Document Type : Research Paper
Authors
Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
Abstract
The rapid expansion of the use of nanomaterials, including nano silicon (SiNP), in industry, medicine and agriculture has increased the risk of their introduction into the environment, and evaluation of their potential effects on organisms, including plant species, is essential. In this study, the effects of SiNP on growth factors, antioxidant enzymes and anatomy of Avean sativa L. were compared with sodium silicate. The experiments were conducted in laboratory with four concentrations of 2.5, 5, 7.5 and 10 mM sodium silicate and SiNP, and the plants received only silicon treatments only 7days at the germination stage. The results showed that SiNPs didn’t have toxic effect on the growth and tissue structure of treated plants and also had a positive effect on many measured parameters. Both forms of silicon increased the growth of leaves, especially the vascular sheath cells, the diameter of the meta-xylem openings and the thickness of vascular cell wall, as well as the diameter of the stem, the vascular poles and the meta-xylem openings II. Unlike the leaf and shoot, both forms of silicon had no positive effects on the most measured-parameters of roots. The activity of superoxide dismutase increased in the presence of SiNP that accompanied with significant increase in vascular cell was thickness compared to the other treatments. These changes can be due to the expression of genes that have been induced in germination phase. In general, the positive effect of sodium silicate on growth and anatomical factors was far greater than that of SiNP.
Keywords
Main Subjects
اثر کوتاه مدت ذرات نانوسیلیکون بر برخی ویژگیهای بافت شناختی و فیزیولوژیکی گیاه جودوسر (Avean sativa L.) و مقایسه آن با اثر سیلیکاتسدیم
فریده عسگری*، احمد مجد، پریسا جنوبی و فرزانه نجفی
ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 23/1/97 تاریخ پذیرش: 15/8/97
چکیده
گسترش استفاده از نانومواد از جمله نانوسیلیکون در صنعت، پزشکی و کشاورزی خطر ورود آنها به محیطزیست را افزایشداده، بنابراین بررسی اثرات احتمالی آنها بر موجوداتزنده از جمله گونههای گیاهی ضروری بهنظر میرسد. در پژوهش حاضر اثر نانوسیلیکون بر فاکتورهایرشد، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و آناتومیگیاه جودوسر (Avean sativa L.) در مقایسه با سیلیکاتسدیم بررسیشد. آزمایشها در شرایطآزمایشگاهی و با چهار غلظت 5/2، 5، 5/7 و 10 میلیمولار سیلیکاتسدیم و نانوسیلیکون به اجرا درآمد و گیاهان تنها بهمدت 7روز در مرحله جوانیزنی سیلیکون را دریافتکردند. نتایج نشاندادند که نانوسیلیکون اثر منفی و سمی بر رشد و ساختار بافتی گیاهان تیمارشده نداشته و در بسیاری از صفات اندازهگیری شده نیز اثرات مثبتی را درمقایسه با گروه شاهد برجای گذاشت. بهبود رشد برگها و خصوصا سلولهای غلافآوندی، قطر دهانهآوندی، افزایش ضخامت دیوارهسلولی آوندچوب و همچنین افزایش قطر ساقه، قطبهای آوندی و دهانهآوندیثانویه همگی از آثار قرارگیری در معرض نانوسیلیکون و سیلیکات بود. برخلاف برگ و ساقه، هردو شکل سیلیکون به کاررفته دریک نگاه کلی، اثرات مثبت معنیداری را بر صفات اندازهگیریشده در ریشه نداشتند. افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در حضور نانوسیلیکون با افزایش معنیدار ضخامت دیوارهسلولی نسبت به سایر تیمارها همراه بود که ارتباط فعالیت این آنزیم و سنتز لیگنین در دیواره را نشان میداد. تغییرات مشاهدهشده در گیاهان تیمارشده، با وجود کوتاهبودن زمان تیمار، میتوانند نشاندهنده القای ژنهای متعدد درگیر در رشد گیاه توسط سیلیکون در همان ابتدای جوانهزنی باشند. درنهایت با نگاهی کلی به نتایج میتوان گفت تاثیر مثبت سیلیکاتسدیم بر صفات رویشی و تشریحی به مراتب بیشتر از نانوسیلیکون بود.
واژه های کلیدی: سیلیکون، نانوسیلیکون، آنزیمهای آنتیاکسیدان، جودوسر
* نویسنده مسئول، تلفن: 09203611675 ، پست الکترونیکی: faride.asgari@gmail.com
مقدمه
نانو مواد شامل ذرات بین 1-100 نانومتر هستند که ویژگی و اثرات آنها علاوه بر ترکیب شیمیایی، تحت تاثیر اندازه آنها نیز میباشد (24). گسترش سریع نانوتکنولوژی در سالهای اخیر توجه زیادی را به اثر نانومواد روی محیط به خود جلب نمودهاست. با توجه به استفاده گسترده از نانومواد در محصولات مصرفی، رها شدن آنها در محیط اجتنابناپذیر است، جایی که سرنوشت و رفتار آنها به میزان بسیار زیادی ناشناخته است. جمعیتهای گیاهی نقش حیاتی و گستردهای در اکوسیستم بازی میکنند و ممکن است به میزان قابل توجهی در معرض نانومواد قرار گیرند (31). نانوسیلیکون (SiNP) یکی از نانوذراتی است که اخیرا توجه زیادی را به عنوان نانوکود به خود جلب نمودهاست و همچنین در صنعت از جمله در باتریهای لیتیومی به کار میرود (25). سیلیکون عنصری ضروری برای گیاهان نیست ولی اثرات مثبت بسیار زیادی بر رشد و میزان محصول گیاهان کشاورزی و همچنین مقاومت آنها در برابر تنشهای زیست محیطی دارد. این عنصر با افزایش فعالیت آنزیم-های آنتیاکسیدانی در گیاهان موجب افزایش مقاومت گیاه در برابر تنشهای زیست محیطی میگردد (1، 2 و26). همچنین رسوب این عنصر در دیواره سلولهای گیاهی موجب مقاومت بافتی در برابر حشرات گیاهخوار میگردد. رسوب این عنصر در قاعده برگها موجب افزایش ایستایی برگ در برابر نور و در نتیجه فعالیت بهتر فتوسنتزی گیاه میگردد (14).
در مورد اثر SiNP بر گیاهان پژوهشهای اندکی صورت گرفتهاست که نتایج گوناگونی را نشان داده اند. با توجه به اندازه SiNP به کار رفته و گونه گیاهی، اثرات مثبت و منفی بر روی گیاهان گزارش شدهاست. نانوذرات کوچکتر از 20 نانومتر (کوانتوم داتها) تاثیر منفی بر جوانهزنی و رشد گیاه برنج داشتند، ولی SiNPهای بزرگتر از 20 نانومتر اثر مثبتی را در پژوهش فوق بر گیاه برنج نشان دادند (28). برخلاف پژوهش پیشین، Siddiqui و Al-Whaibi (35) در پژوهش خود نشان دادند که SiNP با اندازه 12 نانومتر جوانه زنی گیاه گوجه فرنگی را افزایش داد. در حالی که Le و همکاران (23) اثر سمی SiNPهای 30 نانومتری را بر گیاه کتان گزارش کردند. همچنین این نانوذرات با اندازه بیش از 20 نانومتر بر بقای تک سلولی Pesudokirchneriella subcapitata نیز اثر منفی گذاشتند (40). اما گزارشهایی نیز وجود دارند که نشان می دهند اثر این نانوذره بر رشد و فیزیولوژی گیاهان تقریبا مشابه سیلیکون تودهای اما با شدتی متفاوت میباشد (29و 38). هم-چنین گزارشهای اخیر نشان میدهند که نانوذرات سیلیکون موجب کاهش اثرات منفی تنشهای زیست محیطی مانند شوری میگردند (39).
سیلیکون علاوه بر فیزیولوژی گیاهان، بر ساختار سلولی و بافتی آنان نیز اثر میگذارد. این عنصر انعطاف پذیری دیواره را افزایش داده (21) و موجب افزایش قطر دهانه آوندهای چوب نیز میگردد (29). با توجه به بررسی منابع صورت گرفته تا کنون تاثیر نانوذرات سیلیکون بر ساختار سلول و بافت گیاهان به میزان کافی بررسی نشدهاست. تنها در پژوهشی که اخیرا صورت گرفتهاست، Nazaralian و همکاران (29) تاثیر آن را بر سلولهای آوند چوب گیاه شنبلیله بررسی کردند.
با بررسی پژوهش های پیشین در مورد اثر SiNP بر گیاهان، این پرسش مطرح می گردد که اگر گیاهان مدت زمان کوتاهی در معرض غلظت های نسبتا بالای SiNP قرار گیرند، چه تغییراتی در مراحل بعدی رشد می تواند در آنها اتفاق بیافتد. بنابراین اهداف پژوهش حاضر بررسی اثر کوتاه مدت نانوذرات سیلیکون بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی، محتوی پروتئین و ساختار تشریحی اندامهای رویشی گیاه جودوسر و مقایسه آن با اثر سیلیکاتسدیم میباشد. گیاه جودوسر یکی از گیاهان تیره گندمیان است که مانند سایر اعضای این خانواده سیلیکون را به میزان بالایی در خود جمع میکند. این گیاه علاوه بر ارزش غذایی اهمیت زیادی در حوزه پزشکی و تولید لوازم آرایشی- بهداشتی دارد.
مواد و روشها
شرایط کشت: بذرهای گیاه جودوسر از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیهشده و پس از همسان سازی وزنی به وسیله محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد (v/v) )دارای 5 درصد کلر فعال) بمدت 20 دقیقه و سپس اتانول 70 درصد (v/v) بمدت 30 ثانیه استریل شدند. پس از هر مرحله سه بار شستشو با آب مقطر استریل بمدت 30 ثانیه صورت گرفت. 15 بذر روی کاغذ صافی استریل درون پتری دیشهای 10 سانتی متری حاوی 5 میلیلیتر آب مقطر استریل (گروه شاهد) و چهار غلظت (5/2، 5، 5/7 و 10 میلیمولار) از محلول سیلیکاتسدیم و نانوذرات سیلیکون در دمای 2±25 درجه سانتی گراد و شرایط روشنایی/تاریکی 16/8 ساعت کشت شدند. مدت زمان تیماردهی گیاهان محدود به دوران جوانی زنی بوده و دانه رستهای 7 روزه پس از همگن سازی به گلدانهای 5/1 لیتری حاوی محلول غذایی لانگشتاین (20) بدون افزودن هیچ غلظتی از سیلیکاتسدیم و نانوسیلیکون انتقال یافتند و پس از چهار هفته گیاهان منتخب برای بررسیهای بافت شناختی و فیزیولوژیکی برداشت شدند.
سیلیکاتسدیم بصورت تریسیلیکات سدیم (Na2O7Si3؛ شرکت سیگما) و نانوذرات سیلیکون بصورت پودر SiO2 (شرکت US Research Nanomaterials, INS) استفاده شدند. سونیکاسیون SiNPها توسط دستگاه اولتراسونیکاتور در طول موج 10 مگاهرتز بمدت 40 دقیقه در آب صورت گرفت و در نهایت محلول تقریبا یکنواختی از این ذرات به دست آمد. کلیه آزمایشها در آزمایشگاه و در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار انجام شد.
فاکتورهای رشد: گیاهان 4 هفتهای برداشت شده و طول ریشه و اندام هوایی و همچنین وزن تر ریشه و اندام هوایی گیاهان اندازهگیری شد. سپس بمدت 72 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتی گراد قرار داده شدند و وزن خشک آنها اندازهگیری شد.
محتوی پروتئین کل: نمونه برگهای تازه در نیتروژن مایع پودر شدند و با بافر فسفات پتاسیم (pH= 6.8, 0.1 M) حاوی 1 میلیمولار EDTA هموژنیزه گردیدند. محلول فوق بمدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور g 12000 سانتریفوژ شده و سپس محلول رویی برای سنجش پروتئین کل به روش برادفورد استفادهشد (8).
سنجش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی: عصاره سلولی تهیهشده برای سنجش پروتئین کل برای سنجش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی استفادهشد. برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)، به 100 میکرولیتر عصاره استخراج شده، 9/2 میلیلیتر محلول واکنش حاوی 1 میلیلیتر بافر فسفات (25 mM, pH= 6.8)، 50 میکرولیتر گایاکول، 50 میکرولیتر H2O2 اضافه شد. جذب محلول فوق توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج 470 نانومتر بمدت 3 دقیقه خواندهشد (22).
محلول واکنش برای سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) شامل 50 میلیمولار بافر فسفات پتاسیم (pH= 7.5)، 13 میلیمولار متیونین، 75 میکرومول NBT (Nitroblue tetrazolium chlorid)، 4 میکرومول ریبوفلاوین و 1/0 میلیمولار EDTA بود. به 100 میکرولیتر عصاره استخراج شده، 9/2 میلیمولار از مخلوط واکنش اضافه شد، ترکیب حاصله بمدت 20 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد توسط دو لامپ فلورسنت 20 وات بمدت 15 دقیقه نوردهی شد. جذب مخلوط واکنش در طول موج 560 نانومتر تعیین شد (17).
برای اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز، مخلوط واکنش حاوی 100 میلیمولار بافر فسفات پتاسیم (pH= 7)، 15 میلیمولار H2O2 و 100 میلیمولار عصاره آنزیمی در حجم 3 میلیلیتر بود. واکنش در طول موج 240 نانومتر برای مدت 3 دقیقه اندازهگیری شد (3). فعالیت کلیه آنزیمها به عنوان واحد آنزیم در گرم وزن تر (U g-1 fw) محاسبه گردید.
بررسیهای بافتشناسی: برای بررسیهای بافتشناسی 1 سانتی متر از میانه برگ و یک سانتیمتر از میانه میانگره ششم و یک سانتی متر در فاصله 8-9 سانتی متر از نوک ریشه بصورت دستی برش عرضی گرفتهشد. سپس برشها با رنگ آمیزی مضاعف متیلن بلو- کارمن زاجی رنگ آمیزی شدند و با میکروسکوپ نوری مدل (Zeiss، آلمان) مشاهده و با دوربین دیجیتال تصویربرداری شدند. صفات بافتی توسط نرم افزار Micro measure 3.3 اندازهگیری شدند.
آنالیز آماری: آنالیز واریانس (ANOVA) برای تمام دادههای آزمایش در این کار با استفاده از نرم افزار SPSS-19 انجام شد. اختلاف میانگینها با آزمون دانکن در سطح احتمال (P˂0.05) مقایسه گردید و خطای استاندارد میانگینها (±SE) در جدولها و نمودار نشان داده شدهاست.
نتایج
فاکتورهای رشد: اندازهگیری فاکتورهای رشد گیاهان شاهد و تحت تیمار نشان داد که به طور کلی تیمار کوتاه مدت گیاهان با سیلیکات و SiNP تاثیر مثبتی بر افزایش رشد گیاهان داشت و همچنین تاثیر سیلیکات بهتر از SiNP بود (جدول 1). وزن تر و خشک اندام هوایی و وزن تر ریشه تقریبا در تمام غلظت های به کار رفته سیلیکات سدیم افزایش یافته بود. ولی تنها در غلظتهای 5/2 و 10 میلیمولار SiNP وزن تر اندام هوایی (بترتیب 29/0 و 37/0 گرم) و وزن تر ریشه (41/0 و 45/0 گرم) بیشتر از گروه شاهد بود و وزن خشک اندام هوایی نیز در بین تیمارهایSiNP تنها در غلظت 10 میلیمولار افزایش نشان داد. تیمار گیاهان با سیلیکاتسدیم و SiNP وزن خشک ریشه را افزایش نداد. وزن خشک ریشه تیمارهای 5/7 و 10 میلی-مولار سیلیکات و 10 میلیمولار SiNP تفاوت معنیداری با گروه شاهد نداشت و سایر تیمارها موجب کاهش وزن خشک ریشه شدند. طول اندام هوایی گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد افزایش یافت و این افزایش در غلظتهای 10 میلی-مولار هردونوع سیلیکون به کار رفته چشمگیرتر بود. در این صفت نیز تیمارهای سیلیکات عملکرد بهتری را نشان دادند و به غیر از تیمار 10 میلیمولار SiNP، سایر غلظتهای به کار رفته اندام هوایی کوتاهتری داشتند.
جدول1- مقایسه میانگین صفات ریخت شناسی و رشدی در گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم و SiNP.
تیمارها (mM) |
وزن تر اندام هوایی (g) |
وزن خشک اندام هوایی (g) |
وزن تر ریشه (g) |
وزن خشک ریشه (g) |
طول اندام هوایی (cm) |
طول ریشه (cm) |
Control |
23/0 ± 00/0d |
037/0 ± 001/0c |
36/0 ± 01/0f |
014/0 ± 001/0a |
80/27 ± 37/2e |
44/20 ± 79/0bc |
Silicate 2.5 |
38/0 ±13/0b |
052/0 ±022/0a |
38/0 ±01/0ef |
01/0 ±00/0e |
00/48 ±79/0bc |
80/16 ±15/1de |
Silicate 5 |
40/0 ± 01/0b |
052/0 ± 00/0a |
49/0 ± 01/0b |
012/0 ± 001/0bcd |
16/49 ± 63/1b |
92/20 ±86/0ab |
Silicate 7.5 |
45/0 ±02/0a |
046/0 ±00/0b |
43/0 ±02/0cd |
012/0 ±00/0abc |
68/48 ±15/1b |
74/19 ±61/0bc |
Silicate 10 |
40/0 ± 01/0b |
05/0 ± 00/0a |
53/0 ± 01/0a |
013/0 ± 00/0ab |
80/53 ± 45/1a |
20/23 ± 98/0a |
SiNP 2.5 |
29/0 ±01/0c |
035/0 ±00/0c |
41/0 ±01/0de |
012/0 ±001/0bcd |
28/44 ±10/1c |
90/17 ±10/1cd |
SiNP 5 |
22/0 ± 01/0d |
029/0 ± 001/0d |
38/0 ± 01/0ef |
011/0 ± 001/0de |
56/39 ± 67/0d |
92/14 ± 55/0e |
SiNP 7.5 |
25/0 ±01/0d |
036/0 ±00/0c |
32/0 ±02/0g |
012/0 ±00/0cd |
46/44 ±28/1c |
90/18 ±76/0bcd |
SiNP 10 |
37/0 ± 01/0b |
045/0 ± 00/0b |
45/0 ± 01/0c |
013/0 ± 001/0abc |
56/54 ± 89/1a |
76/19 ±78/0bc |
حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
شکل 1- محتوی پروتئین کل در گروه کنترل در گیاهان کنترل و تحت تیمار سیلیکاتسدیم و SiNP. حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد می باشد.
تیمارهای سیلیکات و SiNP به طور کلی تاثیر چشمگیری بر طول ریشه گیاهان تحت تیمار نداشتند، به غیر از تیمار 10 میلیمولار سیلیکات که ریشه بلندتری نسبت به گروه شاهد داشت، سایر تیمارها یا تفاوتی نسبت به گروه شاهد نداشتند یا ریشه آنها کوتاهتر بود. در این صفت نیز نتایج به دست آمده در گیاهان تحت تیمار سیلیکاتسدیم بهتر از تیمارهای SiNP بودند.
محتوی پروتئین: بررسی محتوی پروتئین گیاهان نشان داد که به غیر از غلظت 10 میلیمولار سیلیکاتسدیم که نسبت به گروه شاهد افزایش محتوی پروتئین را نشان داد، سایر گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد تفاوتی نشان ندادند (شکل 1). شیب کاهش محتوی پروتئین با افزایش غلظت SiNP و افزایش محتوی پروتئین با افزایش غلظت سیلیکاتسدیم مشاهدهشد. به نظر میرسد تاثیر سیلیکاتسدیم نسبت به گروه شاهد پر رنگتر از SiNP بود.
فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان: تیمار گیاهان با هردو شکل سیلیکون، به غیر از چند استثنا یا تاثیری بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی POD و CAT نداشت و یا موجب کاهش فعالیت این آنزیمها شد (جدول 2). در گیاهان تیمارشده با غلظت 5-10میلیمولار SiNP و غلظت 5 میلیمولار سیلیکاتسدیم، فعالیت آنزیم SOD نسبت به گروه شاهد وسایر تیمارها بیشتر بود. ولی فعالیت آن در تیمارهای 5/2 و 10 میلیمولار سیلیکات و 5/2 میلیمولار SiNP کاهش نشان داد. غلظتهای 5/2 و 5/7 میلیمولار سیلیکات دارای بیشترین فعالیت POD نسبت به گروه شاهد و سایر تیمارها بودند. گیاهان تحت تیمار بالاترین غلظت SiNP و سیلیکاتسدیم دارای کمترین فعالیت آنزیم POD بودند و در سایرین تغییری در فعالیت این آنزیم مشاهده نشد. فعالیت آنزیم کاتالاز نیز در بیشتر تیمارها نسبت به گروه شاهد کاهش یافت، به غیر از غلظتهای 5/2 و 5/7 میلیمولار سیلیکات که افزایش فعالیت این آنزیم را نشان دادند.
جدول2- سنجش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم و SiNP.
تیمارها (mM) |
SOD (U/g fw) |
POD (U/g fw) |
CAT (U/g fw) |
Control |
18/49 ± 17/5cd |
50/16 ± 75/0b |
10/8 ± 31/0c |
Silicate 2.5 |
66/34 ±65/1f |
50/22 ±75/0a |
46/11 ± 29/0a |
Silicate 5 |
26/53± 90/0b |
10/14 ± 56/1bc |
52/7 ± 27/0d |
Silicate 7.5 |
46/48 ±42/0d |
17/20 ±37/1a |
83/9 ± 16/0b |
Silicate 10 |
42/37 ± 58/1f |
00/12 ± 46/0cd |
37/6 ± 11/0f |
SiNP 2.5 |
33/42 ±43/1e |
50/16 ±40/0b |
53/4 ± 18/0g |
SiNP 5 |
89/58 ± 49/1a |
60/9 ± 46/0d |
23/7 ± 12/0de |
SiNP 7.5 |
45/52 ±64/0b |
80/13 ±23/0bc |
71/6 ±26/0ef |
SiNP 10 |
76/52 ± 62/0b |
30/12 ± 64/0cd |
62/6 ±26/0ef |
حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
بافتشناسی: در بررسی برشهای برگی (جدول 3) مشخص شد که پهنای برگ در تمامی گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد افزایش یافتهبود و این افزایش در گیاهان تحت تیمار سیلیکاتسدیم (شکل 2، A-E) بیشتر از گیاهان تحت تیمار SiNP (شکل 3، A-E) بود. بالاترین غلظتهای به کار رفته در سیلیکاتسدیم و SiNP (10 میلیمولار) برگ پهنتری نسبت به سایر تیمارها داشتند. قطر دهانه آوندی اولیه نیز در تمام گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد افزایش یافتهبود. تاثیر هر دو نوع سیلیکون به کار رفته روی دهانه آوندی ثانویه تقریبا یکسان بود و گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد دارای دهانه آوندی ثانویه بزرگتری بودند. ضخامت دیواره سلولی در حضور سیلیکون نسبت به گروه شاهد افزایش یافت و این افزایش در گیاهان تحت تیمار SiNP چشمگیرتر بود.
نتایج بررسی سلولهای غلافآوندی نشان دادند که قطر این سلولها در حضور سیلیکون تقریبا در تمام تیمارها افزایش یافتهبود. تنها در غلظت 5 میلیمولار سیلیکات سدیم، قطر سلول غلافآوندی تفاوت معنیداری با گروه شاهد نداشت.
در غلظتهای پایین سیلیکاتسدیم (5/2 و 5 میلیمولار) اندازه سلولهای حبابی نسبت به گروه شاهد افزایش یافت، ولی غلظتهای بالای آن اندازه سلولهای حبابی را کاهش داد. اندازه سلولهای حبابی در گیاهان تحت تیمار SiNP به غیر از غلظت 5 میلی مولار که سلول های حبابی بزرگتری دیده شد در سایر تیمارها تغییر معنیداری نسبت به گروه شاهد مشاهده نشد.
جدول3- مقایسه میانگین صفات تشریحی برگ در گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم و SiNP.
تیمارها (mM) |
پهنای برگ (mm) |
قطر دهانه آوندی اولیه (μm) |
قطر دهانه آوندی ثانویه (μm) |
ضخامت نسبی دیواره آوند چوب (μm) |
قطر سلول غلافآوندی (μm) |
قطر سلول حبابی (μm) |
Control |
74/4 ±24/0f |
17/4 ± 09/0f |
26/18 ± 36/0f |
72/1 ± 04/0e |
19/38 ± 94/0cd |
21/50 ± 64/0bc |
Silicate 2.5 |
46/7 ±09/0d |
40/10 ±84/0a |
64/36 ±27/0a |
09/2 ±09/0d |
06/48 ±76/1a |
82/61 ±58/2a |
Silicate 5 |
22/7 ±06/0d |
99/9 ±23/0a |
16/34 ±89/0bcd |
58/2 ±18/0c |
73/36 ±69/0d |
74/57 ±72/0a |
Silicate 7.5 |
70/8 ±09/0a |
00/10 ±44/0a |
63/34 ±79/0bc |
49/2 ±04/0c |
98/48 ±73/3a |
79/42 ±12/2d |
Silicate 10 |
99/7 ±46/0bc |
19/9 ±36/0ab |
59/28 ±41/0e |
45/2 ±03/0c |
72/41 ±67/0b |
93/44 ±23/1d |
SiNP 2.5 |
38/6 ±08/0e |
08/7 ±18/0d |
61/32 ±41/0d |
37/2 ±12/0cd |
78/44 ±64/0ab |
45/46 ±85/0cd |
SiNP 5 |
61/7 ±05/0cd |
90/8 ±17/0bc |
78/36 ±26/0a |
48/3 ±06/0a |
71/45 ±24/1ab |
15/61 ±12/2a |
SiNP 7.5 |
05/6 ±05/0e |
15/8 ±13/0c |
77/33 ±21/0cd |
01/3 ±12/0b |
13/45 ±59/0ab |
22/52 ±25/0b |
SiNP 10 |
08/8 ±03/0b |
78/5 ±19/0e |
52/35 ±74/0ab |
94/2 ±07/0b |
24/47 ±46/0a |
30/52 ±26/1b |
حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
جدول 4- مقایسه میانگین صفات تشریحی میانگره در گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم وSiNP
تیمارها (mM) |
قطر میانگره (mm) |
قطر دهانه آوندی اولیه (μm) |
قطر دهانه آوندی ثانویه (μm) |
ضخامت نسبی دیواره آوند چوب (μm) |
تعداد قطبهای آوندی |
Control |
17/1 ±03/0f |
96/10 ±51/0a |
50/34 ±37/0d |
58/2 ±18/0c |
33/22 ±45/1e |
Silicate 2.5 |
85/1 ±08/0bcd |
63/9 ±08/0bcd |
95/36 ±86/0c |
77/2 ±09/0bc |
00/22 ±58/0e |
Silicate 5 |
24/2 ±14/0a |
66/10 ±12/0ab |
39/42 ±19/0ab |
93/2 ±19/0bc |
67/26 ±33/0c |
Silicate 7.5 |
45/1 ±07/0e |
81/7 ±26/0ef |
01/38 ±54/0c |
19/3 ±22/0ab |
33/22 ±33/0e |
Silicate 10 |
08/2 ±05/0ab |
06/10 ±28/0abc |
00/44 ±64/0a |
72/3 ±10/0a |
00/41 ±58/0a |
SiNP 2.5 |
17/2 ±02/0a |
82/8 ±63/0de |
62/33 ±43/0d |
86/2 ±13/0bc |
00/34 ±58/0b |
SiNP 5 |
93/1 ±04/0bc |
28/10 ±63/0abc |
82/42 ±02/1ab |
78/2 ±07/0bc |
67/24 ±33/0d |
SiNP 7.5 |
76/1 ±07/0cd |
20/9 ±08/0cd |
82/41 ±50/0b |
89/2 ±21/0bc |
67/20 ±33/0e |
SiNP 10 |
62/1 ±09/0de |
31/7 ±29/0f |
24/30 ±62/0e |
19/3 ±27/0ab |
67/24 ±33/0ab |
حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
بررسی بافتشناسی میانگره نشان دهنده تاثیر معنیدار سیلیکون بر صفات بافتی آن بود (جدول 4). قطر میانگره در همه گیاهان تحت تیمار افزایش یافتهبود و این افزایش در تیمارهای سیلیکاتسدیم (شکل 2، F-J ) به نظر بیشتر از تیمارهای SiNP بود. در حضور سیلیکون قطر دهانه آوندی اولیه در میانگره بدون تغییر باقی ماند یا کاهش یافت. تیمارهای 5/7 میلی-مولار سیلیکات (شکل 2-I) و 10 میلیمولار SiNP (شکل 3-J) با قطر تقریبی 7 میکرومتر دارای کوچکترین دهانه آوندی اولیه بودند. اما قطر دهانه آوندی ثانویه در گیاهان تیمارشده با سیلیکون افزایش چشمگیری نسبت به گروه شاهد داشت و تنها غلظت 10 میلیمولار SiNP دهانه آوند ثانویهای کوچکتری داشت. تمام گیاهان تحت تیمار سیلیکون در هر دوشکل آن، دارای دیواره آوندی ضخیمتری نسبت به گروه شاهد بودند و غلظتهای بالای سیلیکاتسدیم (5/7 و 10 میلیمولار) و غلظت 10 میلیمولار SiNP بیشترین ضخامت دیواره آوند چوب را داشتند. بیشترین تعداد قطب آوندی متعلق به غلظت 10 میلیمولار سیلیکاتسدیم بود (41 عدد). به غیر از غلظتهای 5/2 (شکل 5) و 5/7 (شکل 11) میلیمولار سیلیکاتسدیم وغلظت 5/7 میلیمولار SiNP که تغییری نسبت به گروه شاهد نداشتند در سایر تیمارها تعداد قطبهای آوندی افزایش یافتهبود.
جدول5- مقایسه میانگین صفات تشریحی ریشه در گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم و SiNP.
تیمارها (mM) |
قطر ریشه (mm) |
قطر دهانه آوندی اولیه (μm) |
قطر دهانه آوندی ثانویه (μm) |
ضخامت نسبی دیواره آوند چوب (μm) |
Control |
70/461 ±25/0d |
13/14 ±30/0c |
11/63 ±31/0b |
53/2 ±06/0bc |
Silicate 2.5 |
39/574 ±81/14b |
31/18 ±56/0b |
19/72 ±46/0a |
05/3 ±33/0ab |
Silicate 5 |
39/368 ±10/5f |
73/12 ±36/0cd |
79/36 ±86/0h |
79/1 ±12/0d |
Silicate 7.5 |
38/385 ±80/2ef |
44/12 ±64/0d |
40/46 ±27/0e |
26/2 ±11/0cd |
Silicate 10 |
27/552 ±70/9c |
28/21 ±41/0a |
50/54 ±50/0d |
72/2 ±15/0abc |
SiNP 2.5 |
96/633 ±36/3a |
85/17 ±82/0b |
84/59 ±37/0c |
27/3 ±08/0a |
SiNP 5 |
45/381 ±98/3ef |
13/9 ±14/0e |
46/39 ±35/0g |
94/1 ±24/0d |
SiNP 7.5 |
02/398 ±82/1e |
62/12 ±38/0cd |
99/43 ±15/0f |
82/1 ±13/0d |
SiNP 10 |
19/381 ±31/0ef |
12/13 ±22/0cd |
91/43 ±19/0f |
76/2 ±18/0abc |
حروف مشترک بیانگر اختلاف غیرمعنیدار تیمارها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
ساختار بافتشناسی ریشه در حضور سیلیکون چندان افزایش نیافت (جدول 5، شکلهای 2و 3- K-O). قطر ریشه تنها در غلظت 5/2 و 10 میلیمولار سیلیکات و 5/2 میلیمولار SiNP (شکل 3-L) افزایش داشت و در سایر تیمارها نسبت به شاهد کاهش یافتهبود. قطر دهانه آوندی اولیه نیز مانند قطر ریشه تنها در سه غلظت اشارهشده افزایش نشان داد و در سایر غلظتها بدون تغییر باقی مانده یا کوچکتر از گروه شاهد بود. دهانه آوند ثانویه در غلظت 5/2 میلیمولار سیلیکاتسدیم بزرگتر از گروه شاهد بود و در سایر تیمارها اندازه آن کاهش یافت. ضخامت دیواره در گیاهان تحت تیمار 5/2 میلیمولار SiNP بیشتر از گروه شاهد بود. ولی سایر تیمارها بدون تغییر باقی مانده یا کاهش یافتهبودند.
بحث و نتیجه گیری
نتایج پژوهش حاضر نشان دادند که تیمار کوتاه مدت گیاهان با غلظتهای مختلف SiNP اثرات سمی روی گیاه جودوسر نداشت و حتی تعدادی از صفات اندازهگیریشده در این پژوهش در حضور SiNP نسبت به گروه شاهد افزایش نشان دادند. ولی مقایسه این نتایج با گیاهان تیمارشده با سیلیکاتسدیم نشان داد که سیلیکاتسدیم اثری به مراتب بهتر از SiNPها روی رشد گیاهان دارد. مقایسه وزن تر و خشک اندام هوایی و همچنین محتوی پروتئینکل نشان داد که گیاهان تحت تیمار سیلیکاتسدیم علاوه بر افزایش محتوی آب، میزان ماده سازی نیز در آنها افزایش یافتهاست. ولی با وجود افزایش طول اندام هوایی، وزن اندام هوایی در گیاهان تیمارشده با SiNP تغییری نکرد. این امر را شاید بتوان به مقدار کربوهیدراتهای ساختمانی و غیرساختمانی نسبت داد (9).
توسعه سلولها خصوصا در برگ معمولا با افزایش کربوهیدرات ساختمانی همراه است، در حالی که افزایش وزن برگ با افزایش کربوهیدرات ساختمانی و غیر ساختمانی همراه است (9) بنابراین ممکن است عدم افزایش وزن گیاهان تحت تیمار SiNP را بتوان به کاهش کربوهیدراتهای غیر ساختمانی در این گیاهان نسبت داد.
تیمار (mM) |
برگ |
میانگره |
ریشه |
||||||||||||||||||||||
Control |
|
|
|
||||||||||||||||||||||
Silicate 2.5 |
|
|
|
||||||||||||||||||||||
Silicate 5 |
|
|
|
||||||||||||||||||||||
Silicate 7.5 |
|
|
|||||||||||||||||||||||
Silicate 10 |
|
|
|
شکل 2- برش عرضی از برگ، میانگره و ریشه گیاهان شاهد و تحت تیمار سیلیکاتسدیم. bs= غلافآوندی ؛ en= اندودرم؛ me= مزوفیل؛ f= فیبر؛ mxI= متاگزیلم اولیه؛ mxII= متاگزیلم ثانویه؛ p= پارانشیم؛ ph= فلوئم و c= کلانشیم. نوار مقیاس : 100 میکرومتر.
تیمار (mM) |
برگ |
میانگره |
ریشه |
||||||||||||||||||||||
Control |
|
|
|
||||||||||||||||||||||
SiNP 2.5 |
|
|
|||||||||||||||||||||||
SiNP 5 |
|
||||||||||||||||||||||||
SiNP 7.5 |
|
|
|||||||||||||||||||||||
SiNP 10 |
|
|
شکل 3- برش عرضی از برگ (تصاویرA-E)، میانگره (F-J) و ریشه (K-O)گیاهان شاهد و تحت تیمارSiNP. bs= غلافآوندی ؛ en= اندودرم؛ me= مزوفیل؛ f= فیبر؛ mxI= متاگزیلم اولیه؛ mxII= متاگزیلم ثانویه؛ p= پارانشیم؛ ph= فلوئم و c= کلانشیم. نوار مقیاس : 100 میکرومتر.
از طرفی دانه گیاه نیز پیش از جوانهزنی دارای ذخایر سیلیکون میباشد که این خود میتواند هنگام جوانهزنی تاثیر مثبتی بر دانه رست داشته باشد و به همین دلیل تفاوتی میان وزن خشک گیاه شاهد و غلظتهای کمتر از 10 میلیمولار SiNP دیده نشد. نظرعلیان و همکاران (29) در پژوهش خود کاهش وزن خشک گیاه شنبلیله را در حضور سیلیکاتسدیم و SiNP گزارش کردند که با نتایج پژوهش حاضر همسویی نداشت. افزایش محتوی آب گیاه و بهینهشدن مصرف آن در حضور سیلیکون در نوشتارهای پیشین نیز گزارش شدهاست (18) که نتایج پژوهش حاضر نیز همین اثر SiNP را بر گیاهان تحت تیمار نشان دادند. یکی از دلایل مهم افزایش محتوی آب گیاه جلوگیری از هدر رفت آب از سطح برگ با تشکیل لایه دوگانه سیلیکون- کوتیکول است که مانند یک عایق از تبخیر سطحی آب برگ جلوگیری میکند (26 و 42).
برخلاف اندام هوایی، طول ریشه و وزن خشک آن در حضور سیلیکون بدون تغییر باقی مانده یا کاهش پیدا کرد. ممکن است دلیل این کاهش را بتوان به بهینهشدن جذب آب و حفظ آن در گیاهان تحت تیمار نسبت داد، به شکلی که با همین مقدار حجم ریشه گیاه قادر به جذب حداکثری آب و املاح میباشد و نیازی به صرف انرژی و ماده بیشتر برای افزایش حجم ریشه نیست.
یکی از مکانیزمهای دفاعی گیاهان در برابر تنشهای محیطی افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی میباشد. در منابع بسیاری به افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان در حضور سیلیکون اشاره شدهاست، خواه گیاه تحت تنش باشد یا خیر، به طوری که در شرایط بهینه نیز حضور سیلیکون موجب افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان میگردد (12و 36). هم چنین SOD و POD در لیگینی شدن نیز دخالت می کنند (16و 37). این ارتباط به خوبی در پژوهشی بر روی گیاه برنج به اثبات رسیده است (10). لیگنین به عنوان ترکیب پیچیدهای از ترکیبات فنولی، عنصری ضروری در ساختار دیوارهسلولی آوند چوب بوده، از گیاه بصورت مکانیکی حمایت کرده و به انتقال دور برد آب و املاح کمک می نماید (7). علاوه برآن این ترکیب میتواند به عنوان سد دفاعی در برابر حمله پاتوژنها عمل کند (6). Cai و همکاران (10) نشان دادند که سیلیکون موجب افزایش فعالیت آنزیم POD در گیاهان برنج شد. ولی در پژوهش حاضر که سیلیکون تنها در دوران جوانهزنی گیاه اعمال شد، در برخی غلظتها فعالیت این آنزیمها را کاهش داد. افزایش فعالیت SOD بیشتر در حضور SiNP مشاهدهشد و در این تیمارها، ضخیمترین دیواره سلولی نیز مشاهده شد که به خوبی ارتباط این آنزیم و سنتز لیگنین را نشان می دهد. فعالیت آنزیمهای POD و CAT در حضور سیلیکاتسدیم بیشتر بود. شاید دلیل این الگوی تغییرات فعالیت آنزیمی به دلیل تیمار کوتاه مدت این گیاهان و متفاوت بودن اثرگذاری سیلیکات سدیم و SiNP باشد. البته دیواره سلولی آوندها از ترکیبات گوناگون دیگری به غیر از لیگنین نیز تشکیل شده است (15) و بنابراین تمام تغییرات ایجاد شده در دیواره را نمیتوان به سنتز لیگنین نسبت داد و شاید افزایش قطر دیواره با وجود کاهش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در تیمارهای دیگر مربوط به افزایش سنتز سایر مواد تشکیل دهنده دیواره باشد. در هرصورت در تمامی تیمارهای سیلیکون نسبت به گروه شاهد، دیواره سلولی آوند چوب ضخامت بیشتری داشت که این از نظر مقاوت در برابر عوامل محیطی برای گیاه از اهمیت بالایی برخوردار است.
از اثرات سیلیکون در گیاهان بهبود عملکرد فتوسنتزی گیاه است (4) که به یقین یکی از دلایل این اثر ایجاد تغییرات بافتی و ساختاری برگ میباشد. پژوهشهای پیشین نشان دادند که سیلیکون با رسوب در قاعده برگ، ایستایی برگ در برابر نور را افزایش میدهد (21). در این پژوهش نیز در ساختار برگهای گیاهان تحت تیمار سیلیکون تغییرات مثبتی مشاهدهشد. افزایش پهنای برگ در تمام گیاهان تحت تیمار، سطح دریافت نور و توان فتوسنتزی گیاه را افزایش میدهد. همچنین افزایش دهانه آوندی موجب افزایش دریافت آب و املاح مورد نیاز از ریشه میگردد.
دیواره سلولی نقش مهمی در استحکام سلولها و همچنین استحکام و ایستایی برگها بازی میکند. افزایش قطر دیواره سلولی آوندهای چوبی در گیاهان تحت تیمار میتواند ایستایی برگ و مقاومت آن در برابر پاتوژنها را افزایش دهد که این نیز همراستا با افزایش کارایی برگ میباشد. این افزایش قطر دیواره سلولی آوند چوبی در گیاه شنبلیله نیز گزارش شدهاست (29).
سلولهای غلافآوندی سلولهای پارانشیمی بزرگی حاوی کلروفیل و نشاسته هستند که دستجات آوندی را احاطه کرده و رابط بین آنها و سلولهای مزوفیل میباشند (15). این سلولها جریان مواد به داخل برگ را بویژه در زمان تکوین برگ و جریان مواد به بیرون برگ را طی فتوسنتز آسان میکنند. سلولهای غلافآوندی در گیاهانی مانند جودوسر یکپارچگی هیدرولیکی را برای جلوگیری از ورود هوا به گزیلم حفظ میکنند و با ذخیره آب جریانهای تنفسی معمول در آب و هوای خشک مناطق گرمسیری را متعادل مینمایند (24و 34). همچنین در این گیاهان سلولهایی شبیه به سلولهای غلافآوندی تا اپیدرم گسترش مییابند که به آنها گسترههای غلافآوندی گفته میشود. این سلولها از انتشار جانبی گازها به درون مزوفیل جلوگیری کرده، در هدایت مواد دخالت داشته، ساختارهایی سازگار برای ذخیره آب بوده، به عنوان ساختار حمایتی عمل کرده (زیرا این گیاهان بیشتر دارای برگهای نازکی هستند که در برابر باد آسیب پذیر میباشند) (32و 34) و در نهایت به عنوان پنجرههایی عمل میکنند که نفوذ نور به لایههای داخلی مزوفیل را فراهم میکنند (30). با توجه به توضیحات بالا می-توان گفت افزایش حجم سلولهای غلافآوندی و گسترههای غلافآوندی در گیاهان تحت تیمار سیلیکون مزیتهای متعددی برای گیاهان داشته و یکی از دلایل افزایش توان فتوسنتزی و مقاومت گیاه در برابر تنشهای زیستی و غیر زیستی می باشند که پیشتر به آن اشاره شد. افزایش حجم این ساختارها همچنین میتواند دلیل دیگری بر افزایش محتوی آب اندام هوایی گیاه باشد.
افزایش اندازه سلولهای حبابی در گیاهان تحت تیمار سیلیکون ممکن است موجب باز شدن بیشتر برگها، جذب حداکثری نور و همچنین افزایش ذخیره آب شود. این سلولها که سلولهای موتور نیز نامیده میشوند، تقریبا در تمام تک لپهایها وجود دارند (5) و نقشهای متعددی از جمله ذخیره آب (13و 41)، دخالت در باز شدن برگهای جوان (41) و کمک به ورود نور به مزوفیل بازی میکنند (11). در گیاهان تیمارشده با سیلیکون در هر دو شکل آن، خصوصیات بافت شناختی ساقه، کم و بیش بهبود یافتهبود. این گیاهان دارای میانگره قطورتر و قطبهای آوندی بیشتری نسبت به گروه شاهد بودند، که در کنار افزایش دهانه آوندی ثانویه در هردو نوع ترکیب سیلیکون، نشان دهنده افزایش انتقال آب و متابولیتها می-باشد. شاید کاهش قطر دهانه آوندهای اولیه را بتوان به افزایش چوبی شدن دیواره آنها نسبت داد. به غیر از تعداد محدودی از غلظتها، در هردو شکل سیلیکون به کار رفته، صفات بافتی اندازهگیریشده در ریشه افزایش چشمگیری را نشان ندادند. تغییرات مشاهدهشده میتواند نشان دهنده القای ژنهای متعدد درگیر در رشد و گسترش گیاه توسط سیلیکون در همان ابتدای جوانهزنی باشد که آثار به جا مانده از فعالیت آنها تا هفته چهارم رشد دیده میشود. شاید این اثر القایی، بلندمدت است و یا اینکه سیلیکون آبشارهای رونویسی را راهاندازی میکند که در نهایت تا هفته چهارم یا حتی بیشتر ادامه مییابند. حقیقی و همکاران (19) در پژوهشی روی گیاه گوجهفرنگی افزایش طول ریشه در حضور غلظت های 1-2 میلیمولار SiNP (بمدت 10 روز) را گزارش کردند. شاید این اختلاف در نتایج به دلیل اختلاف در مدت زمان تیمار گیاهان با SiNP و همچنین غلظتهای به کار رفته باشد. ولی با در نظر گرفتن وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه و حجم آب انتقال یافته به گیاه می-توان گفت آب و املاح به میزان کافی به گیاه رسیدهاست و در نتیجه این حجم از ریشه کافی بوده و بنابراین گیاه نیازی به صرف انرژی و ماده بیشتر برای گسترش ریشههای خود نداشتهاست.
در جمع بندی نهایی میتوان گفت SiNP نه تنها تاثیر منفی بر گیاه جودوسر نداشت بلکه در بسیاری موارد اثرات مثبتی نیز برجای گذاشت و همچنین اثر آن تقریبا مشابه اثر سیلیکون تودهای روی گیاه جودوسر بود. ولی در صفات بسیاری بویژه صفات مربوط به برگ و همچنین فاکتورهای رشد گیاه، سیلیکاتسدیم اثری به مراتب بهتر از شکل نانو برجای گذاشت. با توجه به اینکه در این آزمایش بذرها برای مدت زمان کوتاهی در معرض تیمارهای نانوسیلیکون و سیلیکات قرار گرفتند، نتایج این مطالعه قابل تعمیم به وضعیت گیاه در طبیعت نمی باشد. چرا که ممکن است در طبیعت یک گیاه در تمام طول دوره چرخه زندگی خود به طور دائم در معرض غلظت های خاصی از این مواد قرار گرفته و یا حتی ممکن است با گذشت زمان توسط اثرات افزایشی این مواد نیز تحت تاثیر قرار گیرد. از این رو پیشنهاد می شود تا زمان بررسیهای دقیقتر اثر این ذرات در طیف وسیعی از گیاهان و موجودات دیگر و در دوره های زمانی طولانی تر در استفاده از آنها احتیاط لازم به عمل آید.