Document Type : Research Paper
Authors
1 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Iran
2 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Khorramabad, Iran
3 Agronomy and plant breeding Department, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran
Abstract
Melatonin (N-acetyle-5-methoxy tryptamine) has recently been considered as a phytohormone in raising the resistance of plants against environmental stresses. The present study aims to assess the effect of melatonin treatment on the tolerance of salt by Phaseolus vulgaris cv. Sadri which was conducted in completely randomized design, repeated three times. In this study, salinity stress was introduced in three levels of 0, 100 and 200 mM of NaCl to bean plants treated by melatonin with respective concentrations of 0, 100 and 200 µM. It was found that salinity stress decreased the dry weight of shoot, the root and the photosynthetic pigments while it increased proline, soluble sugars, malondialdehyde and H2O2 as it increased the activity of antioxidant enzymes of catalase, peroxidase and ascorbate peroxidase. Applying melatonin improved plant growth, the concentration of photosynthetic pigments, proline, soluble sugars and the activity of antioxidant enzymes while it reduced H2O2 and malondialdehyde concentration. Results showed that melatonin had a significant effect on raising the resistance of phaseolus vulgaris cv. Sadri against salt and that lower concentrations of melatonin worked better.
Keywords
اثر ملاتونین بر برخی ویژگیهای مورفوفیزیولوژیکی گیاه لوبیا رقم صدری
(Phaseolus vulgaris cv. Sadri) تحت تنش شوری
فاطمه عزیزی1، حمزه امیری1* و احمد اسماعیلی2
1 ایران،خرمآباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
2 ایران، خرمآباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
تاریخ دریافت:27/4/98 تاریخ پذیرش: 13/7/98
چکیده
به تازگی نقش ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی تریپتامین) به عنوان یک فیتوهورمون در افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنشهای محیطی مورد توجه قرار گرفته است. پژوهش حاضر با هدف ارزیابی اثر تیمار ملاتونین در تحمل گیاه لوبیا رقم صدری به شوری، در قالب طرح بلوکهای کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. در این پژوهش تنش شوری در سه سطح 0، 100 و 200 میلیمولار NaCl به صورت افزوده شده به محلول غذایی نیمهوگلند بر روی گیاهان لوبیا تیمار شده با غلظتهای 0، 100، 200 و 400 میکرومولار ملاتونین اعمال شد. تنش شوری سبب کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه، کاهش غلظت رنگیزههای فتوسنتزی، افزایش میزان پرولین، قندهای محلول، مالوندیآلدهید و H2O2 و نیز افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز شد. با استعمال ملاتونین رشد گیاه بهبود یافت. غلظت رنگیزههای فتوسنتزی، پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان افزایش یافت و از غلظت H2O2 و مالوندیآلدهید کاسته شد. نتایج نشان داد که ملاتونین در افزایش مقاومت گیاه لوبیا به شوری اثر معنیداری داشته است و غلظتهای پایینتر ملاتونین، مؤثرتر عمل کردهاند.
واژههای کلیدی: آنتیاکسیدان، شوری، کاتالاز، لوبیا، ملاتونین
* نویسنده مسئول، تلفن: 33312010-066 ، پست الکترونیکی: amiri_h_lu@yahoo.com
مقدمه
ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی تریپتامین) هورمونی از تیپ ایندولآمین و مشتق از تریپتوفان است که در مهرهداران نقشهای فیزیولوژیک متعددی چون تنظیم ریتمهای سیرکادین، نوردورگی و اثر بر خواب، تولیدمثل، سیستم ایمنی و آنتیاکسیدانی را برعهده دارد. در گیاهان عالی ملاتونین از نظر مسیر بیوسنتز و اعمال فیزیولوژیک دارای اشتراکاتی با هورمون شناخته شده IAA است (20). در گیاهان محل بیوسنتز ملاتونین کلروپلاستها هستند و مقدار ملاتونین سلولهای گیاهی در مقایسه با سلولهای جانوری بسیار بیشتر است (3، 53). آنچه مطالعه ملاتونین را در گیاهان جالب میسازد نقشهای متعددی است که در رشد گیاه و دفاع در برابر عوامل محیطی ایفا میکند. گزارشهایی در زمینه نقش ملاتونین در بهبود پاسخهای گیاه به تنشهایی چون خشکی (12، 16، 19، 40، 45، 48)، شوری (17، 47، 50)، سرما (8، 13، 43، 51)، حمله پاتوژنها و محافظت در برابر علفکش (27)، سمیت یونی (29،42) و تنش اکسیداتیو (21) ارائه شده است. گزارشی از افزایش میزان ملاتونین داخلی در گیاه Glycyrrhiza uralensis تحت تیمار با پرتو UV-B نشان از نقش مؤثر آن در محافظت از آسیب اکسیداتیو ایجاد شده با UV دارد (3). بنظر میرسد یکی از نقشهای کلیدی ملاتونین در گیاهان در رابطه با فتوسنتز و محافظت نوری باشد. علاوه بر آن که در شرایط تنشی مقدار ملاتونین گیاه افزایش مییابد، استفاده از ملاتونین خارجی نیز میتواند در ایجاد مقاومت در برابر تنش تأثیرگذار باشد زیرا گیاهان میتوانند ملاتونین خارجی را جذب و ذخیره کنند (49).
شوری یک تنش غیرزیستی است که در کل دنیا بویژه نواحی خشک و نیمهخشک بر تولید محصولات کشاورزی اثر نامطلوب میگذارد (20، 28، 38، 47). تنش شوری سبب ایجاد تنش اکسیداتیو از طریق افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) میگردد. ROSها کربوهیدراتها را اکسید کرده و رنگدانهها را تخریب میکنند و به لیپیدهای غشا، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک آسیب میزنند. پراکسیداسیون لیپیدها باعث بهم خوردن یکپارچگی غشا و تعادل متابولیسم میشود (28، 31، 49). منبع اصلی تولید ROS در سلولهای آسیبدیده از تنش شوری، اندامکهایی چون کلروپلاست، میتوکندری و پروکسیزومها هستند (32، 38). گیاهان برای اجتناب از اثرات ROSهایی چون H2O2 باید بتوانند بین تجزیه و تولید آنها تعادل ایجاد کنند. بهره بردن از سیستمهای آنتیاکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی برای خنثی کردن ROSها یکی از راهکارهایی است که گیاهان در شرایط تنشی پیش میگیرند (31، 38، 39). ملاتونین به عنوان جاروب کننده عوامل اکسیداتیو و متعادلکننده فرآیندهایی که تعادل ردوکس سلول را تغییر میدهند، میتواند در متحمل کردن گیاهان به نمک گزینه مناسبی باشد (3، 4، 26). برای بهبود بخشیدن تحمل گیاهان زراعی به نمک میتوان از روشهایی چون مقاومسازی به تنش، تنظیم شیمیایی و اصلاح نژاد استفاده کرد که در این میان تنظیم شیمیایی به دلیل چرخه زمانی کوتاهتر و هزینههای پایینتر و اثرات سریعتر بر روشهای مهندسی ژنتیک و اصلاح نژاد مقدم است (20). بدلایلی که شرح داده شد، در سالهای اخیر استفاده از ملاتونین بعنوان یک فیتوهورمون که اثرات جالب توجهی بر روی رشد و نمو و مقاومت به تنش در گیاهان دارد، با اقبال مواجه شده است. از آنجایی که تاکنون هیچ گزارشی از اثر تیمار ملاتونین بر روی گیاه لوبیا در شرایط تنش شوری گزارش نشده است، در پژوهش حاضر به بررسی این مقوله پرداخته شده است.
مواد و روشها
تهیه و پرایم کردن بذرها و کشت هیدروپونیک: این آزمایش در قالب طرح بلوکهای کاملا تصادفی با سه تکرار در گلخانه گروه زیستشناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه لرستان انجام شد. بذرهای لوبیا رقم صدری از ایستگاه ملی تحقیقات لوبیای خمین تهیه شدند. بذرهای هماندازه و سالم انتخاب شده و پس از استریل سطحی با هیپوکلریت سدیم 7% به مدت 5 دقیقه و 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، بمدت 12 ساعت در محلولهای ملاتونین با غلظت صفر و 100 و 200 و 400 میکرومولار خیسانده شدند. سپس مجدداً با آب مقطر استریل شستشو داده شده، بر روی کاغذ صافی واتمن خشک شدند و برای جوانهزنی به پتری دیشهای دارای آب مقطر استریل انتقال یافتند. جوانهزنی در شرایط تاریکی و با میانگین دمای روز و شب به ترتیب 25 و 16 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از جوانه زدن بذرها و انتقال به گلدانهای 10 سانتیمتری حاوی پرلیت، گلدانها به گلخانه با دوره نوری 16 ساعت و شدت نور 1200 لوکس و دمای متوسط شب و روز 16 و 25 درجه منتقل شدند. هر گلدان شامل سه گیاه به عنوان یک تکرار در نظر گرفته شد. آبیاری با محلول هوگلند نیمقدرت (7-8/6= pH) انجام شد. گیاهان در مرحله چهار برگی با غلظتهایی از ملاتونین که با غلظتهایی که پرایم کردن بذرها انجام شده بود، یکسان بودند، سه بار و با فاصله دو روز از همدیگر، محلولپاشی شدند. برای محلولپاشی هر گیاه از 50-30 سیسی محلول ملاتونین استفاده شد تا حدی که محلول بر روی گیاه جاری شد. پس از آخرین مرحله محلولپاشی، برای ایجاد شرایط تنش شوری، NaCl به محلول هوگلند اضافه شد. گلدانها به سه گروه تقسیم شدند و هر گروه در معرض یکی از غلظتهای صفر و 100 و200 میلیمولار NaCl قرار گرفتند. برداشت، 48 ساعت بعد از اعمال تنش صورت گرفت. از هر گلدان یک گیاه برای تعیین وزن تر و خشک برداشت شد و دو گیاه باقیمانده به منظور انجام سنجشهای بعدی، پس از برداشت بلافاصله به نیتروژن مایع و سپس به فریزر 80- منتقل شدند.
وزن خشک بخشهای هوایی و ریشهها پس از 48 ساعت نگهداری در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد به دست آمد.
اندازهگیری رنگیزههای فتوسنتزی: برای اندازهگیری مقدار کلروفیل و کارتنوئید از روش Arnon (1967) استفاده شد. 5./. گرم از بافت تازه برگ گیاه با 1 میلیلیتر استن ۸۰٪ ساییده شد. مخلوط به دست آمده، به مدت 10 دقیقه با سرعت rpm ۶۰۰۰ با استفاده از سانتریفیوژ مدل SIGMA 2-16KL سانتریفیوژ گردید و در نهایت عصاره استنی شفاف جدا شده و پس از ۳۰ دقیقه تاریکی، جذب آن با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدل Epoh، شرکت BioTek انگلستان) در طول موجهای 663 و645 نانومتر برای کلروفیلها و طول موج 470 نانومتر برای کارتنوئیدها سنجیده شد و از فرمولهای مربوطه مقادیر رنگیزهها محاسبه شد (7). مقدار کلروفیل کل نمونه از مجموع کلروفیل a و کلروفیل b بدست آمد.
سنجش قندهای احیا و پرولین: محتوای قندهای احیای نمونه برگ به روش Somogyi (1952) استخراج و جذب نمونهها در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. مقدار قندها با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز و بر اساس میلیگرم در گرم وزن تر ماده محاسبه شد (37). برای تعیین غلظت پرولین برگها از روش Bates و همکاران (1973) استفاده شد. برای این منظور پرولین با سولفوسالیسیلیک اسید ۳٪ استخراج شد و جذب آن در مجاورت نینهیدرین در طول موج 520 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد و با استفاده از منحنی استاندارد، مقدار پرولین نمونه محاسبه شد (9).
سنجش پراکسید هیدروژن و بررسی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: استخراج H2O2 نمونههای برگ بهروش Sergiev و همکاران (1997) با تریکلرواستیک اسید صورت گرفت و جذب نمونه در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. محتوای H2O2 با استفاده از ضریب خاموشی µM-1cm-1 28/0 و بر حسب میکرومول در گرم وزن تر گیاه بیان شد (34). بررسی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به روش هیث و پارکر (1968) و با اندازهگیری مالوندیآلدهید به عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدی غشا انجام گرفت. میزان جذب مالوندیآلدهید تیوباربیتوریک اسید تولید شده و نیز جذب سایر رنگیزههای اختصاصی بترتیب در طول موجهای 532 و 600 نانومتر قرائت شد. میزان جذب در طول موج 600 از مقدار جذب در طول موجnm 532 کسر شد. سپس غلظت مالوندیآلدهید با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM-1 cm-1 155 و بر حسب واحد میکرومول در گرم وزن تر گیاه محاسبه شد (15).
سنجش پروتئین و تعیین فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی تهیه عصاره آنزیمی: 1/0 گرم از نمونه برگ در مجاورت ازت مایع ساییده شد و با 10 میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم mM 50 (7pH=) بهمراه EDTAی mM 1، گلیسرول 60% و پلی وینیل پیرولیدون 1%، به صورت همگن درآمد. سپس در دور g 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی برای سنجش پروتئین و آنزیم مورد استفاده قرار گرفت.
محتوای پروتئین بر اساس روش Bradford (1976) با استفاده از سرم آلبومین به عنوان استاندارد تعیین شد. در این روش 100 میکرولیتر عصاره پروتئینی و 5 میلیلیتر معرف برادفورد به مدت 20 دقیقه ورتکس گردید. پس از قرارگیری به مدت 25 دقیقه در تاریکی و 30 دقیقه سانتریفیوژ در 5000 دور، جذب آن در طول موج 595 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. مقدار پروتئین بر اساس میلیگرم در گرم وزن تر ماده گیاهی گزارش شد (10).
فعالیت کاتالاز (CAT) به روشKato و Shimizu (1987) اندازهگیری شد. در این روش فعالیت این آنزیم بوسیله ارزیابی تجزیه H2O2 به صورت کاهش جذب مخلوط واکنشی شامل عصاره آنزیمی، پراکسید هیدروژن mM10 و بافر فسفاتmM 25، هر 30 ثانیه در طول مدت یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر سنجش شد (18). فعالیت پراکسیداز (POX) با استفاده از روش Mac-Adam و همکاران (1992) در یک مخلوط واکنش شامل عصاره آنزیمی، بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار، محلول پراکسید هیدروژن 3% و گایاکول خالص پس از گذشت 20 ثانیه مورد سنجش قرار گرفت. واکنش با اضافه کردن محلولهای پراکسید هیدروژن و گایاکول آغاز گردید و فعالیت به وسیله افزایش جذب در 436 نانومتر در فواصل زمانی 30 ثانیه، به عنوان نتیجهای از اکسیداسیون گایاکول ارزیابی شد (22). فعالیت آسکوربات پراکسیداز (APX) بر اساس روشNakano و Asada (1981) در یک مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار، آسکوربات 5/0 میلیمولار و پراکسید هیدروژن 25/0 میلیمولار و عصاره آنزیم استخراج شده بر اساس ارزیابی نرخ کاهش غلظت آسکوربات با اندازهگیری جذب آن در طول موج 290 نانومتر اندازهگیری شد (23). فعالیت هر سه آنزیم بر اساس واحد آنزیم در میلیگرم پروتئین در گرم وزن تر گیاه گزارش شد.
آنالیزهای آماری: برای دادهها تجزیه واریانس صورت گرفت و مقایسه میانگین ترکیبهای تیماری با استفاده از روش دانکن به وسیله نرم افزار SPSS 20 انجام شد.
نتایج
رشد گیاه: نتایج تجزیه واریانس صفات وزن خشک اندام هوایی (SDW) و ریشههای (RDW) گیاه لوبیا در جدول1 آمده است. شوری سبب کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه شد.
در بالاترین سطح شوری استفاده شده کمترین SDW مشاهده شد. اثر مثبت ملاتونین بر روی رشد ریشه بیشتر از اندام هوایی بود. مقایسه میانگینها در برهمکنش ملاتونین و شوری نشان داد در سطوح شوری استعمال ملاتونین در همه غلظتها اثرات کاهشی نمک را بهبود بخشید و بیشترین مقدار SDW با 25% افزایش نسبت به شاهد در نمک صفر و ملاتونین µM 100 بود.
جدول1- نتایج تجزیه واریانس اثر ملاتونین بر ویژگیهای فیزیولوژیکی و رشد گیاه لوبیا تحت تنش شوری
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
کلروفیلa |
کلروفیلb |
کلروفیل کل |
کارتنوئید |
وزن بخش هوایی |
وزن ریشه |
میانگین مربعات |
|||||||
شوری |
2 |
**761/8 |
**229/1 |
**514/16 |
**425/7 |
*165/0 |
**009/0 |
ملاتونین |
3 |
**499/0 |
**262/0 |
**411/1 |
**107/6 |
*093/0 |
**012/0 |
شوری×ملاتونین |
6 |
**318/0 |
**044/0 |
**445/0 |
**035/1 |
ns011/0 |
*002/0 |
خطا |
24 |
071/0 |
003/0 |
076/0 |
190/0 |
030/0 |
001/0 |
ns و * و ** به ترتیب غیرمعنیدار و معنیدار در سطح احتمال 01/0 و 001/0 |
ادامه جدول1
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
قند احیا |
پرولین |
MDA |
H2O2 |
POX |
CAT |
APX |
میانگین مربعات |
||||||||
شوری |
2 |
**707/3 |
**814/0 |
**062/0 |
**450/2391 |
**412/34 |
**388/227 |
*483/113 |
ملاتونین |
3 |
*028/1 |
**049/1 |
**029/0 |
**234/533 |
**308/19 |
**175/1265 |
**777/18354 |
شوری×ملاتونین |
6 |
ns102/0 |
**075/0 |
**010/0 |
**060/69 |
*556/7 |
**015/339 |
**195/730 |
خطا |
24 |
224/0 |
003/0 |
002/0 |
346/4 |
00/2 |
352/7 |
708/30 |
ns و * و ** به ترتیب غیرمعنیدار و معنیدار در سطح احتمال 01/0 و 001/0 |
بیشترین مقدار RDW با 46% افزایش نسبت به شاهد به سطح نمک صفر و ملاتونین µM 400 تعلق داشت (شکل1). رنگیزههای فتوسنتزی: شوری و ملاتونین بر روی محتوای کلروفیل a و کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئیدهای برگهای لوبیا اثر معنیداری داشتند. نتایج تجزیه واریانس دادههای این صفات نشان داد که برهمکنش شوری و ملاتونین نیز بر محتوای رنگیزهها اثر معنیداری گذاشت (جدول1). افزایش نمک سبب کاهش رنگیزهها شد. استفاده از ملاتونین مقدار کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئیدها را در مقایسه با شاهد به ترتیب 9%، 30%، 15% و 25% افزایش داد. در مورد کلروفیلها بیشترین تأثیر مربوط به غلظتµM 100 ملاتونین و در مورد کارتنوئیدها مربوط به غلظت µM 400 ملاتونین بود. نتایج حاکی از آن است که اثر بهبوددهنده ملاتونین در شرایط بدون نمک بر روی میزان این رنگیزهها بیشتر بوده است (شکل2). در مورد کارتنوئیدها، بیشترین مقدار کارتنوئید در شرایط نمک صفر و سطح ملاتونین µM 400 مشاهده شد. ممکن است افزایش میزان کارتنوئید در این غلظت از ملاتونین نسبت به سایر غلظتهای ملاتونین به نقش آنتیاکسیدانی این رنگیزه و تنشزا بودن غلظتهای بالای ملاتونین مربوط باشد.
محتوای قند و پرولین: نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که شوری به طور معنیداری سبب افزایش میزان قند و پرولین شد. با افزایش غلظت NaCl مقدار آنها نیز افزایش یافت (جدول1).
شکل 1- مقایسه میانگین صفات وزن خشک اندام هوایی (SDW) و وزن خشک ریشه (RDW) در غلظتهای مختلف NaCl و تیمار با غلظتهای مختلف ملاتونین. هر ستون معرف میانگین ± انحراف معیار 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنیدار از لحاظ آزمون دانکن را نشان میدهد.
شکل2- مقایسه میانگین محتوای رنگیزههای گیاه لوبیا در غلظتهای مختلف NaCl و تیمار با غلظتهای مختلف ملاتونین. هر ستون معرف میانگین ± انحراف معیار 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنیدار از لحاظ آزمون دانکن را نشان میدهد.
ملاتونین به طور معنیداری اثر افزایشی نمک را در مورد محتوای پرولین تشدید کرد. در بین اثرات متقابل شوری و ملاتونین با مقایسه میانگینها بیشترین میزان محتوای قند و پرولین در سطح µM 100 ملاتونین و شرایط mM NaCl 200 مشاهده شد که به ترتیب نسبت به شاهد بدون ملاتونین در این سطح شوری 61% و 280% افزایش میانگین نشان دادند.
مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون غشاها: نتایج واریانس دادههای مربوط به مقادیر H2O2 و MDA برگ در جدول1 آمده است. مقایسه میانگینها نشان داد که افزایش سطح نمک به طور معنیداری سبب افزایش H2O2 و MDA شد. استفاده از ملاتونین سبب کاهش این دو فاکتور در شاهد و سایر سطوح نمک شد که غلظتهای 100 و 200 میکرومولار ملاتونین مؤثرتر عمل کردند. مقایسه میانگینها در اثر متقابل شوری و ملاتونین نشان داد که کمترین مقدار H2O2 و MDA مربوط به غلظت صفر میلیمولار NaCl و µM 100 ملاتونین است که در مورد H2O2، 9% و در مورد MDA، 26% کاهش نسبت به شاهد نشان داد. بیشترین مقدار H2O2 در شرایط mM NaCl 200 و µM 400 ملاتونین مشاهده شد که اختلاف معنیداری با سایر تیمارها داشت (جدول2) و بیشترین مقدار MDA مربوط به شرایط شوری mM NaCl 200 و صفر میکرومولار ملاتونین بود که معنیداری اختلاف میانگینها در جدول2 آمده است.
فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان: نتایج تجزیه واریانس دادههای مربوط به فعالیت آنزیمهای پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در جدول1 آمده است. بجز در مورد CAT، افزایش سطح شوری سبب افزایش فعالیت آنزیم شد.
جدول2- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه لوبیا تحت تأثیر سطوح مختلف شوری و ملاتونین. هر عدد معرف میانگین 3 تکرار است. حروف مشترک عدم اختلاف معنیدار از لحاظ آزمون دانکن را نشان میدهد.
NaCl (mM) |
ملاتونین (µM) |
قند احیا (mg g-1FW) |
پرولین (µg g-1FW) |
MDA (µmol g-1FW) |
H2O2 (µg g-1 FW) |
POX (U mg-1Protein) |
CAT (U mg-1Protein) |
APX (U mg-1Protein) |
|
0 |
410/1e |
g1577/0 |
cd195/0 |
fg231/36 |
d82/4 |
d61/32 |
e183/125 |
0 |
100 |
926/1e |
e4540/0 |
d144/0 |
g672/32 |
d77/5 |
a91/58 |
bc680/145 |
|
200 |
270/1e |
e5430/0 |
bc268/0 |
f125/38 |
d48/5 |
fg40/25 |
f243/106 |
|
400 |
320/1e |
g1547/0 |
b334/0 |
f226/39 |
cd72/6 |
ef72/26 |
h980/61 |
|
0 |
160/2cd |
g2057/0 |
cd213/0 |
d268/53 |
cd48/6 |
de04/31 |
d277/135 |
100 |
100 |
576/2b |
bc9737/0 |
d174/0 |
f572/37 |
a04/11 |
cd98/33 |
b737/151 |
|
200 |
320/2bc |
c9313/0 |
b311/0 |
e933/46 |
cd25/7 |
gh79/20 |
g547/92 |
|
400 |
806/1d |
fg2590/0 |
ab350/0 |
c436/63 |
d30/5 |
fg46/23 |
h420/64 |
|
0 |
886/1d |
f3460/0 |
a438/0 |
b373/68 |
bc45/8 |
b69/53 |
cd01/140 |
200 |
100 |
043/3a |
a3263/1 |
b325/0 |
d030/51 |
a53/11 |
c87/37 |
a170/188 |
|
200 |
543/2b |
b0550/1 |
ab361/0 |
bc541/65 |
ab91/9 |
h26/18 |
g416/85 |
|
400 |
946/1d |
d6650/0 |
ab358/0 |
a231/74 |
cd43/6 |
i77/11 |
i820/48 |
استفاده از ملاتونین سبب افزایش فعالیت این آنزیمها نسبت به شاهد بدون ملاتونین شد. غلظت مؤثر ملاتونین غلظت 100 میکرومولار بود. در اثر متقابل شوری و ملاتونین بیشترین فعالیت POX و APX در غلظت mM NaCl 200 و µM 100 ملاتونین دیده شد. در مورد کاتالاز، حداکثر فعالیت در سطح نمک صفر و ملاتونین µM 100، با 80% افزایش نسبت به شاهد مشاهده شد که اختلاف معنیداری با سایر تیمارها داشت. POX و APX در بیشترین مقدار خود بترتیب نسبت به شاهد 130% و 50% افزایش فعالیت نشان دادند (جدول2).
بحث و نتیجهگیری
تنش شوری با ایجاد محدودیت در جذب آب و نیز سمیت یونی بر وضعیت آب بافتی گیاه، فرآیندهای متابولیکی و رشد گیاه تأثیر میگذارد، کاهش مقدار کلروفیل و نرخ فتوسنتز سبب کاهش قابل توجهی در رشد میشود (31، 50) و متابولیسم کربوهیدرات و اسمولیتهایی چون اسیدهای آمینه (بیشتر از همه پرولین) تغییر میکند (30، 36) سیستمهای غشایی و آنزیمی با بالا رفتن سطح ROS و بهم خوردن هومئوستازی ROS آسیب میبینند. تلاشهای گیاه برای مقابله با آسیبهای ناشی از تنش با بهکار گرفتن یک سیستم آنتیاکسیدانی قوی پروتئینی و غیرپروتئینی، معمولا در ساعات اولیه رویایی با تنش آغاز میشود. تولید ROSها بعنوان پیامبرهای ثانویه (50)، مسیرهای علامترسانی را روشن میکند و در نهایت سیستم آنتیاکسیدانی با کاهش ROS آسیبهای ناشی از تنش را آرام میکند. در پژوهشی در مورد گیاه لوبیا که در معرض شوری mM120 قرار داشت، مقدار پروتئین کاهش زیادی پیدا کرد در حالی که محتوای نسبی رنگیزههای فتوسنتزی افزایش یافت. فتوسنتز کاهش یافت، رشد دانهرستها و وزن خشک آنها با افزایش غلظت نمک در محیط، کاهش یافت (46). در پژوهشی دیگر تنش شوری (mM NaCl 100) در دو رقم لوبیای حساس و غیرحساس به شوری، سبب افزایش فعالیت APX و CAT شد که در رقم متحمل به نمک افزایش فعالیت بیشتر بود. میزان MDA نیز تحت تنش نمک افزایش یافت. مقدار کلروفیل در رقم حساس کاهش یافت و در رقم متحمل تغییری نداشت (44). تنش خشکی سبب تغییر کارکرد فتوسیستم II (کاهش Fv/Fm و Fv و افزایش میزان فلورسانس حداقل)، کاهش محتوای کلروفیلها و کارتنوئیدها در دو رقم لوبیا شد (1).
ترکیبات شیمیایی متعدد برای بهبود مقاومت گیاهان به شرایط تنشی توسط پژوهشگران زیادی استفاده شده است. در مورد گیاه لوبیا، استعمال آسکوربیک اسید (ASA) و جیبرلین خارجی (GA3) بر روی دانهرستهای لوبیای تیمار شده با mM NaCl 200، آسیب اکسیداتیو حاصل از شوری را کاهش داد (33). خیساندن بذرهای لوبیا یا افشانه برگی آنها با SA و MLE (عصاره برگ Moringa oleifera) توانست فاکتورهای فیزیولوژیکی و رشدی و تعادل یونی گیاه را در برابر تنش شوری بهبود بخشد و غلظت کل قندهای محلول و پرولین آزاد را افزایش دهد (31). اسپری برگی گیاه لوبیا با غلظتهایی از اتانول، با بهبود فاکتورهای فتوسنتزی، تحمل گیاه را به تنش خشکی افزایش داد (5). استفاده از کمپوست و ورمیکمپوست در تعدیل اثرات سمی فلزات سنگینی چون کادمیوم و سرب در گیاه لوبیا رقم صدری نقش مثبتی ایفا کرد و با کاهش اثرات سمی این فلزات، اثر مثبتی بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی چون پراکسیداز و پلیفنل اکسیداز داشت (2). اخیراً چندین پژوهش نشان دادهاند که ملاتونین با بهبود بخشیدن به فتوسنتز و هومئوستازی یونی، مقاومت به شوری را در هندوانه، سیب و خیار بهبود بخشیده است (14). پیشتیمار با ملاتونین سبب افزایش ظرفیت فتوسنتزی و توسعه سیستم ریشهای میشود. تیمارهای ملاتونین با افزایش سطح رونوشتبرداری و نیز افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان توانایی گیاه را برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از تنش شوری بهبود میبخشد. ملاتونین به طور معنیداری تولید H2O2 و رادیکالهای هیدروکسیل را سرکوب میکند (50). در پژوهش حاضر کاهش بیوماس ایجاد شده تحت تأثیر تنش شوری در اندام هوایی و ریشه، با تیمار ملاتونین جبران شد. همچنین ملاتونین سبب افزایش میزان رنگیزههای فتوسنتزی در شاهد و در شرایط شوری شد. نتایج مشابهی از اثر ملاتونین بر روی این فاکتورها در گیاهان دیگری گزارش شده است. از جمله استفاده از ملاتونین در گیاه جوی دوسر که در معرض تنش شوری بود سبب افزایش محتوای کلروفیل و سطح برگ شد و وزن تر و وزن خشک گیاه را افزایش داد (14). همچنین در تحقیقی که Zhang و همکاران (2016) بر روی Cucumis melo L. انجام دادند، استفاده از ملاتونین خارجی با غلظت µM 200 به صورت افشانه برگی به طور معنیداری از سرکوب رشد القا شده بوسیله سرما جلوگیری کرد و گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به غیر تیمار شدهها رشد و محتوای کلروفیل بیشتری داشتند (51). Wang و همکاران (2014) نشان دادند که ملاتونین با تغییر بیان ژن یک پروتئین که طی دوره پیری برگ در تجزیه کلروفیل نقش دارد، از کلروفیل محافظت میکند. علاوه بر این تأثیر ملاتونین به عنوان جاروب کننده ROS و فعال کننده آنتیاکسیدانها بر پایداری غشاها، سبب پایداری کلروپلاست و جلوگیری از تجزیه کلروفیل میشود. اثر ملاتونین بر روی فتوسنتز و فعالیت آنزیمهایی چون روبیسکو میتواند بر تولید خالص اولیه تأثیر مثبت داشته باشد که در نهایت افزایش رشد گیاه را به دنبال دارد (41، 51). در پژوهش حاضر شوری در گیاه لوبیا مشابه با پژوهشهای دیگر به طور معنیداری سبب افزایش غلظت قندهای محلول و پرولین شد (25). اثر افزایشی ملاتونین به طور وابسته به غلظت بر این فاکتورها در شرایط تنش و بدون تنش مشهود بود. پرولین بر روی آنزیمها و تمامیت غشای سلولی اثرات مثبتی دارد و بین میزان انباشته شدن اسمولیت پرولین و مقاومت گیاه به تنش ارتباط مثبت وجود دارد. پرولین علاوه بر نقشی که به عنوان تنظیمکننده اسمزی دارد، در تنش شوری که با تنش اکسیداتیو دنبال میشود، در تنظیم پتانسیل ردوکس سلولی نیز مؤثر است و از آسیب رساندن ROSها به غشاهای سلولی در شرایط تنش جلوگیری میکند (32، 24)، با استناد به نتایج حاضر میتوان بر نقش مؤثر ملاتونین در مقاوم کردن گیاه به شرایط شوری، تأکید کرد. Qian و همکاران (2015) نشان دادند که تیمار ملاتونین در گیاه گوجه فرنگی که در معرض حمله باکتریایی قرار داده شد، سبب افزایش سطح قندهایی چون فروکتوز، گلوکز و گلیسرول شد. در میان 16 اسیدآمینهای که اندازهگیری کردند، سطح پرولین به طور معنیداری پس از تیمار افزایش یافت (30). آسیب به غشاهای زیستی در نتیجه تنشهای محیطی از جمله تنش شوری با افزایش مقدار مالوندیآلدهید همراه است که میتواند با افزایش میزان H2O2 ارتباط مستقیم داشته باشد (29). در پژوهش حاضر تنش شوری در گیاه لوبیا سبب افزایش معنیدار غلظت H2O2 و MDA شد و فعالیت آنزیمهای POX، CAT و APX را افزایش داد. استفاده از ملاتونین به طور معنیداری سبب کاهش H2O2 و MDA در شرایط تنش شد که با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان همراه بود. غلظت µm 100 ملاتونین مؤثر بود و غلظت 400 میکرومولار آن اثرات شوری را تشدید کرد که تأیید کننده نتایج پژوهشهای پیشین میباشد. در دانهرستهای ذرت، استعمال µM 100 ملاتونین خارجی سبب کاهش میزان H2O2 و MDA القا شده به وسیله خشکی شد (45). علاوه بر این که ملاتونین به عنوان یک آنتیاکسیدان در جاروب کردن مستقیم H2O2 تولید شده در تنش اکسیداتیو، شوری و سرما به روش وابسته به مقدار مؤثر است، با افزایش فعالیت سیستم آنتیاکسیدانی از جمله آنزیمهای SOD، POX، CAT و APX در کاهش آسیبهای اکسیداتیو ایفای نقش میکند (4، 20، 11، 27، 15). Li و همکاران (2017) نشان دادند که ملاتونین خارجی میتواند آسیبهای ناشی از تنش شوری را در برنج کاهش دهد، میزان H2O2 را کاسته و فعالیت آنزیمهای SOD و CAT را افزایش دهد (20). اثرات افزایشدهنده ملاتونین بر روی تغییر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان در گیاهانی که تحت تنشهای شوری (19، 35، 50)، خشکی (40، 45)، اکسیداتیو (3) و سرما (51) بودهاند، گزارش شده است. Jiang و همکاران (2016) گزارشی از افزایش فعالیت آنزیمهای POX و APX با به کار بردن ملاتونین در برگهای ذرت تحت تنش شوری ارائه دادند (17). همچنین Zhang و همکاران (2016) افزایش فعالیت آنزیمهای SOD، POX و کاتالاز را در دانهرستهای خربزه قرار گرفته تحت تنش سرما گزارش کردند (51).
تأثیر مقادیر مختلف ملاتونین در محدوده غلظتهای بالا و پایین در گونههای مختلف و حتی نزدیک به هم متفاوت بوده است (6، 49، 51). به عنوان مثال در Brassica oleracea L. غلظت 1 و µM 10 ملاتونین اثرات بازدارندگی فلز مس را کاهش داد و غلظت µM 100 ملاتونین، این اثرات را تشدید کرد (29). در حالیکه غلظت µM200 ملاتونین بر روی دانهرستهای خیار که در معرض تنش سرمازدگی قرار داشتند، اثر بهبود دهنده داشت (52). غلظت µM 1/0 ملاتونین در گیاه ذرت تحت تنش شوری سبب بهبود رشد، افزایش فتوسنتز خالص و فعالیت آنتیاکسیدانی آنزیمها و نیز بهبود هومئوستازی یونی شد (17). در پژوهش حاضر غلظت بهینه ملاتونین که سبب بهبود مقاومت گیاه لوبیا در برابر شرایط تنش شوری شد، میزان µM 100 بود که در تعداد محدودی از موارد با غلظتهای بالاتر ملاتونین اختلاف معنیداری نداشت. گزارشات کمی از تأثیر بهبود دهنده غلظتهای بالای ملاتونین بر روی تحمل گیاه به شرایط تنشی گزارش شده است که نتایج پژوهش ما در غلظت µM 400 تأییدکننده اثرات بازدارنده غلظت ملاتونین میباشد.
در مجموع استعمال ملاتونین به طور وابسته به غلظت با افزایش پایداری رنگیزهها و تقویت سیستم آنتیاکسیدانی از آسیبهای تنش شوری به غشاها کاست و با افزایش تجمع قندهای محلول و کاهش H2O2 سبب بهبود رشد گیاه لوبیا در شرایط تنش و شاهد شد.