی

1

**38/108

ns 76/3

**08/4

**26/195

** 38/2

شرایط رطوبتی× باکتری

3

ns 403/0

**43/20

**75/0

**83/61

ns 044/0

خطای آزمایشی

16

125/1

656/2

121 /0

598/1

044/0

ضریب تغییرات (درصد)

-

72/7

33/8

52/9

70/7

78/14

ns ، * و **: بترتیب غیرمعنی­دار، معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد

 

ارتفاع گیاه: نتیجه تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که اثرات اصلی نوع باکتری و تنش رطوبتی بر ارتفاع گیاه بترتیب در سطح پنج و یک درصد معنی­دار شده ولی اثرات متقابل این دو عامل معنی­دار نبود.

مقایسه میانگین اثر تیمارهای باکتریایی (شکل 3) نشان داد که تیمار با هر دو باکتری­ باعث کاهش ارتفاع گیاه شده و در این میان باکتری A. brasilense بیشترین اثر را داشته و موجب کاهش معنی­دار این صفت در سطح پنج درصد شده است. تنش رطوبتی نیز همانطور که انتظار می­رفت، باعث کاهش معنی­دار ارتفاع گیاه در سطح یک درصد گردید. بیشترین مقدار میانگین ارتفاع در تیمار شاهد (875/15 سانتیمتر) و کمترین آن در تیمار تنش (167/10 سانتیمتر) دیده شد (جدول 6).

شکل 3- مقایسه میانگین اثرات ساده سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی بر صفت ارتفاع در گیاه پروانش

 

جدول 5- مقایسه میانگین­های اثرات متقابل سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی و شرایط رطوبتی بر صفات ریشه­ای در گیاه پروانش

ردیف

شرایط رطوبتی

نوع باکتری

میانگین صفات مورد ارزیابی

طول ریشه

حجم ریشه

سطح ریشه

1

شاهد

شاهد

b 667/18

c133/1

c298/16

2

تلقیح ترکیبی

b 000/18

b 767/1

b 983/19

3

باکتری P.f

b 667/16

c033/1

cd696/14

4

باکتری A.b

a 333/23

a333/2

a 150/26

5

تنش

شاهد

a 000/23

d800/0

cd195/15

6

تلقیح ترکیبی

b 333/18

d800/0

de 539/13

7

باکتری P.f

b 333/19

d800/0

d933/13

8

باکتری A.b

b 167/19

e567/0

e641/11

میانگین­ها با حروف مشابه، اختلاف معنی­داری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند.

P.f و A.b بترتیب نشان دهنده P. fluorescens و A. brasilense هستند.

 

طول، حجم و سطح ریشه: اثر متقابل سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی در شرایط رطوبتی مختلف برای هر سه صفت مربوط به ریشه یعنی طول، حجم و سطح ریشه معنی­دار بود (جدول 4). مقایسه میانگین اثرات متقابل تیمارها برای این صفات نشان داد که هر سه صفت بیشترین مقدار را در تیمار با باکتری A. brasilence در شرایط عدم تنش داشته­اند. این تیمار رشد طولی ریشه گیاه را تا میزان  33/23 سانتی­متر افزایش داد که با طول ریشه گیاهان شاهد در تنش کمبود آب برابری می­کرد. سایر تیمارها از لحاظ طول ریشه در یک گروه قرار گرفتند. از نظر حجم و سطح ریشه نیز باکتری A. brasilence در شرایط تنش کمترین مقدار را دارا بود و پس از آن سایر تیمارهای باکتریایی در تنش کمبود آب در یک گروه قرار گرفتند و اختلاف معنی­داری با یکدیگر نداشتند.

 

 

جدول 6- مقایسه میانگین اثرات ساده سطوح مختلف تیمار رطوبتی بر صفات اندازه­گیری شده در گیاه پروانش

ردیف

تیمار

میانگین صفات

ارتفاع

نسبت طول ریشه به ارتفاع

1

شاهد

a 875/15

b106/1

2

تنش رطوبتی

b625/11

a 737/1

میانگین­ها با حروف مشابه، اختلاف معنی­داری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند.

 

نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه: این صفت نیز تنها تحت تاثیر تیمار تنش خشکی قرار گرفت. مطابق با نتایج جدول تجزیه واریانس و مقایسه میانگین، تیمار تنش خشکی، نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه را در سطح احتمال یک درصد افزایش داد.

ارزیابی­های مولکولی بیان ژن: در این تحقیق برای نرمال­سازی داده­ها، از ژن RPS9 به عنوان ژن خانه­داراستفاده شد. کارایی این آغازگر به عنوان یک ژن خانه­دار مناسب در گیاه پروانش تایید شده است. چرا که مقادیر Ct آن تحت تاثیر تیمارهای مختلف قرار نگرفته و در تحقیقات مختلف انجام شده بر روی این گیاه، برای تمام نمونه­ها، تقریبا ثابت بوده است (24 و 25). در تحقیق حاضر نیز مقادیر Ct مربوط به این آغازگر برای تمام نمونه­ها، نزدیک به هم بود. ولی مقادیر Ct آغازگرهای Tdc و Str، در بین تیمارهای مختلف با هم تفاوت داشت. این موضوع بر تاثیر تیمارهای مختلف اعمال شده بر میزان بیان ژن­های مورد بررسی، دلالت دارد. منحنی ذوب حاصل از همه نمونه­ها، تکثیر مطلوب توالی هدف را در تیمارهای مختلف نشان داد (شکل 4).

شکل 4- نمونه­ای از منحنی ذوب حاصل از تکثیر توالی هدف

اثر تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Tdc، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی: اثرات تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Tdc نسبت به گیاه شاهد، در شکل 5 نشان داده شده است. نتایج نشان می­دهد که 30 روز پس از اعمال تنش کمبود آب، بیان ژن Tdc در شرایط تنش رطوبتی نسبت به گیاه شاهد کاهش غیرمعنی­داری داشته است. در رابطه با تیمارهای باکتریایی در شرایط عدم تنش نیز، همانطور که در شکل مشاهده می­شود تمام تیمارها افزایش بیان ژن را به دنبال داشته­اند اما در مورد باکتری
P. fluorescens این افزایش قابل توجه و در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بوده است. همچنین تلفیق باکتری­ها با تیمار تنش کمبود آب، موجب شد تا تیمارهای باکتریایی اثر کمتری بر روی بیان این ژن داشته باشند. در این میان، باز هم باکتری P. fluorescens کمتر از سایرین تحت تاثیر تنش قرار گرفته و افزایش معنی­دار بیان ژن را در پی داشته است.

بیان ژن Tdc در ریشه گیاهان برای تمام تیمارهای باکتریایی در شرایط تنش کمبود آب نسبت به شاهد تحت تنش، افزایش داشت (شکل 6) که باز هم بیشترین میزان افزایش به باکتری P. fluorescens (64/16) و سپس  باکتری A. brasilence (98/6) تعلق داشت. همانطور که نتایج نشان می­دهد، هنگامی­که دو باکتری به طور جداگانه اعمال شدند، اثر بیشتری بر بیان ژن Tdc در هر دو شرایط رطوبتی داشتند.

شکل 5- بیان نسبی ژن Tdc تحت تیمار با تنش کمبود آب و باکتری­های تقویت کننده رشد در شرایط نرمال و تنش نسبت به شاهد در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی

حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.

* و **: بترتیب معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد

شکل 6- بیان نسبی ژن Tdc تحت تیمار با باکتری­های تقویت کننده رشد در شرایط تنش رطوبتی نسبت به شاهد تحت تنش در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی

حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

اثر تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Str، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی: مطابق با شکل 7، به­کارگیری تیمارهای باکتریایی میزان بیان ژن Str را نسبت به گیاه شاهد افزایش داد. تیمار با باکتری P. fluorescens و سپس A. brasilence بیشترین افزایش بیان ژن را بترتیب به میزان 34/10 و 23/6 برابر موجب شد که درسطح پنج درصد معنی­دار بود. هنگامی­که این دو باکتری در تیمار ترکیبی کنار یکدیگر قرار گرفتند میزان بیان ژن کمتر از زمانی که هریک به تنهایی اعمال شدند، افزایش یافت. یعنی در شرایط عدم تنش هر یک از دو باکتری مورد استفاده به تنهایی بهتر از حالت ترکیبی عمل نمودند. همین تیمارها وقتی به مدت 30 روز در شرایط تنش رطوبتی قرار گرفتند، کارایی تیمار باکتری A. brasilense نسبت به حالت ترکیبی کاهش پیدا کرد. اما باز همP. fluorescens بیشترین افزایش بیان ژن (12/5) را در پی داشت. همچنین بیان ژن Str در شرایط تنش خشکی نسبت به گیاه شاهد کاهش غیرمعنی­داری (36/1-) نشان داد.

شکل 8 نیز افزایش بیان ژن Str را در تمام تیمارهای باکتریایی در شرایط تنش کمبود آب نسبت به شاهد تحت تنش نشان می­دهد.

شکل 7- بیان نسبی ژن Str تحت تیمار با تنش کمبود آب و باکتری­های تقویت کننده رشد در شرایط نرمال و تنش نسبت به شاهد در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی

حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.

*: معنی­دار در سطح احتمال پنج درصد

شکل 8- بیان نسبی ژن Str تحت تیمار با باکتری­های تقویت کننده رشد در شرایط تنش رطوبتی نسبت به شاهد تحت تنش در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی

حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.

بحث و نتیجه گیری

در این پژوهش تاثیر هشت تیمار شامل تلفیق فاکتوریل دو گونه از باکتری­های PGPR به صورت جداگانه و توأم با تنش رطوبتی، بر برخی صفات ریخت­شناسی و نیز میزان بیان دو ژن کلیدی در دو شاخه مختلف مسیر بیوسنتزی انواع TIA، یعنی مسیر ایندولی (Tdc) و مسیر میانی (Str) در ریشه گیاه، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی مورد بررسی قرار گرفت.

 کمبود آب در جریان تولید گیاهان می تواند صدمات سنگینی به رشد و نمو و همچنین بر کمیت و کیفیت مواد مؤثرة گیاهان دارویی وارد نماید (3). در مطالعه حاضر، تنش کمبود آب ارتفاع گیاه و حجم ریشه را نسبت به گیاه شاهد به طور معنی­داری کاهش داد ولی افزایش رشد طولی ریشه را بهمراه داشت. افزایش رشد ریشه در اثر تنش کمبود آب، در گیاهانی مانند آفتابگردان (36 و 49) و پروانش (30) گزارش گردیده است. یک سیستم ریشه­ای قوی به ویژه در مراحل اولیه رشد، می­تواند مزیت رشد سریع را برای گیاه فراهم آورد. چرا که آب موجود در لایه­های سطحی خاک را که به راحتی از طریق تبخیر از دست می­رود، جذب می­نماید (29). همچنین در مطالعه حاضر، با کاهش ارتفاع و افزایش رشد طولی ریشه، نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه افزایش یافت. در برخی مطالعات، تنش کمبود آب موجب کاهش مقادیر برخی از صفات رویشی گیاه پروانش از جمله ارتفاع گیاه شده است (14 و 37). هاشم­آبادی در سال 1396 با مطالعه بر تاثیر نوع آب (آب شهر و آب چاه به صورت ساده و مغناطیس شده) و دور آبیاری بر گیاه پروانش، نشان داد که دورهای آبیاری تأثیر به­سزایی در بهبود صفات رویشی و زایشی دارند، به طوری که با فزایش فاصلة دور آبیاری، این صفات کاهش می­یابند (11). به طور کلی تنش کمبود آب، کارایی انتقال و تجمع مواد فتوسنتزی را کاهش داده و می­تواند موجب کاهش رشد گیاه شود (14). کاهش رشد در شرایط تنش ناشی از جلوگیری از تقسیم سلول، رشد سلول و یا هر دوی آن­هاست. این اثرات ممکن است به دلیل تغییر در تعادل هورمون­های گیاهی در اثر تنش باشد. چرا که مشخص شده تحت شرایط نا مساعد محیطی، مقدار درون­زای هورمون­های گیاهی دچار تغییرات اساسی می­شود (12). به گونه­ای که افزایش در نسبت ریشه به ارتفاع، تحت شرایط تنش کمبود آب، به مقدار اسید آبسیزیک ریشه­ها و شاخه­ها نسبت داده شده است (26). پیشنهاد شده است که ABA می­تواند به عنوان یک واسطه در پاسخ گیاهان به طیف وسیعی از تنش­ها از جمله تنش کمبود آب عمل کند و همچنین گیاه را قادر می سازد تا در شرایط نامساعد محیطی زنده بماند (22).

بررسی­های گذشته نشان داده است که ریزوباکتری­های تقویت کننده رشد گیاه اثرات سودمندی را بر رشد و نمو گیاه اعمال می­کنند. مکانیسم­های عمومی تقویت رشد گیاه توسط انواع PGPR عبارت از تثبیت نیتروژن، کاهش سطوح اتیلن، تولید فیتوهورمون­ها، القای مقاومت به پاتوژن، انحلال مواد غذایی، کاهش سمیت آلاینده­ها می‍باشد (17 و 46). نژادهای فلورسنت باکتری Pseudomonas و نیز A. brasilense که در تحقیق حاضر مورد استفاده قرار گرفته­اند، هر دو در شمار باکتری­های PGPR بوده و در منابع مختلف از آن­ها به عنوان مهم­ترین و بزرگ­ترین ریزوباکتری­های تقویت کننده رشد یاد شده است (1، 30 و 32). همانطور که از نتایج این پژوهش پیداست در میان تیمارهای باکتریایی، باکتری
A. brasilense در مورد صفات ریشه­ای، در شرایط عدم تنش کمبود آب، به خوبی عمل کرده و افزایش طول، حجم و سطح ریشه را در پی داشته است. این گونه باکتریایی در بهبود سیستم ریشه­ای گیاه نیشکر از طریق افزایش ریشه­های مویین، جانبی و نابجا موثر بوده است (27). تیمار ارقام گندم نیز با دو سویه از باکتری A. brasilense در غلظت cfu/ml 108 و شرایط بدون تنش، وزن خشک ریشه را به طور معنی­داری افزایش داد (10). همچنین افزایش طول ریشه در لوبیای تلقیح شده با A. brasilense گزارش شده است (21). همانطور که بیان شد، باکتری­های PGPR در تنظیم تولید اتیلن و کاهش آن درگیاه نقش دارند و تنظیم تولید اتیلن در افزایش رشد طولی ریشه و تاثیر غیرمستقیم بر افزایش ریشه­زایی موثر است (1). طبق گزارش برخی از محققین استفاده از تنظیم کننده­های رشد نقش قابل توجهی در افزایش رشد ریشه گیاهان دارد (6). این باکتری­ها نیز قادر به تولید تنظیم کننده­های رشد گیاهی از قبیل اکسین، سیتوکنین و جیبرلین هستند (17 و 30) و می­توانند با تولید این فیتوهورمون­های مختلف، آرایش و ساختار ریشه را تغییر داده و بر رشد و نمو گیاه اثر گذارند (34). لازم به ذکر است که در پژوهش حاضر، در شرایط تنش، از کارایی تیمارهای باکتریایی در رابطه با صفات ریشه­ای کاسته شد. از آنجا که نقش این باکتری­های مفید، به عنوان باکتری­های بیوکنترل موجود در منطقه ریشه، در ایجاد مقاومت سیستمیک به پاتوژن­ها در گیاهان مختلف به اثبات رسیده است (43، 44 و 47)، شاید بتوان گفت که ایفای این نقش و همچنین تاثیر بر بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه، می­تواند منجر به کاهش اثرشان بر صفات رویشی گیاه از جمله ارتفاع در پروانش به ویژه در شرایط بروز تنش گردد.

از نظر تاثیر تیمارهای مختلف بر بیان ژن­های مورد بررسی، باکتری P. fluorescens بهتر از سایر تیمارها عمل نمود و در هر دو شرایط تنش و عدم تنش موجب افزایش معنی­دار بیان هر دو ژن مورد بررسی نسبت به گیاه شاهد شد. دو ژن Str و Tdc در مطالعات گذشته نیز سابقه تنظیم بیان مشترک را داشته­اند. به عنوان نمونه، در مطالعه Pauw et al. در سال 2004 این دو ژن در پاسخ به الیسیتورهای قارچی مانند عصاره مخمر، به صورت هماهنگ با هم تنظیم و بیان شدند (41). P. fluorescens در مقایسه با شاهد تحت تنش نیز افزایش معنی­دار بیان ژن Str را موجب گردید. به طور کلی، در مطالعه حاضر، تیمارهای باکتریایی P. fluorescens و A. brasilense، به طور جداگانه در مقایسه با تلقیح ترکیبی، بیان ژن­ها را در شرایط بدون تنش و تحت تنش نسبت به گیاهان شاهد بدون تنش و تحت تنش افزایش دادند.

همانطور که بیان شد، نقش ریزوباکتری­های غیر بیماری­زا یا PGPR در ایجاد نوعی مقاومت به نام "مقاومت سیستمیک القایی" Induced systemic resistance (ISR) در گیاهان اثبات شده است (16). ویژگی قابلیت دفاعی ISR به این صورت است که گیاهان سطوح جاسمونیک اسید را به عنوان علامتی از دفاع فعال افزایش می­دهند. همچنین حساسیت گیاه را نسبت به مقادیر اتیلن بالا می‍برند. این مولکول­های علامت رسان به نوبه خود فعالیت مجموعه وسیعی از پاسخ­های دفاعی را هماهنگ می­کنند (2، 16 و 44). یک پاسخ دفاعی مهم که به جاسمونات­ها به عنوان مولکول­های علامت رسان بستگی دارد، القای تجمع متابولیت­های ثانویه می­باشد (53). نشان داده شده که کاربرد خارجی متیل جاسمونات (MeJA)، القای تولید متابولیت­های ثانویه را در 36 گونه گیاهی مختلف به دنبال داشته است (46). جاسمونات­ها تولید متابولیت­های ثانویه را در سطح رونویسی و از طریق راه­اندازی هماهنگ یک مجموعه از ژن­های بیوسنتزی القا می­کنند. در مطالعه Van der Fits and Memelink در سال 2000 تیمار متیل جاسمونات، متابولیسم TIA را در سوسپانسیون سلولی
C. roseus تحریک نموده و افزایش بیان تمام ژن­های مورد آزمون مسیر بیوسنتزی TIA را در پی داشت (50). در مطالعه مذکور عامل رونویسی Octadecanoid-derivative responsive Catharanthus AP2-domain protein 3 (ORCA3) در پاسخ به متیل جاسمونات فعال شده و بیان تعدادی از ژن­های مسیر بیوسنتزی از جمله ژن Str (استریکتوسیدین سنتتاز) را کنترل نمود. ORCA3 و فاکتور رونویسی مرتبط با آن به نام ORCA2 یک ناحیه متصل شونده به DNA DNA-binding domain از نوع عامل رونویسی اتیلن ethylene response factor/APETALA2 (AP2/ERF) دارند. این دو عامل رونویسی در تعامل با یکدیگر پروموتور Str را از طریق اتصال اختصاصی توالی به "عامل پاسخ دهنده به الیسیتور و جاسمونات" Jasmonate- and elicitor-responsive element (JERE) که حاوی جعبه GCC می­باشد، فعال می­کنند. بیان ژن­های ORCA به سرعت توسط متیل جاسمونات القا می­شود که خود دال بر این است که عوامل ORCA سطح بیان خود را یا به­طور خودکار و یا توسط یک یا چند عامل رونویسی در بالا دست ژن تنظیم می­کنند. گزینه دوم، یعنی یک جریان رونویسی Transcriptional cascade که بیان ژن پاسخ دهنده به تنش را در گیاه تنظیم می­کند، برای مسیر علامت­دهی اتیلن و علامت­دهی سرما نیز پیشنهاد شده است. در تحقیقی، عامل رونویسی WRKY در گیاه پروانش که به طور ویژه در ریشه­ها و در پاسخ به فیتوهورمون­هایی نظیر جاسمونات، جیبرلین و اتیلن بیان می­شود، مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق نشان داده شد که افزایش بیان عامل رونویسی CrWRKY2 در پاسخ به متیل جاسمونات، در کشت ریشه­های مویین پروانش، باعث افزایش بیان چندین ژن مسیر بیوسنتزی TIA به ویژه Tdc شد. به علاوه سطح بیان عامل رونویسی فعال کننده ORCA3 و عامل مهار کننده ZCT را نیز افزایش داد (48). القای همزمان عوامل رونویسی فعال کننده و مهار کننده ممکن است برای تغییر خاموش و روشن شدن ژن­ها در پاسخ به محرک­ها ضروری باشد (7). در گزارشی نیز نشان داده شد که کاربرد متیل جاسمونات موجب افزایش بیان ژن­های Tdc، G10h و Str در مسیر بیوسنتزی TIA در گیاه پروانش می­شود (53). در مطالعه­ای دیگر، کاربرد تیمار اتیلن تاثیر مثبتی را بر TIA گیاه پروانش در سطح رونویسی و متابولیتی داشت (52).

با توجه به مطالب فوق، شاید بتوان استنباط نمود که با اعمال تیمار PGPR در گیاه پروانش، پاسخ جاسمونیک اسید فعال شده است. این پاسخ نیز به نوبه خود موجب افزایش بیان عامل رونویسی CrWRKT2 و متعاقبا عامل فعال کننده ORCA3 و عامل مهار کننده ZCT گردیده و به این ترتیب بر بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی TIA تاثیر گذاشته است. از این منظر، می­توان بیان نمود که نتایج این تحقیق با نتایج Suttipanta (48) و Zhang et al (53) هم­خوانی دارد. به گونه­ای که در تیمار جداگانه
P. fluorescens و A. brasilense عامل فعال کننده ORCA3 تاثیرگذارتر بوده و در تیمار ترکیبی این دو باکتری طی مکانیسمی که مشخص نیست هر دو عامل فعال کننده و مهار کننده موثر بوده­اند.

با توجه به اثبات وجود رابطه مثبت بین میزان بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی TIA و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط با این ژن­ها در گیاه پروانش (18، 25 و 52) انتظار می­رود با افزایش بیان دو ژن Tdc و Str، محصول این ژن­ها و نیز محصولات نهایی مسیر بیوسنتزی TIA از جمله مقدار آجمالیسین در ریشه گیاه پروانش افزایش یابد. همانطور که در مطالعه Jaleel et al در سال  2007 نیز مقدار آجمالیسین ریشه، به موجب تیمار گیاهان تحت تنش کمبود آب با باکتری P. fluorescens افزایش یافت.

همچنین، این احتمال وجود دارد که شدت تنش به­کار رفته و نیز طولانی بودن مدت زمان اعمال تنش کمبود آب، موجب کاهش اثر برخی از تیمارها از جمله تنش بر بیان ژن­های مورد بررسی شده باشد. بنابراین پیشنهاد می­شود که آزمایش مشابهی با شدت تنش ملایم­تر و طول زمان کمتر اعمال تنش، در گیاه پروانش انجام شود.

سپاسگزاری

با تشکر ازکادر با محبت آزمایشگاه مرکزی دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی کرج و آقایان مهندس پورصفر، مهندس سلیمانی و کلیه کسانی که در این کار ما را یاری نمودند.

  • احمدزاده، م. 1391. کنترل بیولوژیک بیماری­های گیاهی، باکتری­های پروبیوتیک گیاهی. انتشارات دانشگاه تهران 490 صفحه.
  • احمدزاده، م. 1392. کنترل بیولوژیک بیماری­های گیاهی، مکانیسم­ها و سیستم­های تنظیم کننده ژنتیکی. انتشارات دانشگاه تهران 369 صفحه.
  • بابایی، ک.، امینی دهقی، م.، مدرس ثانوی، س. ع. م. و جباری، ر. (1389). اثر تنش خشکی بر صفات مورفولوژیک، میزان پرولین و درصد تیمول در آویشن (Thymus vulgaris ). فصلنامة علمی-پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران. 26 (2): 239-251.
  • بقائی راوری، س.، مسلم­خانی، ک. و خلفتی­بنا، ف. (1395): فیتوپلاسماهای بیمارگر گیاهی. انتشارات آموزش و ترویج کشاورزی. 231 صفحه.
  • پیوندی، م.، سید طالبی، س. م. و مجد، ا. (1395). تاثیر میدان مغناطیسی، محیط کشت و تنظیم کننده های رشد بر جوانه­زنی بذر گیاه پروانش (Catharanthus roseus ). زیست شناسی تکوینی. 9 (1): 69-78.
  • دهقانی بیدگلی، م. (1398). بررسی امکان افزایش عملکرد فیزیولوژیکی گیاه دارویی Lippia citriodora با استفاده از محرکهای زیستی در شرایط تنش شوری. فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی. 27 (3): 77-88.
  • شعبانی، م.، فارسی، م. و میرشمسی کاخکی، ا. (1393). بررسی اثر اتیلن بر بیان ژن­های T16H، G10H، DAT و AVLBS در گیاه پروانش (Catharanthus roseus ). ژنتیک نوین. 9 (2): 151-160.
  • علیزاده، ا. (1385). رابطه آب و خاک و گیاه. انتشارات آستان قدس رضوی. چاپ ششم. 470 صفحه.
  • غلامحسین­پور، ز.، همتی، خ.، دورودیان، ح. ر.، قاسم نژاد، ع. و شرفی، ع. تأثیر سطوح مختلف نیتروژن بر عملکرد و غلظت آلکالوییدهای وین­بلاستین و وین­کریستین در گیاه پروانش (Catharanthus roseus Don). مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 27 (2): 269- 275.
  • قاسمی، ح.ر. و مستاجران، ا. (1397). بررسی اثر همیاری باکتری آزوسپیریلوم برازیلنس (Azospirillum brasilense Sp7 and Sp245) بر شاخص­های رشد و برخی شاخص­های بیوشیمیایی دانه­رست­های گندم (Triticum aestivum L) در شرایط شوری. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران). 31 (3): 629- 641.
  • هاشم­آبادی، د. (1396). تغییر فعالیت آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز تحت تأثیر انواع آب و دور آبیاری در گیاه زینتی پروانش. مجله علوم باغبانی ایران. 48 (1): 49-59.
  • واجدی، س. ج.، ارادتمند اصلی، د. و محمدی ایچی، ر. (1390). اثرات جیبرلیک اسید بر شاخصه­های جوانه­نی گلرنگ تحت تنش خشکی. ششمین همایش ملی ایده­های نو در کشاورزی. 9 صفحه.

 

  • Almagro, L., Fernández-Pérez, F. and Pedreño, M.A. (2015). Indole alkaloids from Catharanthus roseus: bioproduction and their effect on human health. Molecules. 20: 2973-3000.
  • Amirjani, M. R. (2013). Effects of drought stress on the alkaloid contents and growth parameters of Catharanthus roseus. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science. 8 (11): 745-750.
  • Ardakani, S., Heidary, A., Tayebi, L. and Mohammadi, M. (2010). Promotion of cotton seedling growth characteristics by the development and use of new bioformulations. International Journal of Botany. 6: (2): 95-100.
  • Beneduzi, A., Ambrosini, A. and Passaglia, L.M.P. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Their potential as antagonists and biocontrol agents. Genetics and Molecular Biology. 35 (4): 1044-1051.
  • Bhattacharyya, P.N. and Jha, D.K. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): brasilense on root morphology of common bean (Phaseolus vulgaris) under different water regimes. Biology and Fertility of Soils. 32: 259–264.
  • Dutta, A., Batra, J., Pandey-Rai, S., Singh, D., Kumar, S. and Sen, J. (2005). Expression of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway genes corresponds to accumulation of related alkaloids in Catharanthus roseus (L.) G. Don. 220 (3): 376–383.
  • Elfeky, S. S., Osman, M.E.H., Hamada, S.M. and Hasan, A.M. (2007). Effect of salinity and drought on growth criteria and biochemical analysis of Catharanthus roseus International Journal of Botany. 3 (2): 202-207.
  • Fukami, J., Ollero, F. J., Megías, M. and Hungria, M. (2017). AMB Express. 7 (153): 1-13.
  • German, M. A., S. Burdman, O. Yaacov and J. Kigel. 2000. Effects of Azospirillum brasilense on root morphology of common bean (Phaseolus vulgaris) under different water regimes. Biol Fertil Soils, 32:259–264
  • Ghorbani Javid, M., Sorooshzadeh, A., Moradi, F., Modarres Sanavy, S.A.M., Allahdadi, I. (2011). The role of phytohormones in alleviating salt stress in crop plants. Australian Journal of Crop Science. 5(6):726-734.
  • Ghorbanpour, M. and Hatami, M. (2013). PGPR strains affect seedling vigor index and seed secondary metabolites accumulation of black henbane under water stress. Trakia Journal of Sciences. 2: 135-143.
  • Goklany, Sh. (2007). Monitoring the expression of TIA pathway genes in Catharanthus roseus hairy root cultures under optimum elicitation conditions. Master’s thesis, Northeastern University, Boston. Department of Chemical Engineering.
  • Goklany, Sh., Loring, R.H., Glick, J. and Lee-Parsons, C.W.T. (2009). Assessing the limitations to terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus hairy root cultures tthrough gene expression profiling and precursor feeding. Biotechnology Progress. 25 (5): 1289- 1296.
  • Gonzalez, A.J., Larraburu, E.E. and Lorente, B.E. (2015). Azospirillum brasilense increased salt tolerance of Jojoba during in vitro rooting. Industrial Crops Products. 76: 41–48.
  • Gouda, S., Kerry, R.G., Das, G., Paramithiotis, S., Shin, H.S. and Patra, K. (2018). Revitalization of plant growth promoting rhizobacteria for sustainable development in agriculture. Microbiological Research. 206: 131–140.
  • Gupta, S., Pandey-Rai, S., Srivastava, S., Naithani, S.C., Prasad, M. and Kumar, S. (2007). Construction of genetic linkage map of the medicinal and ornamental plant Catharanthus roseus. Journal of Genetics.86 (3): 259- 268.
  • Jaleel, C.A., Gopi, R., Gomathinayagam, M., Panneerselvam, R. (2009). Traditional and non-traditional plant growth regulators alters phytochemical constituents in Catharanthus roseus. Process Biochemistry. 44: 205-209.
  • Jaleel, C.A., Manivannan, P., Sankar, B., Kishorekumar, A., Gopi, R., Somasundaram, R. and Panneerselvam, R. (2007). Pseudomonas fluorescens enhances biomass yield and ajmalicine production in Catharanthus roseus under water deficit stress. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 60 (1): 7-11.
  • Jaleel, C.A., Murali, P.V., Gomathinayagam, M., Lakshmanan, G.M.A. and Panneerselvam, R. (2008). Water deficit stress effects on reactive oxygen metabolism in Catharanthus roseus; impacts on ajmalicine accumulation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 62 (1): 105-111.
  • Karthikeyan, B., Jaleel, C.A. and Azooz, M.M. (2009). Individual and Combined Effects of Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens on Biomass Yield and Ajmalicine Production in Catharanthus roseus. Academic Journal of Plant Sciences. 2 (2): 69-73
  • Karthikeyan, B., Joe, M.M., Jaleel, C.A. and Deiveekasundaram, M. (2010). Effect of root inoculation with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on plant growth, alkaloid content and nutrient control of Catharanthus roseus (L.) G. Don. National Croat. 19 (1): 205–212.
  • Kloepper J.W., Gutierrez-Estrada, A. and Mclnroy, J.A. (2007). Photoperiod regulates elicitation of growth promotion but not induced resistance by plant growth-promoting rhizobacteria. Canadian Journal 53 (2):159–167.
  • B. (2007). Cultivation, mineral nutrition and seed production of Catharanthus roseus (L.) G. Don in the temperate climate zone. Phytochemistry Reviews. 6: 403 – 41.
  • Manivannan, P., Jaleel, C.A., Sankar, B., Kishorekumar, A., Somasundaram, R., Alagu Lakshmanan, G.M. and Panneerselvam, R. (2007). Growth, biochemical modifications and proline metabolism in Helianthus annuus as induced by drought stress. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 59: 141–149.
  • Misra N. and Gupta A.K. (2006). Effect of salinity and different nitrogen sources on the activity of antioxidant enzymes and indole alkaloid content in Catharanthus roseus Journal of Plant Physiology. 163 (1): 11-18.
  • Mokhaberi, A., Ahmadi, J. and Mafakheri, S. (2013). The expression profile of D4H and DAT genes in Catharanthus roseus in response to drought, salinity and salicylic acid. Iranian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2 (2): 38-46.
  • Oksman-Caldentey, K.M. and Inze, D. (2004). Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science. 9 (9): 433- 440.
  • Osman, M.E.H., Elfeky, S.S., El-Soud, K.A. and Hasan, A.M. (2007). Response of Catharanthus roseus shoots to salinity and drought in relation to vincristine alkaloid content. Asian Journal of Plant Science. 6 (8): 1223-1228.
  • Pauw, B., Hilliou, F.A.O., Martin, V.S., Chatel, G., Wolf, C.J.F., et al. (2004). Zinc finger proteins act as transcriptional repressors of alkaloid biosynthesis genes in Catharanthus roseus. The Journal of Biological Chemistry. 297 (51): 52940–52948.
  • Pfaffi, M.W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real time RT- PCR. Nucleic Acids Researches. 29 (9): 2002-2007.
  • Pieterse, C.M. J., van Wees, S.C.M., Hoffland, E., van Pelt, J.A. and van Loon, L.C. (1996). Systemic Resistance in Arabidopsis lnduced bY Biocontrol bacteria is independent of salicylic acid accumulation and pat hogenesis-related gene expression. The Plant Cell. 8: 1225-1237.
  • Pieterse, C.M.J., Johan, A., Pelt, V., Saskia, C.M., Wees, V., et al. (2001). Rhizobacteria-mediated induced systemic resistance: signaling and expression triggering. European Journal of Plant Pathology. 107: 51–61.
  • Sain, M. and Sharma, V. (2013). Catharanthus roseus (An anti-cancerous drug yielding plant) - A review of potential therapeutic properties. International Journal of Pure and Applied Bioscience. 1 (6): 139-142.
  • Sekar, S. and Kandavel, D. (2010). Interaction of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) and endophytes with medicinal plants- new avenues for phytochemicals. Journal of Phytology. 2(7): 91-100.
  • Sindhu, S.S., Rakshia, Y.S. and Sahu, G. (2009). Biological control of soilborne plant pathogens with rhizosphere bacteria‏. Pest Technology. 3 (1): 10-21.
  • Suttipanta, N. 2011. Characterzation of G10H promoter and isolation of WRKY transcription factors involved in Catharanthus terpenoid indol alkaloid biosynthesis pathway. Dissertation, University of Kentucky, USA. Plant Physiology. 157: 2081–2093.
  • Tahir, M.H.N., Imran, M. and Hussain, M.K. (2002). Evaluationof sunflower (Helianthus annuus) inbred lines for drought tolerance. International Journal of Agriculture and Biology. 3: 398–400.
  • Van der Fits, L. and Memelink, J. (2000) ORCA3, a jasmonate responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism. Science. 289:295-297.
  • Van der Heijden, R., Jacobs, D.I., Snoeijer, W., Hallard, D. and Verpoorte, R. (2004). The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology. Current Medicinal Chemistry. 11 (5): 607-628.
  • Wang, X., Pan, Y., Chang, B., Hu, Y., Guo, X. and Tang, Z. (2016). Ethylene-induced vinblastine accumulation is related to activate expression of downstream TIA pathway genes in Catharanthus roseus. Hindawi Publishing Corporation. BioMed Research International. 2016: 8 pages.
  • Zhang, H., Hedhili, S., Montiel, G., Zhang, Y., Chatel, G., Pré, M., et al. 2011. The basic helix-loop-helix transcription factor CrMYC2 controls the jasmonate responsive expression of the ORCA genes that regulate alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus. Plant 67: 61–71.
  • Zhu, X., Zeng, X., Sun, Ch. and Chen, Sh. (2014). Biosynthetic pathway of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus. Frontiers of Medicine. 8(3): 285–293.
Volume 34, Issue 3
September 2021
Pages 560-575
  • Receive Date: 16 April 2020
  • Revise Date: 04 July 2020
  • Accept Date: 02 August 2020