تاثیر عصاره متانولی برخی از گیاهان بومی مازندران بر پارامترهای سنتیکی پراکسیداز بروکلی

مریم مهاجرانی^* و فاطمه ولیان امیری

ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 8/10/1398            تاریخ پذیرش: 25/1/1399

چکیده

بروکلی گیاهی با ارزش غذایی شناخته شده است. کاربرد پراکسیداز بروکلی در بیوشیمی بالینی، فناوری زیستی و صنایع غذایی علاقه برای مطالعه بیشتر این آنزیم را افزایش داده است. اﯾـﻦ ﭘـﮋوﻫﺶ با ﻫﺪف اندازه گیری پارامترهای سنتیکی پراکسیداز بروکلی و تغییرات انها در مجاورت عصاره متانولی برخی از گیاهان بومی مازندران انجام شد. در این مطالعه عصاره خام کلم بروکلی تازه، پس از هموژن سازی و سانتریفیوژ‏‏، بوسیله آمونیوم سولفات، رسوب دهی و سپس دیالیز شد. فعالیت آنزیم با هیدروژن پراکسید و ABTS در بافر سیترات-فسفات و در طول موج 414 نانومتر اندازه گیری گردید. فعالیت ویژه آنزیم بترتیب U/mg 58/0 در عصاره خام و  U/mg 61/3 در عصاره دیالیز شده بدست آورده شد. pH بهینه آنزیم 4 و دمای بهینه آن30 درجه سلسیوس اندازه گیری شد. عصاره متانولی گیاهان درمنه، زولنگ، رزماری، آقطی، پیرسنبل، ولیک سیاه، دارواش، شقایق و الزی بروش خیساندن تهیه شد. سپس فعالیت آنزیم در غلظت های مختلف از این عصاره ها سنجش شد. نتایج سنتیکی نشان دادند که پراکسیداز بوسیله عصاره های ولیک سیاه، رزماری، شقایق و درمنه، در غلظت 33 میکروگرم بر میلی لیتر بترتیب 2/88، 5/79، 6/78 و 3/76 درصد، مهار شد. عصاره پیرسنبل هیچ تاثیری برسرعت بیشینه واکنش نشان نداد، در حالی که مقدار K_m آنزیم را 4 برابر کاهش داد. گیاه الزی مهار جزئی بر روی این آنزیم پراکسیداز نشان داد. بنابراین، مطالعه این گیاهان برای دستیابی به ترکیبات تاثیر گذار بر پراکسیداز بروکلی با کاربردهای دارویی، کشاورزی و صنعتی قابل توصیه می‌باشد.

واژه­های کلیدی: پراکسیداز، بروکلی، پارامترهای سنتیکی، گیاهان بومی، مهارکننده

*نویسنده مسئول، تلفن:01135302455، پست الکترونیکی:m.mohajerani@umz.ac.ir

مقدمه

گیاهان متعلق به خانواده کلمیان ((Brassicaceae بخاطر وجود ترکیبات فعال زیستی فراوان در سراسر جهان شناخته شده‌اند(27). ترکیبات  فسفره‌آلی کلم بروکلی (Brassica oleraceae Var.Italica) فعالیت آنزیم های درگیر در سم زدایی مواد سرطان زا و سایر مواد خارجی جذب شده در بدن را افزایش می دهند. بروکلی همچنین حاوی مقدار زیادی کلروفیل، گلوکز، اینولات و سایر ترکیبات فعال زیستی مانند کاروتنوئیدها، ویتامین C و ترکیبات فنلی می‌باشد(15). گل‌آذین‌های بروکلی بخاطر ویژگی‌های ضد‌سرطانی‌اش در سراسر جهان مصرف می شود و بخش بزرگی از بازارهای جهانی را بخود اختصاص داده است(11,33).

خالص‌سازی، آنالیز شیمیایی و مطالعه ترکیبات سازنده گیاهان مثل فلاونوئیدها و پلی فنولها، خواص آنتی‌اکسیدانی بالا و اثرات محافظتی برجسته‌ای را بر DNA سلولها نشان داد‌ه‌اند. همچنین مطالعات محققین باین موضوع نیز اشاره دارند که هر یک از این ترکیبات به تنهایی مسئول تمام ظرفیت آنتی اکسیدانی یک گیاه نمی‌‌باشد. علاوه بر این بسیاری از گیاهان دارویی که مورد استفاده بشر قرار گرفته‌است بصورت عصاره خام و کامل بخشی یا کل اندام های گیاهان می‌باشد(39).

بسیاری از بیماری‌ها مانند سرطان، بیماری­های کبدی، آلزایمر، دیابت و پارکینسون که با تخریب اکسایشی سلول‌ها در ارتباط می‌باشند، اهمیت استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها را بشدت افزایش داده‌است(24). استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های سنتزی بعلت اثرات جانبی نامطلوبی که بر سلامت انسان می‌گذارند رو به کاهش بوده و جای خود را به آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی و گیاهی داده‌اند. امروزه دانشگاه‌ها، مراکز تحقیقاتی و سازمان بهداشت جهانی، برنامه‌های وسیعی جهت استفاده از گیاهان دارویی تدارک دیده‌اند. این مراکز نقش گیاهان دارویی در ارتباط با موارد مختلف در قرن 21 را سرنوشت‌ساز تلقی نموده‌اند(12).

آنزیم‌های پراکسیداز(EC: 1.11.1.7)  جزء پروتئین‌های هم‌دار (Heme) بوده که وظیفه اصلی آنها اکسیداسیون سوبستراهای مختلف با استفاده از پراکسید هیدروژن می‌باشد. پراکسیدازهای گیاهی در رشد و تمایز گیاهان بعنوان یکی از آنزیم های کلیدی نقش کنترلی دارند. بدلیل نقش این آنزیم در حذف رادیکال‌های آزاد و بالا بودن قدرت کاتالیتیکی، کاربرد وسیعی در حوزه های مختلف مثل سنتز مواد شیمیایی، پزشکی، در انالیز مواد غذایی و شیمیایی، نمونه های بالینی و محیطی پیدا کرده‌اند(17). پراکسیدازها همچنین کاربردهای زیادی بعنوان کاتالیزور در سنتز رزین های فنولی، تولید مواد شیمیایی و سوخت از خمیر چوب، تولید دیمرهای آلکالوئیدی در رنگ زدایی زیستی و در اکسیداسیون یا تبدیل زیستی ترکیبات آلی دارند. همه این موارد بعلت دارا بودن طیف وسیعی از سوبستراهای ویژه می باشد که این آنزیم کاتالیز آنها را تسهیل می کند. از آنجا که پراکسیداز ترب کوهی دارای کاربرد بسیار گسترده ای است تلاش برای یافتن پراکسیداز از منابع دیگر ادامه دارد تا بتواند کاربرد بهتری در تمام زمینه های ذکر شده و بیوتکنولوژی داشته باشد. بروکلی در بین سبزیجات با فعالیت بالای پراکسیدازی قابل مقایسه با منابع دیگر غنی از پراکسیداز مثل ترب کوهی است. از طرفی این گیاه در مناطق مختلف از جمله ایران قابلیت کشت و تکثیر دارد. در رابطه با تعیین جرم مولکولی، دما و pH بهینه، خواص فیزیولوژیکی و مشخصات سنتیکی انواع آنزیم‌های پراکسیداز تخلیص شده از منابع مختلف ، نظیر کلم، هویج، توت فرنگی، برنج و نخودسبز، پژوهش‌های متعددی صورت گرفته است.

از طرفی امروزه علاقه محققین زیادی به بررسی تاثیر عصاره های مختلف گیاهی حاوی ترکیبات متنوع طبیعی بر فعالیت انزیم‌ها و از جمله آنزیم پراکسیداز بوجود امده است. برای این منظور فعالیت آنزیم پراکسیداز در حضور پراکسید هیدروژن بعنوان سوبسترا، ABTS ، گایاکول، پیروگالول و کاتکول، بعنوان معرف الکترون دهنده و افزودن عصاره برخی گیاهان در مقالات اندازه‌گیری شده است(22).

گزارش‌هایی در مورد اثر آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی نظیر روغن‌ فرار اکالیپتوس، برگ چای، ترنج، میخک‏ و لیمو بعنوان کاهنده فعالیت آنزیم پراکسیداز گزارش شده است(29). در این بررسی ها استفاده از مقدار معین اسانس آویشن‏، سبب کاهش تغییرات رنگ و درخشندگی میوه توت فرنگی شده و دلیل آن جلوگیری از فعالیت آنزیم پراکسیداز و بالطبع ممانعت از قهوه‌ای شدن میوه توسط اسانس آویشن بیان شد(1و20).

از آنجا که تلاش برای مطالعه آنزیم پراکسیداز استخراج شده از کلم بروکلی مورد علاقه محققین بوده است، لذا هدف از تحقیق حاضر استخراج این آنزیم از کلم بروکلی و بررسی تاثیر عصاره متانولی گیاهان روئیده در مازندران، شامل درمنه، زولنگ، رزماری، آقطی، پیرسنبل، ولیک سیاه، دارواش، شقایق و الزی، بر فعالیت این آنزیم پراکسیداز بوده است.

مواد و روشها

در جدول 1 گیاهان مطالعه شده و شماره هرباریوم دانشگاه مازندران و محل جمع آوری هر یک اورده شده است. همه نمونه ها پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه بوسیله آسیاب خانگی پودر گردید. به پودر حاصل با نسبت 1:10 متانول اضافه گردید. مخلوط حاصل بمدت 72 ساعت روی شیکر همزده و در این مدت دو بار حلال آن تعویض شد. عصاره‌های متانولی جمع‌آوری شده از صافی عبور داده شد و بوسیله دستگاه تبخیر در خلاء تغلیظ و سپس توزین گردید.

جدول 1- گیاهان مطالعه شده و محل جمع آوری در استان مازندران و شماره هرباریوم دانشگاه مازندران

استخراج آنزیم پراکسیداز: مقدار 400 گرم از گلچه های کلم بروکلی تازه ابتدا بوسیله چاقو به قطعات ریز خرد شد و سپس با 700 میلی لیتر بافر سدیم استات 1/0 مولار بوسیله مخلوط‌کن هموژنیزه شد. مخلوط حاصل پس از عبور از پارچه تنظیف، بمدت 15 دقیقه ( ×g12000)  سانتریفیوژ گردید. پس از سانتریفیوژ، رسوبات دور ریخته شد و محلول باقیمانده بمدت 4 ساعت بوسیله سولفات آمونیوم تا درجه اشباعی %60 رسوب داده شد. سپس سوسپانسیون به مدت 15 دقیقه با همان شرایط قبلی سانتریفیوژ شد. به محلول رویی سولفات آمونیوم تا درجه اشباعی %90 اضافه شد؛ پس از 4 ساعت سوسپانسیون حاصل سانتریفیوژ و این بار رسوبات جمع‌آوری گردید و بمدت 48 ساعت در بافر سدیم استات 1/0 مولار دیالیز شد (در طول این مدت بافر دیالیز 3 بار تعویض شد). تمام مراحل فوق در دمای 4 درجه سلسیوس انجام شد. مخلوط حاصل از کیسه دیالیز خارج، غلظت آن بروش لوری، با استفاده از آلبومین سرم گاوی بعنوان استاندارد، تعیین و به میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری منتقل و در دمای 80- درجه سلسیوس نگهداری شدند(10,18).

تعیین فعالیت آنزیم پراکسیداز: برای تعیین فعالیت آنزیم پراکسیداز 200 میکرولیتر، آب اکسیژنه  8/0 میلی‌مولار بعنوان سوبسترا، 100 میکرولیتر ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 2 میلی‌مولار بعنوان معرف، 2685 میکرولیتر بافر سیترات-فسفات 1/0 مولار (pH  برابر 4) و 15 میکرولیتر عصاره آنزیمی استفاده شد. ABTS بوسیله آنزیم و H₂O₂ به رادیکال ABTS^•+ سبز رنگ تبدیل شده و مقدار جذب آن در طول موج 414 نانومتر بمدت 3 دقیقه بوسیله اسپکتروفتومتر خوانده شد(26). تمام مراحل فوق در سه تکرار انجام گرفت. سپس با استفاده از معادله‌های (2-2) الی (2-5) فعالیت کل (Total Activity)، فعالیت ویژه (Specific Activity)، درصد بازیابی فعالیت (Activity Recovery) و درجه خلوص (Purification Fold) آنزیم تعیین شد.

معادله (1) تعیین فعالیت کل

Total activity = ΔA.V.Df / ε.v.l

در معادله (1)  ΔAتغییرات جذب آنزیم بازای یک دقیقه، V حجم مورد سنجش، Df فاکتور رقت، ε ضریب خاموشی ABTS (8/36 بر میلی مولار بر سانتیمتر)، v حجم آنزیم استفاده شده و l طول عبور نور (برابر یک سانتیمتر) میباشد.

معادله (2)  تعیین فعالیت ویژه آنزیم

Specific activity = Total activity / [Protein]

معادله (3) درصد بازیابی فعالیت آنزیم

Activity Recovery = 100(TA2 / TA1)

معادله (4) درجه خلوص آنزیم

Purification Fold = SA2 / SA1

در معادلات 3و4 TA2 و SA2 بترتیب فعالیت کل و فعالیت ویژه آنزیم در مرحله بعد از دیالیز و TA1 و SA1 فعالیت کل و فعالیت ویژه آنزیم در عصاره خام می باشد(13).

تعیین pH بهینه پراکسیداز: برای تعیین pH بهینه آنزیم از بافرهایی با pH 3 الی 6 استفاده شد. برای این منظور از بافر سیترات فسفات 1/0 مولار جهت محدوده بافری 3 تا 4 و بافر سدیم استات 1/0 مولار برای محدوده بافری 5 تا  7 استفاده شد. ابتدا در هر لوله آزمایش 100 میکرولیتر ABTS 2 میلی‌مولار، 200 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 8/0 میلی‌مولار و 15 میکرولیتر عصاره آنزیمی استخراج شده ریخته که در نهایت با بافر مورد نظر به حجم 3 میلی لیتر رسانده شد. سپس تغییرات جذب در هر لوله آزمایش برای مدت 3 دقیقه در دمای آزمایشگاه در طول موج 414 نانومتر ثبت شد(26).

فعالیت نسبی آنزیم طبق معادله (1) در pH های مختلف محاسبه و با رسم نمودار تغییرات جذب نسبت به pH های مختلف، pH بهینه بدست آورده شد.

معادله (5) فعالیت نسبی آنزیم

A= S/S0 х 100

در معادله (5)، S تغییرات جذب نوری مخلوط واکنش نسبت به زمان بعد از انکوباسیون در هر pH و S0 تغییرات جذب نوری نسبت به زمان در pH بهینه می‌باشد(34).

تعیین دمای بهینه پراکسیداز: تعیین درجه حرارت بهینه برای فعالیت نسبی آنزیم تحت شرایط استاندارد در دمای 10 الی 60 درجه سانتی‌گراد در بافر سیترات-فسفات 1/0 مولار در pH برابر4 انجام شد. سپس نمودار تغییرات فعالیت نسبی آنزیم نسبت به درجه حرارت با استفاده از معادله (1)رسم گردید(25).

تعیین پارامترهای سنتیکی K_m و V_max پراکسیداز بروکلی: برای تعیین مقادیر K_m و V_max فعالیت آنزیم در دما و pH بهینه بازای غلظت‌های مختلف سوبسترا (هیدروژن پراکسید) بررسی گردید. برای این منظور در هر لوله آزمایش مقدار 100 میکرولیتر ABTS 2 میلی‌مولار، 200 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (در پنج غلظت 1/0، 4/0، 8/0، 6/1 و 2 میلی‌مولار) و 15 میکرولیتر عصاره آنزیمی ریخته و در نهایت توسط بافر سیترات فسفات 1/0 مولار با pH 4 به حجم 3 میلی‌لیتر رسانده شد. تغییرات جذب نوری برای مدت زمان 3 دقیقه در دمای 30 درجه سلسیوس در طول موج 414 نانومتر ثبت شد(37). سپس نمودارهای میکائیلیس-منتن و لینویور-برگ بر حسب غلظت‌های نهایی سوبسترا رسم شد و از طریق این نمودار مقادیر K_m و V_maxبدست آورده شد.

سنجش اثر عصاره متانولی گیاهان بر فعالیت آنزیم پراکسیداز: جهت بررسی اثر عصاره‌های متانولی استخراج شده از هر گیاه بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، فعالیت آنزیم در غلظت‌های مختلف عصاره ( 3 تا 33 میکروگرم در میلی لیتر) اندازه‌گیری شد. در لوله آزمایش 200 میکرولیتر از غلظت‌های 2-1/0 میلی‌مولار هیدروژن پراکسید، 100 میکرولیتر ABTS 2 میلی‌مولار، 100 میکرولیتر عصاره متانولی گیاه و 15 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و در نهایت با بافر سیترات-فسفات 1/0 مولار با pH 4 به حجم 3 میلی‌لیتر رسانده شد. تغییرات جذب نوری برای 3 دقیقه و هر 10 ثانیه در طول موج 414 نانومتر ثبت شد. در نهایت طبق معادله (6) درصد مهار پراکسیداز بوسیله هر یک از عصاره‌های متانولی محاسبه گردید.

معادله (6)  تعیین درصد مهار

I(%) = 100.{1-(A_sample/A)}

در معادله (6) A فعالیت آنزیم بدون عصاره متانولی، A_sample فعالیت آنزیم در مجاورت عصاره متانولی و I درصد مهار آنزیم می‌باشد(30).

نتایج

بر اساس نتایج بدست آمده فعالیت کل، فعالیت ویژه، درصد بازیابی فعالیت و درجه خلوص آنزیم از رابطه­های (1) تا (5) بدست آورده شد (جدول2).

جدول2- مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز بروکلی در مراحل تهیه عصاره آنزیمی

نتایج تعیین pH بهینه: تاثیر pH بر آنزیم پراکسیداز بروکلی، با اندازه‌گیری فعالیت نسبی آنزیم در pH‌های متفاوت محاسبه شد. طبق شکل (1) آنزیم حداکثر فعالیت را در pH 4 از خود نشان داده است؛ که همان pH بهینه آنزیم پراکسیداز بروکلی مورد مطالعه می‌باشد.

نتایج تعیین دمای بهینه: شکل (2) میزان تغییر فعالیت نسبی آنزیم پراکسیداز استخراج شده از کلم بروکلی را نسبت به افزایش دما در محدوده 10 الی 60 درجه سلسیوس نشان می‌دهد. مطالعه روند تغییرات بیانگر آن است که بیشترین فعالیت آنزیم در مجاورت آب اکسیژنه و ABTS ، در دمای 30 درجه می‌باشد و با افزایش و یا کاهش این دما فعالیت آنزیم کاهش مییابد. بنابراین دمای 30 درجه، دمای بهینه آنزیم می‌باشد.

نتایج تعیین پارامترهای سنتیکی K_m و V_max پراکسیداز: بر‌طبق معادله میکائیلیس-منتن در واکنش آنزیمی مورد مطالعه با افزایش غلظت سوبسترای آب اکسیژنه، جذب نوری افزایش یافته و تا زمانی که آنزیم از سوبسترا اشباع شود این روند ادامه می‌یابد. پس از اشباع شدن آنزیم از سوبسترا، جذب نوری مخلوط واکنش دیگر تغییری نمی‌کند (شکل3).

بر طبق شکل 4 پس از رسم تغییرات معکوس سرعت نسبت به معکوس غلظت آب اکسیژنه، K_m آنزیم پراکسیداز بروکلی 012/0 میلی‌مولار و V_max آن 1/24 میلی‌مولار بر دقیقه بدست آورده شد (شکل 4).

شکل 1- تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز بروکلی نسبت به تغییر pH  (همه اندازه گیری ها سه بار تکرار شد.)

شکل 2- تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز بروکلی نسبت به تغییر دما(همه اندازه گیری ها سه بار تکرار شد.)

شکل 3- نمودار میکائیلس-منتن، تغییرات سرعت واکنش آنزیم پراکسیداز بروکلی در غلظت‌های مختلف پراکسید هیدروژن. (همه اندازه گیری ها سه بار تکرار شد.)

شکل4- نمودار لینویور‌-برگ، معکوس مقادیر سرعت آنزیم پراکسیداز بروکلی به ازای معکوس غلظت‌های مختلف از پراکسید‌هیدروژن (همه اندازه گیری ها سه بار تکرار شد.)

نتایج عصاره‌گیری گیاهان: همان طور که در بخش روش ها ذکر شد، عصاره گیری از اندام های گیاهی انجام شد و پس از خشک شدن، توزین و با توجه بمقدار اولیه پودر گیاهی بکار رفته، راندمان عصاره‌گیری بصورت درصد وزنی عصاره خشک شده بمقدار اولیه پودر گیاه در جدول 3 گزارش شده است.

جدول 3- راندمان عصاره‌گیری از گیاهان مورد مطالعه بروش خیساندن

نتایج تاثیر عصاره متانولی نمونه های گیاهی بر فعالیت آنزیم پراکسیداز بروکلی: برای مطالعه تاثیر عصاره متانولی گیاهان مورد مطالعه در غلظت‌های مختلف بر فعالیت آنزیم پراکسیداز بروکلی، بر طبق روش ذکر شده در بخش مواد و روش ها سرعت واکنش آنزیمی در مجاورت عصاره ها ( 3تا 33 میکروگرم بر میلی‌لیتر) اندازه گیری شده و نمودارهای میکائیلس-منتن و لینویور-برگ برای انها ترسیم گردید. مقادیر مشخصات سنتیکی از جمله K_m و V_maxو نیز میزان در صد مهار آنزیم بوسیله هر یک از عصاره ها در غلظت 33 میکروگرم بر میلی لیتر گزارش گردیده است.

جدول 4- مقدار پارامترهای سنتیکی پراکسیداز بروکلی تحت تاثیر عصاره­ها در غلظت 33 میکروگرم بر میلی لیتر

بحث و نتیجه گیری

امروزه تنوع بیماری‌ها و محدودیت تعداد داروهای شیمیایی، عوارض جانبی، تحمل دارویی و هزینه‌های اقتصادی سنگین تهیه آن‌ها؛ ضرورت توجه به طب سنتی و گیاهان دارویی را دو چندان کرده است. با توجه به اهمیت طب سنتی بخصوص گیاه‌درمانی و همچنین وجود ترکیبات غنی آنتی‌اکسیدانی در گیاهان استفاده شده در این تحقیق، به مطالعه تاثیر عصاره های متانولی این گیاهان بر روی آنزیم پراکسیداز کلم بروکلی پرداخته شد.

تعداد زیادی از ترکیبات با خواص آنتی‌اکسیدانی بعنوان فرآورده‌های ثانویه توسط گیاهان ساخته می‌شود. از مهمترین این ترکیبات می‌توان به کاروتنوئیدها، آسکوربیک‌اسید و ترکیبات فنولی اشاره کرد. ترکیبات فنولی گروه وسیعی از متابولیت‌های ثانویه را تشکیل می‌دهند که در گیاهان نقش‌های متعددی را بعهده دارند. ازجمله این نقش‌ها می‌توان به خواص هورمونی، دارویی و آنتی‌اکسیدانی آن‌ها اشاره کرد. آنتی‌اکسیدان‌های فنولی رایج شامل توکوفرول‌ها، فلاوونوئیدها، کومارین‌ها، مشتقات سینامیک اسید، چالکون‌ها، دی‌ترپن‌های فنولی و اسیدهای فنولی هستند. این ترکیبات از بافت‌ها،DNA  و RNA در برابر صدمه اکسیداتیو گونه‌های فعال اکسیژن محافظت می‌کنند. رزمارینیک اسید نیز یک ترکیب فنولی با خاصیت آنتی‌اکسیدانی است که در گیاهان تیره‌های گاوزبان و نعناعیان یافت می‌شود. فعالیت آنتی‌اکسیدانی ترکیبات فنولی به طرق مختلف صورت می‌گیرد که ازجمله آن‌ها می‌توان به جاروب کردن رادیکال‌های آزاد، دادن هیدروژن و جمع‌آوری اکسیژن یکتایی اشاره کرد. در تحقیقات بیشماری وجود یک ارتباط مستقیم بین میزان ترکیبات فنولی عصاره‌های گیاهی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی آنها اثبات شده‌است(7).

آنزیم پراکسیداز جزء پروتئین‌های هم‌دار بوده که وظیفه اصلی آن‌ها اکسیداسیون سوبستراهای مختلف با استفاده از پراکسید هیدروژن می‌باشد. این آنزیم بدلیل نقش در حذف رادیکال‌های آزاد و بالا بودن قدرت کاتالیتیکی کاربرد وسیعی در صنعت پزشکی و عرصه بیوشیمی دارد(2). همچنین پراکسیدازها اساسا همراه با آنزیم‌های دیگر مورد استفاده قرار می‌گیرند. از طرفی فرآیند خالص‌سازی پراکسیداز‌ها فرآیندی پرهزینه، طولانی مدت و مشکل است. بنابراین بعلت کاربرد گسترده این آنزیم در زمینه‌های مختلف، لازم است که اشکال متفاوت آن در بافت‌ها و گونه‌های مختلف گیاهی شناسایی شده و انواعی برگزیده شود که در محدوده وسیع و قابل قبولی از pH و دما فعالیت و پایداری دارند(8و17).

در رابطه با مشخصات سنتیکی انواع آنزیم‌های پراکسیداز تخلیص شده از منابع مختلف، پژوهش‌های متعددی صورت گرفته است. در همه این بررسی‌ها ارتباط مستقیمی بین فعالیت آنزیم پراکسیداز و مقدار عصار‌ه‌های اثر داده شده نتیجه گیری شده است(29). همچنین در گزارش‌هایی اثر غلظت اسانس‌ها بر فعالیت پراکسیداز مورد توجه قرار گرفته و نتیجه‌گیری شده که با افزایش غلظت اسانس فعالیت آنزیم پراکسیداز کاهش می‌یابد(1). از طرفی محصولات دارای فعالیت بالای آنزیم پراکسیداز، مقاومت‌های بسیار بالایی را نسبت به اسانس‌های اعمال شده نشان داده اند. در واقع در این گونه از محصولات آنزیم پراکسیداز دارای پایداری است. از این رو برطرف کردن پایداری پراکسیداز یک مشکل جدی برای تولید ترکیبات وابسته‌ای است که ارزش اقتصادی دارند(20).

نتایج این تحقیق نشان داد که آنزیم پراکسیداز استخراج شده از کلم بروکلی در pH‌های اسیدی فعالیت و پایداری بیشتری داشته و در pH های خنثی و قلیایی فعالیت و پایداری پایینی را از خود نشان می‌دهد. این دستاورد با نتایج مدولی و همکاران در سال 2005 در مورد حساسیت پراکسیداز میوه مارولا (Sclerocarya birrea subsp. Caffra) نسبت به شرایط قلیایی و خنثی مطابقت دارد. از طرف دیگر pH های بسیار اسیدی نیز اثر غیرفعال‌کنندگی مشابه pH های قلیایی دارد(26). در بررسی آنزیم پراکسیداز ترب‌کوهی با استفاده از روش طیف‌سنجی رزونانس رامان نشان داده شد که محیط قلیایی، پیوند هیدروژنی بین دو آمینواسید هیستیدین و آسپاراژین را می‌شکند. از آنجا که این دو آمینواسید در فعالیت آنزیم نقش مهمی ایفا می‌کنند، در نتیجه بنظر می رسد هرگونه تغییر در وضعیت آن‌ها بر اثر تغییرات pH ، آنزیم را غیرفعال می‌کند(9).

آنزیم استخراج شده از کلم بروکلی در دمای 30 درجه سلسیوس بالاترین فعالیت را نشان داده و افزایش و یا کاهش این دما، سبب کاهش فعالیت این آنزیم شد. این نتایج با بررسی های سامتورک و همکاران در سال 2014 در رابطه با دمای بهینه آنزیم پراکسیداز استخراج شده از کلم قرمز هماهنگی دارد(36).

در تحقیقی که آقاجانی نسب و همکاران بر روی آنزیم پراکسیداز تربچه انجام دادند فعالیت تام و فعالیت ویژه آنزیم U/ml36/1 و U/mg  19/1 بدست آورده شد که در مقایسه با نتایج این پروژه که در جدول 1 آورده شده مقادیرکمتری می باشد(3).

با توجه به بررسی صادق پور و همکاران در سال 2010 ترکیبات اصلی اسانس گیاه درمنه شامل: داوانون (Davanone) (56%/60)، سیس کریسانتیل استات (Cis Chrysanthenyl acetate) (65%/8)، لیمونن (68%/5)، آلفا پینن (74%/3)، ایزومر اتری داوانون (Davanone ether isomer) (6%/3) و آلفا توجن (α Thujene) (6%/3) است(23و32). داوانون بعنوان ترکیب اصلی در این گیاه ترپنی است که خواص ضد قارچی و ضد اسپاسم آن اثبات شده است(22). در این تحقیق عصاره متانولی درمنه در غلظت 33 میکروگرم بر میلی‌لیتر K_m آنزیم را بمقدار mM 019/0 افزایش و V_max آن را بمقدار mM/min 6/13 کاهش داد؛ و نوع مهار این عصاره از نوع مختلط نتیجه گیری شد.

ترکیبات اصلی گیاه زولنگ شامل: بتا سزکوئی فلاندرن (β-sesquiphellandrene) (%21/44)، لیمونن (%39/18) و بتا بیس آبولن (β-bisabolene)  (%08/6) می‌باشد(21). بتا سزکوئی فلاندرن و لیمونن بعنوان ترکیبات آنتی‌اکسیدان عمل کرده و مهارکنندگی آنها برای پراکسیداز گزارش شده است. هر دو ترکیب دارای خواص ضد سرطانی نیز می‌باشند(40). در این تحقیق عصاره متانولی زولنگ در غلظت 33 میکروگرم بر میلی­لیتر میزان K_m  و V_max آنزیم پراکسیداز بروکلی را بترتیب به میزان mM 008/0 و mM/min 9/9 کاهش داد و نوع مهار آن از نوع نارقابتی تعیین شد.

در گیاه رزماری ماده متشکله اصلی برگ و سرشاخه‌‌ها را روغن فرار تشکیل می‌دهد که مهمترین ترکیبات آن شامل: 1و 8 سینئول، آلفا پینن، کامفن آلفا ترپینول، بورنول است که این مواد بخصوص آلفا تریپنول خواص آنتی‌اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد سرطانی بالایی از خود نشان داده‌اند. گروه دیگر از ترکیبات گیاه رزماری ترکیبات پلی فنولیک شامل: فلاوونوئیدها( مانند هموپلانتاجینین، کرسیمارتین) و مشتقات فنولی (اسید رزماریک، رزمانول، اسید کارنوسیک، کارنوزول) می‌باشد که همگی دارای خواص آنتی‌اکسیدانی بوده و سبب مهار پراکسیداسیون لیپیدها شده‌اند (19). کارنوسیک اسید که فراوان‌ترین ترکیب فنولیک دی‌ترپن موجود در برگ‌های رزماری است، بیشترین اثر آنتی‌اکسیدانی را در میان سایر ترکیبات فنولی دی ترپنی نشان داده است (6). پس از مجاورت عصاره متانولی رزماری بر روی پراکسیداز بروکلی، در غلظت 33 میکروگرم بر میلی‌لیتر V_max آنزیم به میزان mM/min 3/14 کاهش یافت اما K_m آنزیم ثابت باقی ماند؛ بنابراین نوع تاثیر این عصاره بر آنزیم پراکسیداز بصورت مهار غیر رقابتی نتیجه گیری شد.

از جمله ترکیبات موجود در عصاره آقطی می‌توان به فلاوونویید‌ها (شامل: روتین، کوئرستین، ایزوکوئرستین)، اسیدهای فنولی، موسیلاژ، تانن، آلکالوئیدها، تری ترپن، پکتین، رزین، ویتامین A و C، آنتوسیانین، ساپونین، کارتنوئیدها، مشتقات کافئیک اسید، ایبولیتین‌ها و مواد فرار اشاره کرد(35). ویتامین‌ث، ترکیبات فنولی و فلاوونوئیدها بعنوان آنتی‌ویروس در درمان سرماخوردگی، کاهش علایم تب و بعنوان آنتی‌اکسیدان عمل می‌کنند. آنتوسیانین موجود در این گیاه خاصیت ضد سرطانی بسیار بالایی دارد و قدرت آنتی­اکسیدانی آن حتی از ویتامین E و C نیز بیشتر می‌باشد و مسئول حفاظت در مقابل استرس‌های اکسیداتیو می‌باشد و موجب افزایش پاسخ های ایمنی در طول تقسیم سلولی می شود(38). عصاره آقطی در غلظت 33 میکروگرم بر میلی­لیتر سبب کاهش هر دو کمیت K_m و V_max به میزان mM 005/0 و mM/min 9/5 شد و بنابراین آنزیم پراکسیداز بصورت نارقابتی مهار گردید.

برگ­های گیاه پیرسنبل دارای ترکیباتی از قبیل سیس اسیمین (Cis-ocimene)، آلفا پینن، بتا پینن، متیل استر لینولنیک اسید می­باشد. اسیدهای چرب غیراشباع مانند لینولنیک اسید و لینولئیک اسید فراوان‌ترین اسیدهای چرب این گیاه هستند. اسمین یک مونوترپن حلقوی بوده که از پینن بیوسنتز می‌گردد(28). در این بررسی عصاره متانولی گیاه پیرسنبل فعالیت آنزیم پراکسیداز را افزایش داد. این عصاره کاهش  K_m به میزان mM 004/0و از طرفی افزایش V_max آنزیم را موجب شده است. بنابراین عصاره متانولی گیاه پیرسنبل یک فعال کننده غیرضروری آنزیم پراکسیداز محسوب می‌شود(31). بر طبق گزارش های قبلی عصاره ولیک شامل: ترکیبات فلاوونوئیدی از قبیل پروآنتوسیانین ها، کوئرستین و روتین می‌باشد. فلاونوئیدها، ترکیبات پلی فنولی هستند که بطور عمده در گیاهان یافت می‌شوند و بعنوان ترکیبات آنتی‌اکسیدان و ضد رادیکال نقش دارند. عوامل متفاوتی از جمله تعداد گروه‌های هیدروکسیل و ساختار ارتو‌دی‌فنولیک بر روی خاصیت آنتی‌اکسیدانی آن‌ها موثر است. آنتوسیانین‌ها نیز بعنوان فلاونوئید با جذب رادیکال‌های آزاد بعنوان یک ماده آنتی‌اکسیدان و ضد سرطان قوی شناخته شده است(14). در این پروژه عصاره متانولی ولیک سیاه، آنزیم پراکسیداز را بصورت مختلط مهار کرده است؛ بدین صورت که در غلظت 33 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر K_m آنزیم به میزان mM 026/0 افزایش و V_max آن به میزان mM/min 64/17 کاهش نشان داد.

گیاه شقایق دارای ترکیبات مختلفی از جمله ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی است. این ترکیبات در جذب و خنثی‌سازی رادیکال‌های آزاد و تجزیه پراکسیدها نقش دارند. در تحقیقی در سال 2010 گزارش شد که عصاره آبی شقایق حاوی ترکیبات فنولی بوده و در نتیجه خاصیت آنتی‌اکسیدانی قوی از خود نشان داد(39و16). در این پژوهش از عصاره متانولی شقایق استفاده شد و مشخص گردید که این عصاره در غلظت 33 میکروگرم بر میلی‌لیتر می‌تواند آنزیم پراکسیداز را بصورت غیررقابتی مهار نماید؛ با رسم نمودارهای سرعت برحسب غلظت سوبسترا، نتیجه‌گیری شد که K_m آنزیم ثابت بوده ولی V_max آن به میزان mM/min 5/10 کاهش نشان داد.

ترکیبات شیمیایی گیاه دارواش با توجه به محل کشت و رویش آن تغییر می­کند. این ترکیبات شامل: آلکالوئیدها، فلاونوئیدها، تانن‌ها، آنتراکینون‌ها، ساپونین‌ها، ترپنوئیدها و میسکوتوکسین می‌باشد (4). عصاره متانولی این گیاه بدلیل داشتن فلاونوئیدها سبب مهار آنزیم پراکسیداز شده و این مهار از نوع رقابتی می‌باشد باین صورت که عصاره متانولی دارواش در غلظت یکسان با بقیه عصاره‌ها یعنی 33 میکروگرم بر میلی‌لیتر سبب افزایش K_m آنزیم به میزان mM 016/0 شده ولی تاثیری بر مقدار V_max نشان نداد.

برگ‌های گیاه الزی دارای ترکیباتی از قبیل فنولیک اسید، کوماریک اسید، فرولیک اسید، هیدروکسی بنزوئیک اسید و وانیلیک اسید می‌باشد. اما با وجود چنین ترکیبات آنتی‌اکسیدان در این عصاره متانولی برگ‌های این گیاه در ازمایشات انجام شده K_m و V_max آنزیم را تغییر نداده و تاثیر مهاری چندانی بر فعالیت آنزیم پراکسیداز نشان نداد(5). این نتیجه شاید به همان خاصیت جمعی ترکیبات آنتی اکسیدان اشاره داشته باشد که در یک مخلوط اثراتی برخلاف انتظار از خود بروز می‌دهند.

با توجه به نتایج بدست آمده عصاره گیاهان درمنه، زولنگ، رزماری، آقطی، دارواش، ولیک سیاه، شقایق و الزی سبب مهار آنزیم پراکسیداز بروکلی شده و در این بین عصاره ولیک سیاه با مهار 2/88 درصد، رزماری با مهار 5/79 درصد ، درمنه با مهار 3/76 درصد و شقایق با مهار 6/78 درصد اثر مهاری بالایی را نشان دادند. در تمام گیاهان ذکر شده که سبب مهار آنزیم پراکسیداز شدند ترکیبات فلاونوئیدی، مشتقات فنولی و ترپنی وجود دارد. از جمله ترکیبات فلاونوئیدی که در گیاهان فوق وجود دارد می توان به آنتوسیانین‌ها، کوئرستین و روتین در گیاه ولیک سیاه، کوئرستین و لوتئولین، در رزماری لوتئولین و تریسین در گیاه شقایق اشاره کرد. رزماریک اسید، کارنوسیک اسید و آلفا تریپنول از جمله مشتقات فنولی هستند که خاصیت آنتی‌اکسیدانی بسیار بالایی دارند و سبب مهار آنزیم پراکسیداز می‌گردند. بطور کلی با افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در گیاهان خاصیت آنتی‌‌کسیدانی آن‌ها افزایش مییابد. ترکیب آنتی‌اکسیدان قوی دیگری که در این گیاهان مشاهده شده است یعنی لیمونن که یک ترپن حلقوی بوده و در گیاهانی نظیر درمنه و زولنگ وجود دارد.

در این مطالعه مشخصات سنتیکی، pH، و درجه حرارت بهینه آنزیم پراکسیداز بروکلی تعیین شد، در واکنش انزیمی که در آن از آب آکسیژنه و ABTS استفاده شد. بر اساس این دست آوردها نتیجه گیری شد که تلاش برای تحقیقات بیشتر در مورد عصاره های مختلف گیاهان ولیک سیاه، رزماری، شقایق و درمنه مازندران بتواند بعنوان یک موضوع مناسب برای پژوهش‌های آینده پیشنهاد شوند. این پژوهش ها می‌توانند با هدف دستیابی به مهارکننده‌های جدید آنزیم پراکسیداز از بروکلی با کاربردهای دارویی، کشاورزی و صنعتی انجام گردند.

سپاسگزاری

از آنجایی که بودجه بندی این تحقیق از سوی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه مازندران تامین اعتبار شده است  باین وسیله از ایشان تشکر و قدردانی می گردد.