بررسی برهمکنش تیمارهای زیستی و غیر زیستی بر تغییرات آنتی اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی در گیاه گشنیز (Coriandrum sativum) تحت تنش سرب

حمیده فاطمی^1* و بهروز اسماعیل پور²

ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه باغبانی

تاریخ دریافت: 05/09/1398          تاریخ پذیرش: 12/11/1398

چکیده

این مقاله به بررسی اثرات کاربرد همزمان سیلیسیم و تیمارهای بیولوژیکی بر فعالیت آنتی اکسیدان­های آنزیمی و غیر­آنزیمی و پراکسیداسیون لیپیدها تحت تنش سرب می­پردازد. این مطالعه در آزمایش گلدانی برای تعیین اثرات چهار غلظت سرب (0 ، 500 ، 1000 و 1500 پی پی ام) و سه غلظت سیلیسیم (0، 5/1و 3 میلی­مولار) و چهار سطح تیمار بیولوژیک (بدون تلقیح ، جدایه 6 و 19 باکتری و میکوریز) بر گیاه گشنیز انجام شد. صفات مورد اندازه­گیری در این پژوهش شامل بیومس گیاهی، فعالیت آنزیم کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز، آسکوربات پراکسیداز، مالون دآلدهید، فنل، فلاونویید و آنتی اکسیدان بود. نتایج حاصل از این پژوهش حاکی از کاهش معنی­دار بیومس گیاهی در اثر غلظت­های مختلف سرب بود، علاوه براین محتوی مالون دآلدهید، فعالیت آنزیم پراکسیداز، فنل، فلاونویید و آنتی اکسیدان همسو با افزایش غلظت سرب افزایش یافت اما سرب تنها تا غلظت 500 پی­پی­ام توانست فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسیدیسموتاز را افزایش دهد. نکته قابل توجه برهمکنش تیمارهای ریزجانداران با تیمار محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بود که در اکثر صفات سبب افزایش آن­ها شد.

واژه های کلیدی: آنزیم های آنتی اکسیدان، سیلیسیم، گشنیز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09153582650، پست الکترونیکی: ha.fatemi@yahoo.com

مقدمه

در حال ­حاضر امنیت ­غذایی به عنوان یکی از جدی­ترین چالش­های جوامع محسوب می­شود، جمعیت جهان اکنون تقریبا 7 میلیارد نفر است که طی 50 سال آینده به ده میلیارد نفر نزدیک می­شود (30)، که این مسئله موجب افزایش تقاضا برای تولید مواد غذایی جهانی خواهد شد. انتظارات بیشتر تولیدات کشاورزی در هر واحد مسکونی سبب تخریب زمین­های موجود، گسترش کشاورزی به مناطق حاشیه­ای و استفاده از انواع خاک برای تولید محصول بیشتر خواهد شد. اکثر این مناطق و زمین­ها، آلوده به طیف وسیعی از آلاینده­ها می­باشند که فلزات سنگین مانند کادمیوم، سرب، کروم، مس، منگنز و روی سهم عمده­ای از آلودگی این خاک­ها را به خود اختصاص می­دهند (54). با توجه به سمیت بالقوه و پایدار بودن فلزات سنگین، خاک­هایی که آلوده به چنین عناصری هستند، به­طورجدی سلامت محیط زیست را تهدید می­کنند (56).

در بین فلزات سنگین، سرب بعلت حضور در هر سه بخش خاک، آب و هوا دارای اهمیت ویژه­ای است، علاوه­براین سرب به راحتی توسط سیستم ریشه­ای گیاه جذب شده و سمیت آن برای گیاه بین 2 تا20 برابر سایر فلزات سنگین می­باشد، از اینرو به عنوان یکی از جدی­ترین تهدیدات برای گیاهان و سایر موجودات زنده در نظر گرفته می­شود (45 و 7). یکی از آسیب­های مهم بافتی که به دنبال قرارگیری گیاهان در معرض سرب ایجاد می­شود، افزایش انباشته شدن انواع مختلف رادیکال­های اکسیژن­های فعال مانند سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل ودر نهایت ایجاد تنش اکسیداتیو است (51 و 66). تنش اکسیداتیو سبب تاثیرات مخربی مانند جلوگیری از تولید ATP، آسیب به اسیدهای نوکلئیک (81) و غشای سلولی (71) می­شود. علاوه­براین، رادیکال­های فعال اکسیژن با حمله به آنزیم­های آنتی­اکسیدان باعث مهار این آنزیم­ها می­شوند (17). همچنین این رادیکال­ها از سوی دیگر با تحریک ACC سنتاز منجر به افزایش غلظت اتیلن می­شوند، اتیلن به همراه مولکول نشانگر حاصل از پراکسیداسیون چربی غشا باعث القاء ژن­های درگیر در بیوسنتز متابولیت­­های ثانویه می­گردد (76). به­طورکلی، سمیت زدایی رادیکال­های آزاد در برابر تنش­ها در گیاهان به دو سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی دسته­بندی می­شوند (26). این سیستم شامل آنزیم­های آنتی اُکسیدانی مانند کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراُکسیداز (APX)، سوپراُکسیددیسموتاز (SOD)، گایاکول پراُکسیداز (GPX) و فنل پراُکسیداز (POX) و سیستم آنتی­اکسیدانی غیرآنزیمی شامل آسکوربات، آلفاتوکوفرول، کاروتنوئیدها، ترکیبات فنلی، پرولین و گلوتاتیون می­باشد (68).

باتوجه به اینکه تولید آنتی­اکسیدان­ها یکی از مهم­ترین مکانیسم­های درون سلولی برای تخفیف اثرات تنش در گیاهان می­باشند، به­نظر می­رسد تیمارهایی که بتوانند این مکانیسم را تعدیل نمایند، می­توانند از این طریق، اثرات مثبتی را بر گیاهان رشد کرده در مناطق آلوده بگذارند. باتوجه به اثرات مخرب زیست محیطی فلزات سنگین بنظر می­رسد کاربرد تیمارهای دوست­دار محیط زیست، کم هزینه با کارایی بالا بسیار ضروری است. ریزموجودات خاکزی می­توانند به حفظ کارایی گیاه در شرایط تنش­زا کمک شایانی کنند و از آنجایی در درک تحمل تنش، مکانیسم سازگاری و واکنش موثر هستند، می­توان آن­ها را به عنوان مدل­های عالی برای طراحی و ساخت گیاهان جهت مقابله با تنش­ها مانند فلزات سنگین (24) مورد استفاده قرار داد.

مطالعات محققین زیادی نشان می دهد که ریزوباکتری­های محرک رشد (PGPR) رشد، عملکرد و بسیاری از فرآیندهای درونی گیاه را تقویت می­کنند (1 و 22). این باکتری­ها با راه­کارهای مختلفی از جمله تولید انواع ویتامین­ها، اسیدهای آمینه و هورمون­های گیاهی، تولید سیدروفور و همچنین تولید آنزیم ACC دآمیناز، رشد و عملکرد گیاهان را می­افزایند (45). نتایج پژوهش­های مختلف نشان داده افزودن این باکتری­ها به خاک­های آلوده به فلزات سنگین می­تواند اثرات تنش را کاهش داده و به رشد و عملکرد گیاهان در این خاک­ها کمک کند (31 و 38). در کنار این باکتری­ها، قارچ­های میکوریز نیز دارای کارکرد چندمنظوره در بوم نظام­های زراعی هستند؛ به­طوری که سبب بهبود کیفیت فیزیکی خاک (از طریق گسترش ریسه­های قارچ)، کیفیت شیمیایی خاک (از طریق افزایش جذب عناصر غذایی) و کیفیت بیولوژیک خاک (از طریق شبکه غذایی خاک) می­گردند (16). علاوه­براین هاوس و فستر (34) معتقدند ریشه­هایی که با میکوریز کلونیزه شده­اند، توانایی تجمع رادیکال­های اکسیژن را در خود دارند (34)، البته محققین دیگر چند ژن در میکوریز را در تخفیف تنش اکسیداتیو در گیاهان موثر می­دانند (64). بنابراین نکته قابل توجه، تایید نقش حفاظتی ایجاد شده در حضور میکوریز در برابر تنش اکسیداتیو القا شده توسط فلزات سنگین در گیاهان است (40 و68).

تکنیک­های بسیاری در تخفیف اثرات منفی فلزات سنگین توصیه شده است (61)، استفاده از کود سیلیسیم در کشاورزی یکی از گزینه­های بالقوه پایدار برای کاهش تنش­های زیستی در گیاهان مختلف است (23). با اینکه سیلیسیم بخش عمده­ای از خاک را به عنوان سیلیکات یا سیلیکات آلومینیوم تشکیل می­دهد، اما گیاهان قادر به جذب مستقیم آن نیستند (81). یکی از اثرات مهم اثبات شده سیلیسیم حفاظت گیاه در برابر تنش­های غیرزیستی مانند فلزات سنگین، تشعشع و... است (23)، سایر محققین نیز افزایش فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را در گیاهان پاک چوی، پنبه، موز و برنج تحت تنش فلزات سنگین گزارش کرده­اند (80). علاوه­براین سیلیسیم تحت تنش فلزات سنگین می تواند آنتی­اکسیدان­های غیرآنزیمی را نیز در گیاهان مختلف نیز افزایش دهد (70 و 79).

گیاه گشنیز(Coriandrum sativum L.) ، گیاهی علفی، دارویی از خانوادهApiaceae  است که از مناطق مدیترانه و خاورمیانه سرچشمه می­گیرد، از تمام قسمت­های این گیاه برای درمان اختلالات مختلف در سیستم­های پزشکی در تمدن­های مختلف در سراسر جهان استفاده شده است (67). ایران بعد از هند و روسیه رتبه سوم تولید گشنیز در جهان است که از لحاظ اقتصادی نیز بسیار حائز اهمیت است.

باتوجه به اینکه فعال­سازی آنتی­اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی یکی از مهم­ترین مکانیسم­های دفاعی در گیاهان تحت تنش فلزات سنگین است و کاربرد تکی هر کدام از تیمارهایی مورد بررسی به تایید سایر محققین رسیده است، به­نظر می­رسد که کابرد همزمان سیلیسیم و باکتری­های محرک رشد و میکوریز می­تواند سبب افزایش مقاومت و القا این سیستم­ها در گیاه گشنیز شود، با تاکید به این مسئله این پژوهش طرح ریزی و انجام شد.

مواد و روشها

این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار سطح تنش سرب (0، 500، 1000 و 1500 پی­پی­ام سرب)، چهار سطح از ریز­جانداران (جدایه 6، 19 باکتری و قارچ میکوریز) و سه سطح محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم (0، 5/1و 3 میلی­مولار) بود. خاک مورد نظر از مناطق سبزیکاری تهیه و به مدت شش ماه در شرایط خشک و تر با نمک سرب مخلوط شدند و پس از نمونه برداری و حصول اطمینان از آلوده بودن خاک­ها با غلظت­های مختلف جهت آزمایش مورد استفاده قرار گرفت. باکتری­های مورد نظر از آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه محقق اردبیلی تهیه شد که از جدایه­های مقاوم به فلزات سنگین بودند، مشخصات باکتری­ها و ویژگی­های محرک رشدی آن­ها به اختصار در جدول 1 آورده شده است. در ابتدا باکتری­ها در محیط نوترینت براث کشت و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه که جمعیت آن­ها (CFU ml^-1) 10⁸×2/6 بود. بذور گیاه گشنیز (Coriandrum sativum. L) تهیه شده از مرکز تحقیقات استان همدان که قبلا با هیپوکلریت سدیم پنج درصد ضدعفونی شده بود در شرایط استریل به محیط کشت حاوی باکتری اضافه شده و به مدت یک ساعت بر روی شیکر قرار داده شدند و به منظور تثبیت بهتر آن­ها بر روی بذور مدتی در شرایط استریل قرار داده شدند، سپس بذور موردنظر در گلدان­های ده کیلویی (30*25*20) حاوی خاک­هایی که قبلا آلوده شده بودند، کشت شدند. قارچ میکوریز گونه Glomus mosseae از آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه رفسنجان تهیه شد و در پنج سانتی­متری زیر محل کشت بذر با خاک مخلوط گردید. تمامی گلدان­ها در شرایط محیطی یکسان با دمای میانگین 25 درجه سانتیگراد و رطوبت 40 درصد نگه­داری شدند. پس از رشد گیاهان و تشکیل سومین برگ حقیقی محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم در سه مرحله به فاصله هر دو هفته صورت گرفت. خصوصیات نانو ذرات سیلیسیم تهیه شده از شرکت نانو سانی در جدول 2 ذکر شده است.

جدول 1- خواص محرک رشدی جدایه‌های برتر

جدول 2- خصوصیات ساختاری نانو ذرات سیلیسیم

اندازه­گیری فاکتورهای آزمایش: پس از طی دوره رشدی بوته­های گشنیز برداشت و به آزمایشگاه برای اندازه­گیری بیومس (وزن تر بوته) منتقل شدند، این صفت به کمک ترازوی دیجیتال انجام شد.

اندازه­گیری فعالیت برخی از آنزیم­های آنتی­اکسیدان: استخراج عصاره پروتئینی: بدین منظور در ابتدا 5/0 گرم بافت تازه گیاهی با 1 میلی­لیتر بافر فسفات (pH=7) سائیده و به مدت 5 دقیقه با دور 14000 و دمای 4 درجه سانتی­گراد سانترفیوژ شد و روشناوری برای اندازه گیری فعالیت آنزیم­ها در مراحل بعد در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد (10).

فعالیت آنزیم پراکسیداز: فعالیت آنزیم با استفاده از روش (36) اندازه­گیری شد، بدین منظور به حجم مساوی از بافر آب اکسیژنه (225 میلی­مولار) و بافر گایاکول (45 میلی­مولار) مقدار ده میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد و منحنی تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر Genwayمدل 6705 (Genway Biotech, USA) در طول یک دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت و با ضریب خاموشی گایاکول پراکسیداز mM^-1cm^-16/26 بر حسب µMol/g FW.min محاسبه شد.

فعالیت آنزیم کاتالاز: اندازه­گیری فعالیت آنزیم کاتالاز نیز به روش چنس و ماهلی (19) انجام شد، به این صورت ­که پنج میکرولیتر عصاره آنزیمی را به 495 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم حاوی EDTA1/0 میلی­مولار و H₂O₂ ده میلی مولار افزوده و منحنی تغییرات در طول موج 425 نانومتر ثبت شد. فعالیت آنزیمی به‌صورت تغییرات جذب بر زمان در طول موج240 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر  Genwayمدل 6705 (Genway Biotech, USA) به مدت یک دقیقه ثبت گردید. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت وضریب خاموشی mM^-1cm^-140 بر حسبµMol/g FW.min محاسبه شد.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز براساس روش گیانپولیتی و همکاران (28) اندازه­گیری شد. بر اساس این روش سه میلی لیتر مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار (pH=7/8)، متیونین 13 میلی-مولار، نیتروبلوتترازولیوم 75 میکرومولار، ریبوفلاوین20 میکرومولار،EDT  1/0میکرومولار و100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. نمونه­های آنزیمی به مدت 15 دقیقه در مقابل نور 5000 لوکس قرار داده شد و بلافاصله پس از آن جذب نمونه­ها در طول موج560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر  Genway مدل 6705 (Genway Biotech, USA) قرائت شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت ضریب خاموشی mM^-1cm^-1100 بر حسب µMol/g FW.min محاسبه شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: بدین منظور 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی را به بافرفسفات 50 میلی مولار حاوی اسید آسکوربیک 5/0 میلی­مولار افزوده و کاهش جذب با دستگاه اسپکتروفوتومتر  Genway مدل 6705 (Genway Biotech, USA) در طول موج 290 نانومتر دو دقیقه پس از شروع واکنش محاسبه شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت ضریب خاموشی mM^-1cm^-1100 بر حسب µMol/g FW.min محاسبه شد (55).

اندازه گیری مالون دی­آلدئید: سنجش مالون دی­آلدئید به روش هیت و پاکر (35) انجام شد. بر طبق این روش 2/0 گرم از بافت تازه برگی توزین شد و در هاون چینی حاوی پنج میلی­لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1/0 درصد، ساییده شد و عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ به مدت پنج دقیقه در 5000 دور سانتریفیوژ گردید. به یک میلی­لیتر از محلول رویی، چهار میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید 20 درصد که حاوی 5/0 درصد تیو باربیتوریک اسید بود، افزوده شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس بلافاصله در یخ خرد شده سرد گردید. دوباره مخلوط سرد شده به مدت ده دقیقه در 5000 دور سانتریفیوژ گردید. سپس شدت جذب نور در طول موج 523 نانومتر خوانده شد. جذب بقیه رنگیزه­های غیراختصاصی در 600 نانومتر تعیین و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت مالون دی آلدئید از ضریب خاموشی معادل mM^-1cm^-1 155 استفاده گردید و نتایج حاصل از اندازه­گیری بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.

سنجش محتوای ترکیبات فنلی تام، فلاونویید و ظرفیت آنتی اکسیدانی: برای سنجش محتوی ترکیبات فنلی، فلاونوئید و آنتی­اکسیدان ابتدا عصاره­گیری انجام شد. اندام هوایی گیاهان بلافاصله پس از انتقال به آزمایشگاه در سایه خشک شدند و عصاره به روش لین و همکاران (42) آماده شد. عصاره ده درصدی متانولی به روش خیساندن آماده شد وپس از سانتریفیوژ در مراحل بعدی از این عصاره استفاده شد.

محتوای فنلی با روش ماروینا همکاران (48) و با استفاده از معرف فولین –سیوکالتو بر حسب میلی­گرم اسید گالیک بر وزن خشک نمونه و محتوای فلاونوییدی بر اساس روش بکتو و همکاران (11) بر حسب میلی­گرم کوئرستین بر وزن خشک نمونه و همین­طور فعالیت پاکسازی رادیکال­های آزاد DPPH بر اساس آکواه و همکاران (3) اندازه­گیری و از رابطه زیر طرفیت آنتی اکسیدانی محاسبه شد.

(A0 -At)/A0 × 100= درصد ظرفیت آنتی اکسیدانی

در رابطه بالا A0 جذب نمونه شاهد و At  جذب نمونه مورد آزمایش است.

اندازه­گیری محتوی آسکوربیک اسید: برای اندازه­گیری آسکوربیک اسید از برگ گشنیز از روش اومیه و همکاران (58) استفاده شد، بدین منظور یک گرم از نمونه­های پودر شده در 1 میلی­لیتر تری کلرو استیک اسید 10 درصد هضم گردیدند و به مدت 20 دقیقه در 2100 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. از محلول روشناور 10 میکرولیتر برداشته شد و یک میلی­لیتر معرف دی نیترو فنیل هیدرازین- سولفات مس- تیورآ شش میلی­مولار اضافه و به مدت سه ساعت در بن­ماری در دمای 31 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس 110 میکرو لیتر اسید سولفوریک 41 درصد به نمونه­ها اضافه شد و جذب نمونه­ها و استاندارد در طول موج 120 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. محتوای ویتامین ث براساس منحنی استاندارد معادل میلی­گرم اسید آسکوربیک در 100 گرم وزن تر نمونه محاسبه گردید.

تجزیه آماری: در پایان تجزیه واریانس داده­های حاصل از این آزمایش با استفاده از روشANOVA و مقایسه میانگین با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد با نرم­افزار آماری SAS 9.4 انجام شد.

نتایج

تاثیر تلقیح با باکتری‌های محرک رشد و قارچ میکوریز و محلول­پاشی نانو ذرات سیلیسیم بر آنتی اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی در گیاه گشنیز تحت تنش سرب: نتایج تجزیه­ واریانس حاصل از تاثیر تیمارهای تنش سرب و تلقیح با باکتری­های محرک رشد گیاهی و قارچ میکوریز و محلول­پاشی نانوذرات سیلیسیم نشان داد که تاثیر تنش سرب، محلول­پاشی نانوذرات سیلیسیم و تلقیح با باکتری­های محرک رشد گیاه و قارچ میکوریز و اثرات متقابل دوگانه و سه­گانه آن­ها بر میزان بیومس گیاهی، فنل، فلاونویید، ظرفیت آنتی­اکسیدانی، مالون دی آلدهید، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در سطح احتمال یک و پنج درصد معنی­دار بود و بر فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز و میزان آسکوربیک اسید تنها اثرات ساده سرب  معنی دار نود ( جدول3).

بیومس (وزن بوته): مطابق شکل 1 که با افزایش غلظت سرب بیومس گشنیز به طور معنی­داری کاهش یافت و در گیاهان پرورش یافته در خاک حاوی 1500 پی‌پی‌ام سرب در مقایسه با گیاهانی که در خاک بدون سرب رشد کرده بودند، حدود 38 درصد کاهش وزن مشاهده شد. استفاده از کودهای بیولوژیک و محلول­پاشی با نانوذرات سیلیسیم توانست اثرات نامطلوب ناشی ازآلودگی فلز سنگین سرب را کاهش دهد به­طوریکه بیشترین بیومس گیاهان گشنیز (75/0 گرم) در اثر تلقیح با قارچ میکوریز G. mosseae و محلول­پاشی با غلظت سه میلی مولار نانوذرات سیلیسیم در شرایط بدون سرب حاصل شد که با گیاهان تلقیح شده با باکتری جدایه 6 و 19 و محلول­پاشی غلظت مشابه از نانوذرات سیلیسیم در شرایط بدون آلودگی سرب تفاوت معنی­داری نداشت وکمترین بیومس (17/0 گرم) نیز در گیاهان تلقیح و محلول­پاشی نشده در بالاترین غلظت 1500 پی­پی­ام سرب حاصل شد.

شکل1- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر صفت وزن تر بوته گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₅₀₀: 500 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 میلی گرم برکیلوگرم سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

مالون دی­آلدهید: محتوی مالون دی­آلدهید با افزایش غلظت سرب درگیاه گشنیز به طور معنی­داری افزایش یافت و بیشترین میزان برای این ماده (599/0 میکرومول بر گرم وزن تر) درگیاهان پرورش یافته در خاک حاوی 1500 پی‌پی‌ام سرب یافت شد که هیچ­گونه تیمار تلقیح با کودهای بیولوژیک و محلول­پاشی با نانوذرات سیلیسیم را دریافت نکرده بود که تفاوت معنی­داری با گیاهان تحت تیمارهای تلقیح با کودهای بیولوژیک در شرایط بدون محلول­پاشی سیلیسیم در این سطح از آلودگی سرب را نداشت (شکل 2) و کمترین میزان تولید مالون دی آلدهید (113/0 میکرومول بر گرم وزن تر) در گیاهان پرورش یافته در خاک بدون آلودگی سرب و تلقیح شده با باکتری جدایه 6 و محلول­پاشی با 3 میلی­مولار نانو ذرات سیلیسیم حاصل شد.

شکل2- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم محتوی مالون دآلدیید در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₅₀₀: 500 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 میلی گرم برکیلوگرم سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 میلی گرم برکیلوگرم سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

فعالیت آنزیم کاتالاز: با توجه به مقایسه میانگین تاثیر تیمارها مشخص می­شود که با افزایش غلظت سرب میزان فعالیت آنزیم کاتالاز گیاه گشنیز به­طور معنی­داری افزایش یافت و این افزایش در گیاهان پرورش یافته در خاک حاوی 1500 پی‌پی‌ام سرب در مقایسه با گیاهانی که در خاک بدون سرب رشد کرده بودند چشمگیر بود. به عبارت دیگر بیشترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (52/0 میکرو مول بر گرم وزن تر بر دقیقه) در گیاهان پرورش یافته در شرایط آلودگی با غلظت 500 پی­پی­ام سرب حاصل شد که با جدایه 6 باکتری تلقیح شده و تحت تیمار محلول­پاشی با غلظت سه میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم قرارگرفته بودند که تفاوت معنی­داری با گیاهان تلقیح شده با جدایه 19 باکتری و محلول­پاشی شده با همان غلظت نانوذرات سیلیسیم نداشتند (شکل 2) و کمترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (172/0 میکرو مول بر گرم وزن تر بر دقیقه) در گیاهان شاهد و گیاهان تیمار شده با 1500 پی­پی ام حاصل شد که اختلاف معنی­داری با گیاهان تلقیح شده با جدایه های 6 و 19 و بدون تلقیح در شرایط مشابه اختلاف معنی­داری نداشت (شکل 3).

آنزیم پراکسیداز: مطابق شکل 4 افزایش غلظت فلز سرب در بسترکاشت، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاه گشنیز به طور معنی­داری افزایش یافت و درگیاهان پرورش یافته در بسترهای حاوی 1500 پی­پی­ام سرب در مقایسه با گیاهان رشد کرده در بستر بدون آلودگی سرب افزیش یافت. بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز برگ گیاهان گشنیز (54/0 میکرومول بر گرم وزن تر بر دقیقه) در تیمار ترکیبی تلقیح با جدایه 6 باکتری و محلول­پاشی با غلظت 3 میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم در شرایط آلودگی با غلظت 1500 پی­پی­ام سرب حاصل شد وکمترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز (112/0 میکرومول بر گرم وزن تر بر دقیقه) نیز در گیاهان رشد کرده در غلظت 1000 پی­پی­ام سرب تلقیح شده با میکوریز و بدون محلول­پاشی با نانوذرات سیلیسیم، مشاهده شد.

آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: جدول مقایسه میانگین تاثیر تیمارها نشان داد که با افزایش غلظت فلز سرب در بسترکاشت، میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز گیاه گشنیز به­طور معنی­داری افزایش یافت و درگیاهان پرورش یافته در بسترهای حاوی 500 پی­پی­ام سرب در مقایسه با گیاهان رشد کرده در شاهد میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز 230 درصد افزایش یافت (شکل 5). بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در گیاهان گشنیز (40/2 میکرومول بر گرم وزن تر بر دقیقه) در تیمار ترکیبی بدون تلقیح با ریزجانداران و محلول­پاشی با 3 میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم در شرایط آلودگی با غلظت 500 پی­پی­ام سرب عنصر سنگین سرب حاصل شد وکمترین میزان فعالیت این آنزیم (210/0 و 207/0 میکرومول بر گرم وزن تر بر دقیقه) نیز درگیاهان رشد کرده در شرایط 1000 پی­پی­ام آلودگی خاک با سرب با تیمار میکوریز و جدایه 19 باکتری بدون محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم حاصل شد.

شکل 3- اثر متقابل ریزجاندران محرک رشد و میکوریز و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 پی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 پی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 پی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

جدول 3- نتایج تجزیه وارایانس تیمارهای آزمایشی بر آنتی اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی در گیاه گشنیز تحت تنش سرب

شکل 4- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر فعایت آنزیم پراکسیداز در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 پی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 پی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 پی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

شکل 5- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 پی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 پی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 پی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

محتوی فلاونویید: مقایسه میانگین تاثیر تیمارها نشان می­دهد که با افزایش غلظت سرب میزان فلاونویید درگیاه گشنیز به­طور معنی­داری افزایش یافت و بیشترین میزان برای این صفت (23/114 میلی گرم کوئرسیتین بر گرم­وزن­خشک) درگیاهان پرورش یافته در خاک حاوی 1500 پی‌پی‌ام سرب که با قارچ میکوریز تلقیح شده و با 3 میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم محلول­پاشی شده بودند، یافت شد در حالی که با گیاهان تیمار شده با جدایه 19 با 3 میلی­مولار نانو ذرات سیلیسیم در خاک حاوی 1500 پی‌پی‌ام اختلاف معنی­داری نداشت (شکل 6) و کمترین میزان فلاونوئید (82/52 میلی­گرم کوئرسیتین بر گرم­وزن­خشک) در گیاهان شاهد مشاهده شد (شکل 6).

شکل 6- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر محتوی فلاونویید در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 پی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 پی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 پی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

فنل: شکل 7 نشان داد که با افزایش غلظت عنصر سنگین سرب در بسترکاشت، میزان فنل گیاه گشنیز به­طور معنی­داری افزایش یافت و درگیاهان پرورش یافته در بسترهای حاوی 1500 پی­پی­ام سرب در مقایسه با گیاهان رشد کرده در بستر بدون آلودگی سرب میزان فنل 26 درصد افزایش یافت (شکل 7). بیشترین میزان فنل برگ گیاهان گشنیز (43/149 میلی­گرم گالیک اسید بر گرم ­وزن­ خشک) در تیمار ترکیبی تلقیح با جدایه 6 باکتری و محلول­پاشی با 3 میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم در شرایط آلودگی با غلظت 1500 پی­پی­ام سرب عنصر سنگین سرب حاصل شد وکمترین میزان فنل (2/94 میلی­گرم گالیک اسید برگرم ­وزن ­خشک) نیز در گیاهان رشد کرده در شرایط بدون آلودگی خاک با سرب حاصل شد که با هیچ یک از کودهای بیولوژیک تلقیح نشده و محلول­پاشی نانوذرات سیلیسیم نیز در مورد آن­ها انجام نشده بود.

ظرفیت آنتی اکسیدانی تام:  شکل 8 نشان داد که با افزایش غلظت عنصر سنگین سرب در بسترکاشت، ظرفیت آنتی اکسیدانی تام گیاه گشنیز به طور معنی­داری افزایش یافت و درگیاهان پرورش یافته در بسترهای حاوی 1500 پی­پی­ام سرب در مقایسه با گیاهان رشد کرده در بستر بدون آلودگی سرب ظرفیت آنتی اکسیدانی14 درصد افزایش یافت (شکل 8). بیشترین ظرفیت آنتی اکسیدانی گیاهان گشنیز (86/82 درصد) در تیمار ترکیبی تلقیح با جدایه 6 باکتری و محلول­پاشی با غلظت 3 میلی­مولار نانوذرات سیلیسیم در شرایط آلودگی با غلظت 1500 پی­پی­ام سرب عنصر سنگین سرب حاصل شد وکمترین ظرفیت آنتی اکسیدانی (04/46 درصد) نیز در گیاهان رشد کرده در شرایط بدون آلودگی خاک با سرب حاصل شد که با هیچ یک از کودهای بیولوژیک تلقیح نشده و محلول­پاشی با نانوذرات سیلیسیم نیز در مورد آن­ها انجام نشده بود (شکل 8).

شکل 7-  اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم بر محتوی فنل در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 پی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 پی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 پی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

شکل 8- اثر متقابل ریزجاندران و محلول­پاشی با نانو ذرات سیلیسیم محتوی ظرفیت آنتی­اکسیدانی تام در گیاه گشنیز تحت تنش سرب. در این شکل Pb₀: 0 ی­پی­ام سرب، Pb₅₀₀: 500 ی­پی­ام سرب، Pb₁₀₀₀: 1000 ی­پی­ام سرب، Pb₁₅₀₀: 1500 پی­پی­ام سرب. S6: تلقیح با Bacillus cereus strain 264ZG5، S19: تلقیح با Bacillus thuringiensis isolate2 T2، M: تلقیح با میکوریز گونهGlumos mosseae . حروف متفاوت در هر صفت بیان کننده­ی معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح احتمال 5 درصد توسط آزمون LSD می­باشد.

بحث و نتیجه گیری

مطابق نتایج حاصل از این پژوهش بیومس گیاهی بشدت تحت تاثیر غلظت­های مختلف سرب قرار گرفت و با افزایش میزان سرب بیومس گیاهی کاهش یافت. سرب بعنوان یکی از آلاینده‌های مهم اکوسیستم خشکی با خاصیت بسیار سمی برای گیاهان است که با تخریب سلول­ها، ایجاد اختلال در سیستم فیزیولوژیکی گیاهان و نیز کاهش جذب آب و برخی عناصر غذایی، رشد و عملکرد گیاهان را تحت تاثیر قرار می­دهد (68). سرب به دلیل انباشت زیاد در بخش­های سطحی خاک به راحتی در دسترس گیاهان قرار می­گیرد (53). یکی از اولین مکانیسم­های سرب تاثیر بر ریشه گیاه مانند تغییرات نامطلوب در ظاهر ریشه­های تیمار شده با سرب از جمله قهوه­ای شدن ریشه، لیگنینی شدن، ممانعت از رشد، کاهش قابلیت ارتجاع دیواره سلولی و کاهش بیوماس است، که بدین طریق سیستم جذب گیاه را مختل کرده و بر رشد گیاه موثر است (5 و17).

میزان پراکسیداسیون لیپیدها در گیاه گشنیز تحت تنش سرب بویژه در غلظت­های بالاتر افزایش قابل ملاحظه­ای نشان داد، این افزایش نشان از پراکسیداسیون لیپیدها در گیاه گشنیز تحت تنش سرب دارد، در واقع زمانی رادیکال­های آزاد اکسیژن از حالت نرمال خارج می­شوند سبب افزایش تولید مالون دآلدئید در گیاه خواهد شد (57) که یکی از بیومارکرهای برای نشان دادن حالت تنش است. در تحقیق انجـام شـده در گیـاه شـاهی (9) و بــاقلای (78) پــرورش یافتــه تحت غلظت­های مختلف فلـز سـرب مشـخص شـد کـه وجود عناصر سنگین در محیط کشت گیاه موجب کـاهش رشد و آشفتگی در متابولیسم گیاه به دلیل افزایش فعالیـت آنزیم لیپوکسیژناز شده که بـا تخریـب لیپیـدهای غشـای سلول بر محتـوای مـالون دی آلدئیـد و پراکسـید هیدروژن گیاهان تحت تنش شد.

مطابق نتایج حاصل از این پژوهش آنزیم­های آنتی اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در گیاه گشنیز بطور معنی داری تحت تاثیر تنش سرب در تمامی سطوح قرار گرفت، اما نتوانست آنزیم آسکوربات پراکسیداز را تحت تاثیر قرار دهد، تنش اکسیداتیو ممکن است در گیاهان زمانی که در معرض تنش­های زیستی و غیرزیستی مانند تنش فلزات سنگین قرار گیرند رخ ­دهد (2). در واقع سیستم آنتی اکسیدانی آنزیمی یکی از مکانیسم­های اصلی سمیت زدایی فلزات سنگین در گیاهان می­باشند که میزان فعالیت این آنزیم­ها بسته به مدت و نوع تنش، گونه گیاهی و بخش­های گیاهی متفاوت است، سوپراکسید دیسموتاز یکی از اولین آنزیم­های درگیر در این فرآیند است که در این پژوهش مقادیر آن بخصوص در غلظت­های بالاتر سرب افزایش قابل ملاحظه­ای داشته است، در واقع این آنزیم مقادیر O^2- را تعدیل می نماید زیرا بعنوان یکی از اولین مشتقات تولید شده در شرایط تنش می­باشد و قابلیت تولید به مشتقات با خطرات بالاتر مثل پراکسی نیتریت را دارد، همچنین افزایش فعالیت آنزیم به دلیل افزایش سوپراکسید می‌باشد که سبب افزایش سنتز de novo از پروتئین‌های آنزیمی می‌شود احتمالا یون‏های سوپر‌اکسید از طریق نقش سیگنالی سبب افزایش بیان ژن‌های سوپراکسیددیسموتاز می‌شوند (75). آنزیم دیگری که همسو با سوپراکسید دیسموتاز سبب پاکسازی پراکسید هیدروژن در گیاه می شود آنزیم کاتالاز است، زیرا فعالیت آنزیم سوپراکسید منجر به تولید پراکسید هیدروژن  می­شود، در گیاه گشنیز نیز میزان فعالیت این آنزیم افزایش می­یابد، این آنزیم در شرایط تنش اکسیداتیو فعال می­شود و قادر به هضم و حذف رادیکال­های اکسیدهیدروژن می­باشد (29)، در تحقیق صورت گرفته بر روی گیاه لیف (37) و برنج سرب سبب افزیش فعالیت آنزیم کاتالاز شد. افزایش فعالیت کاتالاز در تیمار با فلزات سنگین به‏دلیل افزایش تولید سوبسترای آن مانند پراکسید هیدروژن در سلول‌های گیاهی و به‏منظور مقابله با شرایط تنش می‌باشد (29). البته در تحقیق صورت گرفته در گیاه برنج با افزایش غلظت سرب فعالیت آنزیم کاتالاز همانند این پژوهش کاهش یافت که این نشان می‏دهد که فعالیت سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی وابسته به غلظت سرب است (33). در واقع در غلظت های بالاتر تولید پراکسید هیدروژن و رادیکال‌های آزاد دیگر در سلول به‏شدت زیاد است لذا ممکن است در اثر مکانیسم هایی مانند  بازدارندگی در متابولیسم، غیرفعال شدن آنزیم، تغییر در اجتماع زیر واحدهای آنزیم و از طرفی ممکن است فعال شدن پروتئازهای پراکسی‌زومی فعالیت آنزیم کاتالاز کاهش می‌یابد (75). همچنین کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز در غلظت‌های بالا احتمالا به‏دلیل غیرفعال شدن آنزیم توسط رادیکال­های اکسیژن، کاهش سنتز آنزیم و دلیل دیگری برای کاهش فعالیت آنزیمی باشد (51). همچنین کاتالاز آنزیمی است که حاوی آهن است و سرب سبب کاهش سنتز هم می‌شود و از این‏رو فعالیت کاتالاز در غلظت بالا کاهش می‌یابد (27).

همچنین فعالیت آنزیم پراکسیداز نیز تحت غلظت­های مختلف سرب در گیاه گشنیز شدت افزایش یافت، این آنزیم اثر مخرب یون­های سوپراکسید را دفع می­کند (60). در واقع پراکسیدازها با تبدیل پراکسید هیدروژن به آب از گیاه محافظت می­کنند و همچنین در مورفوژنز و اکسیداسیون اکسین نیز نقش دارند. افزایش فعالیت این آنزیم نیز در تیمار گیاه برنج با 200 میکرومولار سرب تایید شده است (61). در واقع با افزایش سرب موجب افزایش آزاد شدن آنزیم‌های پراکسیداز واقع در دیواره سلول می‌شوند (47 و 21). این افزایش احتمالا یک واکنش حفاظتی برای به تاخیر انداختن پیری است زیرا آنزیم‌ پراکسیداز واکنش‌های که سبب حفاظت گیاهان در مقابل آسیب رادیکال‌های آزاد می‌شود را کاتالیز می‌کند (13).

تنش سرب در گیاه گشنیز آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی را نیز تحت تاثیر قرار داد و در اکثر موارد بجز ویتامین ث سبب افزایش چشمگیر این آنتی اکسیدان­ها شد، تنش فلزات سنگین سبب بیوسنتز ترکیبات فنلی می­شود، این ترکیبات بطور طبیعی نیز در گیاه وجود دارند و نقش­های ساختاری و ایجاد رنگ و ... دارند اما برخی از این ترکیبات نقش آنتی اکسیدانتی داشته و در شرایط تنش در سلول­های گیاهی سنتز می­شوند، فلاونوئیدها، آنتوسیانین­ها، تانن­ها، هیدروکسیسینامیک استرها و لیگنین­ها جزء متابولیت­های ثانویه حاصل از مسیر فنیل پروپانوئید می­باشند که در بافت­های گیاهی به وفور یافت می­شوند، در واقع این مسیر، مسیر اصلی بیوسنتز متابولیت­های ثانویه در سلول می­باشد (78). بالا بودن ترکیبات فنلی دلیل عمده بالا بودن فعالیت آنتی اکسیدانی بعضی از عصاره­ها می­باشد. شواهد موجود ارتباط مثبتی بین میزان ترکیبات فنلی و قدرت آنتی اکسیدانی بسیاری از گیاهان را نشان می­دهد، در طول تنش فلزات سنگین ترکیبات فنلی مانند شلاتور (Chelator) عمل کرده و از سوی دیگر می­توانند به­طور مستقیم گونه­های اکسیژن فعال را پاک سازی کنند (50). یکی از بزرگترین گروه­­های ترکیبات فنلی فلاونوئیدها هستند که به­طور وسیعی درتمام سلسله گیاهی حضور دارند. فلاونوئیدها هم به عنوان عوامل آنتی­اکسیدان وهم به عنوان ترکیبات کلاته کننده فلزات، نقش مهمی در ایجاد تحمل نسبت به تنش فلزات سنگین درگیاهان به عهده دارند (49).

در این پژوهش تلقیح با باکتری های محرک رشد و میکوریز تاثیر مثبتی بر بیومس گیاه گشنیز گذاشت بطوریکه بالاترین بیومس در گیاهان تلقیح شده با جدایه 6 باکتری و یا میکوریز همراه با محلول­پاشی با 3 میلی­مولار سیلیسیم حاصل شد. پونامیا و همکاران (64)گزارش کردند مایه­زنی قارچ  G. mosseae سبب افزایش رشد و عملکرد گیاهان علفی در خاک­های آلوده به سرب می­شود. برای مثال بافیل (9)گزارش کردند که استفاده از قارچ Glomus sp. در خاک­های آلوده به سرب سبب افزایش رشد و عملکرد ریشه­های گیاه اکالیپتوس می­شود. باکتری­ها محرک رشد نیز از طرق مختلفی مانند تولید انواع ویتامین­ها، اسیدهای آمینه و هورمون­های گیاهی، تولید سیدروفور و همچنین تولید آنزیم ACCدآمیناز، رشد و عملکرد گیاهان را می­افزایند (45). نتایج پژوهش­های مختلف نشان داده افزودن این باکتری­ها به خاک­های آلوده به فلزات سنگین می­تواند اثرات تنش را کاهش داده و به رشد و عملکرد گیاهان در این خاک­ها کمک کند (31 و 38).

 از مهم­ترین رو­ش­های­کاهش اثرات منفی تنش، راه­کارهای بیولوژیکی است (8)، در میان کودهای زیستی متنوع باکتری­های محرک رشد گیاهی، مواد معدنی حل­کننده خاک، هورمون­های گیاهی، آنزیم­ها و متابولیت­های ثانویه مختلف را در گیاهان تولید می­کنند که باعث تسریع در رشد و توسعه گیاه و محافظت از گیاهان در برابر تنش فلزات سنگین مختلف می­گردد. در واقع باکتر­ی­ها به­عنوان یک کاتابولیسم عمل می­کنند، علاو­ه­براین فعالیت آنزیم­هایی مانند سوپراکسیداز و کاتالاز را افزایش می­دهند (15). با توجـه به نقش مهم آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز در حـذف رادیکال سمی پراکسیدهیدروژن در شرایط تـنش­هـای مختلــف، بنــابراین افــزایش فعالیــت ایــن آنــزیم در اثر تلقیح باکتری، می­تواند عاملی مؤثر در حـذف گونه­های فعال اکسیژن و در نتیجـه افـزایش مقاومـت گیاهان به تنش باشد. تیمارهای زیستی در گیاه گشنیز سبب تغییر در فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی شد به­طوریکه بیشترین تاثیر را میکوریز و جدایه 6 باکتری نشان دادند که در اکثر تیمارها اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. بطورمثال در گیاهان تلقیح شده با باکتری فعالیت آنزیم­ها به­ خصوص آنزیم کاتالاز در پاسخ به تنش­های اکسیداتیو بیشتر از گیاهان شاهد بود (44). این نتایج در مورد گیاهان گوجه فرنگی (65)، تربچه (20)، اسفناج (59)، برنج (60) وکلم پیچ (63) همخوانی دارد. رفیعی دمنه و همکاران (66) در بررسی القا مکانیسم دفاعی آنتی اکسیدان در گیاهچه­های فستوکا تلقیح شده با قارچ میکوریز تحت تنش نیکل اظهار کردند حضور قارچ، سبب افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در شرایط سمیت نیکل می­شود. حضور قارچ Glomus intraradices  در گیاهچه­های فستوکا باعث تقویت سیستم آنتی اکسیدان شده و همچنین اثرهای منفی سمیت نیکل را در این گیاهچه­ها کاهش داد. وانگ و همکاران (79) معتقد بودند که تلقیح باکتریایی سبب سنتز آنزیم­های آنتی اکسیدان را تحریک می کند. این احتمال وجود دارد که تولید متابولیت­ها از طریق باکتری­های محرک رشد، از جمله هورمون ها، نقش مهمی در تحریک و بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانی داشته باشد (72). گونزالز-مندوزا و همکاران (32) گزارش داد که تلقیح باکتری­ها در شرایط استرس زا باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز می­شود. در تحقیق دیگر بر تلقیح با باکتری­های گونه باسیلوس با کاهش پراکسیداسیون لیپیدها وافزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکیسدان وآمیلاز و پروتئیناز، این اثر تنش را کاهش داده و باعث رشد گیاه در خاک آلوده به فلزات سنگین می­شوند (60).

گزارش شده است که سیلیسیم به طور مثبتی فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان را تحت تاثیر قرار داد (4)، افزایش در میزان فعالیت آنزیم­های برگی همزمان با تحریک ایزوفرم­های مربوطه تحت شرایط تنش گزارش شده است (74). اثرات مثبت سیلیسیم بر روی تغییرات القاء شده به وسیله­ی تنش در خسارت اکسیداتیو به رنگدانه­های فتوسنتزی، پروتئین­ها، لیپیدها و فعالیت برخی آنزیم­ها را در گیاه گندم رشد یافته در گلدان بررسی شده است. نتایج بررسی آن­ها نشان داد که کاربرد سیلیسیم در مقایسه با تیمار شاهد، فعالیت برخی آنزیم­های پاد اکسایشی، اسیدهای چرب اشباع نشده لیپیدها، میزان رنگدانه­های فتوسنتزی و پروتئین­های محلول را تحت تنش افزایش می­دهد (43). بعبارت دیگرسیلیسیم باعث افزایش جذب کربن خالص، سرعت هدایت روزنه­ای، مقدار تعرق و فعالیت آنزیم­های پاد اکسایشی در گیاه می­شود (62). میتال و همکاران (52) در آزمایشی نشان دادند که بهبود عملکرد فعالیت کلزا تحت تنش، مربوط به افزایش در فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز در اثر محلول­پاشی با سیلیسیم بوده است. اثر تحریکی سیلیسیم بر روی آنتی اکسیدان­ها در گیاه گندم (12)، پنبه (25) تحت تنش کادمیوم و در موز (14) و تحت تنش سرب گزارش شده است. درواقع سیلیسیم با تحریک سیستم آنتی­اکسیداتی در گیاه و تشکیل کمپلکس با فلزات سنگین و انتقال فلزات سنگین به اندام­هایی نظیر واکوئل سلول­های گیاهی باعث کاهش اثرات تنش و سمیت فلزات سنگین در گیاهان می­شود (41). علاوه­براین گزارش شده است که سیلیسیم محتوی مالون دی آلدئید، پراکسید هیدروژن و نشت الکترولیتی در شاخه­ها و ریشه­های گیاهان پنبه تحت تنش کادمیوم، روی و سرب را کاهش می­دهد (6). به­طور مشابه، کاربرد سیلیسیم محتوای پراکسید هیدروژن و مالون دآلدئید در اسفناج، برنج، گندم و ریشه در تنش روی، کادمیم، آهن، بور، آرسنیک و منگنز را کاهش می­دهد (73 و 18). همچنین کاربرد سیلیسیم باعث افزایش فعالیت آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی (گلوتاتیون، پروتئین غیر تیئولی و اسید آسکوربیک در خیار، برنج و پاک چوی تحت تنش منگنز و کادمیوم شد (77). علاوه براین سیلیسیم ممکن است نقش اضافی در افزایش مقاومت به وسیله میانجیگری متابولیسم ترکیبات فنولیکی داشته باشد .گزارش شده که تیمار با سیلیسیم در گیاه ذرت مقدار ترکیبات فنولیکی را به میزان پنج برابر افزایش داده است، سیلیسیم با سازوکارهایی مانند تغییرات آناتومی در بافت­های گیاهی که ناشی از تجمع فیتولیت­ها هستند، اثر تنش­های غیرزیستی را کاهش و استحکام گیاه را افزایش می­دهد و حرکت آب و مواد غذایی را تسهیل می­کند (39).

در این پژوهش تنش سرب سبب کاهش معنی­دار بیومس گیاهی در گیاه گشنیز شد، از آنجاییکه مکانیسم­های زیادی در این قضیه درگیر هستند، هدف ما بررسی یکی از مهم­ترین مکانیسم­های مقاومت یعنی آنتی­اکسیدان­ها بود. نکته بعدی کاربرد همزمان ریزجانداران و سیلیسیم بود که در موارد بسیار محدود در گیاهان دیگر در تتنش های دیگر فلزات سنگین بررسی شده بود اما مکانیسم اصلی کاربرد این دو بایکدیگر هنوز ناشناهته است. نویسندگان این مقاله معتقدند که کاربرد همزمان این دو در ابتدا آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی تاثیر بیشتری گذاشته و سبب افزایش تمامی آنتی اکسیدان­های اندازه گیری شده اما در آنتی اکسیدان­های آنزیمی تنها آنزیم پراکسیداز توانست تا غلظت­های بالای سرب واکنش خوبی نشان دهد هرچند آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در غلظت­های پایین سرب بسیار خوب عمل کردند. در این پژوهش جدایه 6 باکتری و محلول­پاشی با 3 میلی­مولارسیلیسیم نتایج درخشانتری داشت که احتمالا بعلت خواص محرک رشدی بالاتر این جدایه بود هرچند در بسیاری از صفات با میکوریز اختلاف معنی داری نشان نداد. البته تایید این قضایای ذکر شده نیاز به مطالعات بیشتر در گیاهان دیگر و خصوصا در بحث مولکولی می­باشد.